Mezenchiminės kamieninės ląstelės palengvina eksperimentinį reumatoidinį artritą per mikroreguliuotą iκb ekspresiją | mokslinės ataskaitos

Mezenchiminės kamieninės ląstelės palengvina eksperimentinį reumatoidinį artritą per mikroreguliuotą iκb ekspresiją | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių biologija
  • Reumatoidinis artritas

Anotacija

Ankstesni tyrimai parodė, kad mezenchiminių kamieninių ląstelių (MSC) transplantacija sumažina pelių kolageno sukelto artrito (CIA) sunkumą, kuris yra žmogaus reumatoidinio artrito (RA) pavyzdys. Tačiau pagrindiniai molekuliniai mechanizmai nėra tiksliai apibrėžti. Čia mes parodėme, kad MSC transplantacija sumažino NF-κB signalizacijos aktyvumą ir sumažino mikroRNR-548e (miR-548e) lygį jungtiniame CIA pelių audinyje, neva aktyvuodama transformuojančio augimo faktoriaus β receptorių signalizaciją. Bioinformatikos analizė atskleidė, kad miR-548e slopino NF-κB inhibitoriaus IκB baltymų transliaciją, jungdamasis prie IκB mRNR 3′-UTR. MSC, persodinti kartu su adeno-virusu (AAV), turinčiu miR-548e, panaikino terapinį MSC poveikį CIA. Kita vertus, AAV, gavusio miR-548e (as-miR-548e) antisenzę, transplantacija iš dalies pamėgdžiojo MSC transplantacijos poveikį CIA. Šie duomenys kartu rodo, kad MSC transplantacija gali iš dalies palengvinti eksperimentinį RA, slopindama miR-548e tarpininkaujamą IκB slopinimą.

Įvadas

Reumatoidinis artritas (RA) yra lėtinė uždegiminė liga, kuri pirmiausia pažeidžia sąnarius ir sukelia sąnarių sunaikinimą bei su tuo susijusį skausmą, sustingimą ir sinovitą 1, 2, 3 . RA ne tik sukelia įgimtos, bet ir adaptyvios imuninės sistemos 1, 2, 3, 4 sutrikimą, taip pat yra susijęs su serumo autoantikūnų prieš savaiminius baltymus ir 5, 6, 7, 8 reumatoidiniais veiksniais buvimu. Tačiau tikslūs šio RA fenotipo sukėlėjai lieka nežinomi. Taigi, norint suprasti molekulinius mechanizmus, pagrindžiančius RA patogenezę, reikia sukurti žmonėms tinkamus RA modelius.

Kolageno sukeltas artritas (CIA) turi daug panašumų su žmogaus RA 9, 10, 11, 12, 13 . CIA pirmiausia buvo taikoma graužikams, įskaitant žiurkes ir peles 14, 15 . LKA išsivystymo jautrumas priklauso nuo gyvūnų atmainų. DBA / 1J pelės yra plačiausiai naudojamos CŽV modelyje 16, 17, 18, 19 . Klinikiniai požymiai, panašūs į žmogaus RA, paprastai atsiranda DBA / 1J pelėms praėjus 21–25 dienoms po pradinės inokuliacijos ir yra siejami su B ir T limfocitų atsakais gaminant II tipo kolageno antikūnus ir kolageno specifinius T ląstelės 16, 17, 18, 19 . Tikimasi, kad ligos sunkumas bus didžiausias maždaug 35 dieną, po kurios DBA / 1J pelėms bus remisija, pasižyminti padidėjusia IL-10 koncentracija serume ir transformuojančiu augimo faktoriu β (TGFβ) bei vėlesniu priešuždegiminių citokinų sumažėjimu: interleukinu (IL). ) -1β, naviko nekrozės faktorius (TNF) -α ir IL-6 20, 21, .

