Mechaninis ir kiekybinis į ląstelių paviršių nukreipto molekulinio vaizdo gavimo agento projektavimo įžvalga | mokslinės ataskaitos

Mechaninis ir kiekybinis į ląstelių paviršių nukreipto molekulinio vaizdo gavimo agento projektavimo įžvalga | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Fluorescenciniai dažai
  • Molekulinė inžinerija
  • Molekulinis vaizdas
  • Peptidų pristatymas
  • Ikiklinikiniai tyrimai

Anotacija

Molekulinio vaizdo agentų projektavimas apima kelių zondo savybių optimizavimą tuo pačiu metu. Nors kelios norimos charakteristikos yra paprastos, įskaitant aukštą afinitetą ir žemą nespecifinį foninį signalą, praktikoje yra kiekybinių kompromisų tarp šių savybių. Tai apima plazmos klirensą, kai greitas klirensas mažina foninį signalą, tačiau gali sumažinti tikslo įsisavinimą, ir jungimąsi, kai didelio afiniteto junginiai kartais kenčia nuo mažesnio stabilumo ar padidėjusio nespecifinio sąveikos. Toliau apsunkindami zondo vystymąsi, daugelis optimalių parametrų skiriasi priklausomai nuo tikslinio audinio ir vaizduojančiojo agento savybių, todėl sunku išversti empirinius metodus ar ankstesnę patirtį. Čia pagrindinis dėmesys skiriamas mažos molekulinės masės junginiams, nukreipiantiems į tarpląstelinius receptorius, kurių vaizdavimo priemonių kontrastinės vertės yra didžiausios. Mes naudojame mechanistinį metodą, kad pateiktume kiekybinę molekulių kompromisų svėrimo sistemą. Mūsų rezultatai rodo, kad konkretaus tikslo įsisavinimas yra gerai aprašytas kiekybiniais įvairių taikinių sukėlėjų modeliavimais, tuo tarpu nespecifinį foninį signalą numatyti sunkiau. Palyginami du in vitro eksperimentiniai foninio signalo įvertinimo in vivo metodai - nespecifinis ląstelių įsisavinimas ir prisijungimas prie plazmos baltymų. Kartu šie duomenys pateikia kiekybinį metodą, pagal kurį nustatomas zondo dizainas ir sutelkiamas gyvūnų darbas, siekiant molekulinių vaizdų sudarymo priemonių rentabilumo ir laiko efektyvumo.

Įvadas

Nukreipimas į ląstelių paviršiaus receptorius yra patikimas metodas nenormaliam audiniui identifikuoti, ligos progresui stebėti ir terapiniam atsakui nustatyti 1 . Paprastai aptinkamas etiketė (pvz., Radioaktyvusis izotopas, fluorescenciniai dažai, MRT, CT arba ultragarso kontrastinė medžiaga) chemiškai konjuguojama su taikomu ligandu, kad būtų sukurtas vaizdo gavimo zondas. Tuomet šie agentai skiriami pacientui ar gyvūnui, norint nukreipti audinius, kurie ekspresuoja antigenus, specifinius nukreipiančiam ligandui. Vaizdo junginio stebėjimas in vivo suteikia vertingos informacijos apie įvairius biologinius procesus, tokius kaip ląstelių signalizavimas, naviko augimo greitis ir atsakas į vaistą priklausomai nuo tiriamos sistemos.

In vivo ląstelių paviršiaus taikymas yra sudėtingas audinių ir vaizdavimo agento savybių sąveika (1 pav.). Tyrėjai gali manipuliuoti ligando cheminėmis ir fizinėmis savybėmis, pridėdami arba pašalindami funkcines grupes, kad pakeistų molekulinę masę, krūvį, afinitetą ir stabilumą 2, 3, 4 . Pavyzdžiui, molekuliniu svoriu galima manipuliuoti rekombinantiniais baltymais 5, 6 arba atliekant mažų molekulių PEGilinimą, siekiant sulėtinti kraujo klirensą 2, 7 . Prie plazmos baltymų prisijungimo taip pat galima manipuliuoti per mažų molekulių grynąjį krūvį ir krūvio pasiskirstymą 8, 9, 10, 11 . Atliekant fluorescencinius vaizdus, ​​net ir tirpiuose vandenyje tirpiuose matomos šviesos dažuose, molekulinis krūvis ir logD (pH 7, 4) turi įtakos lipidų dvisluoksnėms sąveikoms 10 . Visai neseniai, siekiant padidinti ląstelių įsisavinimą ir atsparumą 12, 13 proteazėms, buvo naudojama antrinės peptido struktūros stabilizacija, kuri taip pat gali turėti įtakos nespecifinei sąveikai. Ne mažiau svarbios yra audinių savybės ir vietinė fiziologija, kurios labai skiriasi skirtinguose audiniuose ir sveikose, ir sergančiose. Priklausomai nuo tikslinio audinio, vidiniai transportavimo parametrai, tokie kaip kraujo tėkmė (Q) ir kraujagyslių paviršiaus plotas iki tūrio (S / V), skiriasi. Dėl skirtingos vietinės fiziologijos yra optimalios audinių vaizdavimo priemonės savybės, todėl sunku apibendrinti remiantis empirinėmis taisyklėmis ar ekstrapoliuoti ankstesnius rezultatus. Panašiai ir iš pradžių terapijai sukurti sukurti skaičiavimo metodai dažnai reikalauja išsamių eksperimentinių duomenų arba daroma prielaida, kad vaisto koncentracija yra pastovi, o tai nėra tinkama vaizdavimo priemonės kūrimui. Eksperimentiniams duomenims kiekybiškai analizuoti buvo panaudota daugybė vaizdo gavimo agentų modelių 16, tačiau dauguma šių skyrių modelių nebuvo sukurti numatyti pasiskirstymo pagal zondo savybes. Todėl vaizdavimo priemonės paprastai kuriamos kiekvienu konkrečiu atveju, atliekant mažus pralaidumo ir daug sąnaudų reikalaujančius eksperimentus su gyvūnais. Nors kokybinis in vivo sąlygų supratimas leidžia suprasti, kokie parametrai vaidina svarbų vaidmenį, kiekybinis modelis, kuris yra ir mechanistinis, ir nuspėjamasis, leistų žymiai efektyviau suprojektuoti vaizdavimo zondus.

Image

Eksendinas parodytas naudojant „PyMol“ paviršiaus krūvį kaip mėginio vaizdavimo agentą (PDB 1JRJ).

Visas dydis

Norėdami padėti nukreipti naujų vaizdo gavimo priemonių kūrimą pagal tarpląstelinius taikinius, pateikiame kiekybinį ir mechanistinį modelį bei in vitro eksperimentinius metodus, apibūdinančius taikinio audinių įsisavinimą ir foninį signalą. Modeliavimas grindžiamas anksčiau paskelbtais modeliais, apimančiais skirtingą laiką ir erdvėje nevienalytę audinių koncentraciją esant pusiausvyros sąlygoms po boliuso dozės. Tada galima kiekybiškai palyginti molekulinių savybių kompromisus, kad būtų galima pasirinkti perspektyviausius agentus, kad būtų galima tobulinti vaizdavimo zondo plėtrą.

