Citochromo c ir jo peroksidazės mažo afiniteto kompleksas | gamtos komunikacijos

Citochromo c ir jo peroksidazės mažo afiniteto kompleksas | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Fermentų mechanizmai
  • Struktūrinė biologija

Anotacija

Mielių citochromo c peroksidazės ir citochromo c kompleksas yra biologinio elektronų perdavimo (ET) paradigma. Remiantis septynių dešimtmečių tyrimais, buvo paaiškinti du skirtingi modeliai, paaiškinantys jo funkcinę redokso veiklą. Vienas postuluoja, kad tarpląstelinis ET atsiranda tik vyraujant didelio afiniteto baltymų ir baltymų orientacijai, o kitas teigia, kad susidaro papildomas mažo afiniteto kompleksas, kuris yra daug aktyvesnis nei dominuojantis. Skirtingai nuo didelio afiniteto sąveikos - išsamiai ištirtos rentgeno kristalografijos ir NMR spektroskopijos būdu - iki šiol citochromo c prisijungimas prie mažo afiniteto vietos nebuvo tiesiogiai stebimas, bet daugiausia daromas remiantis kinetikos eksperimentais. Pateikiame šio nekontroliuojamo, silpno baltymų komplekso struktūrą ir parodome, kad jį sudaro dominuojančios, neaktyvios surištos rūšys ir mažos, ET-kompetentingos baltymų ir baltymų orientacijos, kurios apibendrintai atspindi eksperimentiškai nustatytą ET normos vertę. pastovus.

Įvadas

Biologinės elektronų perkėlimo (ET) reakcijos yra būtinos daugeliui gyvybiškai svarbių ląstelių veiklų, įskaitant oksidacinį fosforilinimą ir fotosintezę - du procesus, kurių metu energija iš maisto ar saulės spindulių virsta chemine adenozino trifosfato energija. Mielių baltymų citochromo c (Cc) ir citochromo c peroksidazės (CcP) kompleksas yra biologinio ET tyrimo paradigma. CcP, esantis mielių mitochondrijose, yra kraujo fermentas, kuris mažina hidroperoksidus, naudodamas elektronus, kuriuos teikia jo fiziologinis partneris Cc. H2O2 redukcijos katalizinis mechanizmas apima CcP I junginio (CpdI), kuris yra tarpinis, oksiduotas dviem ekvivalentais, viršijančiais CcP (Fe 3+ ) ramybės būseną, susidarymą, kai Fe (IV) = O yra hemioferrilas ir W191 +. · Katijono radikalas 1, 2 . Tolesnis CpdI sumažinimas dviem vieno elektrono etapais apima komplekso susidarymą su geležies Cc, tarpmolekuliniu ET ir produkto disociacija. Remiantis dideliu eksperimento darbu (apžvelgtu 1, 2 skyriuose), buvo pateikti du kontrastingi modeliai, paaiškinantys ET veiklą. Pagal pirmąjį 3, 4, 5, 6, ET atsiranda tik nuo to, kai Cc yra prijungtas CcP didelio afiniteto vietoje, kaip matyti iš komplekso rentgeno struktūros 7 . Alternatyvus mechanizmas siūlo daugialypę ET-aktyvaus baltymo ir baltymo orientaciją ir teigia, kad ET nuo Cc, surišto į mažo afiniteto vietą, yra greitesnė nei kristalografinėje orientacijoje 8, 9, 10, 11 . Nuo to laiko mažo afiniteto Cc – CcP komplekso struktūra ir ET savybės buvo aktyvaus susidomėjimo ir nuolatinių diskusijų tema.

Pirmieji įtikinami duomenys apie 2: 1 Cc – CcP komplekso susidarymą buvo gauti Hoffmano ir bendradarbių 8, 9, 10 tyrimuose, kurie sekė trigubos būklės Zn pakeisto CcP arba Cc numalšinimą keičiant atitinkamo redokso koncentracijas. partneris. Stebima gana sudėtinga kinetika buvo paaiškinta modeliu, kuriame teigiamos dvi nesąveikaujančios Cc surišimo vietos, turinčios ryškiai skirtingą afinitetą ir ET savybes. Dėl didelio ( ~ 10 000 kartų) skirtumo tarp dviejų jungimosi vietų Cc afinitetų, trišakio komplekso biofizinis apibūdinimas pasirodė esąs nepaprastai sudėtingas uždavinys, reikalaujantis labai jautrios technikos, turinčios didelį dinaminį diapazoną, norint aptikti mažą surišimą. poveikis mažo afiniteto vietoje, esant daug stipresniam, dominuojančiam signalui iš didelio afiniškumo vietos. Kiek mums yra žinoma, tik du nekinetiniai pusiausvyros tyrimai parodė tvirtus 2: 1 Cc – CcP komplekso formavimo įrodymus. Ankstyvajame potenciometriniame darbe Maukas ir kt. 12 stebėjo Cc prisijungimą prie dviejų CcP vietų, turinčių skirtingas protono savybes, ir nustatė, kad trišalis kompleksas yra jautrus druskai, o antrasis surišimo įvykis panaikinamas esant dideliam jonų stiprumui ( I ≥ 100 mM). Vėliau, naujausiame kalorimetrijos tyrime, Morar ir Pielak 13 pranešė, kad trisacharido melezitozė stabilizuoja Cc – CcP sistemą santykiu 2: 1, ir parodė, kad CcP mutacija D148A ardo trišakio komplekso susidarymą, leisdama manyti, kad ši liekana gali būti dalis. mažo giminingumo svetainė. Nepaisant šių pastangų, tiksli mažo afiniteto vietos vieta išlieka neaiški, jos rišamosios savybės, jei nėra cukraus, neaiškios, ir mažo afiniteto komplekso struktūra nežinoma.

Norėdami išspręsti šiuos nežinomus dalykus, pateikiame tirpalo neįveikiamo mažo afiniteto komplekso struktūrinį apibūdinimą. Du svarbūs elementai, neatsiejami nuo šio tyrimo sėkmės, - rišamųjų įvykių abiejose vietose atsiejimas ir tirpalo BMR spektroskopijos, visų pirma paramagnetinio NMR, naudojimas norint gauti reikiamą struktūrinę informaciją. Norėdami pasiekti pirmąjį tikslą, užblokavome didelio afiniteto CcP vietą, sukryžiuodami (CL) partnerio baltymus per tarpmolekulinę disulfidinę jungtį. Su CcP (V197C) -Cc (A81C) produkto C α atomų ir natūralaus Cc – CcP komplekso 14 bendrojo padėties šakninio vidurkio kvadratiniu nuokrypiu kvadratu 2, 5 Å, ši vieta specifinė, kovalentinė CL yra puiki struktūrinė mimika. didelio afiniteto surišimo geometrija. Taigi, kai baltymai yra užfiksuoti beveik natūralioje kristalografinėje orientacijoje, ši CL leidžia ištirti mažo afiniteto Cc – CcP sąveiką, nesant stipraus surišimo efekto iš didelio afiniteto vietos.

Norėdami išspręsti CL – Cc komplekso struktūrą, mes panaudojome paramagnetinio relaksacijos pagerinimo (PRE) BMR spektroskopiją, galingą metodą tiriant silpnus tirpių baltymų 15, 16, 17, 18 kompleksus ir apibūdinant mažas būsenas, susijusias su membranomis susijusios sąveikos metu. ir integraliosios membranos baltymai 19, 20 . PRE sukelia dipolinė sąveika tarp branduolio ir nesusijusio (-ių) paramagnetinio centro elektronų (-ų), esančių natūraliame baltyme arba įvesto biokonjugacijos metodais. Dėl didelio nesusijusio elektrono magnetinio momento ir priklausomybės nuo r- 6 atstumo PRE efektas yra tolimas (besitęsiantis iki 35 Å) ir išskirtinai jautrus mažai apgyvendintoms rūšims 21, 22 . 1 H Γ 2 PRE gali būti naudojamas kaip suvaržymas atliekant vėlesnius struktūros skaičiavimus 21, 22, išreiškiamas mažėjant BMR signalo intensyvumui ir paprastai matuojamas kaip paramagnetinio mėginio protonų skersinio atsipalaidavimo greičių skirtumai ir diamagnetinės atskaitos vertės.