Branduolinis faktorius-KB (NF-KB) buvo gerai žinomas kaip pagrindinis uždegimo reguliatorius RA 23, 24, 25 . Tačiau naujausi eksperimentai parodė platų NF-κB dalyvavimą kituose RA patologijos aspektuose, įskaitant T helper 1 reakcijų vystymąsi, abejotiną apoptozę ir RA susijusių fibroblastų tipo sinovijos ląstelių dauginimąsi 26 . NF-κB yra dimerinių transkripcijos veiksnių grupė, susidedanti iš baltymų Rel šeimos, kuri apima RelA (p65), c-Rel, RelB, NF-κB1 (p50) ir NF-κB2 (p52) 23, 24, 25 . Gausiausia forma aktyvintose ląstelėse yra RelA / NF-κB1 (p65 / p50) heterodimeras 23, 24, 25 . NF-κB yra latentinės formos citoplazmoje, tačiau stimuliuojant persikelia į branduolį. 23, 24, 25 . Citoplazminis NF-κB susilaikymas atsiranda dėl jo sąveikos su slopinančiais baltymais, vadinamais IκB 23, 24, 25 . Nepakankamas IκB lemia NF-κB atsiskyrimą nuo IκB, o atsiskyręs NF-κB vėliau patenka į branduolį, kad būtų galima inicijuoti genų transkripciją 23, 24, 25 . Pažymėtina, kad graužikų tyrimais RA gydymui buvo naudojami specifiniai NF-κB inhibitoriai ir buvo gauti daug žadančių rezultatų 23, 24, 25 .

Mesenchiminės kamieninės ląstelės (MSC) yra daugiapotencialės progenitorinės ląstelės, galinčios diferencijuotis į mezenchiminės kilmės audinius, įskaitant kaulą, kremzlę ir riebalinį audinį 27, 28, 29 . Keli tyrimai pranešė apie alogeninės arba ksenogeninės MSC transplantacijos terapinį poveikį CIA pelėms. 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 . Tačiau šių efektų molekulinė bazė nėra visiškai suprantama.

Čia mes parodėme, kad MSC persodinimas sumažino NF-κB signalizacijos aktyvumą ir sumažino mikroRNR-548e (miR-548e) lygį jungtiniame CIA pelių audinyje, neva aktyvuodamas transformaciją sukeliančius augimo faktoriaus β receptorių signalus. Bioinformatikos analizė atskleidė, kad miR-548e slopino NF-κB inhibitoriaus IκB baltymų transliaciją, jungdamasis prie IκB mRNR 3′-UTR. MSC, persodinti kartu su adeno-virusu (AAV), turinčiu miR-548e, panaikino terapinį MSC poveikį CIA. Kita vertus, AAV, gavusio miR-548e (as-miR-548e) antisenzę, transplantacija iš dalies pamėgdžiojo MSC transplantacijos poveikį CIA. Šie duomenys kartu rodo, kad MSC transplantacija gali palengvinti eksperimentinį RA, iš dalies slopindama miR-548e tarpininkaujamą IκB slopinimą.

Rezultatai

Pelių MSC paruošimas

Mes ištyrėme molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas MSC terapinis poveikis CIA. Tuo tikslu mes išskyrėme pelių MSC iš kaulų čiulpų (1 pav. A) ir patvirtinome pasirinktos klono MSC savybes diferenciacijos tyrimu (1 pav. B – D).

Image

( A ) Pelių kaulų čiulpų gautos MSC kultūros. ( B - D ) Atrinktų MSC klonų diferenciacijos savybės buvo ištirtos pagal Von kossa dažymą, siekiant įvertinti osteogeninę indukciją ( B ), Aliejaus raudonojo dažymą, siekiant įvertinti adipogeninę indukciją ( C ), ir Alciano mėlyną dažymą, siekiant įvertinti chondrogenetinę indukciją ( D ). Mastelio juostos yra 50 μm.