Rezultatai

Svarbiausiems parametrams, siekiant maksimaliai padidinti kontrastą optimaliomis sąlygomis, buvo naudojama supaprastinta sistema. Darant prielaidą, kad rišiklis, kurio afinitetas yra didelis, be kraujo tėkmės apribojimų, pirmosios eilės įsisavinimas foniniuose audiniuose ir zondo skilimo greičiai, lėtesni už plazmos klirensą ir internalizaciją (SI), maksimalų tikslinio ir foninio santykį (TBR) galima išreikšti kaip:

Image

kur P yra tikslinio audinio kraujagyslių pralaidumas, S / V yra audinio kraujagyslės paviršiaus plotas, ε yra audinio intersticinio tuštumos tūris, o k int, ns - nespecifinis internalizacijos koeficientas fone. Remiantis šiais rezultatais, ryškiausi kontrasto projektavimo parametrai yra afinitetas, molekulinė masė (veikianti P), etiketės stabilumas / likutiškumas ir nespecifinė sąveika. Optimalios šių parametrų vertės priklauso nuo audinių kraujotakos, kraujagyslių tipo, kraujagyslių paviršiaus ploto, taikinio išraiškos ir internalizacijos greičio.

Ankstesnėse ataskaitose nurodoma, kad esant mažesniam nei 35 kDa molekuliniam svoriui, absorbcijos į audinį efektyvumas (% sušvirkščiamos dozės vienam gramui) padidėja sumažinus molekulinį svorį dėl padidėjusio pralaidumo 4 . Galų gale ekstrahavimo dalis artėja prie 100%, ir tai suteikia viršutinę ribą mažesnio dydžio pranašumui. Siekiant optimalaus vaizdavimo medžiagos ištraukimo iš kraujotakos į tikslinį audinį, buvo nustatyti molekulinės masės ribos. Ekstrahavimo frakcija yra molekulinio svorio, plazmos tekėjimo greičio, efektyvaus pralaidumo ir S / V 17 funkcija . Koreliacija tarp efektyviojo pralaidumo kaip molekulinio dydžio funkcijos buvo tinkama kraujagyslėms su aptvertomis, neapsaugotomis ir navikinėmis kraujagyslėmis. Kaip anksčiau pranešė Schmidt ir kt. 4, naviko duomenys parodė poras, kurių spinduliuotės pora buvo 4, 5 ir 500 nm, o mažosios ir didžiosios poros - atitinkamai 17, 6 ir 0, 65 cm −1 santykiniu santykiu 17, 6 ir 0, 65 cm – 1 . Fenestrais aptikti indai parodė poras, kurių spindulys yra 8 ir 35 nm, o mažųjų ir didelių porų santykinis plotas ir storis yra atitinkamai 30 ir 2 cm – 1 . Neuždengti indai pasiūlė 0, 7 ir 60 nm porų spindulius, atitinkamai mažų ir didelių porų, kurių frakcijų ploto ir storio santykis yra 10 ir 2 cm – 1 . Naudojant šiuos pralaidumo įtaisus ir pašalinant 50% ekstrahavimo frakciją, pagal auglio prognozę nurodoma, kad molekulė yra mažesnė nei 2200 Da, iš kraujagyslės veiksmingai išveš į naviko audinį (2 pav.). Panašios analizės atliekamos organams ir audiniams, kurių kraujagyslės yra pažeistos ar neuždengtos. Audiniams, kurių kraujagyslės neapšviestos, pavyzdžiui, kaulams, širdžiai, kepenims ir raumenims, 50% ekstrahavimo molekulinis svoris yra mažas dėl didelio kraujotakos greičio ir mažo pralaidumo: kaulas (<570 Da), širdis (<100 Da), plaučiai (<80 Da), raumenys (<600 Da). Atliekant organų, kuriems buvo pažeista danga, molekulių masė buvo didesnė, nei inkstų (<3600 Da), endokrininės kasos (<3000 Da) ir egzokrininės kasos (<6900 Da).

Image

Šios vertės grindžiamos 50% ekstrahavimo frakcija, naudojant kraujagyslių tipą, kraujo tėkmę ir kraujagyslių paviršiaus plotą ( A ). Navikai turi padidėjusį makromolekulinį pralaidumą, tačiau padidėjęs intersticinis slėgis gali prisidėti prie mažesnio efektyvaus pralaidumo nei mažos molekulinės masės junginių audiniai, kuriems netaikomas audinys. Duomenys ir tinkamumas naviko reikšmėms yra identiški nuorodai. 4 ( B ). 50% ekstrahavimo frakcija yra savavališka riba, pagrįsta mažėjančia grąža, kaip matoma navikui ( C ).

Visas dydis

Norėdami ištirti afinitetų poveikį, mes atrinkome dvi tokio dydžio junginių serijas prieš naviko antigeną HER2 ir endokrininės kasos taikinį GLP-1R ir palyginome eksperimentiškai išmatuotą ir numatytą įsisavinimą. Aukšto HER2 ekspresuojančios naviko ląstelių linijos atveju (SKOV-3> 10 6 receptoriai / ląstelė) numatomas įsisavinimas artėja prie maksimalios 14–15% ID / g vertės, susijusios su jungimosi potencialu (BP = tikslinė koncentracija, palyginti su disociacijos konstanta, Šių lėtai internalizuotų afi kūnų [T] / K d ) vertės yra 50 ar didesnės (K d <20 nM). Eksperimentiniai rezultatai rodo, kad afigenijos molekulės, kurių išmatuotas K d <20 nM, iš tikrųjų eksperimentiniu būdu pasiekia 14–15% ID / g (pvz., PEP07127 su 3, 8 nM K d, 3B pav.). Navikui, kurio ekspresija yra ~ 30 kartų mažesnė (LS174T navikai = 30 000 receptorių / ląstelė), afinitetas tam pačiam BP turi būti 30 kartų didesnis. Todėl Kd turi būti <0, 7 nM dideliam įsisavinimui. Sutikus su šiais rezultatais, PEP07127 pasižymi mažu LS174T ksenografų įsisavinimu, tačiau ZHER2: 342 (Kd = 0, 022 nM) pasiekia didelį ~ 15% ID / g įsisavinimą.

Image

Naudojant naviko fiziologiją, tikslinimo efektyvumas (% ID / g) nubraižomas atsižvelgiant į internalizacijos greitį ir surišimo potencialą (tikslo išraiškos ir giminingumo funkcija ( A )). Šie rezultatai lyginami su afiodydinių molekulių, kurios skiriasi afinitete, radioaktyviu etikete ir tiksline išraiška, serijomis ( B ). Kasos salelių fiziologija lemia daug didesnį potencialą, nukreiptą į% ID / g, dėl didesnės kraujo tėkmės ir kraujagyslių tankio. Veiksmingesnis transportavimas taip pat pasuka kontūro linijas į dešinę, todėl reikalingas didesnis afinitetas dėl greitesnio išplovimo ( C ). Prognozių palyginimas su paskelbtais duomenimis apie skirtingos molekulinės masės ir afiniteto eksendino pagrindu pagamintus peptidus rodo, kaip greita internalizacija sumažina surišimo afiniteto griežtumą, nepaisant greitesnio išplovimo ( D ).

Visas dydis

„ In silico“ prognozės daugeliu atvejų sutapo su eksperimentiniais rezultatais. Šie modeliavimai daro prielaidą, kad visiška liekana (visas vidinis zondas yra neribotą laiką įstrigęs ląstelėje). Yra žinoma, kad metaliniai radionuklidai, tokie kaip technecijus ir indis, yra etikečių liekanos 18, 19, 20, 21, 22 per eksperimento laiką, o halogeniniai radionuklidai, tokie kaip jodas, nelieka 23, 24 . Tai galėtų paaiškinti mažesnes jodinto junginio eksperimentines vertes 3B pav.

