Matrina slopina bcg823 skrandžio vėžio ląstelių adheziją ir migraciją, darydama įtaką vazodilatatorių stimuliuojamo fosfoproteino (vazos) struktūrai ir funkcijai | acta pharmaologica sinica

Matrina slopina bcg823 skrandžio vėžio ląstelių adheziją ir migraciją, darydama įtaką vazodilatatorių stimuliuojamo fosfoproteino (vazos) struktūrai ir funkcijai | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Vazodilatatorių stimuliuojamo fosfoproteino (VASP) ekspresija yra padidinta žmogaus vėžiu ir yra koreliuojama su labiau invazinėmis pažengusiomis naviko stadijomis. Šio tyrimo tikslas buvo išaiškinti mechanizmus, kuriais matrina, alkaloidas, gaunamas iš Sophora rūšies augalų, veikė VASP baltymą žmogaus skrandžio vėžio ląstelėse in vitro .

Metodai:

VASP buvo išreikštas ir išgrynintas. Matrinos prisijungimui prie VASP buvo taikoma vidinė fluorescencinė spektroskopija. CD spektroskopija buvo naudojama tiriant VASP baltymo antrinės struktūros pokyčius. Buvo tiriama žmogaus skrandžio karcinomos ląstelių linija BGC823. Ląstelių migracijai ir adhezijai nustatyti buvo naudojami įbrėžtų žaizdų ir ląstelių adhezijos tyrimai. MRNR ir baltymo VASP ekspresijai matuoti buvo naudojami realaus laiko PGR ir Western blotting metodai.

Rezultatai:

Atliekant fluorescencijos testą, matricos prisijungimo prie VASP baltymo disociacijos konstanta buvo 0, 86 mmol / L, taigi tiesioginis jungimasis tarp dviejų molekulių buvo silpnas. Tačiau matrina (50 μg / ml) sukėlė akivaizdžių antrinės VASP baltymo struktūros pokyčių, parodytų CD spektre. BGC823 ląstelių gydymas matrina (50 μg / ml) reikšmingai slopino ląstelių migraciją ir adheziją. Alkaloidas pakeitė VASP tarpląstelinį pasiskirstymą ir aktino streso skaidulų susidarymą BGC823 ląstelėse. Alkaloidas sukėlė nedidelį, bet statistiškai reikšmingą VASP baltymo ekspresijos ir fosforilėjimo sumažėjimą, tačiau neturėjo reikšmingo poveikio VASP mRNR ekspresijai.

Išvada:

Matrina moduliuoja VASP struktūrą, tarpląstelinį pasiskirstymą, raišką ir fosforilinimą žmogaus skrandžio vėžio ląstelėse, taip slopindama vėžio ląstelių adheziją ir migraciją.

Įvadas

Skrandžio vėžio atvejų padaugėja. Ligonių, sergančių metastazavusiu skrandžio vėžiu, išgyvenamumas yra tik 50%. Matrina, natūralus alkaloidų komponentas, gaunamas iš Sophora rūšių augalų ir ilgą laiką naudojamas tradicinėje kinų medicinoje gydant uždegimines ligas ir kietas vėžį, įskaitant skrandžio, kepenų, storosios žarnos, plaučių, kiaušidžių ir krūties vėžį, ir turi buvo naudojami kartu su chemoterapija ar radioterapija, siekiant sumažinti toksiškumą normalioms ląstelėms 1, 2, 3 . In vitro ir in vivo atlikti tyrimai parodė, kad matrina gali slopinti įvairių žmogaus navikinių ląstelių linijų augimą skatindama apoptozę padidindama Bax ekspresiją ir žemindama augimo faktorių receptorius, tokius kaip Akt ir branduolio faktorių-kappa B (NF-κB)., kurie dalyvauja epidermio augimo faktoriaus (EGF) / kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) –VEGFR1 – Akt – NF-κB signalizacijos kelyje. Preliminarūs tyrimai taip pat parodė, kad matrina gali parodyti priešnavikinį aktyvumą nutraukdama ląstelių-ląstelių adheziją ir migraciją, nurodydama, kad matrina potencialiai gali užkirsti kelią naviko invazijai ir metastazėms 4, 5, 6, 7 .

Ląstelių migracijai reikia suderintos įvykių serijos, įskaitant ląstelių sukibimą su tarpląsteline matrica ir membranos išsikišimą bei atitraukimą erdvėje ir laike, kad būtų sukurtas produktyvus ir tinklinis judėjimas pirmyn, priklausantis nuo aktino citoskeleto surinkimo, išardymo ar pertvarkymo 8 . Citoskeleto baltymo vazodilatatoriaus stimuliuojamas fosfoproteinas (VASP) yra pradinis įjungtų (Ena) / VASP šeimos narys, kurio nariai daugiausia lokalizuojami įtempių skaidulų, ląstelių-matricų ir ląstelių-ląstelių jungčių jungtyse ir labai dinamiškoje membranoje. srityse. Dabar plačiai pripažįstama, kad Ena / VASP baltymai gali įtakoti aktino gijų ilgį, taip pat jų tariamą išsišakojimo tankį lamellipodijoje, ir kad šie baltymai yra reikalingi 9, 10 filopodijai formuotis. VASP aktyvumą pirmiausia reguliuoja fosforilinimas, ir buvo įrodyta, kad VASP fosforilinimas yra labai svarbus reguliuojant ląstelių adheziją ir migraciją. Nors žmogaus VASP yra nustatytos trys bendrosios nuo cGMP priklausomos baltymų kinazės / nuo cAMP priklausomos baltymo kinazės fosforilinimo vietos (Ser157, Ser239 ir Thr278), Ser-157 yra tinkamiausias PKA taikinys.