Visas dydis

Terapinis MSC poveikis CIA pelėms

Eksperimentai, skirti įvertinti MSC poveikį CIA, parodyti schematiškai (2A pav.). Remdamiesi letenų storio (2B pav.), Klinikinio artrito (2C pav.) Ir histologinio artrito (2D pav.) Analize, mes nustatėme, kad MSC transplantacija žymiai sumažino artrito sunkumą. Be to, persodinus MSC, sumažėjo IL-1β (2E pav.), IL-6 (2F pav.) Ir TNF-α (2G pav.) Baltymų kiekis ir padidėjo IL-10 (2H pav.) Bei TGFβ1 (2 pav. 2I pav.) CIA pelių uždegiminiuose sąnariuose. Šie duomenys patvirtina, kad MSC transplantacija turi terapinį poveikį pelių CIA.

Image

( A ) MSC poveikio CIA įvertinimo eksperimentų parodymo schema. Fiziologinis tirpalas: CŽV sukeltas, persodintas fiziologiniu tirpalu. MSC: CŽV sukeltas, persodintas kartu su MSC. ( B ) Kojos storis. ( C ) visų galūnių klinikinio artrito balas. ( D ) Histologinio artrito balas. ( D ) ELISA IL-1β, IL-6, TNF-α, IL-10 ir TGFβ1 lygiams uždegiminiuose CIA pelių sąnariuose, gydomuose MSC (MSC) arba be MSC (fiziologiniame tirpale). * p <0, 05. N = 5.

Visas dydis

MSC sumažina CIA sukeltą NF-κB aktyvumo padidėjimą sinoviniuose fibroblastuose

Sinoviniai fibroblastai vaidina pagrindinį vaidmenį vystant CŽV. Taigi, norėdami ištirti NF-κB signalizacijos pokyčius, gautus atlikus MSC transplantaciją CIA pelėms, išanalizavome NF-κB ir IκB baltymų lygį sinoviniuose fibroblastuose, išskirtuose iš pelių sąnarių. Mes nustatėme, kad MSC transplantacija sumažino branduolinį NF-KB baltymą (p65, 3 pav. A) ir padidino citoplazminį IκB baltymą (3 pav. B) sinoviniuose fibroblastuose. Tačiau MSK transplantacija nepakeitė IRB mRNR lygio sinoviniuose fibroblastuose (3C pav.). Šie duomenys rodo, kad po transkripcijos gali būti kontroliuojama IκB atliekant MSC transplantaciją.

Image

( A, B ) Branduoliniai NF-κB (p65) lygiai ( A ) ir citoplazminiai IκB lygiai ( B ) Cino pelių, gydomų MSC (MSC) arba be MSC (fiziologinio tirpalo), sinoviniuose fibroblastuose. ( C ) IκB mRNR lygis sinoviniuose fibroblastuose. * p <0, 05. NS: nereikšmingas. N = 5.

Visas dydis

„MiR-548e“ nukreipia IκB mRNR 3′-UTR, kad slopintų jo transliaciją sinoviniuose fibroblastuose

Tada atlikome bioinformatinę analizę, kad nustatytume miRNR, jungiančio IκB mRNR 3′-UTR, IKB taikinių seką. Iš šių kandidatų mes konkrečiai nustatėme, kad miR-548e prisijungė prie IκB mRNR 3′-UTR 50–56 - oje bazinėje vietoje (4A pav.), O miR-548e lygis sinoviniuose fibroblastuose žymiai padidėjo po CIA ( palyginti su negydytais), tačiau žymiai sumažėjo atlikus MSC transplantaciją (4B pav.). Norėdami nustatyti, ar miR-548e jungiasi su IκB mRNR, mes iš sveiko žmogaus išskyrėme sinovinius fibroblastus ir ląstelėms pernešėme miR-548e arba antisense miR-548e (as-miR-548e). Sinoviniai fibroblastai taip pat buvo transfekuoti kaip kontrolinė nulio seka. MiR-548e lygio moduliavimas šiose ląstelėse buvo patvirtintas RT-qPCR (4 pav. C). Tada šios miR-548e modifikuotos ląstelės buvo transfekuotos 1 μg IκB-3′-UTR luciferazės reporterio plazmidės. Mes nustatėme, kad luciferazės aktyvumas ląstelėse, kurių organizme trūksta miR-548e, buvo žymiai didesnis nei kontroliniame, tuo tarpu luciferazės aktyvumas miR-548e ekspresijos ląstelėse buvo žymiai mažesnis nei kontroliniame (4 pav. D). Šie duomenys rodo, kad miR-548e nukreipia IκB mRNR 3′-UTR, kad slopintų jo baltymo transliaciją.