Prognozuojamas įsisavinimas endokrininėje kasoje labai skiriasi nuo naviko tiek jo dydžiu, tiek forma. Didesnė kraujo tėkmė ir pralaidumas lemia daug didesnes maksimalias įsisavinimo vertes, bet ir griežtesnius surišimo afiniteto reikalavimus (bendras poslinkis į dešinę pagal loginę skalę 3C pav.). Kadangi GLP-1R raiška (54 000 receptorių vienoje ląstelėje) yra artimesnė LS174T HER2 lygiams, tikėtina, kad bus reikalingas didelis afinitetas. Tačiau GLP-1R internalizacijos greitis yra daug spartesnis (2 × 10 –3 s – 1 ), todėl zondas įstrigia ląstelės viduje, kol jis gali atskirti. Todėl efektyviam taikymui reikalingas tik 10 nM Kd. Sutikus su šiomis prognozėmis, afiniteto sumažėjimas nuo 2, 6 nM iki 8, 3 nM turėjo minimalų poveikį kasos įsisavinimui 25 .

Norint kiekybiškai įvertinti foninio audinio signalo poveikį, buvo ištirti du papildomi zondo duomenų rinkiniai - mažos molekulinės masės prostatos specifinio membranos antigeno (PSMA) ligandai ir integriną surišantys ligandai. Integrinų ir PSMA rišiklių TBR, palyginti su kraujo klirensu, brėžiniai (4A, B pav.) Rodo panašias tendencijas. PSMA rišiklių atveju praėjus 4 val. Po injekcijos, didesnis TBR (naviko ir raumenų santykis, raumenų įsisavinimas naudojamas kaip fonas) paprastai atitinka mažą koncentraciją kraujyje (MIP1095 neįtraukta, apvažiuota). MIP1072 ir MIP1404, junginiai, kurių didžiausia 4 h TBR yra 171 ir 157, turi mažiausią koncentraciją kraujyje, esant atitinkamai 0, 06 ir 0, 02% ID / g. MIP1405, MIP1427 ir MIP1428 mažesnės TBR vertės yra atitinkamai 72, 31 ir 42 ir jų kraujo klirensas yra santykinai lėtesnis, kai 4 val. Kraujo vertės yra 0, 26, 0, 28 ir 0, 14% ID / g. Integrino rišikliai rodo panašią tendenciją tarp TBR ir kraujo signalo (praleistas 17 junginys). Šie rezultatai rodo, kad tokio dydžio diapazone (gerokai žemiau inkstų filtracijos ribos) greitesnis plazmos klirensas naudingas TBR, nes sumažina foną. Nors tokios savybės kaip prisijungimas prie plazmos baltymų gali sulėtinti klirensą ir leisti daugiau laiko tikslui įsisavinti, šį poveikį sušvelnina tai, kad prisijungimas prie plazmos baltymų taip pat sumažina ekstravazacijos greitį, nes sumažina nesurišto zondo koncentraciją.

Image

Tiek mažos molekulinės masės PSMA rišikliams ( A ), tiek integrino rišikliams ( B ), didžiausios TBR vertės (rodyklės) yra mažo kraujo signalo atveju. Linijos rodo bendrą mažesnės TBR tendenciją, kai kraujo signalas yra didesnis. Apibendrinti duomenys buvo pašalinti kaip aprašyta tekste. Nors greitesnis klirensas gali sumažinti tikslo įsisavinimą ir sumažinti TBR, šie rezultatai rodo, kad paprastai to nėra šio dydžio zondo zonduose. Baltymų / peptidų atveju net viena alfa spiralė gali sudaryti antrinę struktūrą, vaidinančią reikšmingą vaidmenį nustatant nespecifinį įsisavinimą ( C ). Vienos aminorūgšties pakeitimas PEP07127 hidrofobinio pleistro viduryje sumažino fono audinių koncentracijas, todėl didžiausia TBR ir greičiausias kraujo klirensas ( D ). Duomenys pritaikyti iš Tolmachevo ir kt. 26

Visas dydis

Tolmachev ir kt. Ištyrė trijų afiikūnų seriją . ištirti mažų baltymų afinitetų ir fizikinių bei cheminių savybių įtaką taikymui 26 . Lyginant PEP05838 ir PEP05541 peptidus, seka buvo labiau hidrofobinė 27 PEP05838, todėl padidėjo kepenų įsisavinimas (4 pav. C). Mažiausiai įsisavinta PEP07127, kuri ypač skyrėsi hidrofilinėmis liekanomis, esančiomis kitaip hidrofobinio pleistro viduryje ant paviršiaus. Tačiau remiantis vien seka, PEP07127 turėjo tarpinį hidrofiliškumą, tai rodo, kad antrinė struktūra gali atlikti variklį net atliekant likučių pokyčius vienoje alfa spiralėje. Panašus į integrino ir PSMA rišiklius, kraujo klirensas buvo lyginamas su TBR (4 pav. D), o didžiausia TBR turėjo mažiausią kraujo signalą. Dėl šios analizės 3 peptidų Kd verčių gausaus diapazono buvo įvertinti 4 val. Laiko taškai, kad būtų sumažintas afinitetų poveikis, nes 24 val. Arba esant mažai ekspresuojančiai ląstelių linijai, afiniteto poveikis dominuoja, palyginti su skirtumais nespecifinė sąveika.

Duomenys rodo, kad greitas plazmos klirensas yra naudingas molekulinius vaizdus atvaizduojantiems agentams, esantiems vieno kDa diapazonui, ir mes hipotezavome, kad nespecifinė sąveika galėtų kiekybiškai paaiškinti klirenso iš kraujo skirtumus šiame dydžių diapazone. Tačiau nėra paprastos koreliacijos tarp mažų molekulių ar peptidų sekų fizikinių ir cheminių savybių bei veiksmingo klirenso dėl daugybės nespecifinių mažo afiniteto (joninių, hidrofobinių, koloidinių) sąveikų, kurias sunku numatyti vien pagal struktūrą. Norint perspektyviai ištirti fizikinių ir cheminių savybių įtaką klirensui, buvo susintetinta fluorescencinių integriną rišančių peptidomimetinių agentų serija, naudojant skirtingus fluorescencinius dažus, kad būtų galima manipuliuoti fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Nespecifinei sąveikai matuoti buvo naudojami du skirtingi tyrimai - nespecifinis ląstelių įsisavinimo tyrimas ir pusiausvyros ryšys su plazmos baltymais. Ląstelių pagrindu atliktame tyrime buvo naudojamas nefluorescencinis zondas, siekiant užblokuoti specifinę sąveiką ir išmatuotas fluorescencijos signalo padidėjimas per tam tikrą laiką (greičiausiai dėl nespecifinių paviršiaus baltymų ir membranų sąveikos), o plazmos baltymų surišimo tyrimas buvo naudojamas kaip surogatas visam nespecifinė sąveika. Zondų plazmos klirensas buvo išmatuotas C57BL / 6 pelėms per 24 valandas. Labiausiai hidrofobinis agentas turėjo labai greitą ankstyvosios fazės skilimą, tačiau vėliau jis turėjo aukštesnį signalą, tuo tarpu hidrofiliškesniuose zonduose klirensas padidėjo per 24 valandas (5 pav.). Dėl greito perskirstymo į audinius iš pradžių sumažėja koncentracija plazmoje, tačiau viso kūno klirensas iš audinių daro didesnę įtaką 28 TBR. Atsižvelgiant į peptido hidrofobiškumo poveikį taikymui ir įsisavinimui, taip pat buvo susintetinta fluorescencinių egzendino peptidų serija, pasižyminti skirtingu hidrofobiškumu, ir pelėms įvedama į veną. Nespecifinis molekulių įsisavinimo greitis ląstelėse buvo nubraižytas kaip koncentracijos plazmoje funkcija po IV įvedimo ir parodė tvirtą ryšį tarp plazmos klirenso ir nespecifinės sąveikos (5F pav.). Tiek nespecifinis ląstelių įsisavinimo greitis, tiek prisijungimas prie plazmos baltymų koreliuoja su plazmos klirensu ir gali būti vykdomas didelio pralaidumo būdu. Kiekvienas metodas turėjo skirtingas stipriąsias puses. Plazmos baltymų jungimosi tyrimas atliekamas be ląstelių, todėl mažesnis kintamumas, o baltymų prisijungimas taip pat turi įtakos įsisavinimui tiksliniame audinyje 29, todėl jis yra naudingas koreliuojant tiek su įsisavinimu, tiek su foniniu signalu. Tačiau kai kuriems junginiams sunku pasiekti pusiausvyrą naudojant dializę. Tokiais atvejais, kaip antai egzendino peptidai, baltymai ir junginiai, kurie stipriai sąveikauja su dializės membrana, gali būti naudojamas ląstelių įsisavinimo tyrimas.

