Intarpinių ląstelių mezenchiminė būsena gali paaiškinti didesnį polinkį į kylančią aortos aneurizmą bicuspidiniuose aortos vožtuvuose | mokslinės ataskaitos

Intarpinių ląstelių mezenchiminė būsena gali paaiškinti didesnį polinkį į kylančią aortos aneurizmą bicuspidiniuose aortos vožtuvuose | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Aneurizma
  • Proteomika

Anotacija

Asmenims, turintiems bicuspidinį aortos vožtuvą (BAV), yra žymiai didesnė aortos komplikacijų rizika nei asmenims, kuriems diagnozuotas tricuspidinis aortos vožtuvas (TAV) ir kuriems embriono vystymosi metu yra sutrikusi signalizacija ir (arba) nenormalios hemodinamikos poveikis gyvenimo metu. Tačiau paaiškinimas apie BAV aortopatijos molekulinius mechanizmus dar nepateiktas. Mes sujungėme proteomiką, RNR analizę, imunohistochemiją ir elektronų mikroskopiją, kad nustatytume BAV (N = 62) ir TAV (N = 54) pacientų neplatintų kylančių aortų molekulių skirtumus. Taip pat buvo atlikta išsiplėtusių aortų (N = 6 BAV ir N = 5 TAV) proteominė analizė, kad būtų galima įgyti daugiau informacijos apie BAV aortopatiją. Mūsų rezultatai kartu parodė endotelio / epitelio-mezenchiminio (EndMT / EMT) pereinamojo proceso molekulinį parašą, susijusį su intralinių ląstelių jungčių nestabilumu ir RHOA kelio aktyvacija kylančiosios aortos intimos ir terpės sluoksniuose BAV sergantiems pacientams. Mes siūlome, kad netinkamas EndMT / EMT reguliavimas per pusmėnulio vožtuvų ir kylančiosios aortos, esančios BAV, spaustuemporaliniu ryšiu susijusiose embriogenezėse, gali sukelti aortos nesubrendimą ir nestabilumą prieš išsiplėtimą. EndMT / EMT būklės pablogėjimas po embriono gyvenimo ir (arba) nefiziologinės hemodinamikos poveikis gali sukelti kylančiosios aortos aneurizmą BAV asmenims.

Įvadas

Bispidinis aortos vožtuvas (BAV) yra dažniausias įgimtas širdies apsigimimas, pasireiškiantis 1–2% žmonių. Asmenims, turintiems BAV, yra žymiai didesnė rizika susirgti rimtomis aortos komplikacijomis nei asmenims, turintiems trikampius aortos vožtuvus (TAV). Vožtuvo apsigimimo ir kylančiosios aortos aneurizmos susidarymo sutapimą buvo siūloma nustatyti genetiškai 1 ir bendro defekto, atsirandančio ankstyvoje širdies embriogenezės stadijoje, pasekmę 2 . Padidėjęs hemodinaminis krūvis, kurį sukelia pati BAV morfologija, taip pat buvo svarstomas kaip alternatyvus kylančiosios aortos trapumo priežastinis veiksnys 3 .

Pusiau sklindančių vožtuvų (aortos ir plaučių vožtuvų) ir pradinės aortos iš nutekėjimo trakto (OFT) vystymasis yra susiję procesai, apimantys sudėtingą, tačiau nevisiškai apibūdintą molekulinę sąveiką. Pirmasis embrioninio vožtuvo vystymosi pasireiškimas yra endokardinių pagalvėlių formavimas OFT dėl endotelio / endokardo-mezenchiminio perėjimo (EndMT). Šio proceso metu dalis endokardo ląstelių delaminuojasi ir virsta mezenchiminėmis ląstelėmis ir įsiveržia į širdies želė. OFT įsiskverbimas į kylančią aortą ir plaučių kamieną yra susietas su sporais ir yra suderinamas su pagalvėlių brendimu į pailgius pusiau šoninius vožtuvus. Tai pasiekiama sąveikaujant tarp OFT pagalvėlės, antrojo širdies lauko (SHF) pirmtakų ir migruojančių širdies nervų keteros ląstelių (NCC). 2, 4 .

Panašiai kaip epitelinis-mezenchiminis perėjimas (EMT), EndMT taip pat gali būti vėl suaktyvinamas suaugusio žmogaus gyvenime tam tikromis patologinėmis sąlygomis, tokiomis kaip žaizdų gijimas, vėžys ir fibrozinė liga 5 . EMT ir EndMT inicijavimą lemia gerai apibūdinti transkripcijos veiksniai, tokie kaip SNAIL1 / 2, ZEB1 / 2 ir TWIST, kurie atitinkamai epitelio ir endotelio ląsteles (EC) paverčia mezenchimine būsena, sukeldami transkripcijos perprogramavimą. „EndMT“ / „EMT“ yra suskirstyti į tris potipius, atspindinčius skirtingus biologinius procesus, dėl kurių susidaro skirtingi ląstelių tipai - ty mezenchiminės ląstelės I tipo atveju, fibroblastai II tipo ir invazinės naviko ląstelės III tipo. Visų tipų bruožas yra ląstelių-ląstelių jungčių išardymas - ląstelių poliškumo ir judriojo elgesio pasikeitimas pertvarkant citoskeletą 6 .

Ankstesni mūsų transkriptominiai ir baltymų duomenys parodė, kad BAV ir TAV sergantiems pacientams aneurizmos vystymasis vyksta skirtingais molekuliniais procesais. BAV aneurizmos formavime dalyvauja žymiai mažiau diferencijuotai išreikštų genų ir baltymų, reiškiančių laipsniškesnius ir laipsniškesnius molekulinius pokyčius aortos sienelėse 7, 8 . Norėdami gauti daugiau informacijos apie BAV aortopatiją, mes atlikome neobjektyvų proteominį palyginimą tarp nedidėjusių, taip pat išsiplėtusių BAV ir TAV pacientų. Įdomu tai, kad proteomikos duomenys, po kurių sekė KEGG / Hallmark / Ingenuity kelio analizė, atskleidė BAV neišplatintos aortos molekulinį parašą, primenantį atitinkamai EMT arba EndMT aktyvaciją vėžio metastazių ir širdies pagalvėlės vystymosi metu. Mes siūlome, kad šio proceso pasunkėjimas prisidėtų prie aneurizmos vystymosi BAV. Pasinaudodami turimomis žiniomis, mes toliau palyginome kai kurių pagrindinių EMT / EndMT žaidėjų pasiskirstymą BAV ir TAV pacientų neišplatintose aortos sienelėse.