Pateikiame tirpalo mažo afiniteto Cc – CcP komplekso struktūrinę analizę ir parodome, kad jį sudaro dominuojanti baltymo – baltymo orientacija ir mažos rišamosios geometrijos rinkinys, apimantis elektrostatiškai palankias sąveikos erdvės sritis. Mes gauname atskiras, mikroskopines, dviejų rūšių jungimosi konstantas ir įvertiname jų ET savybes. Sprendžiant iš didelių atstumų tarp Cc ir CcP redokso centrų, dominuojanti rišamoji forma yra neaktyvi tarpmolekuliniame ET. Tuo pat metu mažosios rūšies konformacinis ansamblis turi daugybę, ET-kompetentingų, baltymų ir baltymų orientacijų su trumpais hemo ir hemo atskyrimais. Apskaičiuota ET greičio konstanta puikiai atitinka eksperimentiškai išmatuotą vertę, o tai rodo, kad mažo afiniteto kompleksas atspindi išmatuotą hemo-hemo ET aktyvumą. Mūsų išvados išsprendžia ilgai trukusias diskusijas apie mažo afiniteto Cc – CcP sąveikos pobūdį ir suteikia mechanistinių įžvalgų apie tarpmolekulinį ET procesą šioje paradigminėje sistemoje.

Rezultatai

Disulfido CL sintezė ir apibūdinimas

Norėdami paruošti kovalentinius, su disulfidais susietus Cc – CcP kompleksus, mes priėmėme eksperimentinę Otting ir bendradarbių 23 strategiją, kurioje vienas iš cisteino baltymų variantų aktyvuojamas Ellmano reagentu, o po to reaguoja su laisvu tiolą turinčiu rišamuoju partneriu. (žr. metodus). Iš reakcijos mišinio išgrynintas naudojant jonų mainų chromatografiją, gauta kovalentinė CL išsiskiria vienoje smailėje, gerai atskirtoje nuo kitų baltymų komponentų (1a pav.). Norint užtikrinti aukščiausią galutinio mėginio grynumą, buvo surinkta tik centrinė CL eliuacijos smailės dalis (paryškinta 1a pav.), Paliekant baltymų frakcijas priekiniame ir galiniame kraštuose. Įvertinus galutinio [D, 15 N] V197C CcP – A81C Cc CL pradinio tirpalo ultravioletiniais spinduliais matomą spektrofotometriją, bendras CL išeiga buvo mažiausiai 85%. (Tikėtina, kad tikroji vertė bus didesnė, nes ne visos CL frakcijos buvo įtrauktos į analizę.) Čia pasiektas CL derlius yra žymiai didesnis nei 25–40%, pranešta pradiniuose Pappa ir Poulos 24 CL eksperimentuose, arba apskaičiuotas> 60%. tolesniame darbe 14, kurie abu panaudojo Cu2 + katalizuotą baltymų tiolių oksidaciją, kad būtų skatinamas tarpmolekulinių disulfidų susidarymas.

Image

a ) CL gryninimas katijonų mainų chromatografija. Kietos ir punktyrinės linijos parodo ultravioletinių spindulių absorbciją ir linijinį druskos gradientą (atitinkamai nuo 0 iki 1 M NaCl 20 mM NaP i pH 6, 0) baltymų eliuavimui iš HiTrap SP FF kolonėlės (GE Healthcare). Baltymų frakcijos, išanalizuotos SDS – PAGE, nurodomos rodyklėmis. Išryškintos jungtinės frakcijos, kuriose yra gryna CL. b ) Nemažinantis etaloninių mėginių SDL – PAGE (baltymų masėje) ir SP kolonėlės frakcijų, pažymėtų a . ( c - e ) SDS – PAGE su (+) ir be (-) disulfidą redukuojančio agento DTT iš ( c, d ) šviežiai išgryninto CL ir e ) CL atsargų, naudojamų NMR eksperimentams ir 1 mėnesį laikomoms 4 ° C temperatūroje. ° C. Inkubuotas 15 min kambario temperatūroje, „+“ mėginys, esantis c punkte, turėjo 10 mM DTT, tuo tarpu ( d, e ) mėginiuose buvo 125 mM DTT ir prieš analizę buvo inkubuotas 15 min 99 ° C temperatūroje. Nuoroda į tai, kad wt baltymų mėginiai yra įtraukti į d . B - e raidėse 'M' žymi molekulinio svorio žymeklį, kurio vertės nurodytos kairėje. f ) Išgryninto CL analizė taikant analitinę dydžio išskyrimo chromatografiją (SEC). Juodos ir raudonos linijos rodo atitinkamai SEC baltymų etalono (Bio-Rad) ir CL mėginio eliuavimą iš ENrich SEC 70 kolonėlės (Bio-Rad), išbalansuotos 20 mM NaP i 0, 1 M NaCl, pH 6, 0. Etaloninių baltymų molekulinis svoris (kDa) nurodomas chromatogramoje. Laukiama CL molekulinė masė yra 46 kDa.

Visas dydis

Kaip parodyta 1b – e pav., [D, 15 N] V197C CcP – A81C Cc CL yra labai grynas ir atrodo nepaprastai stabilus. Sutikus su ankstesne ataskaita 14, šio CL apdorojimas 10 mM ditiotreitoliu (DTT) nesumažina tarpląstelinio disulfido (1c pav.), Kurį galima pasiekti tik stipriai denatūravus dideliais kiekiais redukuojančiojo agento (1 pav. 1d). Laikomas 4 ° C temperatūroje, pradinis CL tirpalas išlieka stabilus daugiau nei mėnesį (1 pav. 1e) - to laiko iš esmės pakanka atliekant NMR eksperimentus, atliktus šiame darbe.

V197C CcP (CN) –A81C Cc CL dviejų dimensijų (2D) [ 1 H, 15 N] skersinės relaksacijai optimizuotos spektroskopijos (TROSY) spektras yra labai panašus į laisvojo [D, 15 N] laukinio tipo (wt) CcP (CN) 25, leidžiantis lengvai perduoti stuburo amido rezonanso priskyrimus. 22–30 ir 99–119 CcP likučių, kurie jau yra silpni laisvajame baltyme 25, BMR signalai CL išnyksta, greičiausiai dėl greitesnio skersinio atsipalaidavimo, kurį sukelia padidėjęs sunkesnio CcP – Cc sukimosi koreliacijos laikas. CL. Be to, CcP CL likučių 193–199, esančių tarpmolekulinėje sąsajoje, rezonansai arba išnyksta, arba pasislenka į naujas spektrines pozicijas, kurių negalima vienareikšmiškai priskirti iš dviejų [ 1 H, 15 N] TROSY spektrų persidengimo. Apskritai, didelis laisvojo ir su Cc-sujungto CcP BMR spektrų panašumas patvirtina, kad CL netrikdo CcP molekulės 14, ir rodo, kad atskiri baltymai išlaiko savo pirmines struktūras, o tai pateisina griežtą kūno tobulinimą Cc – CcP kompleksuose. naudojami šiame ir ankstesniuose darbuose 26, 27, 28 .

Panašiai kaip aukščiau aptarta V197C CcP – A81C Cc CL, kiti šiame darbe naudojami CL gali būti gaunami didelio derlingumo ir išgryninti iki homogeniškumo (papildomi 1 ir 2 pav.). Kaip nustatyta SDS – PAGE (poliakrilamido gelio elektroforezės) analize, galutiniai produktai atitinka norimas CL. Atstovavus atskirų baltymų 29 absorbcijos sumą, ultravioletiniu spinduliu matomas kovalentinio komplekso spektras (papildomas 1b pav.) Patvirtina jo grynumą ir rodo, kad 3-tio-6-nitorbenzoatas (TNB), naudojamas aktyvuoti cisteino liekanas CL reakcija ir pasižyminti didele absorbcija esant 412 nm (nuoroda 30) nėra kartu gryninama su baltymų mėginiais.

Cheminio poslinkio perturbacijos analizė

Parengę baltymo CL, atlikome CL – Cc sąveikos BMR cheminio poslinkio perturbacijos (Δ δ ) analizę (2 pav.). Norėdami stebėti jungimosi poveikį abiems baltymams, stebėjome (1) Cc komplekso susidarymą su [D, 15 N] izotopiniu ženklu, NMR aktyvų CcP, susietą su natūraliu gausumu, NMR, tylųjį Cc ir (2), jungimąsi su NMR aktyvus, 15 N pažymėtas Cc iki Cc – CcP CL, kuriame abu baltymai neturi NMR (ty, atitinkamai, 2a, b pav.). Kaip matyti iš 15 N pažymėtų baltymų [ 1 H, 15 N] koreliacijos spektrų (2a, b pav.), Laipsniškas rišančiojo partnerio pridėjimas sukelia laipsniškus kelių stuburo amido rezonansų poslinkius, rodančius, kad CL – Cc sąveika vyksta greitai. Atlikus CL ir Cc stebėtų BMR titravimo kreivių analizę, buvo gautos labai panašios pusiausvyros disociacijos konstantos ( K d ) vertės, leidžiančios manyti, kad abiejų baltymų pusių stebimi padariniai rodo tą patį surišimo įvykį (2c, d pav.). Šiame darbe gauta bendra 2, 0 ± 0, 4 mM Kd vertė gerai suderinama su ankstesniu įvertinimu, K d ≥ 1 mM, dėl mažo afiniteto surišimo panašiomis eksperimento sąlygomis 12 .