Image

Mažesnis prisijungimas prie plazmos baltymų ir nespecifinis ląstelių įsisavinimas paprastai koreliuoja su greitesniu plazmos klirensu integrino zonduose, išskyrus tai, kad labai lipofiliniai junginiai gali greitai pasiskirstyti audinyje, sukeldami aukštą foninį, bet žemą plazmos signalą ( A ), ypač per pirmąjį. valanda (pvz., BODIPY 650 konjugatas, ( B )). Plazmos baltymų prisijungimas, įprastas mažų molekulių vaistų tyrimas, koreliuoja su nespecifiniu ląstelių įsisavinimu in vitro ( C ). Kai plazmos baltymai prisijungia, frakcija sumažėja, kai frakcija yra mažesnė nei ~ 60% ( D ). Remiantis nespecifiniu ląstelių įsisavinimo tyrimu, kuris yra naudingas agentams, kuriems negali būti atliekama greita pusiausvyros dializė (pvz., Dėl molekulinės masės ar membranos prilipimo), nespecifinis ląstelių įsisavinimo greitis in vitro yra mažesnis nei ~ 10 –5 s - 1 taip pat mažėja grąža ( E ), pateikdama kiekybinius zondo parinkimo nurodymus. Keturi egzendino dariniai, kurių prisijungimo prie plazmos baltymų nebuvo galima išmatuoti, tiesiogiai rodo, kad nespecifinis ląstelių įsisavinimo tyrimas koreliuoja su plazmos klirensu ( F ).

Visas dydis

Atsižvelgiant į tai, kad ikiklinikiniuose tyrimuose ir klinikiniuose tyrimuose (atliekant intraoperacinį vaizdavimą) vis dažniau naudojama infraraudonųjų spindulių (NIR) fluorescencija, mes išmatuojome baltymų jungimąsi prie fluorescencinių dažų serijos (1 lentelė). Nors taikytinas ligandas ir jungiklis taip pat daro įtaką bendram prisijungimui prie plazmos baltymų, santykinė šių verčių skalė yra naudinga norint įvertinti bendrą zondo PPB.

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Molekuliniai vaizdo agentai gali pateikti išsamų vaizdą apie biologinius reiškinius in vivo minimaliai invaziniu būdu. Tačiau šių agentų kūrimas reikalauja daug laiko ir kainuoja. Tarp savybių, kurios maksimaliai padidina signalą, empirinių metodų fiksavimas ir paskelbtų verčių ekstrapoliacija dažnai būna kompensuoti nuo audinių ir tikslo. Norėdami patobulinti vaizdo gavimo agentų dizainą ir padėti sutelkti ikiklinikinius eksperimentus į perspektyviausias molekules, išanalizavome ir kiekybiškai įvertinome zondo kūrimo mechaninius kompromisus.

Parametrus, kurie nustato taikymą įsisavinant vaizdus in vivo, galima suskirstyti į vaizdavimo zondo savybes arba į audinių savybes (1 pav.). Molekulinis svoris ir krūvis vaidina įsisavinimą ir klirensą, o afinitetas ir etiketės liekanos daro įtaką tikslo išlaikymui. Šios vaizdo gavimo medžiagos vertės yra susijusios su audinių savybėmis, todėl sunku apibendrinti. Radionuklidų atveju radioaktyviųjų izotopų ir chelatorių pasirinkimas taip pat yra kritiškai svarbus. Tam tikri aspektai, tokie kaip lengvas sintezė ir komplekso stabilumas in vivo , nepatenka į šios analizės sritį. Tačiau kitos savybės, tokios kaip radioizotopų skilimo pusinės eliminacijos laikas (kai greitai pašalinamiems agentams priimtini trumpo izotopo pusinės eliminacijos periodai), radioizotopo likutizacijos laipsnis ir chelavimo chemija (daranti įtaką plazmos baltymų prisijungimui ir nespecifinei sąveikai). visi turi įtakos čia aptartiems parametrams.

Tikslinio zondo molekulines savybes tiesiogiai kontroliuoja tyrėjas, ir jos turi būti optimizuotos atsižvelgiant į tikslinio audinio tipą, kad būtų maksimalus signalas ir kontrastas. Remiantis ankstesne navikų taikymo efektyvumo analize, egzistuoja du vietiniai maksimalūs tikslo įsisavinimo būdai - vienas, kurio molekulinės masės diapazonas yra vienas kDa, o antikūnų dydis yra artimas 4 . Vaizdo agentams klirensas yra svarbus kontrastui, todėl mažesnės molekulinės masės zondai sąlygoja didesnį taikinio ir fono santykį. Antikūnų naviko ir organų santykis retai būna didesnis nei 100 ir paprastai būna 3–10 30, 31 . Tačiau keletas šiame darbe nurodytų mažos molekulinės masės zondų pasiekia didesnį nei 100 santykį, ir svarbu, kad šios aukštos TBR vertės susidarytų per kelias valandas po injekcijos, palyginti su dienomis, antikūnams. Todėl šioje analizėje mes sutelkėme dėmesį į mažos molekulinės masės junginių optimizavimą.

Atsižvelgiant į dydį, palyginti su pralaidumu ir klirensu, mažesnė molekulinė masė yra efektyvesnė įsisavinant taikinį. Tačiau mes siekėme nustatyti optimalų agento dydį, nes galų gale kraujo tėkmės apribojimai paneigia bet kokią mažesnio dydžio naudą. Įvairių audinių molekulinės masės ribos buvo nustatytos remiantis 50% ekstrahavimo frakcijos kriterijumi (susijęs su kraujagyslių išeikvojimo skaičiumi 17 ). Prognozės rodo, kad organai be aptvarų, kurių porų dydis yra mažas, pvz., Kaulas, širdis, plaučiai ir raumenys, yra žymiai mažesni, palyginti su inkstais ir kasa, kuriems nėra aptvarų. Prognozės taip pat rodo, kad organuose, kuriuose plazmos srautas didelis, pavyzdžiui, širdyje (4, 06 ml / min / g) ir plaučiuose (24 ml / min / g), daugelio zondų ekstrahavimo frakcija gali būti labai maža (nors ir nedidelė labai didelis pristatymas).