Daugybė tyrimų buvo sutelkti į Ena / VASP baltymų vaidmenį naviko vystymuisi ir progresui 11, 12, 13, 14, 15 . VASP baltymo ekspresija yra padidinta žmogaus plaučių karcinomų ir krūties vėžio srityje ir yra koreliuojama su labiau invazinėmis pažengusiomis naviko stadijomis; todėl VASP ekspresijos ir aktyvumo slopinimas gali trukdyti naviko augimui, invazijai ir metastazėms.

Buvo pranešta, kad matrina slopina žmogaus vėžio ląstelių migraciją, adheziją ir proliferaciją, slopindama VASP fosforilinimą 6, 8, 16, 17, 18 . Tačiau tikslus mechanizmo, kuriuo matrina veikia tiesiogiai VASP, mechanizmas vis dar nežinomas. Šiame tyrime buvo ištirtas matrinos poveikis VASP struktūrai, tarpląsteliniam pasiskirstymui, transkripcijai ir ekspresijai, siekiant ištirti galimą matrinos slopinamojo poveikio žmogaus skrandžio vėžio ląstelėms mechanizmą.

medžiagos ir metodai

Chemikalai ir reagentai

Matrina (molekulinė masė: 248, 364; Nr. XHBZP-014) buvo įsigyta iš Xi-an Xu-Huang Biotechnology Co, Ltd, Kinija (1 paveikslas). Šio junginio grynumas buvo didesnis nei 98%, nustatytas HPLC analize ir pateiktas tiekėjo. „Dulbecco“ modifikuota „Eagle“ terpė (DMEM), vaisiaus galvijų serumas (FBS), antibiotikai ir tripsinas buvo įsigyti iš Gibco (Grand Island, NY, JAV). Jei nenurodyta kitaip, visos šiame tyrime naudojamos cheminės medžiagos buvo įsigytos iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO, JAV).

Image

Cheminės matrinos struktūros.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Baltymų ekspresija, gryninimas ir analizė

VASP viso ilgio cDNR seka buvo klonuota į pET-28a (+) vektorių. VASP buvo ekspresuojamas E coli Rosetta ir indukuotas 0, 5 mmol / L izopropil-1-tio-β- D- galaktopiranozidu (IPTG) 18 ° C temperatūroje 16 valandų. Taikant anksčiau aprašytą 19 gryninimo metodą, bakterijos buvo surinktos greituoju centrifugavimu 15 minučių ir ištirpintos 50 mmol / L NaH2P04, 300 mmol / L NaCl (pH 8, 0), 10 mmol / L imidazolo, 10 mmol / L β-merkaptoetanolio, 1 mmol / L PMSF ir proteazės inhibitoriaus kokteilis (Roche). Supernatantas buvo partiškai surištas su Ni-NTA derva (QIAGEN). Derva buvo du kartus plaunama didėjančiomis imidazolo koncentracijomis (20 mmol / L ir 50 mmol / L) ir vėliau buvo eliuuojama eliuavimo buferiu, kuriame buvo 500 mmol / L imidazolo. Kiekviena frakcija buvo analizuojama natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforeze (SDS-PAGE). Šiuo metodu iš 1 l bakterijų kultūros buvo išvalytas 2–3 mg VASP kiekis. Iki kitos savaitės baltymų analizės VASP atsargos buvo laikomos natrio fosfato buferyje 4 ° C temperatūroje.

Vidinė fluorescencinė spektroskopija

Vidiniai fluorescenciniai spektroskopiniai eksperimentai, skirti ištirti matrinos sąveiką su VASP, buvo atlikti 25, 0 ° C temperatūroje LS-55 liuminescencijos spektrometru (Perkin-Elmer Life Sciences, Shelton, CT, JAV). Vidinės fluorescencijos matavimams buvo naudojamas sužadinimo bangos ilgis - 295 nm, o emisijos spektrai buvo užregistruoti tarp 300 ir 450 nm. Tiek sužadinimo, tiek emisijos plyšiai buvo 10 nm, o nuskaitymo greitis buvo 1000 nm / min. Šeši šimtai mikrolitrų VASP (0, 35 μmol / l) buvo įpilti į 1 mm termostatą turinčią kvarco fluorescencinę kiuvetę ir titruojami 9 mg / ml matrina nuolat maišant. Fluorescencijos matavimai buvo atlikti su baltymų mėginiais, kurių optinis tankis esant 280 nm buvo mažesnis kaip 0, 3, kad būtų išvengta vidinio filtro efektų 20 . Kontrolinės sistemos, kurią sudarė buferis, titruojamas ekvivalentišku matrinos kiekiu, fluorescencija taip pat buvo išmatuota tomis pačiomis sąlygomis, o rezultatai buvo naudojami pataisytai mėginių fluorescencijai koreguoti. Kiekvienas spektras buvo nuskaitytas tris kartus, kad būtų gauti galutiniai fluorescencijos emisijos spektrai. Grafikas buvo pritaikytas pagal šią lygtį: Δ F / Δ F max = [Matrine] / ([Matrine] + K d ). Δ F yra fluorescencijos intensyvumo pokytis po kiekvienos injekcijos. Δ F max yra didžiausias fluorescencijos intensyvumo pokytis. [Matrine] yra matrinos koncentracija.