Rezultatai

Neaplėstų kylančių aortų proteominė analizė parodė padidėjusį EndMT aktyvumą BAV sergantiems pacientams

Naujasis skysčių chromatografijos ir masių spektrometrijos pagrįstas proteominis metodas, HiRIEF LC-MS / MS 9, kuris yra neobjektyvus atradimo metodas, turintis gilų proteomų aprėptį, leido aptikti ir kiekybiškai įvertinti 2894 baltymus neišplatintų ir išsiplėtusių intimose terpėse. kylančios aortos. Dvimatė PCA analizė kartu su prižiūrima OPLS baltymų duomenų analize parodė, kad TAV ir BAV mėginiai sudarė du skirtingus klasterius (S1 pav., 3 papildoma lentelė), pabrėžiant, kad TAV ir BAV aortos audiniai turėjo skirtingą baltymo ekspresijos profilį. Norint nustatyti baltymus, atsakingus už neišplestų mėginių grupavimą, buvo apskaičiuoti „peilio peilio“ pasikliovimo lygiai, gauti iš kryžminio OPLS analizės patvirtinimo. Reikšmė buvo apskaičiuota kaip ABS (pakrovimas) - ABS (kėliklio ir peilio pasikliovimo intervalas); teigiamos vertės nurodė reikšmingus baltymus. Tai leido identifikuoti 276 skirtingai išreikštus baltymus tarp BAV-ND ir TAV-ND (papildoma 4a lentelė).

276 baltymų KEGG ir Hallmark analizė atskleidė endocitozę, apoptozę, EMT ir su židinio adhezija bei ECM susijusius kelius. Aktyvuoti biocheminiai keliai apėmė glikolizę, hipoksiją, oksidacinį fosforilinimą, TCA ciklą ir riebalų bei aminorūgščių metabolizmą, ty metabolinius procesus, sukeltus ląstelių transformacijos metu (5a, b papildoma lentelė). Be to, atlikta 276 diferencijuotai išreikštų baltymų išradingumo kelio analizė (6 papildoma lentelė), kartu su literatūra ieškant 30 labiausiai reguliuojamų ir žemyn reguliuojamų baltymų BAV-ND (atitinkamai 7 ir 8 lentelės, kai baltymai yra aukštyn ir žemyn). baltymų skaidymo ir apyvartos procesų ir baltymų praturtinimas, ląstelių jungimosi dinamika, apoptozė, ląstelių ciklas ir su vėžiu susiję biologiniai procesai. Didžiausias išradingumo analizės balų taškas buvo ūminės fazės atsakas, kuris suaktyvėja uždegimo metu ir audinių rekonstravimo metu. Neseniai gaubtinės žarnos adenokarcinoma 10 buvo aprašyta diferencinė baltymų, susijusių su šiuo keliu, ekspresija kartu su LXR / RXR. Literatūros paieška patvirtino aukščiau minėtus rezultatus.

Toliau atlikome išsiplėtusios BAV ir TAV aortos proteominę analizę. Iš viso 805 baltymai buvo reikšmingai diferencijuoti tarp BAV-D ir TAV-D (papildoma 4b lentelė). Atsirandantys keliai atliekant KEGG ir Hallmarko analizę apėmė citoskeleto, su autofagija susijusios mTORC1 ir su ląstelių jungtimis susijusių kelių (tankios ir viršūninės sankryžos) reguliavimą (5c, d papildoma lentelė). Diferencinis leukocitų transendotelio migracijos suaktyvinimas gali būti susijęs su uždegimu ar endotelio judėjimu, o disfunkcija atsirado dėl EB sankryžų suirimo. Aukščiausias 805 diferencijuotų baltymų išradingumo analizės kelias buvo susijęs su citoskeleto pertvarkymu, po kurio sekė keli su RHO susiję procesai, endocitozė ir ląstelių judėjimas, ląstelių jungimosi būdai ir biologiniai keliai, kurie, kaip žinoma, aktyvuoti vėžyje, ty PI3K / AKT, IL8, arilo angliavandenilių receptorių, CXCR4, Cdc42 ir PAK (6 papildoma lentelė). Ypatingas susidomėjimas buvo kelių, suaktyvintų delaminuojant, EMT, ir NCC migracijos širdies vystymosi metu įtraukimas, būtent, Rho šeimos GTPazių signalizavimas, efrinų receptorių signalizacija ir integrino signalizacija 11 .

Mes toliau konstravo tinklus sąveikaujančių baltymų iš KEGG kelio (1 pav.) Ir Hallmark analizė (S2 pav.), Neišsiplėtę ir išsiplėtę mėginiai. Pagrindiniai keliai atskirai parodomi didesniu padidinimu S3 pav. Kaip matyti 1 ir S2 paveiksluose, EMT parašas buvo sujaudintas padidėjusioje BAV pacientų aortoje (raudona spalva rodo aukščiau reguliuojamus genus).

Image

Sąveika gaunama iš žmogaus baltymų nuorodų duomenų bazės (HPRD) 46 . Baltymai yra dažomi atsižvelgiant į išraiškos pokyčio kryptį atitinkamai neišplatintose ir išsiplėtusiuose mėginiuose. Raudona spalva rodo, kad BAV reguliuojama aukščiau, palyginti su TAV; Žalia rodo BAV sumažintą reguliavimą, o pilka - nepakitusią.

Visas dydis

Kadangi buvo pranešta apie angiogenezės indukciją aneurizmoje 12, o dalinis EndMT 13 aprašytas angiogenezės metu ir greičiausiai kraujagyslės sienelėje, mes ištyrėme VEGF šeimos ligandų, receptorių ir ko-receptorių mRNR raišką (9 papildoma lentelė, amžius). taisyti duomenys iš Folkersen ir kt ., 7 ). Įdomu tai, kad keli šeimos nariai parodė arba reikšmingumą ( VEGFR1 , VEGFC ), arba tendenciją ( VEGFA , VEGFR2 ) BAV-ND reguliavimui. Pažymėtina, kad dauguma pagrindinių angiogenezės proceso dalyvių ( VEGFA , VEGFC , VEGFR1 , NRP1 , NRP2 ) buvo reikšmingai sumažintos BAV pacientų išsiplėtusios aortos srityje, atmetant angiogenezės indukciją BAV kylančiose aortose. NRP1 ir NRP2 yra svarbūs NCC 11 migracijos veiksniai ir reikšmingai sumažino baltymų lygį BAV-D aortoje.