Kraujo tėkmė ir ekstrahavimo frakcija nustato zondo kiekį, pasiekiantį audinį, tačiau tai nereiškia, kad vaizdavimo agentas jungiasi ir sulaiko tikslą. Nors antikūnus galima lengvai sukurti didelio afiniteto (~ 1 nM Kd ), didelio afiniteto mažos molekulinės masės junginiai gali būti sudėtingesni projektuojant 32, 33, 34, 35 . Atsižvelgdami į šį bendrą molekulinio svorio ir afinitetų kompromisą (pvz., Dimerizaciją, padidinančią tariamąjį afinitetą, bet taip pat ir molekulinę masę 36 ), mes nustatėme reikiamą disociacijos konstantą efektyviam lokalizavimui.

Prognozinis ir mechanistinis modelis buvo naudojamas palyginimui su paskelbtomis naviko ir endokrininės kasos įsisavinimo vertėmis dviem tikslinių molekulių klasėms (3 pav.) - HER2 surišantys afiķidai (MW ~ 6 kDa) ir GLP-1R surišantys peptidai (MW ~ 5 kDa). monomerui). HER2 agentams buvo modeliuojamos naviko ląstelių linijos, turinčios aukštą (SKOV-3) ir žemą (LS174T) HER2 ekspresiją. Siekiant atsižvelgti į skirtingus išraiškos lygius, jungimosi potencialas buvo palygintas su internalizacijos greičiu. Skirtingi [T] arba K d manipuliuodami BP davė tuos pačius rezultatus. Prognozuojamos įsisavinimo vertės buvo apskaičiuotos darant prielaidą, kad atsekamosios medžiagos (subsočiosios) dozės. Tačiau naviko ksenografai, kurių ekspresijos lygis yra žemas, gali būti lengvai prisotinti, todėl keli duomenų taškai buvo išskirti dėl praneštų įrodymų apie taikinio prisotinimą37. Kadangi literatūroje šių molekulių sąveika su plazmos baltymais nėra gerai apibūdinta, buvo padaryta prielaida, kad jungiasi su plazmos baltymais vieninga vertė (surišta 42%); tai yra eksperimentiškai apskaičiuota fluorescencinio eksendino, peptido, kurio molekulinė masė ir alfa-spiralinė antrinė struktūra, vertė. Tačiau vertė gali būti didesnė dėl galimos sąveikos su kitais plazmos baltymais 38 .

Modeliavimo rezultatai gerai sutapo su literatūroje nurodytomis HER2 vertėmis (2B pav.). Esant labai aukštiems SKOV-3 ląstelių ekspresijos lygiams, 3, 8 nM rišiklio (PEP07127) pakanka dideliam įsisavinimui, tačiau 50 nM Kd (ZHER2: 4) sumažina signalą. Priešingai, mažesnė LS174T ksenografų išraiška lemia mažesnį 3, 8 nM rišiklio įsisavinimą ir norint išlaikyti didelį sulaikymą reikalingas 22 pM afinitetas (ZHER2: 342). (Atkreipkite dėmesį, kad reikalingas afinitetas taip pat yra molekulinės masės funkcija, o mažo afiniteto sąveikos atveju didesnis tikslinimo efektyvumas dažnai gali būti pasiektas padidinant molekulinę masę virš optimalaus diapazono, aprašyto čia 4. )

Nepaisant labai skirtingos audinių fiziologijos, modelio prognozės taip pat atitinka egzendino monomerų, dimerų ir trimerų įsisavinimą endokrininėje kasoje. Lėtai internalizuotam afiódijos-HER2 kompleksui 39, 40 (3, 9 × 10 –6 s – 1 ) reikėjo labai aukšto afiniteto (<1 nM), kad būtų galima maksimaliai įsisavinti esant vidutinio stiprumo receptorių ekspresijai (LS174T). Priešingai, daug greičiau internalizuotų GLP-1 receptorių (2 × 10 –3 s – 1 ) mažesnis poreikis (<10 nM) reikalingas dideliam įsisavinimui, net esant panašiam išraiškos lygiui kaip LS174T (54 000 GLP-1 receptorių, palyginti su 30 000 HER2). receptoriai vienoje ląstelėje), kaip matyti su 8, 3 nM rišikliu. Įsisavinimas pastebimai sumažėja, kai K d yra 20, 9 nM. Modelis šiek tiek per daug prognozuoja įsisavinimą, o tai gali būti klaidos funkcija bet kuriuose neatitinkančiuose modelio parametruose, tokiuose kaip prisijungimas prie plazmos baltymų, beta ląstelių masės procentas, pralaidumas ir kt. Svarbu, kad šie modeliavimai pabrėžia skirtumus tarp afinitetų reikalavimai, pagrįsti audinių savybėmis ir tikslo internalizavimu. Kadangi šie zondai yra skiriami atsekamosiomis dozėmis, internalizavimas nepadidina signalo, kaip tai darytų sočiųjų dozių atveju. Tačiau tai sumažina reikiamą afinitetą, nes zondas yra internalizuotas ir įstrigęs prieš disociaciją. Šie duomenys rodo, kad reikalingas afinitetas priklauso nuo tikslo išraiškos, audinių fiziologijos ir internalizacijos greičio.

Skirtingai nuo tikslo įsisavinimo greičio, kurį galima tiksliai prognozuoti iš sigmoidinių rišamųjų kreivių ir išmatuotų ekstravazacijos greičių, fono signalą numatyti yra sunkiau. Mažos molekulinės masės agentai šalinami greičiau nei didesnės molekulinės masės agentai 41, 42, tačiau mažoms molekulėms, žymiai mažesnėms už nominalų inkstų molekulinio svorio ribą, didelę reikšmę turi nespecifinės sąveikos. Šių agentų molekulių, stipriai sąveikaujančių su plazmos baltymais, klirensas bus lėtesnis - 29, 43 . Nors tai gali užtrukti daugiau laiko įsisavinimui, tai taip pat sumažina ekstravazaciją tiksliniame audinyje 29, todėl grynasis pelnas yra nedidelis arba jo visai nėra. Be to, nespecifinė sąveika gali padidinti foninį signalą.