Žiedinės dichroizmo (CD) spektroskopija

Tolimųjų ultravioletinių spindulių CD spektrai buvo matuojami 190–250 nm bangos ilgio srityje (antrinė baltymo struktūra) 25, 0 ° C temperatūroje, naudojant Jasco J-810 spektropolarimetrą (Jasco Corporation, Tokijas, Japonija) su 0, 1 cm ilgio cilindrine kiuvele. Pralaidumas buvo 1 nm, o reakcijos laikas buvo 1 s. VASP buvo kruopščiai sumaišytas su skirtingomis matrinos koncentracijomis NaH2P04-Na2HP04 buferiniame tirpale (10 mmol / L, pH 7, 4) ir, prieš atliekant CD matavimus, buvo leistas 4 minutes termiškai subalansuoti. Kiekvienas mėginio spektras buvo pataisytas atimant iš spektro (pradinio lygio), kuris buvo užfiksuotas buferiui, sumaišytam su lygiaverte matrinos koncentracija. Santykinis VASP α-spiralės turinio pokytis, išreikštas santykiniu VASP molinės elipsės pokyčiu esant 222 nm, buvo apskaičiuotas iš CD spektro 21 . Kiekvienas spektras yra vidutiniškai trijų skirtingų nuskaitymų, gautų renkant duomenis 0, 1 nm intervalais, nuskaitymo greičiu 200 nm / min.

Ląstelių kultūros

Žmogaus skrandžio karcinomos nediferencijuota ląstelių linija BGC823 buvo gauta iš Kinijos tipo kultūros kolekcijos centro. Ląstelės buvo palaikomos visiškai DMEM, papildytos 10% FBS, esant 37 ° C, 5% CO 2 atmosferoje.

Įbrėžimo žaizdos tyrimas (dvimatis ląstelių migracijos tyrimas)

Ląstelės buvo pasodintos tolygiai, esant 1 x 106 ląstelių / ml tankiui, 6 duobučių plokštelėje ir leista išaugti iki 100% santakos. Ląstelės buvo serumu badomos 12 valandų, prieš tai žaizda buvo įbrėžta per vienkartinį ląstelių sluoksnį kiekvieno šulinio vidiniame dugne su P-200 pipetės galiuku. Ląstelės buvo du kartus plaunamos fosfato buferiniu druskos tirpalu (PBS), kad būtų pašalintos ląstelių nuosėdos, ir į serumą įpiltas DMEM su 10 μg / ml mitomicino C ir skirtingos matrinos koncentracijos (0, 50 ir 100 μg / ml) buvo pridėtas prie kiekvienas šulinys. Toje pačioje srityje esančios ląstelės buvo fotografuojamos praėjus 0 ir 24 valandoms po ląstelių subraižymo. Žaizdos uždarymo procentas buvo apskaičiuotas pagal šią formulę, kurioje S yra žaizdos lauko paviršiaus plotas:

Image

Ląstelių adhezijos tyrimas

96 šulinėlių plokštelės buvo padengtos 50 μL fibronektinu (Fn; 20 μg / ml) arba Matrigel (200 μg / ml; Becton-Dickinson, Heidelbergas, Vokietija) 37 ° C temperatūroje 2 valandas, du kartus plaunamos PBS ir užblokuojamos serumas neturintis DMEM + 2% BSA 30 minučių 37 ° C temperatūroje. BGC823 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis matrinos koncentracijomis (0, 50 ir 100 μg / ml) 24 valandas 37 ° C temperatūroje drėkintame inkubatoriuje, papildytame 5% anglies dioksido. Po to apdorotos ląstelės buvo surinktos su 0, 25% tripsino-EDTA, pakartotinai suspenduotos iki 1 × 105 ląstelių / ml tankio DMEM terpėje, kurioje nėra serumo, ir pasėtos į anksčiau padengtas 96 šulinėlių plokšteles, kurių tūris 100 μl kiekvienoje duobutėje. Ląstelėms buvo leista 1, 5 valandos prilipti prie plokštelių 37 ° C temperatūroje.

Po to, kai ląstelės du kartus švelniai plaunamos PBS, kad būtų pašalintos nelipnios ląstelės, į kiekvieną šulinėlį buvo įpilama 20 μL 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difeniltetrazolio bromido (MTT). MTT buvo pašalintas po 4 valandų inkubacijos ir 200 μL dimetilsulfoksido (DMSO) buvo įpilta į kiekvieną šulinėlį. Po 15 min. Kiekvieno šulinio optinis tankis ( OD ), esant 570 nm, buvo išmatuotas mikroplokštelių skaitytuvu. Eksperimentai buvo atlikti tris kartus. Kontrolinės ląstelės nebuvo apdorotos matrina. Ląstelių sukibimo santykis buvo apskaičiuotas pagal šią formulę:

Image

Konfokusinis imunofluorescencinis vaizdas

Ląstelės buvo pasėtos ant sterilizuotų apvalkalų ir inkubuotos apdorojant, kaip aprašyta paveikslo legendose. Vėliau ląstelės buvo fiksuotos PBS + 4% formaldehide 10 min., Permeabilizuotos PBS + 0, 2% Triton X-100 10 min., Ir užblokuotos PBS + 5% BSA 30 min. Ląstelės buvo nudažytos VASP ekspresijai, naudojant pirminį anti-totalinį VASP (Alexis IE273) antikūną (skiedimas santykiu 1: 100) per naktį 4 ° C temperatūroje ir rodaminu pažymėtu antriniu antikūnu (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, JAV). h kambario temperatūroje. F-aktinas 40 minučių buvo dažomas Alexa 488-Phalloidin (Invitrogen A12379, JAV), o ląstelių branduoliai buvo dažomi Hoechst (Sigma Aldrich, JAV). Tada dangteliai buvo pritvirtinti ant plokštelių su gliceroliu. Ląstelės buvo vizualizuotos naudojant PE Ultra View VOX, kad būtų galima fluorescencija, kad būtų nustatytas aktino citoskeleto ir VASP pasiskirstymas po ląstelėmis. Žalia fluorescencija žymi aktiną, raudona fluorescencija žymi VASP, o mėlyna fluorescencija žymi ląstelės branduolį.

Pusiau kiekybinis realaus laiko PGR

Realaus laiko PGR buvo naudojama pusiau kiekybinei analizei atlikti, norint ištirti VASP ekspresijos lygius po to, kai ląstelės 24 valandas buvo veikiamos matrina (0, 50 ir 100 μg / ml). Bendra RNR buvo ekstrahuota iš ląstelių TRIzol reagentu (Invitrogen, JAV), o 2 μg buvo panaudota pirmosios grandinės cDNR sintezei su RevertAid TM First Strand cDNR sintezės rinkiniu (Fermentas, LTU). Žmogaus VASP pradmenys buvo 5′-AAAGTCAGCAAGCAGGAGGA-3 ′ ir 5′-ATTCATCCTTGGGGGTTTTC-3 ′. Grunto rinkinys buvo amplifikuotas didėjant ciklų skaičiui 95 ° C 15 s, 58 ° C 15 s, 72 ° C 45 s ir galutinis išplėtimas 72 ° C 5 min. Β-aktino pradmenys buvo 5′-GTCCACCGCAAATGCTTCTA-3 ′ ir 5′-TGCTGTCACCTTCACCGTTC-3 ′. Pusiau kiekybinis PGR buvo atliktas naudojant „iCycler iQ“ realiojo laiko PGR aptikimo sistemą (Bio-Rad Laboratories, Inc, Hercules, CA, JAV), dalyvaujant SYBR Green. Visos PGR reakcijos buvo vykdomos trimis egzemplioriais ir pakartotos bent tris kartus. Skirtumai buvo apskaičiuoti taikant ΔΔCt santykinės kvantizacijos metodą; kalibravimui buvo naudojamas β-aktino genas.

Western blot analizė

Norėdami nustatyti matrinos poveikį VASP baltymo ląstelių ekspresijos lygiams, serumo negautos ląstelės 24 valandas buvo gydomos matrina (0, 50 ir 100 μg / ml). Ląstelės lizuojamos tiesiogiai lizės buferyje [1% Triton X-100, 50 mmol / L Tris-HCl (pH 7, 4), 25 mmol / L glicerofosfato, 150 mmol / L NaCl, 2 mmol / L EDTA, 2 mmol / L EGTA., 1 mmol / L PMSF, 10% glicerolio, proteazės ir fosfatazės inhibitorių] 10 minučių ant ledo. Lizatai buvo subraižyti į mikrocentrifugos mėgintuvėlius ir centrifuguojami 14 000 aps / min 15 minučių 4 ° C temperatūroje. Supernatantai buvo kiekybiškai įvertinti naudojant BCA rinkinį, ir į kiekvieną 10% SDS-poliakrilamido gelio juostą buvo įpilti vienodi baltymų kiekiai. Baltymai buvo atskirti elektroforezės būdu ir pernešti į polivinildifluorido (PVDF) membranas. Membranos buvo inkubuotos su anti-total VASP (VASP-IE273, Alexis) ir anti-fosfo-VASP (Ser157; Santa Cruz Biotechnology, TX, USA) antikūnais. Po to membranos buvo plaunamos Tris buferiniu druskos tirpalu su Tween 20 (TBST) ir inkubuojamos su šarminiu fosfatazės konjuguotu antriniu antikūnu (Promega Corp, WI, JAV). Baltymai buvo vizualizuojami atliekant chromatogenines substrato reakcijas. Β-aktino antikūnas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė.

Statistinė analizė

Visi rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Statistinė duomenų su vienodais dispersijomis analizė buvo atlikta atliekant vienpusę arba dvipusę dispersijos analizę (ANOVA), kur prireikus sekė Tukey post hoc testas. Vertė P <0, 01 buvo laikoma labai reikšminga. Vertė P <0, 05 buvo laikoma statistiškai reikšminga.