Image

CcP pastebėtas Cc prisijungimas prie V197C CcP – A81C Cc CL ir Cc pastebėtas CL surišimas 20 mM NaP i pH 6, 0 esant 25 ° C. ( a, b ) Atrinktų laisvųjų baltymų (mėlynos spalvos) 1 -kvantinio heteronuklearinio vienaląsčio koreliacijos spektro spektro spektrai, padengti [ 1 H, 15 N], esant 5 atitinkamo surišimo partnerio ekvivalentams (rudai), rodo tipišką cheminį poslinkį. pasipiktinimas susidarius kompleksui. Intarpai schematiškai pavaizduoja eksperimentinę struktūrą, o BMR aktyvūs baltymai yra šviesiai mėlynos spalvos. Simbolis „s“ nurodo amido rezonansą šoninėje grandinėje. ( c, d ) NMR cheminių poslinkių titravimas: ( c ) CL CcP branduolių A147 HN (atviri apskritimai), D148 HN (užpildyti apskritimai), E214 HN (atviri kvadratai) ir L213 N (užpildyti kvadratai) ir ( d ) Cc HN atomų. iš K86 (užpildyti apskritimai) ir K5 (atviri apskritimai). Kiekvieno brėžinio kreivės buvo sujungtos tuo pačiu metu įrišimo modeliu su bendruoju K d . Kietosios linijos rodo, kad Kd vertės yra 1, 74 ± 0, 25 mM (pastebėtas CL) ir 2, 30 ± 0, 66 mM (Cc pastebėtas). ( e, f ) ( e ) CL CcP ir ( f ) Cc stuburo amidų surišimo sukeltos kombinuotos cheminės poslinkio perturbacijos (Δ δ ). Horizontalios linijos rodo vidutinį Δ δ ir vidurkį plius vieną standartinį nuokrypį. Kelios likučių grupės, kurias labiausiai paveikė surišimas, nurodomos etiketėse, kurių Δ δ spalva yra oranžinė. g ) δ šilumos žemėlapiai (nuo 0, 001 ppm mėlynai iki 0, 02 ppm raudonai; pailgėja ir liekanos su nepriskirtomis arba nepastebėtomis stuburo amidų rezonancijomis yra pilkos spalvos) CL CcP ir Cc. Etiketėse nurodomi keli likučiai, paveikti surišimo. h ) Cc ir CcP elektrostatinės savybės, kai molekuliniai paviršiai yra nudažyti elektrostatiniu potencialu (nuo –5 kB T raudonai iki +5 k B T mėlynai), apskaičiuotam naudojant APBS 57 . Molekuliniai vaizdai g, h rodo Cc – CcP CL (PDB 1S6V) 14 rentgeno spindulių struktūrą, kai Cc yra žalia juostelė, o CcP yra molekulinis paviršius ir Cc sąsaja su kraujo grupe ( g ) spalvota rausvai raudona arba h ) rodomi lazdelėmis.

Visas dydis

Kaip matyti iš kitų NMR tyrimų dėl tokios silpnos baltymų ir baltymų sąveikos 17, 18, 31, čia pastebėti nedideli cheminių poslinkių trikdžiai (2a, b, e, f pav.), Atspindintys kuklią Cc – CL komplekso pusiausvyros populiaciją. NMR mėginiuose. Δ δ analizė atskleidžia, kad abiejų baltymų jungiamasis poveikis pasireiškia tik keliomis liekanų grupėmis, sudarančiomis gretimus paviršiaus paviršius (2g pav.). Dauguma paveiktų CcP grupių yra regione, besiribojančiame su D148 ir D217, klasikiniame Brauno dinamikos tyrime nustatyta kaip tikėtina mažo afiniteto vieta 32 . Cc pusėje rišamąją sąsają apibrėžia K5, T12 ir K86, apimantys plotą, esantį greta atidengto hemo krašto. Manoma, kad tai skatina papildoma elektrostatika, o mažo afiniteto Cc – CcP sąveika iš tikrųjų apima priešingai įkrautus baltymų paviršius, kaip parodė dabartinė BMR analizė ir Puasono – Boltzmanno skaičiavimai (2g pav., H). Galiausiai mūsų išvadas patvirtina kontroliniai eksperimentai, parodantys, kad Cc jungimasis su CcP (E290C) -Cc (K73C) CL, alternatyvia didelio afiniteto komplekso mimika, vyksta iš esmės per tą pačią baltymo sąsają ir su tuo pačiu K d. kaip ir aukščiau aptartos CL (papildomas 3 pav.).

PRE NMR spektroskopija

Δ δ analizė pateikia gerą Cc – CL rišamosios sąsajos kokybinį apibūdinimą, tačiau to nepakanka norint nustatyti abipusę rišamųjų partnerių orientaciją, tai yra komplekso struktūrą 33 . Norėdami gauti kiekybinę struktūrinę informaciją, reikalingą šiam tikslui pasiekti, mes panaudojome PRE NMR spektroskopiją. Čia mažo afiniteto Cc – CcP komplekso tarpmolekuliniai PRE buvo gauti iš esmės ta pačia eksperimentine sistema, kaip ir panaudota mūsų naujausiame didelio afiniteto Cc – CcP sąveikos tyrime 28 . Visų pirma, trys vieno cisteino Cc variantai D50C, E66C ir E88C buvo paženklinti EDTA pagrindu pagaminta chelatine žyma, kurioje yra paramagnetinis metalo jonas (Mn 2+, S = 5/2), ir jų sąveika su [D, 15 N ] CcP, susietas su natūralios gausos Cc, buvo stebimas [1H, 15 N] TROSY eksperimentuose. Pagal nustatytą metodiką 28, iš TROSY spektro serijos buvo gautas tarpmolekulinių PRE rinkinys, aptiktas CcP stuburo amido protonuose, gaunant atskirus Γ 2 profilius kiekvienam Cc-EDTA (Mn 2+ ) variantui (3a pav.). . Cc – CL komplekso struktūros skaičiavimai, kuriuos sukėlė Γ 2 suvaržymų rinkinys iš visų trijų EDTA (Mn 2+ ) padėčių, sukūrė tiksliai apibrėžtų mažai energijos vartojančių sprendimų rinkinį (3b pav. Ir papildomas 4 pav.). Cc, prijungtas prie CcP paviršiaus, apriboto D148 ir D217 liekanomis, mažo afiniteto Cc – CcP surišimo geometrija puikiai atitinka cheminių poslinkių trikdžių žemėlapius (3c pav., Taip pat palyginkite 3b ir 2g pav.). Ši išvada dar ryškesnė, nes atliekant molekulinius patobulinimus nebuvo naudojami Δ δ duomenys. Kai trumpiausias 19 Å atstumas tarp bet kurių dviejų citochromų dviejų sunkiųjų atomų, nėra tiesioginės sąveikos tarp Cc molekulių, sujungtų su mažo ir didelio afiniteto vietomis.

Image

( a ) Tarpmolekuliniai, CcP stebimi CL PRE komplekse su parametrais Cc, pažymėtais E88C, D50C ir E66C. Brėžiniai rodo išmatuotus PRE (atvirus simbolius), values 2 reikšmes, atgal apskaičiuotas pagal vieningą, mažiausią energiją turinčią CL – Cc struktūrą (mėlyna linija), ir PRE, apskaičiuotus dominuojančios surišamosios geometrijos ir gautų kelių baltymų – baltymų orientacijų deriniui tipiniame ansamblio tobulinimo bėgime (raudona linija). Klaidos yra sd. Įraše schematiškai pavaizduota eksperimentinė sąranka, kurioje NMR aktyvus baltymas yra šviesiai mėlynos spalvos ir pridedama paramagnetinė etiketė pažymėta raudona rutuliu. ( b ) Dominuojančios CL – Cc komplekso formos struktūra. Cc, sujungtas su mažo afiniteto CcP vieta, yra pavaizduotas kaip mėlyna karikatūra, o CL CcP ir Cc pavaizduoti atitinkamai kaip geltonas molekulinis paviršius ir žalia karikatūra. CL orientacija yra tokia pati kaip 2g pav. CcP likučiai D148 ir D217 yra raudonos spalvos. Haemo grupės rodomos kaip lazdelės, o geležies atomai - kaip rutuliai. c ) vyraujančios mažo afiniteto jungimosi orientacija tarpmolekuliniu būdu. Baltymai yra spalvoti kaip ir b punkte . CcP likučiai D148 ir D217 bei Cc likučiai K5, T12 ir K86 užpildyti erdve ir parodyti atitinkamai mėlynai ir oranžiškai.