Nors gali būti, kad nėra tikslinio įsisavinimo grynojo padidėjimo, palyginti su prisijungimu prie plazmos baltymų, mes hipotezavome, kad molekulės, kurių silpna sąveika su plazmos baltymais ir greitas kraujo klirenso laikas, turėtų mažesnį foninį įsisavinimą neprarandant tikslo įsisavinimo, todėl vaizduojant padidėja TBR. Tai priešingai nei žinomos didesnių baltymų tendencijos, kai dėl mažesnės molekulinės masės padidėja TBR, tačiau mažesnio tikslo įsisavinimo sąskaita 5 . Svarbu tai, kad prisijungimas prie plazmos baltymų gali būti matuojamas dideliu pralaidumu, priešingai nei eksperimentai su gyvūnais biologiniu pasiskirstymu, tokiu būdu gaunant patikrinimo įrankį. Norėdami parodyti šią tendenciją, buvo svarstomos dvi paskelbtos mažos molekulinės masės ligandų, turinčių skirtingą afinitetą ir klirenso greitį, serijos, nukreiptos į PSMA arba α v β 3 formos integriną. Ilgą laiką po injekcijos abu molekulių rinkiniai parodė, kad didžiausios TBR vertės buvo gautos esant mažiausiam kraujo% ID / g (4 pav., B). Taip pat buvo nustatyta bendra koreliacija su didesne TBR su mažesniu kraujo signalu, nors duomenys išskaidyti dėl daugybės papildomų veiksnių, turinčių įtakos TBR, išskyrus foninį klirensą (pvz., Afinitetas), ir du iškrypimai aptariami išsamiau. Vienas iš PSMA rinkinio išorinių bruožų (4 pav. Brėžtas punktyrinis apskritimas) yra junginys MIP1095, pasižymintis ir lėtu klirensu, ir dideliu TBR. Ši molekulė pasižymėjo stipriausiu afinitetu tarp visų tirtų PSMA rišiklių (Kd = 240 pM), didžiausias naviko įsisavinimas (34, 3% ID / g) ir didžiausias griaučių raumenų įsisavinimas (0, 26% ID / g). Tai rodo vieną iš daugelio kiekybinių kompromisų, kai tvirtas giminiškumas mažo apmokestinimo sąskaita vis tiek gali sukelti aukštą TBR. Visos savybės (ne tik plazmos klirensas) turi būti kiekybiškai įvertintos.

Devynios dvivalentės integrinams skirtos medžiagos, suprojektuotos įvairaus ilgio tarpikliais, taip pat patvirtina nuostatą, kad molekulės, kurių koncentracija kraujyje maža per 24 valandas po injekcijos, gali pasiekti aukštesnę TBR. Vėlgi, didžiausios TBR vertės atitiko žemiausią kraujo signalą. Vienas iš pašalinių yra 17 junginys (4B pav. Brėžtas punktyrinis ratas), kuriame abiejų koncentracija kraujyje ir TBR 24 val. Buvo mažos - atitinkamai 0, 031% ID / g ir 18. Tačiau tai lemia neįprastai didelis raumenų įsisavinimas -> 0, 6% ID / g - daug didesnis nei visų kitų junginių serijoje ir iš tikrųjų padidėja nuo 4 iki 24 val. Tai rodo specifinį zondo įsisavinimą raumenyse arba eksperimentinį artefaktą.

Numatyti silpną ir nespecifinę molekulių sąveiką yra sudėtinga. Ši sąveika tiriama dėl didelių baltymų, tokių kaip antikūnai, ir palyginimai su šiais radiniais suteikia tam tikros įžvalgos 44, 45 . Šių baltymų paviršiuje esantys hidrofobiniai ir įkrauti pleistrai gali padidinti koloidinę sąveiką, pakeisdami farmakokinetines savybes. Ypač antikūnų atveju nespecifinė audinių sąveika padidina klirensą iš paprastai ilgai cirkuliuojančių molekulių 46, o plazmos baltymų sąveika paprastai sumažina normaliai greitai pašalinamų mažų hidrofilinių molekulių klirensą.

PSMA ir integrino ligando rezultatai rodo, kad nėra paprastos koreliacijos tarp TBR ir bendro krūvio (SI). Daugelis krūvių yra iš kompleksonų, o chelatorių parinkimas yra kritinis zondo projekto komponentas 47, 48 . Kai kurie kompleksonai, tokie kaip indio-DTPA, turi labai mažą nespecifinę sąveiką, kiti, pavyzdžiui, Tc-99m-DTPA, 28, 49, turi daugiau jungimosi su plazmos baltymais ir bendras lipofilines savybes. Buvo suprojektuota daugiau hidrofilinių chelatorių, tačiau čia jie vėlgi nėra visiškai koreliuojami su fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis 50, todėl prognozuoti vien struktūrą yra sudėtinga.

Tolmachevo ir kolegų atlikta netikslinio baltymų įsisavinimo analizė, atsižvelgiant į hidrofobiškumo funkciją, leidžia suprasti peptidų agento dizainą, palyginti su ne peptidinių mažų molekulių ligandais 26 . Dėl L18S aminorūgšties pakeitimo junginys PEP07127 suardė hidrofobinį pleistrą, esantį pradiniame junginyje. Net šiam mažam alfa spiralės regionui antrinė struktūra vaidino vaidmenį nespecifinėje sąveikoje. Kaip pažymėjo šie autoriai, rezultatai yra svarbūs kuriant didelio afiniteto baltymus ir peptidus, kai daugelis rišamųjų sąsajų turi hidrofobinius regionus, skatinančius aukštą afinitetą 26, pabrėžiant tiesioginį giminingumo ir foninio signalo kompromisą. Hackel ir kt. ištirtas paviršiaus krūvio ir hidrofiliškumo modifikavimo poveikis fibronektino junginiams 51 . Manipuliuodami paviršiaus savybėmis, jie sugebėjo kontroliuoti pasiskirstymą dviejuose pagrindiniuose klirenso organuose - kepenyse ir inkstuose. Dabartinė mūsų analizė nėra skirta organų klirensui, tačiau integrino ir PSMA rišikliams efektyvesnis klirensas iš kraujo paprastai koreliuoja su mažesniu signalu kepenyse ir inkstuose šiems nepeptidiniams agentams.

Afiūnijos rezultatai pabrėžia, kad aminorūgščių pakaitų įtakos gausiai in vivo mažo afiniteto sąveikai, priklausomai nuo sekos ir struktūros, numatymas yra labai sudėtingas ir sudėtingas, ypač tiriant junginius, kurių struktūra gali būti nežinoma. Atvirkščiai, baltymų inžinerijos srities 44, 45, 52 pavyzdys, eksperimentiniai nespecifinės sąveikos matavimo didelio pralaidumo metodai gali būti naudingesni. Hidrofobinė ir kita nespecifinė sąveika daro įtaką šių molekulių įsisavinimui ne pagal tikslą (4 pav. C) ir tiesiogiai sumažina naviko ir organų santykį. Atvirkščiai, didžiausia TBR reikšmė nustatyta junginiui, turinčiam žemiausią kraujo signalą, atitinkančiam integrinų ir PSMA vaizdavimo priemonių serijas. Lėtas klirensas greičiausiai yra tiesioginis padidėjusios plazmos baltymų sąveikos rezultatas, kurį sunku įvertinti peptidais. Tikslus mažesnės molekulinės masės molekulių plazmos baltymų kiekybinis įvertinimas yra įmanomas naudojant keletą metodų, tokių kaip greitoji pusiausvyros dializė arba ultrafiltracija, ir jie buvo tiriami toliau.