Rezultatai

Matrina daro įtaką antrinei VASP struktūrai

Yra žinoma, kad VASP reguliuoja aktino pluoštų surinkimą ir kaupimąsi ir tokiu būdu dalyvauja įvairiuose ląstelių elgesiuose, susijusiuose su aktino citoskeletu, tokiais kaip adhezija, susitraukimas ir judrumas 22, 23, 24, 25 . Norint ištirti tiesioginį matrinos poveikį VASP, buvo sukonstruota ekspresijos plazmidė pET28a-VASP, kuri koduoja pilno ilgio žmogaus VASP. SDS-PAGE gelio rezultatai, parodyti 2A paveiksle, rodo, kad tiek supernatantas, tiek nuosėdos turėjo VASP baltymą. Išgryninti baltymai išplaunami pirmiausia su 500 mmol / l imidazolo, o ultrafiltracija buvo naudojama baltymams sukoncentruoti ir buferiui pakeisti. Stebėta tik viena ryški elektroforezės juosta, atitinkanti surinktą frakciją, rodanti, kad VASP sėkmingai išgrynintas.

Image

Matrina paveikė VASP antrinę struktūrą. Žmogaus VASP buvo ekspresuojamas, išgryninamas ir išmatuotas SDS-PAGE, Western blot analize, vidinės fluorescencijos spektroskopijos ir žiedinės dichroizmo spektroskopijos metodais. (A) VASP išraiškos SDS-PAGE analizė. 1 juosta, pET-28a prieš IPTG indukciją; 2 juosta, pET-28a po IPTG indukcijos 16 h 18 ° C temperatūroje; 3 juosta, pET-28a-VASP prieš IPTG indukciją; 4 juosta, pET-28a-VASP po IPTG indukcijos 16 h 18 ° C temperatūroje; 5 juosta, supernatantas; 6 juosta, krituliai; 7 juosta, lizatas; 8 juosta, praplaukite buferį su 20 mmol / L imidazolo; 9 juosta, praplaukite buferį 50 mmol / l imidazolo; 10 juosta, eliuavimo buferis su 500 mmol / l imidazolo; 11 juosta, frakcija, surinkta ultrafiltravimo būdu; ir 12 juosta, ultrafiltracijos likutis. (B) VASP ekspresijos Western blotting. 1 juosta, praplaukite buferį 20 mmol / l imidazolo; 2 juosta, praplaukite buferį 50 mmol / l imidazolo; 3 juosta, eliuavimo buferis su 500 mmol / l imidazolo; 4 juosta, frakcija, surinkta ultrafiltravimo būdu. (C) Vidinis VASP fluorescencijos spektras esant skirtingoms matrinos koncentracijoms 25, 0 ° C temperatūroje. (D) Disociacijos konstanta buvo gauta atlikus fluorescencijos testą tiesiniu būdu. (E) Tolimosios UV CD spektrai, kurie atitiko VASP antrinę struktūrą, buvo jautrūs matrinos koncentracijai.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norint patvirtinti teisingą VASP išraišką, rekombinantinis VASP buvo patikrintas Western blot analize. Kaip parodyta 2B paveiksle, surinktoje frakcijoje buvo VASP, taip pat nedidelis kiekis p-VASP (Ser157).

Išreikšti ir išgryninti VASP buvo siekiama ištirti jo struktūrą. Triptofanas yra naudingas vidinis zondas, nes jo emisijos fluorescencijos spektras kinta priklausomai nuo šoninės grandinės molekulinės aplinkos; Natūralaus baltymo struktūros sutrikimas lemia triptofano šoninių grandinių veikimo tirpiklyje pokyčius. Čia buvo stebimi triptofano liekanų fluorescencijos emisijos spektrai VASP po sužadinimo 295 nm bangoje. Kaip parodyta 2C paveiksle, kai matrinos koncentracija padidėjo nuo 0 iki 0, 89 mmol / L, VASP fluorescencijos intensyvumas sumažėjo, reikšmingo maksimalios fluorescencijos spinduliuotės bangos ilgio poslinkio nepakito. Šiame diapazone fluorescencijos intensyvumo ir matrinos koncentracijos diagrama buvo maždaug tiesinė (2D paveikslas). Iš jungimosi kreivės gauta disociacijos konstanta buvo 0, 86 mmol / L, o tai rodo, kad tiesioginis rišimasis tarp matrinos ir VASP baltymo buvo silpnas. 2E paveiksle pavaizduoti VASP tolimojo UV UV spektro spektrai esant skirtingoms matrinos koncentracijoms 25, 0 ° C temperatūroje. VASP tolimosios UV CD spektras, nesant matrinos, parodė du papildomus intensyvius neigiamus maksimumus, esant 222 ir 208 nm bangos ilgiui, ir tai rodo reikšmingą α-spiralės struktūros buvimą. Esant matrinos koncentracijai 50 μg / ml, intensyvus neigiamas maksimumas, esant 222 nm, nebebuvo matomas. Tačiau buvo pastebėtas dalinis dviejų neigiamų maksimumų atsistatymas, kai matrinos koncentracija buvo padidinta iki 100–150 μg / ml. Esant dideliam ultravioletinių spindulių kompaktinio disko signalo praradimui, kai matricos koncentracija buvo 200 μg / ml, labai sumažėjo. Visi šie rezultatai rodo, kad matrina iš dalies gali pakeisti antrinę VASP struktūrą ir kad VASP antrinė baltymų struktūra buvo jautriausia 50 μg / ml matrinos.