Atsižvelgiant į mechaninį EMT, sergančio vėžiu, ir EndMT / EMT dubliavimąsi širdies pagalvėlėje / NCC embrioninio OFT vystymosi metu ir neįtraukiant angiogenezės aktyvavimo, šie rezultatai tvirtai rodo, kad vykstantis EMT / EndMT panašus mechanizmas kylančioje BAV aortoje yra.

Nors aortos sienelės intima sluoksnį pirmiausia veikia nenormali hemodinamika, kurią sukelia BAV morfologija, žmogaus BAV būklė ir vientisumas iš esmės nebuvo ištirti. Be to, dėl endotelio specifinių mutacijų tam tikruose genuose atsirado BAV 14, 15 modelių gyvūnams, o endotelio specifinio GATA5 delecijos atveju, kai ketvirtadalis palikuonių turėjo BAV, buvo pasiūlyta sutrikusi EB migracija ir (arba) diferenciacija. prisidedantis veiksnys 14 . Taigi, ypatingą dėmesį skirdami intima, mes tyrėme ir palyginome EndMT BAV-ND ir TAV-ND asmenims.

BAV-ND sergantiems pacientams suaktyvėja endocitozė

Naudodamiesi elektronų mikroskopija, mes ištyrėme ultrainfrastruktūrinius skirtumus tarp BAV-ND ir TAV-ND intima. BAV-ND (2a – g pav.) Pastebėtas išskirtinai didesnis atotrūkis tarp EB sankryžų, kai endokitinės pūslelės kaupiasi greta ardančiosios medžiagos (2a – g pav.). Ląstelės pacientams, kuriems išsiplėtusi aorta, paprastai buvo labiau išsigimusios, ir buvo pastebimas didelis jungiamųjų medžiagų skaidymas, sudarantis didelius tarpus, ir EB fagocitizuojančios gretimas ląsteles (S4 pav.), Tai reiškia, kad jungties trapumas yra BAV požymis tiek prieš, tiek po išsiplėtimo.

Image

Reprezentatyvūs BAV-ND ( a – c ) ir TAV-ND ( d – g ) aortos EM vaizdai. Rodyklių galvutės nurodo į pinocitozines pūsleles, N = 3 pacientai / grupė.

Visas dydis

Nuo klatrino priklausoma endocitozė yra pagrindinis kelias jungiamųjų kompleksų perdirbimui vėžio progresavimo metu ir EndMT 16 . Norint ištirti ir palyginti endocitinį aktyvumą, buvo atlikta konfokalinė mikroskopija, naudojant antiklatrino antikūnus. BAV-ND intima, palyginti su TAV-ND, pastebėjome tankesnį klatrino turinčios medžiagos kaupimąsi ir mažesnę CDH5 ekspresiją su keliomis kartu lokalizuojančiomis dėmėmis (3 pav.).

Image

Clathrin (žalia) ir CDH5 (raudona). Branduoliai dažomi DAPI (mėlyna). Diferencialinės sąsajos kontrasto mikroskopija arba Nomarski (pilka). Masto juosta = 5 μm, N = 4 pacientai / grupė.

Visas dydis

EB jungtys yra nestabilios BAV-ND sergantiems pacientams

Pagrindinis įvykis inicijuojant EndMT yra ląstelių-ląstelių jungčių disociacija 6 . BAV-ND endotelyje pastebimai sumažėjo įtempto jungiamojo baltymo Claudin 5 (CLDN5) dažymas, palyginti su TAV-ND (4a, b pav.). Be to, fosforilinimas yra vienas iš pagrindinių adhezijos jungties baltymo VE-kadherino (CDH5) apykaitos signalų. Tarp tirozino liekanų buvo intensyviai tiriamas Y658 fosforilinimas ir nustatyta, kad fosforilinimas šioje vietoje demaskuoja CDH5 internalizacijos 17, 18 signalą, sukeldamas sankryžų destabilizaciją 19 . Be to, fosforilinimas šioje vietoje reguliavo EB perėjimą į mezenchiminę būseną 20 . Dažydami BAV-ND ir TAV-ND pacientus, sergančius anti-CDH5 ir anti-Phos-CDH5-Y658, BAV-ND intima parodė žymiai mažesnę CDH5 ir aukštesnę Phos-CDH5-Y658 baltymo išraišką (4c pav., D). Šis pastebėjimas suponavo, kad mažesnė CDH5 ekspresija BAV-ND gali būti dėl CDH5 fosforilinimo ties Y658 padidinant jo apyvartą.

Image

Tipiniai CLDN5 ( a, b ), CDH5, CDH5-Y658 ( c, d ) dažymo vaizdai. VWF dažymas parodo endotelio vietą. Masto juosta = 50 μm, N = 7–9 pacientai / grupė. Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD (Mann-Whitney U-testas).

Visas dydis

Tirozino fosforilinimas liekanoje Y658 taip pat buvo susijęs su angiogenine stimuliacija 21 . Tų pačių pjūvių aortos neovaskuliarizacijos sritys buvo naudojamos kaip vidinė kontrolė anti-CDH5 ir anti-CDH5-Phospho-Y658 antikūnams. Šiuose regionuose nebuvo pastebėtas skirtumas tarp BAV-ND ir TAV-ND, tai rodo, kad BAV dažymo anti-CDH5-Phospho-Y658 intensyvumas BAV neatsirado dėl artefaktų (S5 pav.).

Kartu su padidėjusiu tirozino fosforilinimu, sumažėjęs PTPRB fosfatazės reguliavimas sumažina pralaidumą, o tokie agentai kaip VEGF, sukeliantys endotelio pralaidumą, sukelia PTPRB ir CDH522 disociaciją. Palyginome PTPRB pasiskirstymą kadherino fosforilinimo atžvilgiu iš eilės BAV-ND ir TAV-ND skyriuose. Kaip ir tikėtasi, dažymas CDH5-fosfo Y658 padidėjo lygiagrečiai su sumažėjusiu PTPRB dažymu (S6 pav.). Iš papildomos 9 lentelės matyti, kad CDH5 geno ekspresija taip pat buvo žymiai mažesnė išsiplėtusiose BAV aortose, palyginti su TAV, tuo tarpu mezenchiminis žymeklis N-kadherinas ( CDH2 ) buvo didesnis išsiplėtusiose BAV aortose . Kitos sukibimo molekulės PECAM1 ekspresija taip pat buvo mažesnė BAV išsiplėtusioje aortoje. Pažymėtina, kad tiek CHD2, tiek PECAM1 baltymo ekspresija parodė tą patį modelį, kaip ir genų ekspresija BAV-D.