Norėdami palyginti du nespecifinės sąveikos, susijusios su kraujo plazmos klirensu, matavimo metodus, mes sukūrėme mažų molekulių fluorescencinių peptidomimetikų seriją, naudodami skirtingas fluorescencines dažų struktūras, kad būtų galima manipuliuoti fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis. Nespecifinė sąveika dėl lipofiliškumo buvo apibūdinta daugeliui matomos šviesos fluoroforų 10, 11, tačiau mažiau žinoma apie šią artimųjų infraraudonųjų spindulių (NIR) fluoroforų sąveiką, kuri in vivo turi vaizdų pranašumų. In vivo klirensas ir nespecifinis peptidomimetikų įsisavinimo greitis naudojant NIR fluoroforus, tokius kaip AF680, 800CW ir ZW800, parodo nespecifinės sąveikos įtaką vaizdavimo priemonės dizainui. Plazmos klirensas buvo išmatuotas per 24 valandas (5A, B pav.) Ir palygintas su prisijungimu prie plazmos baltymų, išmatuotu greita pusiausvyros dialize ir nespecifiniu įsisavinimu ląstelių kultūroje. Ląstelių įsisavinimo greitis koreliuoja su prisijungimu prie plazmos baltymų, o tai rodo, kad šie tyrimai gali suteikti panašios informacijos apie nespecifinę sąveiką (5 pav. C). Zondai, kurių plazmos baltymai mažiau jungiasi, paprastai turėjo greitesnį alfa fazės klirensą ir mažesnį plazmos signalą per 24 val. Atsižvelgiant į koreliaciją su didesniu TBR 4 pav., Tai gali būti įtraukta į didelio našumo atrankos metodus, siekiant nustatyti polinkį valytis iš audinių. Atminkite, kad labiausiai lipofilinis agentas (konjugatas „BODIPY 650“) pasižymėjo greitu ankstyvu (alfa fazės) klirensu, bet po 24 val. Svarbu atskirti greitą klirensą nuo greito zondo persiskirstymo iš plazmos į audinį, nes pirmasis gali sumažinti foninį signalą, o antrasis gali jį žymiai padidinti (pvz., PEP05838, 4C pav. 26 ).

Plazmos baltymų surišimo tyrimas turi sistemos be ląstelių pranašumą (sumažėja kintamumas) ir tuo pat metu teikia duomenis apie tikslo įsisavinimą (nes paprastai į audinį patenka nesurištas zondas). Tačiau komerciškai prieinami tyrimai dažniausiai veikia tik mažesnio kaip 1–2 kDa dydžio zondus ir gali turėti problemų su agentais, kurie sąveikauja su dializės membrana, todėl ląstelių įsisavinimo tyrimas yra perspektyvi alternatyva. Kaip pavyzdys buvo susintetinti keturi egzendino peptido konjugatai, turintys skirtingas hidrofobines savybes. Nors plazmos baltymų nebuvo įmanoma įvertinti dėl jų didesnės molekulinės masės, nespecifinių ląstelių įsisavinimo greitis buvo didesnis lipofilinių konjugatų atžvilgiu ir koreliavo su pelių 3 val. Koncentracija plazmoje (5 pav. F).

Santykinės jungimosi su plazmos baltymais vertės ir nespecifinis ląstelių įsisavinimas gali būti naudojami junginiams klasifikuoti, tačiau absoliuti rekomendacija yra naudinga nustatant, ar reikalinga tolesnė molekulinė inžinerija. Panašiai kaip molekulinio svorio mažinimas ir afiniteto padidėjimas, yra ir padidėjusio hidrofiliškumo, siekiant sumažinti foną (pvz., PEG pridėjimas prie integrinų rišiklių 53 ), pranašumų, tačiau galiausiai mažėja grąža, įdedant dar daugiau pastangų. Remiantis čia pateiktais duomenimis ir literatūros vertėmis (SI), reikšmingo fono sumažėjimo nesitikima, kai jungiasi 60–80% plazmos baltymų ar 10–5 s – 1 ląstelių įsisavinimo greitis. (Palyginimui, pinocitozės dažnis 54 buvo įvertintas maždaug 1, 1 × 10 –5 s – 1.) Sumažinus šiuos parametrus, galima pasiekti geresnių rezultatų nei šie lygiai, tačiau tai nėra be išlaidų. Tokio dydžio diapazono molekulės, kurios neturi išmatuojamo plazmos baltymų jungimosi, klasikinis pavyzdys yra inulinas, yra labai hidrofiliškos ir lanksčios, tiesiogiai priešingos daugumos afinitetą rišančių sąsajų atžvilgiu.

Atsižvelgiant į vis dažnesnį artimųjų infraraudonųjų spindulių zondo naudojimą ikiklinikiniams tyrimams ir klinikiniam intraoperaciniam vaizdavimui, kiekybiškai įvertinome kelių komerciškai prieinamų dažų jungimąsi su plazmos baltymais, kad būtų galima nustatyti fluorescencinio zondo vystymąsi. Nors šių dažiklių junginiai pakeis prisijungimą prie plazmos baltymų (ir praras karboksirūgštį, kai jie bus konjuguoti su aminu), santykinis dydis gali būti naudojamas bendroms savybėms įvertinti. Dažams, kurių diapazonas yra 680–700 nm, mažiausi bandomieji dažai buvo „Alexa Fluor 680“, plazmos baltymai jungėsi mažiausiai, o 750–800 nm diapazonui - ZW800–1. These values, in addition to the dye residualization rates 55, are helpful in rational design of NIR probes.

In conclusion, we have analyzed data from 32 low molecular weight probes to provide a quantitative and mechanistic framework for comparing cell surface imaging agents. The qualities of optimal imaging agents are well known, but in practice, there are many trade-offs. This analysis is designed to quantitatively determine the magnitude of these impacts to select the most promising agents for preclinical analysis. For example, data on blood flow and permeability could be used to identify an appropriate scaffold and/or library for screening based on the target tissue (Fig. 2). The internalization and expression level of the target can be used to define a target affinity or compare predicted retention of lead compounds (Fig. 3). A high throughput test of plasma protein binding and/or non-specific cellular uptake can be used to quantitatively compare liabilities in tissue background signal (Figs 4 and 5). Alternatively, for a series of in vitro characterized compounds, these plots can be used to quantitatively compare the expected TBR based on molecular weight, affinity, and lipophilicity/non-specific interactions. These data will help select the most promising candidates to move forward in a more quantitative and rational manner for molecular imaging agent design.

Metodai

Computational Model Development

The original tissue simulation model was based on a non-linear partial differential equation model of tissue concentration with time-varying mixed boundary conditions and axial and radial gradients 56 . This model provides a self-consistent framework for simulating the distribution of agents from small molecule drugs to biologics and nanoparticles 57 . To limit the scope of the simulations, we used previous modeling results indicating that the highest target uptake occurs for very low molecular weight agents and those similar in size to antibodies 4 . In addition to high uptake, low molecular weight compounds benefit from rapid clearance and have demonstrated target to muscle ratios over 100 58, 59 . To focus on the design of imaging agents for extracellular targets, lipophilic compounds that can diffuse across plasma membranes with significant retained intracellular signal were excluded 60 . Finally, since imaging agents are ideally delivered at tracer doses, a subsaturating dose was assumed. Based on the four classes of pharmacokinetic behavior in tissue (blood flow-limited, permeability-limited, diffusion-limited, or binding/metabolism-limited agents) 57, the lack of transcellular extravasation of highly lipophilic compounds and tracer dose eliminates the diffusion-limited and binding/metabolism-limited regimes, respectively, narrowing the analysis to blood-flow and permeability limited probes. Since peptide and protein-based agents form a large contingent of extracellular imaging agents, we focused on a permeability-limited model subject to blood-flow limitations.

A compartmental analysis assuming equilibrium binding was performed on plasma, tissue, and internal compartments (SI). Briefly, the imaging agent extravasates from the plasma compartment into the tissue compartment, where it is either receptor-bound or free. Bound imaging agent is then trafficked to the internal compartment. Binding equilibrium is assumed to be very fast relative to diffusion of the imaging agent out of the plasma. The model also assumes a sub-saturating tracer dose of imaging agent with the receptor in excess. It can be shown (SI) that the concentration of imaging agent in the extracellular tissue and internal compartments as a function of time can be represented by

Image

ir

Image

kur

Image
Image

The parameters are described in the supplementary file. This model was used in conjunction with experimental data and simplifying assumptions to quantify the impact of probe and tissue parameters on target to background signal. While high contrast is not always necessary for an imaging agent, in most cases (delineating diseased tissue, quantifying changes in receptor expression) high contrast is beneficial and reduces artifacts from surrounding tissue signal.