Matrina slopino BGC823 ląstelių migraciją ir adheziją

Norėdami ištirti matrinos poveikį žmogaus skrandžio vėžio ląstelių migracijai, mes analizavome BGC823 ląstelių migracinį elgesį žaizdų gijimo tyrime. Kaip parodyta 3A paveiksle, po 24 val. Kontrolinės grupės žaizdos krašte (be matrinos) buvo pastebėta reikšminga ląstelių migracija. Tačiau ląstelėse, kurios 24 valandas buvo gydomos matrina (50 ir 100 μg / ml), žaizdų gijimas nebuvo aiškiai stebimas. Ląstelių migracija ties žaizdos kraštais buvo stipriai slopinama po 24 val. Matricos gydymo. Statistiniai duomenys (vidurkis ± SD), parodyti 3B paveiksle, buvo gauti iš keturių nepriklausomų eksperimentų. Žaizdų uždarymo procentas kontrolėje buvo 28, 7 ± 3, 5, o ląstelėse, apdorotose 50 ir 100 μg / ml matrina, reikšmingai sumažėjo (atitinkamai 8, 4 ± 2, 5 ir 10, 3 ± 2, 4, n = 4, P <0, 01).

Image

Matrina slopina ląstelių migraciją ir adheziją. BGC823 ląstelių migracinis elgesys buvo tiriamas atliekant žaizdų gijimo tyrimą. Po 24 valandų ląstelių migracija ties žaizdos kraštais buvo reikšminga kontrolinėje grupėje ir pastebimai slopinta matrine gydymo grupėje (A). Žaizdų uždarymo procentas žymiai sumažėjo, kai buvo gydoma 50 arba 100 μg / ml matrinos (B). Matrinos poveikis žmogaus skrandžio vėžio ląstelių adhezijos santykiams buvo įvertintas MTT tyrimu. Statistiniai duomenys, kurie atitiko Fn (C) ir Matrigel (D). n = 4. Vidurkis ± SEM. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontroline verte.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Matrinos poveikis žmogaus skrandžio vėžio ląstelių adhezijos santykiui buvo įvertintas MTT tyrimu. Statistiniai duomenys, kurie atitiko Fn (3C paveikslas) ir Matrigel (3D paveikslas), buvo gauti iš keturių nepriklausomų eksperimentų (vidurkis ± SD). Ląstelėms, kurios 24 valandas buvo gydomos 50 μg / ml matrinos, ląstelių adhezijos santykis buvo žymiai sumažintas naudojant Fn ir Matrigel ( P <0, 01, P <0, 05), palyginti su kontroliniu, kuris buvo savavališkai nustatytas 1 kiekvienam eksperimentui. Ląstelėms, kurios 24 valandas buvo gydomos 100 μg / ml matrinos, ląstelių adhezijos santykis buvo žymiai sumažintas naudojant Fn ( P <0, 05), bet ne su Matrigel ( P > 0, 05), palyginti su kontroliniu. Šie duomenys rodo, kad ląstelių adhezija Fn ar Matrigel buvo jautresnė 50 μg / ml matrinos. Visi duomenys, kurie prisidėjo prie galutinės analizės, parodytos 3C ir 3D paveikslėliuose, yra pateikti 1 ir 2 lentelėse.

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

Matrina paveikė VASP pasiskirstymą po ląstelėmis ir aktino streso skaidulų susidarymą

Siekiant išsiaiškinti, kaip matrina slopina ląstelių migraciją ir adheziją, buvo nustatytas matrinos poveikis VASP ir F-aktino pasiskirstymui po ląstelėmis. Kontrolinėje grupėje nustatyta, kad F-aktino koncentracija yra didesnė branduolyje nei citoplazmoje. Be to, streso pluoštai, surinkti F-aktino, buvo išdėstyti daugiausia viena kryptimi. VASP buvo tolygiai pasiskirstęs ląstelėje, nesiskiriant branduolio ir citoplazmos koncentracijai. Po gydymo 50 μg / ml matrinos VASP daugiausia pasiskirstė citoplazmoje, o branduolyje VASP koncentracija buvo maža. Ląstelių periferijoje buvo pastebėti kai kurie netaisyklingi aktino siūlai, neturint įtempių skaidulų (4 paveikslas).

Image

Matrina paveikė VASP pasiskirstymą po ląstelėmis ir aktino streso skaidulų susidarymą. BGC823 ląstelės buvo inkubuojamos 24 valandas DMEM, esant arba nesant 50 μg / ml matrinos. Fiksuotos ląstelės buvo dažytos fluorescenciniais antikūnais, kaip aprašyta skyriuje Medžiagos ir metodai. Fluorescencinis dažymas buvo vizualizuotas ir nufotografuotas lazeriniu konokalinio skenavimo mikroskopu.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Matrina slopino VASP raišką ir fosforilinimą

Siekiant dar labiau išaiškinti matrinos poveikį VASP BGC823 ląstelėse, buvo ištirtas matrinos vaidmuo VASP transkripcijos ir ekspresijos lygiuose. Kaip parodyta 5 paveiksle, 50 ir 100 μg / ml matrinos neturėjo reikšmingos įtakos VASP mRNR ekspresijos lygiui BGC823 ląstelėse, palyginti su negydyta grupe.