ZEB1 yra pagrindinis EMT / EndMT transkripcijos veiksnys ir veikia pirmiausia nukreipdamas ir slopindamas kadheriną 23, 24 . ZEB baltymai vaidina svarbų vaidmenį kontroliuojant ląstelių dauginimąsi ir išgyvenimą reguliuojant su ląstelių ciklu susijusius genus. Kaip parodyta papildomoje medžiagoje, BEB-ND ZEB1 aktyvacijos lygis buvo žymiai didesnis, palyginti su TAV-ND, o BAV-ND pacientų intima-media sluoksnis buvo žymiai labiau proliferacinis nei TAV-ND, kaip vertinama pagal skaičių KI67 teigiamų branduolių (5 ir S7 pav.). Didesnis aortos sienelių plitimas BAV-ND sergantiems pacientams patvirtina ankstesnį atradimą, kad lygiųjų raumenų ląstelės (SMC) gali būti „nesubrendusios“ BAV-ND, palyginti su TAV-ND 2 .

Image

ZEB1 dažymas ( a, b ); ir KI67 ( c, d ). VWF dažymas parodo endotelio vietą. Mastelio juostos = 50 μm, N = 9 pacientai / grupė. Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD (Mann-Whitney U-testas).

Visas dydis

Apskritai, mažesnė ekspresija ir didesnis jungiamųjų medžiagų skaidymas rodo BAV-ND vidinį nestabilumą.

Padidėjęs RHOA aktyvavimas BAV-ND sergančių pacientų aortos sienelėse

„RhoA GTPase“ šeimos aktyvinimas yra svarbus žingsnis progresuojant „EndMT 6 “, keičiant ląstelių funkcijas, susijusias su sukibimu, pralaidumu, migracija ir mechaninėmis savybėmis, EC ir SMC. Keli su RHO susiję keliai buvo tarp 40 geriausių, atrinktų išsiplėtusių pacientų išradingumo analizės būdu (6 papildoma lentelė).

Mes ištyrėme dviejų pagrindinių RHOA kinazių - su Rho susijusios, suvyniotos ritės turinčios kinazės (ROCK2) ir nuo Ca2 + -kalmodulino priklausomos miozino lengvosios grandinės kinazės (MYLK) - pasiskirstymą. Tiek ROCK2 (6a, b pav.), Tiek MYLK (6c, d pav.) Baltymai parodė didesnę BAV-ND intima ir terpės sluoksnį, palyginti su TAV-ND pacientais. Be to, BAV pacientų intima sluoksnyje pastebėtas ryškus ROCK2 reguliavimas ( P = 0, 0111, 5b pav.). Išsiplėtę BAV, ROCK2 mRNR ir baltymai buvo reikšmingai sureguliuoti (papildoma 9 lentelė). MYLK mRNR buvo žymiai didesnė pacientams, kuriems išsiplėtė, ir buvo patvirtinta, kad jie yra sureguliuoti naudojant Western blot analizę BAV-ND pacientams (S8c pav., D).

Image

Reprezentatyvūs pagrindinių RHOA kinazių ROCK2 ir MYLK) vaizdai ( a – d ) ir jų taikiniai MYL9 ( e, f ) ir MYL6 ( g, h ). VWF dažymas parodo endotelio vietą. Mastelio juostos = 50 μm, N = 6–8 pacientai / grupė. Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD (Mann-Whitney U-testas).

Visas dydis

MYL9 koduoja SMC specifinio miozino II (R LC20) 20 kD reguliavimo subvienetą ir reguliuoja miozino fosforilinimą ir aktomiozino kontraktilinį aktyvumą. MYL9 buvo iš esmės padidintas BAV-ND sergančių pacientų SMC (6e, f pav.). Antikūno, nukreipto prieš MYL9 serino 19 fosforilintą formą (MYL9-P), panaudojimas taip pat parodė stipresnį BAV-ND terpės dažymą, palyginti su TAV-ND (6e, f pav.). MYL9 / MYL9P santykis BAV-ND buvo 1, 5 karto didesnis, palyginti su TAV-ND, tai reiškia, kad MYL9 buvo ir labiau reguliuojamas, ir labiau fosforilintas BAV-ND. MYL6 genas koduoja 17 kD miozino II esmines lengvas grandines ir yra ekspresuojamas tiek ne raumenų ląstelėse, tiek SMC. MYL6 parodė didesnę BAV-ND endotelio ir SMC išraišką, palyginti su TAV-ND pacientais (6g pav., H). Tai dar kartą patvirtino proteomika (papildoma 4a lentelė).

Ultrastruktūriniai EK tyrimai parodė sudėtingą pseudopodijos formavimosi modelį BAV-ND asmenims, tuo tarpu TAV-ND jų nebuvo arba jie buvo daug mažiau išplėsti (7a pav.). Be to, stresinės skaidulos buvo gausesnės BAV-ND sergančių pacientų endotelyje (7b pav.), O tai atitiko didesnę ZYX raišką (7 papildoma lentelė).

Image

Reprezentatyvūs pseudopodijos ( a ) ir stresinių skaidulų, SF ( b ), EM vaizdai, N = 3 pacientai / grupė.

Visas dydis

Padarėme išvadą, kad RHOA kelias buvo aktyvuotas BAV-ND intima-terpėse, sukeldamas pseudopodijos ir streso skaidulų formavimąsi intime, savybes, kurios suderinamos su mezenchiminiu perėjimu.