Visas dydis

Kaip matyti 3a pav., Ne visi Γ 2 suvaržymai yra apskaitomi vienoje Cc – CL struktūroje. Anksčiau stebėtas didelio afiniteto Cc – CcP komplekso 26, 28, parodytas kaip dominuojanti surišimo forma ir mažai apgyvendintų baltymų – baltymų orientacijų visuma, iš kurių imami pereinamojo laikotarpio veiksmai, metu - tokie papildomi PRE yra mažareikšmių rūšių pėdsakas 21, 22 Skirtingai nuo cheminio poslinkio perturbacijos, kuri yra tiesinis, pagal gyventojų skaičių svertinis Δ δ vidurkis skirtingose ​​baltymo ir baltymo orientacijose, PRE yra nuo r r6 priklausomas poveikis. Taigi, jei mažosios formos elektronų ir branduolių atstumas yra mažesnis nei dominuojančiojo, pirmieji sukels labai didelį PRE, o tai reikšmingai padidins bendrą populiacijos svertinę Γ 2 vertę 21, 22 . Tai paaiškina, kodėl profiles 2 profiliuose pastebimas papildomas poveikis, kurio nėra Δ δ grafikuose.

Kaip išsamiai aprašyta mūsų neseniai atliktame didelio afiniteto Cc – CcP komplekso tyrime, EDTA (Mn 2+ ) konjugacija su Cc duoda vieną, gerai apibrėžtą produktą ir netrukdo prigimtajam Cc – CcP surišimui 28 . Norėdami įsitikinti, kad 3a pav. Pateikti PRE nėra eksperimentiniai artefaktai, bet iš tikrųjų atsiranda dėl CC – CL sąveikos, mes atlikome keletą kontrolinių eksperimentų. Pirmiausia buvo atkreiptas dėmesys į galimą prijungto paramagnetinio zondo jungimąsi su NMR aktyviu baltymu, o tai kelia ypatingą susirūpinimą šio tyrimo nedidelio jonų stiprumo sąlygomis. Kaip parodyta 4a pav., Cc sąveika su paramagnetiškai paženklintu CcP sukelia labai stiprų PRE poveikį, paveikiantį du baltymų regionus (paryškinti). Kontroliniai eksperimentai su paramagnetiškai paženklintu ubikvitinu (Ub) - nesusijusiu baltymu, nesiejančiu nei Cc, nei CcP - duoda Γ 2 profilius, turinčius stiprų poveikį tuose pačiuose dviejuose regionuose (4b pav.). Galiausiai atrodo, kad Cc suriša laisvojo EDTA (Mn 2+ ) zondą, tai patvirtina dideli PRE, paveikiantys vieną iš minėtų baltymų sričių (4c pav.). Apibendrinant, šie radiniai atskleidžia nepageidaujamą sąveiką tarp priešingai įkrauto Cc ir CcP pririšto EDTA (Mn 2+ ) fragmento, o tai neleido atlikti Cc stebėtų BMR eksperimentų su paramagnetiškai paženklintu CcP, iš pradžių numatytu šio darbo dalimi.

Image

Tarpmolekuliniai PRE, skirti ( a - c ) 15 N Cc stuburo amidų rezonansams, kuriuos sukelia ( a ) CcP E221C-EDTA (Mn 2+ ), b ) Ub D32C-EDTA (Mn 2+ ) ir c ) laisvoji paramagnetinė etiketė ; ir ( d - f ) [D, 15 N] wt CcP, sukeltas ( d ) Cc E88C-EDTA (Mn 2+ ), e ) Ub D32C-EDTA (Mn 2+ ) ir f ) laisvosios paramagnetinės etiketės. Žvaigždės nurodo likučius, kurių rezonansai dingsta paramagnetiniame spektre. Klaidos yra sd. Intarpai schematiškai pavaizduoja eksperimentinę struktūrą, kurioje NMR aktyvus baltymas yra šviesiai mėlynas, o paramagnetinė etiketė pažymėta raudona rutuliu. Išryškinti regionai, kuriuose yra didelis PRE. BMR mėginiuose buvo ( a ) 0, 3 mM CcP E221C-EDTA (Mn 2+ ) ir 3 ekvivalentai 15 N Cc; ( b ) 0, 3 mM 15 N Cc ir 3 ekvivalentai Ub D32C-EDTA (Mn2 + ); ( c ) 0, 3 mM masės CcP, 0, 45 mM kiekvienos iš 15 N pažymėtų ir natūralių gausos Cc, ir 0, 45 mM laisvosios paramagnetinės etiketės; ( d ) 0, 4 mM [D, 15 N] masės CcP ir 3 ekvivalentai Cc E88C-EDTA (Mn2 + ); ( e ) 0, 4 mM [D, 15 N] masės CcP ir 3 ekvivalentai Ub D32C-EDTA (Mn2 + ). Mėginys f buvo gautas iš d d, pridedant DTT molinį perteklių (Cc atžvilgiu), kuris nutraukia disulfidinį ryšį tarp Cc ir EDTA (Mn 2+ ) fragmentų, išleisdamas pastarąjį į tirpalą. Visi eksperimentai buvo atlikti 20 mM NaPi, pH 6, 0, esant 25 ° C.

Visas dydis

Skirtingai nei Cc atveju, CcP stebimi kontroliniai eksperimentai liudija, kad reikšmingos specifinės sąveikos nėra (4d – f pav.). Su wc CcP jungiantis Cc-EDTA (Mn 2+ ) gaunamas Γ 2 profilis, pasižymintis dideliais PRE, iš kurių dauguma atsiranda dėl didelio afiniteto Cc – CcP surišimo formos ir susijusio susidūrimo komplekso (4d pav.) 28 . Tuo pačiu metu eksperimentai su paramagnetiniu Ub ir laisvu EDTA (Mn 2+ ) rodo tik keletą silpnų padarinių (4e, f pav.), Kurių nėra nei wt CcP, nei CcP – Cc PRE profiliuose. CL (atitinkamai 4d ir 3a pav.). Be to, CL kompleksų su skirtingais Cc-EDTA (Mn 2+ ) variantais (3a pav.) Stebimi aiškūs CcP nustatyti PRE modeliai (3a pav.), Ir tai būtų mažai tikėtina, jei išmatuotame efekte vyktų paramagnetinio zondo surišimas - tikimasi, kad būti beveik nejautrus prisirišimo vietai. Galiausiai, tarpmolekuliniai PRE, stebimi CL – Cc sistemoje, yra atkuriami (papildomas 5 pav.), O CL – Cc Γ 2 poveikis taip pat aptinkamas natūraliajame nekovalentiniame wt CcP – Cc komplekse (žr. Toliau). Šie duomenys patvirtina, kad išmatuoti PRE rodo Cc – CcP jungimąsi, o ne trivialią baltymo ir zondo sąveiką.