Image

( A ) IκB taikinių sekos bioinformatikos analizė, parodanti, kad miR-548e jungiasi prie IκB mRNR 3′-UTR 50–56 bazinėje vietoje. ( B ) miR-548e lygis sinoviniuose fibroblastuose žymiai padidėjo po CIA (palyginti su negydytais), bet po to žymiai sumažėjo po MSC transplantacijos (MSC). ( C ) Žmogaus sinoviniai fibroblastai buvo transfekuoti miR-548e arba antisense miR-548e (as-miR-548e). Sinoviniai fibroblastai taip pat buvo transfekuoti kaip kontrolinė nulio seka. MiR-548e lygio moduliavimas sinoviniuose fibroblastuose buvo patvirtintas RT-qPCR. ( D ) „miR-548e“ modifikuoti sinoviniai fibroblastai buvo transfekuoti 1 μg IκB-3 ′ UTR luciferazės reporterio plazmidės ir ištirti dėl luciferazės aktyvumo. * p <0, 05. N = 5.

Visas dydis

MSC gali slopinti miR-548e sinoviniuose fibroblastuose per TGFβ receptorių signalizaciją

Kadangi TGFβ1 yra gerai žinomas augimo faktorius, kurį gamina ir išskiria MSC, ir kadangi po MSC transplantacijos CG ir pelių sąnariuose TGFβ1 kiekis žymiai padidėja, mes hipotezavome, kad MSC gali slopinti miR-548e lygį sinoviniuose fibroblastuose per TGFβ receptorių signalizaciją. . Šiai hipotezei patikrinti mes davėme kultivuojamus pelių sinovijos fibroblastus 10 μmol / l TGFβ1 su TGFβ receptoriaus inhibitoriumi SB431542 arba be jo (10 μmol / l). SB431542 slopina TGFβ receptorių signalizaciją slopindamas TGFβ 1 receptoriaus fosforilinimą. Mes nustatėme, kad TGFβ1 sumažino miR-548e lygį sinoviniuose fibroblastuose. Šis poveikis buvo panaikintas SB431542 (5 pav. A). Be to, TGFβ1 padidino citoplazminio IBB baltymo lygį ir sumažino branduolinių NF-κB baltymų kiekį - poveikį, kurį taip pat panaikino SB431542 (5B pav., C). Šie duomenys rodo, kad MSC gali slopinti miR-548e sinoviniuose fibroblastuose per TGFβ receptorių signalizaciją.

Image

Mes davėme kultivuojamus pelių sinovinius fibroblastus 10 μmol / l TGFβ1 su TGFβ receptoriaus inhibitoriumi SB431542 arba be jo (10 μmol / l). ( A ) TGFβ1 sumažino miR-548e lygį sinoviniuose fibroblastuose, kuriuos panaikino SB431542. ( B, C ) TGFβ1 sumažino branduolinį NF-κB baltymą ( B ) ir padidino citoplazminį IκB baltymą ( C ), kuriuos taip pat panaikino SB431542. * p <0, 05. N = 5.

Visas dydis

Per didelis miR-548e ekspresija panaikina terapinį MSC poveikį CIA

Toliau mes kartu su MSC persodinome AAV-miR-548e ir ištyrėme poveikį CIA pelėms (6A pav.). Pirmiausia buvo patvirtintas AAV-miR-548e poveikis miR-548e lygiui sinoviniuose fibroblastuose (6 pav. B). Mes nustatėme, kad per didelis miR-548e ekspresija sinoviniuose fibroblastuose panaikino MSC terapinį poveikį CIA, remdamasis letenų storio (6 pav. C), klinikinio artrito (6 pav. D) ir histologinio artrito įvertinimu (6 pav. E) analize.