NOTCH aktyvuojamas BAV-ND pacientams prieš išsiplėtimą

Teigiama, kad NOTCH ligando-receptoriaus sąveikos sureguliavimas - atlikus ligandų endocitozę, suaktyvintą E3 ubikvitino ligazės „Mind Bomb“ ( MIB1), arba atlikus transliacijos receptoriaus modifikaciją per glikoziltransferazės manijos šonkaulį ( MFNG ) endokarde, buvo reikalingas tinkamam širdies širdies endMT. pagalvėlė ir aortos vožtuvų formavimas pelėms 25 . Naudodami IHC, mes parodėme žymiai aukštesnę NOTCH3 ir NOTCH1 tarpląstelinio domeno (ICD), ligandų JAG1, JAG2 ir DLL4 išraišką ir didesnę NOTCH4 ekspresijos tendenciją ( P = 0, 0571) BAV-ND intima-terpėse, palyginti su TAV. -ND (8a-l pav.). Tačiau NOTCH šeimos receptorių ir ligandų geno ekspresija reikšmingai nesiskyrė pacientams, kurie nėra išsiplėtę, o tai rodo postransliacinį NOTCH signalo signalo reguliavimą BAV-ND. MIB1 genas BAV-ND ir MIB1 genas bei baltymas buvo sureguliuoti BAV-D. „BAV-ND“ ir „TAV-ND“ aortos (N = 8 + 8 = 16) intima-media terpių ekstraktų „Western blot“ analizė parodė mažesnę MFNF baltymų ekspresiją BAV-ND sergantiems pacientams (S8a, b pav.). MFNG genas taip pat reikšmingai sumažėjo BAV-D, palyginti su TAV-D ( P <0, 00001, 9 papildoma lentelė). Tai atitiko duomenis, paskelbtus pelėse 25, palaikančius MIB1 ir MFNF norminį vaidmenį NOTCH keliui BAV.

Image

Reprezentatyvūs NOTCH receptorių ( a – f ) ir ligandų ( g – l ) vaizdai. Masto juosta = 50 μm, N = 7–10 pacientų / grupė. Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD (Mann-Whitney U-testas).

Visas dydis

Ląstelių jungties ir RHOA bei NOTCH kelio baltymų ekspresija vidinėje krūtinės arterijoje

Norint ištirti, ar pastebėti skirtumai būdingi kylančiai aortai, tų pačių pacientų vidinės krūtinės arterijos buvo dažytos antikūnais, naudojamais aortos intimos terpėms (CLDN5, CDH5, CDH5-Y658, MYLK, ROCK2, MYL9, MYL9-P, MYL6)., NOTCH1-ICD, NOTCH3, JAG1 ir DLL4). Nė vieno iš baltymų (S9 – S12 pav.) Reikšmingo skirtumo tarp BAV-ND ir TAV-ND pacientų nenustatyta, o tai reiškia, kad skirtumai būdingi aortai.

Diskusija

Mes nustatėme baltymų / KEGG / Hallmark / Ingenuity kelio analizę ir literatūros paiešką su IHC / konfokaline / elektronine mikroskopija, kad nustatytume diferencinę baltymų raišką ir ląstelių reorganizaciją neišplatintose BAV ir TAV pacientų aortose. Mes pateikiame įrodymų apie vykstančius procesus, suderinamus su pradine EMT / EndMT faze BAV-ND asmenų kylančioje aortoje, ty endocitozę, židinio adhezijos pokyčius, taip pat apie metabolinių kelių, kurie, kaip žinoma, aktyvuoti EndMT / EMT / vėžyje, indukciją. . Daugiausia dėmesio skiriant intima, citologiniai duomenys dar labiau patvirtino EB sankryžos nestabilumą ir citoskeleto pertvarkymą - savybes, suderinamas su EndMT 5 indukcija. Išsiplėtusių aortos mėginių proteomikos tyrimai dar labiau patvirtino, kad pradėjus prekybą baltymais ir pereinant prie su vėžiu susijusių medžiagų apykaitos būdų BAV-ND, baigėsi ląstelių jungčių ir citoskeleto pertvarkymas bei kelių su vėžiu susijusių būdų indukcija. Mes siūlome, kad šie struktūriniai pokyčiai gali turėti esminės reikšmės kylančių aortų nestabilumui BAV asmenims.

EndMT / EMT indukcija kylančioje BAV aortoje gali atsirasti dėl aortos veikimo visą gyvenimą nefiziologinės hemodinamikos ir (arba) nepakankamo embriono vystymosi. Įrodyta, kad sutrikęs srautas sukelia EndMT tiek in vivo, tiek in vitro 26, 27, taip pat daro įtaką ląstelių jungčių 18 būklei ir RHO 28 ekspresijai. Be to, EMT / EndMT vaidina esminį vaidmenį kuriant pusrutulinius vožtuvus tiek formuojant širdies pagalvėlę iš 5 endokardo, tiek atliekant NCC delaminciją ir migraciją iš nervinio epitelio per visą skalę arba dalinį EMT 11 . Arba sumažėjęs 15, 29, arba per didelis 30 EndMT endokardinės pagalvėlės rezultatas - embriono pusinės sklendės ir OFT embriono išsivystymas buvo nepakankamas.

Kardiogenezės metu pusmėnulio vožtuvai išsivysto ir nutekėjimo traktas išsiskiria į kylančiąją aortą ir plaučių kamieną. Naujausi tyrimai, kuriuose buvo naudojami konkrečiai linijai būdingi gyvūnų modeliai, išnagrinėjo šio tarpusavio ryšio molekulinį pobūdį ir pagrindžia hipotezę, kad esant nepakankamam endokardo pagalvės, SHF ir NCC, signalo mainui ankstyvajame vožtuvo formavimosi etape yra ryšys tarp vožtuvų netinkamo formavimo ir anomalijos, atsirandančios aortos sienelėje 4 . Neseniai buvo atskleistas vienas iš tokių kryžminių pokalbių pavyzdžių, kai iš NCC išvestas SEMA3C gali suaktyvinti endotelio NRP1 raišką OFT, kad būtų galima inicijuoti EndMT, ir kad ši komunikacija buvo būtina norint inicijuoti endokardinį EndMT ir skatinti OFT 31 skyriuje . Tuose keliuose transgeninių tyrimų su gyvūnais metu, kurių metu buvo atkreiptas dėmesys į nenormalų pusinės žarnos vožtuvų vystymąsi ir kylančiosios aortos patologinę būklę, dėl sutrikusios signalo mainų tarp endokardinės pagalvėlės, NCC ir SHF kylančios kylančiosios aortos vystymasis buvo lygiagretus vožtuvui. apsigimimai, patvirtinantys kryžminio pokalbio svarbą 4, 30, 32 .