Šalutinių rūšių struktūrinė ir termodinaminė analizė

Norėdami įvertinti mažosios rūšies populiaciją ir vizualiai suformuoti baltymų – baltymų orientacijas, atlikome dominuojančio Cc – CL komplekso 34 patikslinimą ir papildomų surišančių formų ansamblį prieš stebimus PRE. Praktiškai santykinės dviejų surištų rūšių, p 1 ir p 2, populiacijos buvo keičiamos keliais patobulinimais. Kiekvieną kartą eksperimentinių duomenų ir the 2 verčių, gautų remiantis gautais sprendimais, sutapimas buvo įvertintas apskaičiuojant Q koeficientą (1 lygtis) - kiekybinį atitikimo matą, mažesnėmis Q reikšmėmis nurodant geresnį atitikimą 34 . 5a paveiksle parodytas Q kaip p 1 ir p 2 funkcija dviem skirtingais įrišimo scenarijais. Pirma, jei šiame darbe gauta 2 mM Kd reikšmė yra bendra, mažo afiniteto komplekso ( K d, tot ) makroskopinė disociacijos konstanta, apimanti ir dominuojančią, ir mažą rūšį, tada p 1 + p 2 = 1 . Šiuo atveju bendras su Cc surišto CL kiekis nepriklauso nuo santykinio abiejų jungimosi formų populiacijų. Priešingai, jei išmatuota Kd vertė yra tik dominuojančios rišamosios vietos mikroskopinė disociacijos konstanta ( K d, 1 ), tada surišto CL dalis didėja didėjant p 2 (tai yra, p 1 + p 2 > 1 ties fiksuotas p 1 = 1). Molekulinio tobulinimo rezultatai, atitinkantys dvi situacijas, yra pateikti atitinkamai kairiajame ir dešiniajame kraštuose, 5a pav. Dešinėje skiltyje esančios Q vertės yra pastoviai mažesnės nei kairėje, o minimalios vertės, esančios p 2 = 0, 6–0, 9, esant pastoviai p 1 = 1, 0, rodo geriausią suderinamumą su eksperimentiniais duomenimis. Taigi lyginamoji Q veiksnių analizė leidžia atskirti du privalomus scenarijus. Be to, nustatytas populiacijas galima paversti dviejų surišimo formų mikroskopinėmis disociacijos konstantomis: K d, 1 = 2, 0 ± 0, 4 mM ir K d, 2 = 2, 7 ± 0, 5 mM, taip pat kaip bendra, makroskopinė K d, tot. = 1, 2 ± 0, 2 mM žemo afiniteto kompleksui (1 papildoma pastaba ir papildomas 7 pav.). Kaip buvo parodyta ankstesniuose tyrimuose 35, 36 ir minėta aukščiau, cheminių poslinkių pasipiktinimai yra beveik nejautrūs nedidelių rūšių, turinčių daugialypę, trumpalaikę baltymo ir baltymo orientaciją, buvimui ir daugiausia atspindi dominuojančią komplekso formą. Tai paaiškina, kodėl čia atlikti Δ δ titravimai suteikė mikroskopinę disociacijos konstantą tik dominuojančiai CL – Cc formai, tai patvirtina ir PRE paremta Q faktoriaus analizė.

Image

( a ) Q faktoriai, lemiantys CL-Cc kompleksų patobulinimą, atsižvelgiant į skirtingas dviejų surištų rūšių, p 1 ir p 2, santykines populiacijas ir du surišimo scenarijus (žr. tekstą). Baltos juostos rodo mažiausias Q reikšmes. Žvaigždute žymimas duomenų rinkinys, pateiktas b punkte . Intarpas rodo natūraliojo, ne kovalentinio Cc – CcP komplekso energijos diagramą, kur „HA“ ir „LA“ nurodo atitinkamai didelio ir žemo afiniteto domenus, o „1“ ir „2“ nurodo dvi pastarųjų rišamosios vietos (išsamią informaciją rasite tekste). b ) Stereo vaizdas, kuriame vaizduojamos Cc molekulės vyraujančioje rišamojoje geometrijoje (mėlynas paveikslėlis) ir kelios mažos afiniteto Cc – CcP komplekso formos, pateiktos kaip pakartotinis svertinis atominės tikimybės tankio žemėlapis bendram Cc sunkiųjų atomų pasiskirstymui, pavaizduotai ties ne didesnė kaip 40% riba 58 . CL CcP ir Cc yra atitinkamai geltonos ir žalios spalvos.

Visas dydis

Ansamblio patobulinti mažosios reikšmės Cc – CL formos nuosekliai gaminami tirpalai su surištų Cc molekulėmis, turinčiomis du erdvinius regionus: vienas ribojasi su CcP liekanomis D148 ir D217 ir tęsiasi iki paviršiaus pleistro, kuriame yra D33 ir E35, o kitas, apibrėžtas CcP liekanomis E167, D261 ir E267 (5b pav.). Daugybiniai nepilnamečių rūšių Cc konformatoriai nepersidengia su Cc molekulėmis dominuojančioje Cc – CL formoje, nors toks sutapimas buvo leidžiamas ansamblio tobulinimo protokole. Šis radinys patvirtina dabartinę mažo afiniteto Cc – CL komplekso kiekybinę analizę su dviejų atskirų, nepersidengiančių vietų, surišimo modeliu. Išplečiant šias išvadas į natūralųjį, ne kovalentinį Cc – CcP kompleksą ir pasiskolinus Hoffmano bei bendradarbių terminologiją 11, galime pasakyti, kad CcP turi dvi sritis - tas, kurios jungia Cc su dideliu ir mažu afinitetu, ir duoda atitinkamai. kristalografinė Cc – CcP forma ir čia tiriamas silpnasis kompleksas. Mažo afiniteto domenas susideda iš dviejų surišimo vietų, susidedančių iš dominuojančios baltymų ir baltymų orientacijos, ir iš mažai apgyvendintų surišimo geometrijų, kurios apibendrintai atspindi stebėtą PRE poveikį. Toks dinamiškas trijų aukštų CcP– (Cc) 2 komplekso vaizdas atitinka ankstesnių skaičiavimo tyrimų išvadas ir naujausius ET kinetikos darbus 32, 37 .

Skirtingų surištų rūšių pusiausvyros populiacijos, apskaičiuotos pagal dviejų šiame darbe gautų mikroskopinių Kd s reikšmes ir pateiktos didelio afiniteto 1 srities Kd vertės, gali būti konvertuotos į atitinkamas surišimo energijas, schematiškai pavaizduotas energijos diagramoje (įdėta 5a pav.). Ankstesni eksperimentiniai tyrimai parodė, kad elektrostatinė atstumas tarp dviejų Cc molekulių triračiame komplekse sukelia drastišką afinitetų konstantų skirtumą pirmoje ir antroje surišimo pakopose 37, 38, 39 . Didelio ir mažo afiniškumo vietų (ΔΔ G ) rišamosios energijos skirtumai nusako viršutinę elektrostatinės atstūmimo energijos (Δ G Φ ) ribą, kaip spėjamą vyraujantį energetinės baudos už tokį „priešoperatyvinį“ surišimą terminą. Šiame darbe apskaičiuotą ΔΔ G ≤5, 5 kcal mol −1 vertę galima palyginti su Δ G Φ = 6 kcal mol −1 ir Δ G Φ ≤ 3, 3 kcal mol −1, gauta atliekant pastovios kinetikos ir fotolizės eksperimentus su blykste. atliktas panašiomis eksperimentinėmis sąlygomis.

Eksperimentinis stebimo rišamojo poveikio patvirtinimas

Tarpmolekulinių PRE, turinčių skirtingą jonų stiprumą, analizė patvirtina, kad Cc, jungiantis prie mažo afiniteto CcP domeno, yra jautrus druskai (6 pav.). Daugelio CL CcP liekanų paramagnetinis poveikis mažėja eksponentiškai didėjant druskos koncentracijai, gaunant iš esmės plokščius Γ 2 profilius esant 100 mM NaCl (6a, b pav.). Taigi, sutikus su ankstesniais tyrimais 1, 2, 12, mažo afiniteto jungtis panaikinama esant 100 mM druskos. Remiantis šia išvada, mažo afiniteto srities poveikis sukelia didžiąją dalį natyvaus, nekovalentinio Cc – CcP komplekso PRE profilių skirtumų esant dideliam ir mažam jonų stiprumui (7 pav.). Esant 100 mM NaCl, išmatuoti PRE gerai parodo didelio afiniteto surišimo geometrijos ir jos laikinosios būsenos būklės deriniai (7a pav.) 28 . Atspindint didesnę surišto CcP frakciją, atitinkamos values 2 vertės, esant 0 mM NaCl, yra pastoviai didesnės, tačiau dažniausiai laikosi to paties modelio, kaip ir didelės jonų stiprio vertės, kas rodo, kad Cc – CcP komplekso struktūra ir jo susidūrimas būklė išlieka ta pati (7b pav.). Išryškėjant kaip papildomas mažai druskos darančių PRE duomenų pagrindiniai skirtumai tarp dviejų Γ 2 profilių yra CcP regionuose, kurie jaučia Cc prisijungimą prie mažo afiniteto srities (paryškinta 7 pav.). Šie rezultatai rodo, kad stebimas poveikis nėra būdingas Cc – CL sistemai, bet taip pat yra natūraliame, nekovalentiniame komplekse.

Image

( a ) CcP pastebėtas PR 2 PRE už CL, esant 3 ekvivalentams Cc E88C-EDTA (Mn 2+ ) 20 mM NaP i pH 6, 0 esant kintamai NaCl koncentracijai. b ) PRE profilių, gautų esant 0 mM (juoda) ir 100 mM (mėlyna) NaCl, palyginimas. Žvaigždės nurodo likučius, kurių rezonansai dingsta paramagnetiniame spektre. Klaidos yra sd. Įraše schematiškai pavaizduotas eksperimentinis rinkinys, kuriame NMR aktyvus baltymas yra šviesiai mėlynos spalvos, ir pridedama paramagnetinė etiketė pažymėta raudona rutuliu. c ) kai kurių CL CcP liekanų joninio stiprio of 2 priklausomybė. Klaidos yra sd. Raudonos linijos rodo tinkamiausią eksponentinio skilimo funkciją, kai slopinimo greičiai yra 28 ± 4 (D140, r 2 = 0, 97), 36 ± 6 (K183, r 2 = 0, 98) ir 25 ± 4 (N220)., r2 = 0, 98).