Image

Matrina neturėjo reikšmingo poveikio VASP mRNR ekspresijos lygiui BGC823 ląstelėse. Matrinos poveikis VASP nuorašo lygiams buvo nustatytas pusiau kiekybine realaus laiko PGR. n = 3. Vidurkis ± SEM.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Paveiksle 6A parodyta, kad juosta, atitinkanti 46 kDa, po matrinos apdorojimo žymiai sumažėja, palyginti su neapdorota grupe. Juosta, kuri kontrolinėje grupėje atitiko 50 kDa, buvo nedidelė, palyginti su ta pačia juosta PMA grupėje. Matrine gydytose grupėse nebuvo pastebėta akivaizdi 50 kDa juosta. Procentinės p-VASP (Ser157) ir VASP išraiškos vertės buvo apskaičiuotos palyginus 50 arba 100 μg / ml matrinos arba 1, 0 μg / ml PMA stimuliuotus mėginius su neapdorotais mėginiais, kuriems savavališkai buvo nustatytas 100 proc. kiekvienam eksperimentui. Po to, kai ląstelės 24 valandas buvo gydomos 50 arba 100 μg / ml matrinos, p-VASP (Ser157) ekspresijos lygis buvo žymiai sumažėjęs, palyginti su neapdorotos grupės ( P <0, 01). VASP raiška buvo aiškiai sumažinta reaguojant į 50 arba 100 μg / ml matrinos ( P <0, 05). Visi duomenys, kurie prisidėjo prie galutinės analizės, parodytos 6B paveiksle, pateikti 2 lentelėje.

Image

Matrina slopino VASP fosforilinimą. Matrinos poveikis tiek VASP ekspresijai, tiek Ser157 fosforilinimo lygiams buvo nustatyti atliekant Western blot analizę (A). Procentinės p-VASP ir VASP išraiškos vertės buvo apskaičiuotos palyginus 50 ir 100 μg / ml matrinos arba 1, 0 μg / ml PMA stimuliuotus mėginius su neapdorotais mėginiais, kuriems kiekvienam eksperimentui buvo savavališkai nustatyta 100 proc. n = 3. Vidurkis ± SEM. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontroline verte (B).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Natūralus junginys „Matrine“ per ilgą istoriją buvo naudojamas kaip priešvėžinis augalas dėl savo įvairaus biologinio aktyvumo ir mažo toksiškumo. Taigi būtina ištirti molekulinius mechanizmus, kuriais matrina slopina vėžio ląstelių adheziją, migraciją ir metastazes. Šiame tyrime pateikti duomenys rodo, kad tiesioginis jungimasis tarp matrinos ir VASP yra silpnas, kad akivaizdžiausi antrinės VASP struktūros pokyčiai buvo pastebėti reaguojant į gydymą matrina 50 μg / ml, kad 50 μg / ml matrinos žmogaus skrandžio vėžio BGC823 ląstelių migracija ir adhezija ir tai, kad 50 μg / ml matrinos pakeitė tiek subkaulinį VASP pasiskirstymą, tiek aktino streso skaidulų susidarymą BGC823 ląstelėse. Be to, 50 μg / ml matrinos slopino VASP ekspresiją ir fosforilinimą, nedarant reikšmingo poveikio VASP mRNR ekspresijos lygiui BCG823 ląstelėse.

VASP yra aktiną reguliuojantis baltymas, turintis ląstelių migracijos ir adhezijos funkcijas. Aktino struktūrų pertvarkymas yra labai svarbus skatinant ląstelių migraciją ir adheziją. VASP aktino reguliavimo funkcijos yra labai jautrios druskos koncentracijai, o tai rodo, kad VASP fosforilinimas gali dramatiškai paveikti aktino reguliavimo aktyvumą. Iš trijų VASP konservatyvių fosforilinimo vietų (Ser-157, Ser-239 ir Thr-278) tik dėl Ser-157 fosforilinimo tariamoji molekulinė masė pasikeitė nuo 46 iki 50 kDa, tai rodo, kad šis fosforilinimas gali sukelti molekulės antrinės struktūros pasikeitimas 26, 27 . Mūsų duomenys parodė, kad tolimosios UV CD spektrai, kurie atitiko VASP antrinę struktūrą, buvo jautrūs matrinos koncentracijai. Trūkstant matrinos, VASP turėjo nemažą kiekį α-spiralinės struktūros, kuri sumažėjo, kai matrinos koncentracija pasiekė 50 μg / ml, ir buvo iš dalies atgauta, kai matrinos koncentracija padidėjo iki 100–150 μg / ml. Kai matrinos koncentracija siekė 200 μg / ml, labai sumažėjo VASP antrinė struktūra. VASP fosforilinimas „Ser157“ taip pat buvo reikšmingai slopinamas BGC823 ląstelėse, naudojant 50 μg / ml matrinos, parodant, kad matrina gali paveikti VASP struktūrą ir funkcijas, slopindama VASP fosforilinimą šiose ląstelėse. Šie duomenys sutinka su ankstesnėmis ataskaitomis, kuriose aprašytas matrinos poveikis kitų tipų vėžio ląstelėms 6, 8, 18, 28, 29 .