Dėl biomarkerio išraiškos nenuoseklumų EMT / EndMT proceso apibūdinimas yra sudėtingas, ypač in vivo ir žmogaus paciento medžiagoje, kur liga greičiausiai pakito audinius, o manipuliavimo galimybė neegzistuoja. EndMT / EMT molekulinis parašas gali skirtis priklausomai nuo potipio, kilmės audinio (endotelio ir epitelio ląstelių) ir signalizacijos konteksto. Nepaisant to, baltymų duomenų analizė, papildyta įvairių tipų mikroskopijomis ir RNR analize, leido mums daryti išvadą, kad endocitozės ir RHO kelio aktyvinimas, ląstelių jungčių nestabilumas ir vėžiui būdingo metabolinio perprogramavimo sukėlimas intime ir greičiausiai BAV-ND kylančiosios aortos terpės yra pradinis EMT / EndMT proceso etapas. Tolesnis baltymų, išsiplėtusių ir neišplatintų pacientų, duomenų palyginimas parodė, kad ląsteliniai ir metaboliniai pokyčiai, nepastebėti išsiplėtusios aortos, baigėsi išsiplėtusiu būsena kaip citoskeleto ir ląstelių poliškumo pakitimai, ląstelių jungties nestabilumas ir naujos biologinės signalizacijos atsiradimas. dar aiškiau įtrauktas į vėžį / EMT / EndMT. Bendras su EMT / EndMT susijusių pokyčių rezultatas būtų ląstelės, turinčios mezenchiminių savybių ir būdingą aortos nestabilumą, kurios gali pasunkėti, ir tai prisideda prie aneurizmos formavimosi. Didesnė baltymų ir mRNR ekspresija N-Cadherin, pagrindiniame EMT / EndMT biologiniame žymenyje BAV-D sergantiems pacientams, patvirtina šią išvadą.

Sutelkdami dėmesį į BAV-ND intima, mes atradome citologinius įrodymus dėl aukšto endocitozės aktyvumo ląstelių sankryžose, RHOA kelio (ROCK2 ir MYLK) aktyvavimo, dėl kurio buvo pertvarkyta citoskeleto struktūra ir susidarę streso pluoštai, žemyn reguliuojant sandarius ir adreno jungiamųjų baltymų, taip pat jungčių destabilizacijos molekulių pirštų atspaudai, ty VE-kadherino fosforilinimas, žemas PTPRB reguliavimas. Šiems pacientams RHO kelio aktyvacija neapsiribojo intima, bet buvo išplėsta ir žiniasklaidoje. ROCK2 ir MYLK buvo labiau išreikšti, o jų taikinys, MYL9, buvo labiau išreikštas ir fosforilintas BAV-ND terpėse. Myl6, kita lengva miozino grandinė, taip pat buvo padidintas BAV-ND, o tai dar kartą patvirtino proteominė analizė, o MYL6 ir MYL9 bei ROCK2 baltymai buvo sureguliuoti BAV-D sergantiems pacientams. MYLK baltymo proteomika nenustatė, tačiau Western blot patvirtino MYLK padidėjusį reguliavimą BAV-ND.

Nė vienas iš tirtų baltymų nebuvo skirtingai ekspresuojamas vidinėse krūtinės arterijose, pabrėžiant molekulinių pokyčių aortos specifiškumą. Pažymėtina, kad dauguma žymenų, išbandytų IHC eksperimentuose, įskaitant CDH5, CLDN5, PTPRB, ZEB1, ROCK2 ir MYLK, kurie nebuvo skirtingai išreikšti mRNR lygyje tarp BAV-ND ir TAV-ND, buvo išsiplėtusiuose mėginiuose.

EndMT pradžia ir pabaiga atrioventrikulinio kanalo ir OFT širdies pagalvėlėse yra griežtai reguliuojama VEGF signalo svyravimu 33, 34, kuris yra selektyvus VEGFR1, atliekant OFT 35 EndMT. Mes pastebėjome reikšmingą VEGFR1 sulėtėjusį reguliavimą ir kitų VEGF šeimos narių geno ekspresijos tendenciją BAV kylančioje aortoje. VEGF signalizacija taip pat vaidina svarbų vaidmenį migruojant NCC 36 . Todėl kyla pagunda spėlioti, kad VEGF signalų sumažinimas BAV yra susijęs su netinkamu pagalvės EndMT nutraukimu ir (arba) signalais, susijusiais su NCC migracija. Akivaizdu, kad mažesnis VEGF signalizavimas gali būti netinkamo EndMT / EMT nutraukimo priežastis ar rezultatas. VEGF veikia prieš notch, ir tarpusavio reguliavimo dėka jie vaidina pagrindinį vaidmenį tinkamai formuojant širdies vožtuvus37. Šiuos du būdus širdies vožtuvų 38 EndMT vaidina priešingai, o tai sutinka su mūsų pastebėjimu, kad EndMT parašas BAV sutampa su VEGF žeminimu ir NOTCH signalizacijos padidinimu.

NOTCH vaidina lemiamą vaidmenį kiekviename embriono vystymosi etape, kuriame vystosi pusrutuliniai vožtuvai ir kylančiosios aortos, įskaitant endokardinės pagalvėlės 39 EndMT, ir EndMT, SHF pirmtakų bei migruojančių NCC sąveikos koordinavimas OFT vystymosi metu 4 .

Čia parodytas NOTCH ligandų ir receptorių reguliavimas BAV-ND. Anksčiau mes pranešėme apie NOTCH1 ir NOTCH3 genų padidėjusį reguliavimą tiek BAV, tiek TAV sergantiems pacientams dėl išsiplėtimo, tačiau šis padidėjimas buvo akivaizdesnis TAV-D 7, o mūsų proteominiai duomenys parodė didesnę NOTCH3 baltymo ekspresiją BAV-D sergantiems pacientams. Šis neatitikimas reiškė NOTCH reguliavimą keičiant baltymus BAV. Tam pagrindžiant, MFNG baltymo ir mRNR raiška buvo atitinkamai sumažinta BAV-ND ir BAV-D, atsižvelgiant į pastebėjimą, kad MFNG yra chaperonas, neigiamai reguliuojantis NOTCH3 apykaitą žmogaus vėžio ląstelių linijose 40 . Be to, MIB1 mRNR reguliavimas BAV-ND ir jo padidinimas genų ir baltymų lygiuose BAV-D suponavo dar vieną posttransliacinio NOTCH modifikavimo lygį BAV. Atitinkamai, NOTCH išraiškos reguliavimas gali skirtis mechaniškai, atliekant skirtingas biologines funkcijas išsiplečiant TAV ir BAV aortai.