Visas dydis

Image

( a, b ) [D, 15 N] masės CcP stuburo amido rezonansų tarpląsteliniai PRE, sąveikaujantys su Cc E88C-EDTA (Mn 2+ ) esant 20 mM NaP i pH 6, 0 ir [NaCl] = 0 mM (atviri simboliai). arba [NaCl] = 100 mM (užpildyti simboliai). Aukštos ir mažai druskos mėginiuose buvo atitinkamai 0, 4 mM CcP ir 1 arba 3 ekvivalentai Cc. Duomenys, kuriuose yra daug druskos, buvo paimti iš ankstesnio mūsų darbo 28 . Raudona linija a rodo Γ 2 reikšmes, apskaičiuotas derinant didelio afiniteto jungimosi orientaciją ir susidūrimo kompleksą, kai [NaCl] = 100 mM 28 . Mėlyna linija ( b ) žymi PRE, apskaičiuotą dominuojančios surišimo geometrijos ir kelių, mažai apgyvendintų baltymų ir baltymų orientacijų deriniui, sudarančiam mažo afiniteto Cc – CcP kompleksą (ištirtas šiame darbe) ir atitinka raudoną pėdsaką 3a pav. Pabrėžti keli regionai, kuriuose yra didelis druskos ir mažai druskos PRE profilių skirtumas.

Visas dydis

Galiausiai, norėdami patvirtinti mažo afiniteto rišamosios vietos vietą ir įvertinti CcP liekanų D148 ir D217 vaidmenį formuojant CL – Cc kompleksą, paruošėme du krūvio grįžtamąjį variantą CL, kuriuose vienas arba abu yra aspartatai. pakeistas lizinais. PRE NMR eksperimentai su D217K ir D148K / D217K CL rodo, kad pirmojoje Cc jungimosi efektas labai sumažėja, o dar labiau - pastarojoje sistemoje (8 pav.). Stebimas didelis tarpmolekulinių PRE, atsirandančių iš dominuojančios ir mažosios CL – Cc formų, sumažėjimas, kurį galima priskirti CcP elektrostatinių savybių pokyčiams CL variante. Šie rezultatai iliustruoja D148 ir D217 liekanų svarbą mažo afiniteto Cc – CcP komplekso formavimuisi ir patvirtina, kad klasikiniame Brauno dinamikos tyrime 32 nustatytas neigiamai įkrautas CcP paviršiaus plotas iš tikrųjų yra mažo afiniteto surišimo vietos vieta. .

Image

( a, b ) Tarpmolekuliniai, CcP stebimi PRE, kuriuos sukelia paramagnetiškai paženklintų E88C ir D50C Cc surišimas su ( a ) D217K / V197C ir ( b ) D148K / D217K / V197C [D, 13 C, 15 N] CcP– A81C Cc CL. Išmatuoti PRE (mėlyni simboliai) lyginami su originalo, „wt“ CL (atviri simboliai; taip pat parodyta 3a pav.). Klaidos yra sd. Intarpai schematiškai pavaizduoja eksperimentinę struktūrą, kurioje NMR aktyvus baltymas yra šviesiai mėlynos spalvos, pridedama paramagnetinė etiketė, pažymėta raudona sfera, ir taškų mutacijos, pavaizduotos žvaigždutėmis. c, d ) krūvį keičiantis CL, kurio molekulinis CcP paviršius yra spalvotas elektrostatiniu potencialu (nuo –5 kB T raudonoje iki +5 k B T mėlynos spalvos, apskaičiuota naudojant APBS) 57 . Baltymų orientacija yra tokia pati kaip 2h pav. Įvestos mutacijos nurodytos brūkšniais. Visuose BMR mėginiuose buvo 0, 5 mM CL ir 1 ekvivalentas CC 20 mM NaP i, pH 6, 0.

Visas dydis

Mažo afiniškumo vietos ET savybės

Daugelyje biologinių sistemų ET greičio konstantos apibūdinamos kaip eksponentinė priklausomybė nuo atstumų tarp redokso centrų 40 . Taigi, norėdami įvertinti mažo afiniteto Cc – CcP komplekso ET savybes, išanalizavome atskyrimus tarp Cc heminės grupės ir dviejų CcP CpdI redokso centrų - hemoksiferrilo ir W191 katijonradikalų (9 pav.). Remiantis dideliais atstumais 21 Å (heem – W191) ir 22 Å (haem – haem), dominuojanti mažo afiniteto surišimo geometrija yra neaktyvi tarpmolekuliniame ET. Atvirkščiai, mažosios formos formavimo ansamblyje yra daugybė orientacijų į baltymus ir baltymus su ET ir baltymais su trumpais hemo-hemo atskyrimais <16 Å (9a pav.). Apskaičiuotas nuo atstumo nuo krašto iki krašto keturiuose modeliuojamuose ansambliuose (paryškinta 5a pav.) Kaip populiacijos svertinis vidurkis visose Cc – CcP orientacijose, sudarančiose mažo afiniteto kompleksą, ET dažnį ( k Nustatyta, kad ET ) yra 1 324–2 343 s – 1 . Bendra vidutinė < k ET > = 1 950 ± 450 s – 1 vertė gali būti palyginta su eksperimentiškai išmatuotu k ET = 1 540 ± 80 s – 1 tiesioginio hemo – hemo ET iš mažo afiniteto srities 2: 1 Cc. –CcP kompleksas 10, 11 . Kadangi didelio afiniteto kristalografinė orientacija ir susidūrimo būsena rodo didelius protezų grupių atskyrimus 7, 28, atrodo, kad vien žemo afiniteto sritis yra išmatuota hemo-hemo ET aktyvumas 8, 9, 10, 11 .

Image

( a, b ) Pasiskirstymas tarp kraštų ( a ) hemo – hemo ir ( b ) Cc haem – CcP W191 atstumai mažo afiniteto komplekse. Vertių vidurkis apskaičiuojamas pagal 5a pav. Paryškintus duomenų rinkinius; klaidos yra sd Kietosios ir punktyrinės linijos nurodo atitinkamai atstumus kristalografinėje orientacijoje ir dominuojančią mažo afiniteto jungimosi formą. c ) Mažiausios afinitetų (storos linijos) ir mažo afiniteto (plonos linijos ir kieti cilindrai) kompleksų redoksų centrai (Å) yra mažiausi nuo krašto iki krašto (Å). CcP ir Cc paviršiaus kontūrai kristalografinėje orientacijoje yra spalvoti geltona ir žalia spalvomis, o dominuojančios formos pavidalai ir mažo afiniteto komplekso tipinė ET aktyvioji geometrija yra atitinkamai mėlynos spalvos (kairėje apačioje) ir mėlynos (viršutinėje kairėje). Pastarosiose vietose kieti cilindrai rodo tarpmolekulinį ET kelią, kurį sąlygoja kovalentiniai ryšiai (raudona) hemo grupėse ir įsikišanti CcP liekana D146 bei du šuoliai per erdvę (geltona).

Visas dydis

Čia ištirtas mažo afiniteto kompleksas yra tinkamai aprašytas baltymų ir baltymų sąveikos „dinaminio sujungimo modeliu“ 41, kuriame daugybė mažai apgyvendintų Cc – CcP orientacijų prisideda prie bendro jungimosi, tačiau tik nedaugelis jų yra ET aktyvūs. . Be to, kaip parodyta skaičiavimo tyrimuose, kurie nubrėžė Cc – CcP konformacinės erdvės 42 sritis, kuriose ET yra kompetentingi, ir nubrėžti ET jungimosi keliai prie baltymų paviršių 11, aktyviausia ET aktyvioji orientacija nebūtinai yra termodinamiškai stabiliausia. Pereinamosios, ET-kompetentingos Cc – CcP orientacijos pavyzdys pateiktas 9c pav. Tikimasi, kad 15 Å nuo hem-to-hem atskyrimo ši jungtinė forma bus labai aktyvi ET. Iš tikrųjų elektroninio tunelinio sujungimo su Beratan ir kt. Sukurtu modeliu analizė . 43 nustatė optimalų ET kelią, kai bendras k ET greitis yra 3, 6 × 10 5 s – 1 . Kilęs iš Cc hem konjuguotos π sistemos, kelias vyksta per du kovalentinius tioeterio surišto 4-etileno pakaito ryšius, po kurio einama per CcP liekanos D146 Oδ 2 atomą per erdvę ir keliaujama išilgai. jo Oδ 2- C γ- C β- C α- C kovalentiniai ryšiai, po kurio eina dar vienas per erdvę šuolis į CcP hem 1-metilą (9c pav.).