Ena / VASP baltymai turi konservuotą trišalę architektūrą, apimančią N-terminalo Ena / VASP homologijos 1 (EVH1) domeną, kuris reikalingas taikymui po ląstelėmis, centrinį prolino turtingą domeną, susijusį su profilin-aktino kompleksų įdarbinimu, ir C-galo EVH2 domenas, kuris tarpininkauja tetramerizacijai ir sąveikai su rutuliniais (G) ir gijiniais (F) aktinais 28, 29 . VASP turi G-aktino, profilino ir F-aktino surišimo vietas, leidžiančias VASP veikti kaip aktino spygliuotas, galą surišantis baltymas ir palengvinančios aktino gijų pailgėjimą. Fibroblastų tyrimai parodė, kad Ena / VASP išeikvojimas sukelia trumpesnius aktiino siūlus priekiniame krašte, palyginti su kontrolinėmis medžiagomis. Priešingai, per didelis Ena / VASP ekspresija lemia ilgesnius nei įprasti siūlai priekiniame krašte. VASP taip pat palengvina aktino gijų rišimąsi ir gali blokuoti Arp2 / 3 kompleksų susidarymą šakotų aktinų tinklų formavimo metu. Ena / VASP baltymų asociacija su aktino gijomis gali konkuruoti su Arp2 / 3 dėl surišimo vietų šalia spygliuoto galo, arba sąlyga, kad gijos galėtų slopinti šakojimąsi arba skatinti atitraukimą. Mūsų imunofluorescencijos tyrimo rezultatai parodė, kad gydymas 50 μg / ml matrinos pakeitė tiek subkaulinį VASP pasiskirstymą, tiek aktino streso skaidulų susidarymą žmogaus skrandžio vėžio ląstelėse. Tiek aktino streso pluošto formavimas, tiek ląstelių migracija atitinka VASP funkciją. Šie stebėjimai taip pat parodė, kad matrina gali pakeisti VASP funkciją BGC823 ląstelėse, esant tokiai pačiai koncentracijai, kuri paveikė antrinę VASP baltymų struktūrą. Be to, tai gali paaiškinti, kodėl matrina neturėjo įtakos vėžio ląstelėms priklausomai nuo dozės, pasak Ma et al. 6 .

VASP yra labai ekspresuojamas kraujagyslių endotelio ir lygiųjų raumenų ląstelėse, kur jis prisideda prie endotelio ląstelių-ląstelių kontaktų stabilizavimo ir pagerina kraujagyslių barjero funkcijas. VASP raiška yra padidinta kraujagyslių ir angiogenezės metu. Keletas tyrimų pranešė, kad VASP ekspresijos lygis susijęs su navikogeneze in vitro ir in vivo . Dertsiz ir kt. Pranešė, kad VASP gali būti susijęs su plaučių adenokarcinomos proliferacija reguliuojant tarpląstelinio F-aktino susidarymą, židinio adheziją ir ląstelių migraciją. Manoma, kad VASP fosforilinimas vaidina svarbų vaidmenį vėžio invazijoje ir metastazėse. Reakcijai į VASP funkcijos 30 sutrikimus buvo stebimi aktino pertvarkymo normos pokyčiai ir ląstelių-ląstelių adhezijos migracijos bei stiprumo sumažėjimas. Zhang ir kt. Nustatė, kad matrina gali slopinti HeLa ląstelių adheziją ir migraciją, sumažindama VASP fosforilinimą, slopindama PKA aktyvumą 8 . Dviejų matmenų ląstelių migracijos tyrimo ir ląstelių adhezijos tyrimo rezultatai parodė, kad gydymas 50 μg / ml matrinos gali slopinti BGC823 ląstelių migraciją ir adheziją. Įdomu tai, kad pusiau kiekybiniai realiojo laiko rezultatai atskleidė, kad matrina nedaro reikšmingos įtakos VASP mRNR ekspresijos lygiui BGC823 ląstelėse; tačiau Western blot analizė aiškiai parodė VASP ekspresijos ir fosforilėjimo sumažėjimą reaguojant į gydymą 50 arba 100 μg / ml matrinos, parodant, kad matrina gali sukelti VASP baltymo skilimą tokiose koncentracijose dėl poveikio VASP antrinei struktūrai. . Tačiau šį mechanizmą reikia toliau nagrinėti.

Apibendrinant, mes atskleidėme, kad VASP struktūra buvo jautri apdorojimui 50 μg / ml matrinos tiek vandeniniame tirpale, tiek BGC823 ląstelėse. Gydant 50 μg / ml matrinos BGC823 ląstelėse, VASP funkcijas, tokias kaip aktino streso skaidulų formavimosi skatinimas ir ląstelių migracija, taip pat reikšmingai slopino. Įdomu tai, kad VASP antrinė baltymo struktūra yra jautri matrinos koncentracijai, ir šis atradimas gali būti naujas mechanizmas, kuriuo konkrečios matrinos dozės selektyviai veikia navikines ląsteles.

Santrumpos

VASP, vazodilatatorių stimuliuojamas fosfoproteinas; G-aktinas, rutulinis aktinas; F-aktinas, siūlinis aktinas; DMEM, Dulbecco modifikuota Eagle terpė; FBS, vaisiaus vaisiaus serumas; Fn, fibronektinas; MTT, 3- (4, 5-dimetil-2-tiazolil) -2, 5-difeniltetrazolio bromidas; DMSO, dimetilsulfoksidas; OD , optinis tankis; PVDF, polivinildifluoridas; TBST, tris buferinis tirpalas su Tween 20; IPTG, izopropil-1-tio-β- D- galaktopiranozidas; CD, žiedinis dichroizmas.

Autoriaus indėlis

Fang YANG ir Jin XIANG sukurti tyrimai; Jing-wei ZHANG, Ke SU ir Wen-tao SHI atliko tyrimus; Ying WANG ir Peng-chao HU pateikė naujų analizės priemonių ir reagentų; Yang WANG ir Lei WEI išanalizavo duomenis; Fang YANG ir Jin XIANG parašė darbą.