Image

( A ) Mes kartu su MSC persodinome AAV-miR-548e virusus ir ištyrėme poveikį MSC transplantacijai CIA pelėms. ( B ) RT-qPCR ant sąnario miR-548e. ( C - F ) Dėl per didelio miR-548e ekspresijos panaikintas MSC terapinis poveikis CIA, atsižvelgiant į letenų storį ( C ), visų galūnių klinikinio artrito balus ( D ) ir histologinio artrito balus ( E ). * p <0, 05. NS: nereikšmingas. N = 5.

Visas dydis

Vien miR-548e slopinimas imituoja terapinį MSC poveikį CIA

Galiausiai mes CAV pelėms suleidome AAV-as-miR-548e virusus ir ištyrėme jų poveikį CIA sunkumui (7A pav.). Pirmiausia buvo patvirtintas AAV-as-miR-548e poveikis miR-548e lygiams sinoviniuose fibroblastuose (7 pav. B). Mes nustatėme, kad vien as-miR-548e išraiška, nereikalaujant MSC transplantacijos, imitavo terapinį MSC poveikį CIA, remdamasi letenų storio (7 pav. C), klinikinio artrito įvertinimu (7 pav. D) ir histologiniais tyrimais. artrito balas (7E pav.). Šie duomenys kartu rodo, kad MSC transplantacija gali palengvinti eksperimentinį RA slopindama miR-548e tarpininkaujamą IκB slopinimą.

Image

( A ) Mes CAV pelėms sušvirkštėme AAV-as-miR-548e virusus ir ištyrėme jų poveikį CŽV sunkumui. ( B ) RT-qPCR ant sąnario miR-548e. ( C - F ) Vien tik as-miR-548e išraiška, nereikalaujant MSC persodinimo, imitavo MSC terapinį poveikį CIA, atlikdama letenų storį ( C ), klinikinį artrito balą visoms galūnėms ( D ) ir histologinio artrito balą ( E ) * p <0, 05. NS: nereikšmingas. N = 5.

Visas dydis

Diskusija

Keli tyrimai pranešė apie alogeninės arba ksenogeninės MSC transplantacijos terapinį poveikį CIA pelėms. 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 40, 41 . Nepaisant to, pagrindiniai mechanizmai yra mažai suprantami. Iki šiol daugiausia dėmesio buvo skiriama MSC imunoreguliacinio poveikio tyrimui. Nei viename tyrime nenustatyta, kad MSC reguliuotų NF-κB. Iš tiesų, žinoma, kad NF-κB yra pagrindinis RA patogenezės žaidėjas ir jis yra pagrindinis prouždegiminių tarpininkų gamyboje uždegtoje sinovijoje. Tačiau molekulinis NF-κB signalo reguliavimas iš esmės nežinomas.

Šiame tyrime pirmiausia patvirtinome terapinį MSC poveikį CIA pelėms, naudodamiesi bendrai taikomais kiekybinio įvertinimo metodais, įskaitant letenų storį, klinikinio artrito balą, histologinio artrito balą ir priešuždegiminių citokinų, tokių kaip IL-1β, IL-6, moduliavimą. TNF-α, IL-10 ir TGFβ1. Tarp šių citokinų, kaip žinoma, IL-1β, IL-6 ir TNF-α skatina imuninį atsaką RA, tuo tarpu IL-10 ir TGFβ1 poveikis imuniniam atsakui RA paprastai yra neigiamas. MSC poveikis šiems citokinams palaiko sumažintą imuninę reakciją po MSC transplantacijos.