Remdamiesi pateiktais rezultatais, mes siūlome, kad esant kritiniam laiko tarpui sutrikęs genetinis ir (arba) epigenetinis signalas gali įtakoti tinkamą ryšį tarp endokardo, SHF pirmtakų ir NCC, dėl ko „nepilnai“ nutraukiama širdies pagalvėlė EndMT ir (arba) EMT sukeltas NCC delaminuojant ir pereinant į OFT 11 . Sutrikus kryžminiam pokalbiui, atsirastų BAV ir neteisingai diferencijuota kylanti aorta. RHOA, ZEB1 aktyvacija, taip pat didesnis proliferacija, vertinama pagal KI67 dažymą BAV aortos terpėje, gerai atitinka šią hipotezę ir sutinka su BAV asmenų kylančiosios aortos SMC nesubrendimu 2 . Šis pasipiktinimas yra būdingas aortai ir neturi įtakos vidinėms krūtinės arterijoms. Kaip alternatyva, EndMT būsena ir netinkamas diferenciacija vien intima gali sukelti būdingą aortos sienelių nestabilumą. Dėl nefunkcionalaus / nesandaraus endotelio taip pat gali atsirasti RHOA aktyvacija ir pasikeisti kraujagyslių tonusas terpėje, susitraukiant SMC. Tai gerai sutinka su dideliu stresinių skaidulų susidarymu endotelyje ir didesniu BAV aortos 41 standumu. Akivaizdu, kad abu mechanizmai gali vienu metu prisidėti prie aortos nestabilumo BAV.

Nesant reprezentatyvaus žmogaus aneurizmos, susijusios su BAV, modelio, informacija, gauta atlikus pacientų tyrimus, bus ribota, o bandymai suprasti aukščiau aprašytą ląstelinės komunikacijos detalę iš esmės liks spekuliatyvūs. Tačiau mūsų išvados rodo, kad NOTCH / VEGF balansas gali būti svarbus signalizacijos kaskados komponentas tinkamam aortos vožtuvų vystymuisi ir kylančiosios aortos brendimui, kurios pokyčiai galėtų lemti didesnį jautrumą aneurizmai. Mūsų rezultatai toliau apibūdina aneurizmos formavimąsi BAV kaip laipsnišką procesą ir jau esančio proceso gilinimą, aiškindami dramatiškesnius TAV pokyčius, palyginti su BAV, kai susidaro aneurizma, suderindami su ankstesne mūsų ataskaita 7 .

Nors OFT vystymosi metu galimas EndMT / EMT sutrikimas signalizavimu gali paveikti EndMT / EMT, BAV paveldėjimas su NOTCH1 mutacija, tvirtų įrodymų apie BAV ryšį su TGFβ mutacijomis nebuvimas ir čia aprašyti rezultatai kartu reiškia, kad lygiagretus NOTCH / VEGF kelių reguliavimo panaikinimas, o ne TGFβ pagrįstas procesas, gali būti aktualesnis aneurizmos vystymuisi BAV, remiantis mūsų neseniai paskelbtais stebėjimais42. Iš tikrųjų buvo pranešta apie NOTCH suaktyvinimą prieš TFGβ, vykstant širdies vystymuisi ir onkogeninei transformacijai 43, kurie turi bendrus molekulinius bruožus su EndMT / EMT.

Metodai

Klinikiniai mėginiai

Kylančios aortos ir vidinės šlaunies arterijos biopsijos buvo gautos iš ASAP biobanko. Išsamų tiriamosios populiacijos aprašymą galima rasti kitur 44 . Trumpai, pacientams buvo atlikta pasirenkama atvirosios širdies operacija Švedijos Karolinska universitetinėje ligoninėje dėl aortos vožtuvo ir (arba) kylančios aortos ligos. Pacientai buvo klasifikuojami pagal aortos vožtuvo susiaurėjimą ir išsiplėtimą (aortos skersmuo> 45 mm ir <40 mm buvo klasifikuojami kaip atitinkamai išsiplėtę (D) ir neišplečiami (ND)). Dėl nefunkcionuojančių vožtuvų pacientai, kuriems nebuvo išsiplėtę, buvo operuojami. Neįtraukti pacientai, sergantys sindrominėmis aortos patologijomis, dissekcija ir (arba) reikšminga vainikinių arterijų liga. Tyrimą patvirtino Žmogaus tyrimų etikos komitetas Karolinskos institute (paraiškos numeris 2006 / 784-31 / 1), o metodai buvo atlikti laikantis atitinkamų gairių. Remiantis Helsinkio deklaracija, buvo gautas visų pacientų rašytinis sutikimas.

Biopsijos buvo paimtos iš kylančiosios aortos priekinės dalies, keliais cm virš aortos vožtuvo, ir iš vidinės šlaunies arterijos proksimalinės dalies. Vidinė šlaunies arterija buvo naudojama siekiant kontroliuoti BAV sukeliamus srauto sutrikimus, taip pat galimus genetinius pakitimus, kurie galėjo būti atsekti induose, išskyrus aortą. Aortos sienos intima-media buvo atskirtos nuo adventicijos. Dėl mažo neišplatintos biopsijos, BAV-ND = 62 ir TAV-ND = 54 buvo atlikti atsitiktinai parinkti mėginiai proteominei, RNR analizei, imunohistochemijai, imunofluorescencijai, elektronų mikroskopijai ir Western blot tyrimui atlikti. aorta buvo atlikta N = 6 BAV ir N = 5 TAV. Pacientų, kuriems taikoma baltymų, RNR analizė ir imunohistochemija / fluorescencija, charakteristikos pateiktos 1a – c papildomoje lentelėje.