Atsižvelgiant į nominaliąją vertę, ET kompetencija pasižyminčių rišamųjų geometrijų egzistavimas, atrodo, prieštarauja Ermano ir bendradarbių išvadoms, kurie parodė, kad kovalentiniai Cc – CcP kompleksai su užblokuota didelio afiniteto vieta –CcP (V197C) –Cc ( A81C), pirmiausia čia ištirtas, ir CcP (E290C) -Cc (K73C) - pirmoji specifinė vieta CL, skirta ET aktyvumui zonduoti mažo afiniteto vietoje 24 - neaktyvi išorėje pridėto Cc 29 atžvilgiu . Tačiau faktas, kad, stebint hemo-hemo-ET, nėra įmanoma stebėti fermentų apykaitą, tai patvirtina, kad katalizinis ciklas apima ET iki W191 katijono radikalo 1, 2, 29 ir pabrėžia šio CpdI redokso tarpinio junginio svarbiausią vaidmenį CcP funkcija. Sutikdamas su šia išvada, mažo afiniteto kompleksas rodo didelius Cc hem ir CcP W191 grupių atskyrimus (9b pav.), Parodantį, kad jis nepalaiko funkciškai reikšmingo ET aktyvumo. Ši išvada taip pat atitinka Hoffmano ir bendradarbių tyrimus, nes jų greitojo fotolizės eksperimento metu pastebėtas ET įvyksta tiesiogiai tarp dviejų kraujo grupių, apeinant W191 + · rūšių formavimąsi 8, 9, 10, 11 . Nors mažo afiniteto Cc – CcP surišimas yra didelis akademinis susidomėjimas, atrodo, kad jis neturi reikšmės fiziologinei funkcijai. Ši sąveika panaikinama esant fiziologinėms, didelio jonų stiprumo sąlygoms, CcP ląstelių fermentinis aktyvumas priklauso tik nuo tarpmolekulinių ET iki CpdI W191 + ·, vykstančių pagal didelio afiniteto, kristalografinę Cc – CcP orientaciją.

Metodai

Baltymų mėginiai

Mielių Cc ir CcP pavieniai cisteino mutantai buvo paruošti naudojant vietinę mutagenezę, naudojant plazmidės sintezės PGR (WHOPS PCR) 44 protokolą, pradedant nuo DNR sekų, koduojančių baltymus su pakeistais natūraliaisiais cisteino liekanomis (T-5A / C102T Cc, nurodytos kaip wt Cc 45 ir C128A CcP, paruoštos atskirame WHOPS PGR etape). Įkrovą keičiantys CcP mutantai D217K / V197C / C128A ir D148K / D217K / V197C / C128A buvo paruošti papildomais WHOPS PGR naudojant V197C / C128A CcP DNR šabloną. Visos konstrukcijos buvo patikrintos DNR seka. Wt baltymų, Cc variantų D50C, E66C ir E88C ir vieno cisteino D32C ​​Ub ekspresijos vektoriai buvo paruošti prieš 25, 28, 45 .

Natūralaus baltymų masės baltymai ir jų vieno cisteino variantai, vienodai paženklinti [D, 15 N] masės ir V197C / C128A CcP ir 15 N pažymėtais wt Cc, buvo gaminami Escherichia coli ir išgryninti laikantis paskelbtų procedūrų 25, 28, 45 . EDTA (Mn 2+ ) paramagnetinis zondas buvo prijungtas atliekant cisteino reakciją su N- [S- (2-piridiltio) cisteaminil] etilendiamino- N , N , N ′, N ′ -tetraacetato monoamido Mn 2+ kompleksu (Toronto Research Chemicals ), o konjuguoti produktai buvo išgryninti ir apibūdinti taip, kaip aprašyta anksčiau 28 .

Baltymų koncentracijos buvo apskaičiuotos pagal ultravioletiniuose spinduliuose matomus spektrus, naudojant žinomus ekstinkcijos koeficientus Soret'o juostos absorbcijai maksimaliai 14, 25, 45 . Šiame darbe buvo tiriami žemo sukimosi CcP (CN) ir Cc (Fe 2+ ) kompleksai, imituojantys CpdI 46 . Visi BMR mėginiai buvo paruošti 20 mM NaP i pH 6, 0 ir juose buvo 6% D2O užraktui. Jei nenurodyta kitaip, PRE matavimai buvo atlikti su 0, 4 mM [D, 15 N] CcP – Cc CL ir 1 ekvivalentu Cc-EDTA (Mn 2+ ) (paramagnetiniams mėginiams) arba wc Cc (diamagnetinei atskaitai). . Kontroliniams eksperimentams naudotų pavyzdžių kompozicijos (4 ir 6, 7, 8 ir papildomi 5 pav.) Yra nurodytos atitinkamose paveikslų legendose.

Disulfido CL sintezė

Norėdami gauti didelio derlingumo V197C CcP – A81C Cc ir E290C CcP – K73C Cc CL, mes priėmėme „Otting“ ir bendradarbių strategiją 23, schematiškai parodyta papildomame 6 pav. Pirmiausia, siekdami sumažinti galimus tarpmolekulinius disulfidus, atitinkamą pavienį vienetą. Cisteino CcP variantas buvo inkubuotas su 10 kartų didesniu DTT pertekliumi 1 valandą kambario temperatūroje (RT), po to iškeistas į 20 mM Tris-HCl 100 mM NaCl, pH 8, 0, HiTrap druskos pašalinimo kolonėlėje (GE Healthcare), kartu pašalinant. reduktorius. Antra, CcP, dabar turintis laisvą tiolio grupę, buvo inkubuotas su 10 kartų moliniu 5, 5′-ditiobis (2-nitrobenzoato) [DTNB arba Ellmano reagento] pertekliumi 1 valandą kambario temperatūroje, gaunant modifikuotą baltymą. ir geltonos spalvos TNB. Nesureagavęs DTNB ir TNB produktas buvo pašalinti ant gėlinimo kolonėlės, paliekant baltymo tirpalą, kuriame yra CcP-TNB adduktas. Trečia, atitinkamo vieno cisteino Cc varianto penkis kartus didesnis molinis perteklius (CcP atžvilgiu) buvo inkubuotas su 10 kartų DTT pertekliumi (Cc atžvilgiu) 1 h kambario temperatūroje, iškeičiamas į 20 mM Tris-HCl 100 mM. NaCl pH 8, 0 ant gėlinimo kolonėlės ir derinamas su CcP-TNB tirpalu. Kryžminio susiejimo reakcija tarp laisvo tiolą turinčio Cc ir TNB aktyvuoto CcP buvo vykdoma 16–18 h kambario temperatūroje, gaunant norimą disulfidu sujungtą CcP – Cc heterodimerį (papildomas 6 pav.). Galiausiai, CL baltymas buvo išgrynintas iš reakcijos mišinio naudojant jonų mainų chromatografiją ir apibūdintas SDS – PAGE, ultravioletinėje spinduliuose matomos spektrofotometrijos ir analitine dydžio išskyrimo chromatografija (1 pav. Ir papildomi 1 ir 2 pav.). Analitiniai gelio filtravimo eksperimentai buvo atlikti naudojant ENrich SEC 70 kolonėlę (Bio-Rad), subalansuotą 20 mM natrio fosfato (NaPi) 100 mM NaCl, pH 6, 0, srautu 0, 5 ml min –1 . Į CL mėginius buvo įšvirkščiama 0, 25 mM koncentracija. Kolonos kalibravimui buvo naudojamas Bio-Rad dydžio išskyrimo standartas (liofilizuotas mišinys, kurio molekulinės masės žymekliai svyruoja nuo 1, 35 iki 670 kDa). Ta pačia procedūra buvo paruošti du įkrovos keitimo CL variantai: D217K / V197C ir D148K / D217K / V197C CcP – A81C Cc, kurių vienodai paženklinti [D, 13 C, 15 N] CcP, ir gaunami norimi gryni produktai (papildomas pav. .2).