Toliau mes ištyrėme MSC poveikį NF-κB aktyvumui šiame modelyje. Mes išanalizavome pagrindinio NF-κB komponento, p65, taip pat pagrindinio inhibitoriaus IκB lygį sinoviniuose fibroblastuose. Mes nustatėme, kad MSC transplantacija žymiai sumažino branduolinį p65 lygį sinoviniuose fibroblastuose, o tai rodo, kad NF-κB aktyvumas sinoviniuose fibroblastuose žymiai sumažėja atlikus MSC transplantaciją. Kadangi NF-κB veiklą reguliuoja daugybė veiksnių, o IκB yra pagrindinis tarp šių veiksnių, mes ištyrėme IκB lygius. Mūsų atradimas baltymų, bet ne mRNR pokyčių IκB srityje, atliktas MSC, leido sukelti hipotezę, kad MSC gali modifikuoti IκB kontroliuodamos po transkripcijos.

Kadangi miRNR vaidina pagrindinį vaidmenį atliekant genų transliacijos kontrolę, mes patikrinome IκB taikymą miRNR srityje ir specialiai nustatėme, kad miR-548e lygis sinoviniuose fibroblastuose buvo pakeistas atliekant MSC transplantaciją. MSC reikšmingai nepakeitė kitų IκB, nukreiptų į miRNR, lygio. Naudodami sinovinius fibroblastus, mes nustatėme, kad miR-548e nukreiptas į IκB mRNR 3′-UTR, kad slopintų jo transliaciją. Be to, užginčydami pavienius sinovijos fibroblastus su TGFβ1 su jo receptoriaus inhibitoriumi 42 arba be jo, mes nustatėme, kad vien tik TGFβ1 mėgdžiojo MSC poveikį stebint miR-548e ir NF-κB / IκB lygio pokyčius sinoviniuose fibroblastuose. Šie duomenys rodo modelį, kuriame MSC gamina ir išskiria TGFβ1, kuris aktyvuoja TGFβ receptorius sinoviniuose fibroblastuose 43, sukeldamas miR-548e slopinimą, o vėliau padidėja IκB lygis ir sumažėja NF-κB lygis. Ateityje šis modelis gali būti dar labiau patvirtintas naudojant fibroblastų specifines indukuojamas TGFβ receptorių peles.

Nors sinoviniai fibroblastai yra pagrindinis MSC taikinys, MSC taip pat gali reguliuoti limfocitų, pvz., T reguliarių ląstelių, proliferaciją ir diferenciaciją. Šie aspektai gali būti toliau analizuojami būsimoje strategijoje.

Galiausiai mes atlikome dar du bandymus in vivo, kad patvirtintume miR-548e svarbą terapiniam MSC poveikiui CIA pelėms. Pirma, miR-548e ekspresija MSC įskiepytų CIA pelių sąnariuose, priešingai, nei MSC slopino miR-548e sinoviniuose fibroblastuose, panaikino visą MSC terapinį poveikį CIA sunkumui. Antra, vien as-miR-548e ekspresija CIA pelėms, kurios sumažino miR-548e sinoviniuose fibroblastuose, mėgdžiojo MSC transplantacijos padarinius, neprireikiant MSC. Šie duomenys tvirtai rodo, kad MSC transplantacija bent iš dalies gali palengvinti eksperimentinį RA, slopindama miR-548e tarpininkaujamą IκB slopinimą. Dabartiniame tyrime tarpininkaudami miRNR mes naudojome AAV, o ne adenovirusą, kuris turėtų labai ribotą poveikį šeimininko imuninei sistemai ( 44, 45, 46, 47) .

Kiek mums yra žinoma, tai yra pirmasis tyrimas, kuris parodė, kad terapinis MSC poveikis CIA pelėms iš dalies yra susijęs su miRNR kontroliuojamu NF-κB signalo slopinimu. Neseniai Liu ir kt . parodė, kad miR-937 slopino Brn-4 mRNR transliaciją, prisijungdamas prie Brn-4 mRNR 3′-UTR MSC. Be to, as-miR-937 ekspresuojančių MSC persodinimas žymiai sumažino Abeta nusėdimą, padidino BDNF lygį ir žymiai pagerino pelių išvaizdą Alzheimerio ligos modelyje 48 . Analagoziškai mes modifikavome MSC mikroRNR, kad pagerintume jų terapinį poveikį RA modelyje.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.