The strategy outlined in this approach aims to maximize TBR by internalizing the probe within the target cells and minimizing binding/sticking and internalization in non-target tissues. An alternative approach is to select targets that are slowly internalizing and design probes that rapidly leak out of cells once they are metabolized. This would lower the signal intensity in off-target and clearance organs such as the liver and kidney. While this has been shown to improve target to background ratios for these organs 61, there are several limitations to this approach. The internalization, metabolism, and clearance of the probe from non-target tissue has to occur much faster than in the target tissue. Since metabolism and clearance often takes several hours to a day or more, ideally the target would not be internalized significantly over this time frame. Because most cell surface proteins have a constitutive internalization rate of several hours 62, this greatly limits the number of applicable targets. As noted in Fig. 3, this can increase the required affinity for high target uptake by 10 to 100-fold. Finally, the lipophilic chelate can increase plasma protein binding and liver uptake, lowering targeting efficiency. Although this approach can decrease the liver signal more than it decreases the target signal 61, in contrast, the approach discussed in the current work decreases non-specific uptake while increasing target signal. This may explain why the reported TBR values for the current approach are much higher than those achieved by a non-residualizing agent.

Permeability versus Molecular Weight

The relationship between molecular radius and permeability was modeled using a two-pore representation as described by Schmidt et al 4 . Previously reported measurements for permeability (P) for small molecules, peptides, proteins, polymers, and liposomes were compiled from literature (SI) and fit to determine the radii and fractional area of small and large pores. To quantify the extraction ratio of various molecular weight molecules, the permeability was first calculated using the two-pore prediction with the appropriate tissue vasculature. Then, using experimentally measured values for plasma flow rate and S/V (SI), a mixed flow and permeability-limited model was adopted from Tofts et al. to predict the fraction of imaging agent extracted from blood to tissue 17 . Organ systems were categorized as either fenestrated (kidney, pancreas), non-fenestrated (bone, heart, lung, muscle), or tumor for analysis (SI). A two-pore model was used to generate optimized fits for each of the three categories based on vasculature type.

Affinity versus Expression and Internalization

To predict uptake in various tissue types, a previously published model was used 56 . In short, the non-linear partial differential equation (PDE) model utilizes a Krogh cylinder geometry of tissue vessels with both axial and radial gradients for the imaging agent. Plasma concentration is modeled with biexponential decay with local concentrations determined by blood velocity and vessel permeability. A list of parameters used for tumor and endocrine pancreas uptake predictions are found in the supplementary data (SI). Experimentally measured affinity values were adjusted for temperature assuming constant free energy of binding. MATLAB was used to solve the system of nonlinear PDEs using finite differences to quantify tissue uptake. To generate a full %ID/g contour, internalization rates were varied between 10 −6 s −1 to 10 −2 s −1 . Fixing antigen concentration and varying affinity generated a range of binding potential from 10 −1 to 1000. Identical results were obtained when varying the binding potential by fixing affinity and varying the antigen concentration. Predicted uptake values were compared with experimentally determined values reported in the literature. For endocrine pancreas simulations, whole organ %ID/g was converted to islet %ID/g assuming islets are 1 wt% of the pancreas. Uptake values with 10% increases and decreases in internalization rate, affinity, and antigen expression were used as simulation error.

Plasma Clearance versus Contrast

The impact of plasma clearance on TBR was investigated using previously published data from mammary and prostate tumor models (SI). In short, small molecule inhibitors targeting prostate-specific membrane antigen (PSMA) with various dissociation constants and blood clearance rates were used to target LNCaP or PC3 xenografts in mouse models. Measured values for tumor and skeletal muscle uptake were used to calculate the TBR, which was then plotted against the blood concentration. A similar analysis was performed for various integrin binders targeting mammary adenocarcinomas in a mouse model and HER2-binding affibodies. TBR for both sets of compounds were also plotted against the total compound charge at physiological pH to demonstrate a lack of trend between uptake and molecular charge (SI). An analysis of non-target uptake was performed as well for molecules of varying hydrophobicity using previously published data of anti-HER2 affibodies (SI). Additionally, a correlation between plasma clearance and non-specific interactions was explored for exendin, a 4 kDa therapeutic peptide used to treat type 2 diabetes. The hydrophilic dye Alexa Fluor 680 or a lipophilic non-sulfonated Cy7 dye were conjugated to exendin 25 using either directly to the 14 th position or using a helix-stabilizing linker 12 to generate four variants. The peptides were administered intravenously in C57BL/6 mice and the plasma concentration monitored over time. Non-specific cellular uptake for peptide conjugates in HT1080 cells was quantified as well using in vitro assays (SI).

Plasma Clearance versus Non-specific Interactions

The targeting ligand was synthesized by ChemPartner (Waltham, MA) as an ester. The ester was hydrolyzed with 150 μL of ethanol and 7 μL of 1 M NaOH per mg of drug overnight, neutralized with 1 M HCl, and dried under vacuum. IRDye 800CW NHS ester was obtained from LI-COR (Lincoln, NE), ZW800-1 NHS ester was obtained from Curadel ResVet Imaging (Worcester, MA), and Alexa Fluor 680 NHS ester and BODIPY 650/665-X NHS ester were obtained from Life Technologies (Carlsbad, CA). The hydrolyzed integrin binder was reacted with the fluorescent dyes in a 1:1.5 molar ratio in the presence of 2 μL of triethylamine per mg of drug overnight and purified using a preparative scale Luna C18(2) column (Phenomenex; Torrance, CA) on a Shimadzu reversed phase HPLC unit. Successful conjugation was confirmed by ESI-MS and MALDI-TOF (SI).

All animal experiments were approved by the University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) and carried out in accordance with their guidelines. To quantify the blood clearance, the fluorescent compounds (15 nmol) were injected via the tail vein in C57BL/6 mice. Blood samples were collected at predetermined time points and the plasma concentration of the compounds was quantified using an Odyssey CLx. To quantify non-specific uptake rates, MDA-MB-231 cells were plated in 96 well plates and allowed to attach overnight. The cells were incubated with 200 nM of non-fluorescent ligand for 15 minutes followed by a co-incubation with 10 nM or 20 nM of fluorescent ligand and 100 nM of non-fluorescent probe. At 15, 30, 45, and 60 min, the cellular uptake was quantified using an Attune Acoustic Focusing Cytometer (Applied Biosystems) with fluorescent beads (Bangs Laboratories, Inc.) to measure the non-specific uptake rate. Plasma protein interactions were quantified for commonly used, commercially available far-red and near-infrared fluorescent dyes. For IRDye 800CW, ZW800, BODIPY 650, Alexa Fluor 680, and integrin conjugates, a Rapid Equilibrium Dialysis (RED) plate (Thermo Scientific) was used following the manufacturer's protocol.

Papildoma informacija

How to cite this article : Zhang, L. et al. Mechanistic and quantitative insight into cell surface targeted molecular imaging agent design. Mokslas. Rep. 6, 25424; doi: 10.1038/srep25424 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.