BMR eksperimentai ir duomenų analizė

BMR eksperimentai buvo atlikti 298 K temperatūroje, naudojant Varian NMR tiesioginės pavaros sistemos 600 MHz spektrometrą ( 15 N Cc stebimas CL titravimas) arba 800 MHz spektrometrą, kuriame yra arba RT, arba druskai toleruojantis PFG-Z šalto zondas ( visi kiti eksperimentai). NMR duomenys buvo apdoroti „NMRPipe 47“ ir išanalizuoti CCPN 48 . [D, 15 N] CcP (CN) ir 15 N Cc stuburo amido rezonansai buvo paimti iš ankstesnio mūsų darbo 25, 28, 45 . Daugelio CcP rezonansų, esančių [D, 15 N] CcP – Cc CL, atžvilgiu, užduotys galėjo būti perkeltos tiesiai iš laisvojo baltymo spektro (žr. Rezultatų skyrių aukščiau). Įkrovos keitimo CL variantų D217K / V197C ir D148K / D217K / V197C CcP – A81C Cc, turinčių vienodai paženklintus [D, 13 C, 15 N] CcP, priskyrimai buvo patikrinti naudojant TROSY parinktą, deuterio atsietą 3D HNCA., HN (CO) CA ir atvirkštinio HN (CA) CB eksperimentai. Išskyrus kelis likučių rezonansus mutacijos vietose ir aplink jas, CL variantų 2D [ 1 H, 15 N] TROSY spektrai yra praktiškai identiški pradiniam [D, 15 N] V197C CcP – A81C Cc konstruktui, nurodant kad įvestos taškinės mutacijos netrikdo CcP struktūros.

BMR titravimas buvo atliekamas laipsniškai pridedant koncentruoto Cc pradinio tirpalo (2, 6–2, 9 mM) į CcP – Cc CL mėginius pradinėmis 0, 32–0, 46 mM koncentracijomis. Kiekvienu žingsniu buvo stebimi [D, 15 N] CcP – Cc CL arba 15 N Cc stuburo amido rezonansų cheminiai poslinkiai, taikant 2D [ 1 H, 15 N] koreliacijos spektrus. Titravimo kreivės buvo analizuojamos naudojant dviejų parametrų netiesinius mažiausius kvadratus, naudojant vienos vietos surišimo modelį, pataisytą atsižvelgiant į skiedimo efektą 46 . Vidutiniai cheminių poslinkių perturbacijos buvo apskaičiuoti kaip Δ δ = (Δ δ N 2/50 + Δ δ H 2/2 ) 0, 5, kur Δ δ N ir Δ δ H yra, atitinkamai, stuburo amido azoto ir protono cheminiai poslinkio perturbavimai., tam tikram baltymų likučiui.

1 H Γ 2 PRE buvo gauti iš dviejų identiškų [ 1 H, 15 N] TROSY parinktų heteronuklearinių vienos kvantos koreliacijos eksperimentų su 10 s atsipalaidavimo delsimu, paleidžiamais paramagnetiniais ir diamagnetiniais mėginiais. Į analizę neįtraukti rezonansai, rodantys stiprų spektrinį sutapimą. Signalo intensyvumo santykiai buvo paversti values 2 vertėmis, o Γ 2 paklaidos buvo išplėstos iš signalo intensyvumo ir spektrinio triukšmo lygio, kaip aprašyta mūsų naujausioje ataskaitoje 28 .

Ansamblio tobulinimas atsižvelgiant į tarpmolekulinius PRE

Cc – CcP CL koordinatės buvo paimtos iš rentgeno struktūros (PDB ID 1S6V) 14 . Naudojant PRE duomenų rinkinį, gautą iš trijų EDTA (Mn 2+ ) konjugacijos vietų (D50C, E66C ir E88C Cc), standžiojo kūno modeliuotas Cc – CL komplekso atkaitinimas buvo atliktas Xplor-NIH 49, 50 po paskelbta procedūra 34 . Trumpai tariant, CL padėtis buvo fiksuota ir pakabinta viena arba kelios Cc molekulės kopijos, siekiant sumažinti energijos funkciją, susidedančią iš PRE tikslinio termino, van der Waals atstūmimo termino, kad būtų išvengta atomų persidengimo tarp Cc ir CL. ir silpnas raiščio spindulio suvaržymas, naudojamas tarpmolekuliniams Cc – CL kontaktams skatinti 34 . Atkreipkite dėmesį, kad ši procedūra leidžia atomų sutapimą tarp Cc molekulių, sudarančių ansamblį, taip pat tarp Cc ansamblio narių ir dominuojančios surištos formos Cc. Siekiant atsižvelgti į pritvirtintos etiketės mobilumą, apskaičiuotų efektų vidurkis buvo 50 EDTA (Mn 2+ ) konformatorių, kuriuos sukūrė imituotas atkaitinimas sukimo kampo erdvėje 51 . Kaip paaiškinta tekste, santykiniai dviejų surištų rūšių - p 1 ir p 2 - populiacijos buvo įvairūs keliais patobulinimais. Paprastai kiekviename bandyme buvo atlikta 100 nepriklausomų skaičiavimų, o tolimesnei analizei buvo atrinkta 50 sprendimų su mažiausiais Q koeficientais (žr. Toliau).

Norėdami įvertinti susitarimą tarp stebėtų PRE ir PRE, apskaičiuotą iš kiekviename bandyme sugeneruotų Cc ansamblių, apskaičiavome Q koeficientą 34 (1 lygtis):

Image

kur j = 1–3 eina per tris EDTA (Mn 2+ ) prisijungimo vietas CC ir

Image
gaunamas iš 2 lygties:

Image

kur p 1 ir p 2 yra visos dominuojančių ir mažesnių Cc – CL rūšių populiacijos, atitinkamai, N yra pastarųjų ansamblio dydis, Γ 2, ijk yra PRE iš EDTA (Mn 2+ ) ( j ) apskaičiuotas Cc ansamblio nario likučiui ( i ) ( k ), o Γ 2, ij yra PRE, apskaičiuotas iš EDTA (Mn 2+ ) ( j ), Cc liekanai ( i ) dominuojančios formos pavidalu. kompleksas.

ET normos skaičiavimai

Tarpmolekulinės ET greičio konstantos, k ET, buvo apskaičiuotos atsižvelgiant į atstumus tarp krašto grupių iki krašto (3 lygtis) 40 :

Image

kur k 0 = 10 13 s −1 yra branduolio dažnis,

Image
yra elektroninės jungties skilimo koeficientas, r yra atstumas tarp krašto iki redokso centrų, r 0 = 3, 6 Å yra van der Waals kontaktinis atstumas, Δ G yra laisvosios energijos skirtumas tarp reaktyvinio ir produkto būsenų, λ yra pertvarkymo energija, k B yra Boltzmanno konstanta, o T yra temperatūra. Δ G = −0, 797 eV ir λ = 0, 7 eV vertės buvo paimtos iš literatūros 42, 52 . Kaip parodė Marcusas ir Sutinas 53 ir toliau patvirtino elektronų tankio pasiskirstymo hemo dariniuose 54, 55 tankio funkcinės teorijos skaičiavimais, Fe centro t 2g -orbitalių sumaišymas su cc ir porfirino π * -orbitalėmis žiedas efektyviai praplečia metalo d -elektrono tankį iki porfirino krašto, o tai pateisina atstumo nuo krašto iki krašto naudojimą Cc – CcP sistemos ET analizėje. The overall average < k ET > reported in the text was obtained from the k ET rates of the Cc–CcP complexes generated in four ensemble refinement runs with the smallest Q factors (highlighted in Fig. 5a), calculated as population-weighted averages of the k ET values for individual protein–protein orientations in the 50 best Cc–CcP solutions.

Alternatively, the k ET was derived from the analysis of the ET pathways (equation 4) 56 :

Image

where h is the Planck constant, T DA is the electronic donor-to-acceptor tunnelling coupling and the other symbols are the same as above. The T DA factor can be estimated using the Pathways model 43, which treats electron tunnelling as a sequence of steps taking place through a covalent bond, a hydrogen bond, or the vacuum, and represents the T DA as the product of penalties for each step, equation 5 (ref. 56):

Image

where ɛ C =0.6 is the penalty for the covalent bond-mediated step;

Image
is the penalty for a through-space jump, where R S is the jump distance in Å;
Image
is the penalty for a hydrogen bond-mediated step, where R H is the hydrogen bond length in Å; ir
Image
is the decay factor for the vacuum 56 . The search for the ET pathways and the T DA calculations were carried out with the Pathways plugin for the molecular visualization programme VMD 56 . In general, the k ET values calculated from the ET distances (equation 3) or obtained with the Pathways model (equations 4 and 5) in this work agreed to within a factor of two.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-7, Supplementary Table 1, Supplementary Note 1 and Supplementary References

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.