Baltymų mėginių HiRIEF ir LC-MS / MS

Bendras baltymas buvo išgautas iš 21 paciento (5 BAV-ND, 5 TAV-ND, 6 BAV-D ir 5 TAV-D) intimedijos sluoksnio. Mes panaudojome skysčių chromatografijos - masės spektrometrijos (LC-MS / MS) - metodą, pagrįstą didelės skiriamosios gebos izoelektriniu fokusavimu (HiRIEF) ir išankstinį frakcionavimą peptido lygyje dviem skirtingais pH intervalais, 3, 7–4, 9 ir 4, 00–4, 25 9 . Visų MS / MS spektrų buvo ieškoma pagal „Sequest“ ir apdorota naudojant „Percolator“ pagal programinės įrangos platformą „Proteome Discoverer 1.4“, atsižvelgiant į žmogaus šveicaro pogrupį, įskaitant kanoninius ir izoforminius įrašus, 2015-12 versija (42080 sekos, iš uniprot.org). Buvo panaudotas 1% FDR peptidų lygyje. Vieno baltymo peptidas buvo laikomas pakankamu baltymų identifikavimui. Kiekybinis įvertinimas buvo atliktas naudojant izobarines žymes santykiniam ir absoliučiajam kiekiui nustatyti (iTRAQ, ABsciex). 21 proteomikai naudojamas pavyzdys buvo sudėtas į tris „iTRAQ8plex“ rinkinius, kiekviename rinkinyje buvo 7 mėginiai ir vienas vidinis standartas (paruoštas sujungus visų 21 mėginio peptidus), kurie buvo naudojami kaip vardiklis. „iTRAQ“ reporterio jonų kiekybinis ir santykinis skaičiavimas buvo atliktas naudojant „Proteome Discoverer“ modulį „Reporter ionons Quantifier“. Kiekybinė kiekvieno paciento baltymo vertė buvo apskaičiuota kaip PSM (peptidų spektro atitikties) santykio, priskiriamo tam konkrečiam baltymui, mediana. Gauti santykiai buvo toliau normalizuojami sutelkiant kiekvieno mėginio vidurkį.

Masinės spektrometrijos proteomikos duomenys buvo perduoti „ProteomeXchange Consortium“ per PRIDE partnerių saugyklą su duomenų rinkinio identifikatoriumi PXD003702 ir juos galima rasti apsilankant adresu //www.ebi.ac.uk/pride/archive/login. Vartotojo vardas: Slaptažodis: EhAG6nMr).

Imunohistochemija (IHC)

Buvo tiriama aortos ir vidinių krūtinės arterijų lokalizacija ir baltymų ekspresija. Deparafinuoti skyriai buvo apdoroti DIVA tirpalu arba be jo prieš pirminius antikūnus (2 papildoma lentelė).

Western blot analizė

Manijos Fringe (MNFG) ir miozino lengvosios grandinės kinazės (MYLK) ekspresijos lygis buvo tiriamas baltymų lizatuose iš neišplatintų aortų Western Blot būdu. Buvo naudojami anti-MNFG ir anti-MYLK monokloniniai antikūnai bei krienų peroksidaze pažymėti antriniai antikūnai.

Imunofluorescencija

Acetonu fiksuotos keturių BAV ir TAV neišplatintų aortų kriosekcijos buvo inkubuotos su triušio anti-VE-kadherinu 4 ° C temperatūroje per naktį, po to 1 valandą - su AlexaFluor 594 pažymėtu ožkos anti-triušio IgG. Skyriai buvo inkubuojami per naktį su pelių antiklatrinu, po to - su AlexaFluor 488 pažymėtu ožkos anti-pelės IgG. Branduoliai buvo dažomi DAPI. Antikūnų specifiškumas buvo patvirtintas inkubuojant su izotipu suderintu kontroliniu IgG. Vaizdai buvo gauti naudojant Zeiss LSM700 konfokalinį lazerinį mikroskopą, naudojant x40 vandens objektyvą, 1, 2 NA. Kiekvieną atvaizdą sudarė Z-pluoštas nuo 15 iki 20 optinių pjūvių, paimtų 0, 3 μm intervalu.

Perdavimo elektronų mikroskopija (TEM)

Iš BAV ir TAV neišplatinti ir išsiplėtę aortos mėginiai buvo fiksuoti 2% glutaraldehidu + 1% paraformaldehidu. Itin ploni pjūviai (apytiksliai 50–60 nm) buvo supjaustyti „Leica EM UC 6“ ir kontrastuojami uranilacetatu, po to švino citratu ir ištirti Tecnai 12 Spirit Bio TWIN perdavimo elektronų mikroskopu, esant 100 kV. Skaitmeniniai vaizdai buvo daromi naudojant „Veleta“ kamerą.

Statistinė analizė

Baltymų ekspresijai analizuoti buvo naudojama pagrindinių komponentų analizė (PCA) ir latentinių struktūrų diferencialinės analizės ortogonaliosios projekcijos (OPLS-DA) (programinė įranga „Simca P + 14 × 64“). Daugiamačių modelių kokybės parametrai parodyti 3 papildomoje lentelėje. Kiekybiškai išreikštų baltymų reikšmingumas buvo analizuotas naudojant apkrovas OPLS-DA modelyje, įskaitant domkratų peilio pasitikėjimo lygius, gautus atlikus kryžminį apkrovų įteisinimą, ir apskaičiuotus kaip [absoliutus apkrovų vertės] - [absoliučios kėglio peilio pasikliovimo intervalų vertės]. IHC ir WB baltymų raiškos skirtumai buvo įvertinti Mann-Whitney U-testu (GraphPad Prism 5). Diferencialinė genų išraiška anksčiau buvo paskelbta mūsų 7, o čia pateikiami pakoreguoti pagal amžių duomenys. Trumpai tariant, Affymetrix GeneChip Human Exon 1.0 ST masyvai buvo išanalizuoti naudojant studento t-testą, darant prielaidą, kad dispersija yra nevienoda. Masyvai buvo patvirtinti qRT-PGR 11 genų 7 . Duomenys išreiškiami kaip vidutinis ir procentais išreikštas paviršiaus plotas ± SD atitinkamai genų ir baltymų ekspresijai. P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu. Išradingumo kelio analizė, KEGG kelio ir Hallmark analizė (GSEA / MSigDB v5.0) 45 buvo naudojamos tiriant diferencijuotai išreikštus baltymus 45 . Šie baltymai buvo atrinkti neišsiplėtusiuose arba išplėstuosiuose mėginiuose ir buvo surinkti į baltymų ir baltymų sąveikos duomenų bazę (Žmogaus baltymų nuorodų duomenų bazė 46. Gauta sąveika parodyta 1 pav., S2 ir S3 pav.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Maleki, S. et al . Intiminių ląstelių mezenchiminė būsena gali paaiškinti didesnį polinkį į kylančią aortos aneurizmą bicuspidiniuose aortos vožtuvuose. Mokslas. Rep. 6, 35712; „doi“: 10.1038 / srep35712 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.