Metabolinė ląstelių diferenciacijos trajektorija plonojoje žarnoje, atliekant fazorinės fluorescencijos mikroskopiją per visą ilgį | mokslinės ataskaitos

Metabolinė ląstelių diferenciacijos trajektorija plonojoje žarnoje, atliekant fazorinės fluorescencijos mikroskopiją per visą ilgį | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biofizika
  • Vystymosi biologija
  • Diferenciacija
  • Kamieninės ląstelės

Anotacija

Trūksta greitų ir aukštos skiriamosios gebos metodų, kaip išmatuoti atskirų ląstelių metabolizmą jų gimtojoje aplinkoje. Čia mes sukūrėme paprastą, neinvazinį ir jautrų metodą, skirtą gyvų audinių pavienių ląstelių metaboliniam fenotipui išmatuoti. Naudodami NADH kaip optinį biomarkerį ir fazinį požiūrį į visą gyvenimą trunkančią fluorescencinę mikroskopiją (FLIM), nustatome ląstelių metabolinius pirštų atspaudus, susijusius su skirtingais oksidacinio fosforilinimo ir glikolizės greičiais. Pirmą kartą mes išmatuojame trimatį metabolinio gradiento rodymą plonosios žarnos (SI) epitelyje, kuris yra glaudžiai susijęs su epitelio ląstelių proliferacija, diferenciacija ir Wnt gradientu. Aukščiausias laisvojo / surištojo NADH santykis matuojamas kriptos centre labai proliferatyvių kamieninių ląstelių srityje, tai rodo aukštą glikolizės lygį. Pirmą kartą nepažeistų gyvų kriptų pelių plonosios žarnos kamieninės ląstelės atpažįstamos audinyje pagal jų metabolinį pirštų atspaudą.

Įvadas

Nors pastaraisiais dešimtmečiais buvo sukurtos kelios metodikos, skirtos išmatuoti fiziologinius procesus audiniuose ir genų ekspresiją vienoje ląstelėje, pagrindiniu trūkumu išlieka tvirtų ir neinvazinių metodų nebuvimas, užtikrinantis greitą kiekybinį atskirų ląstelių metabolizmo rodymą natūraliojoje mikroaplinkoje. gyvojo audinio.

Metabolinis aktyvumas proliferuojančiose ląstelėse, tokiose kaip vėžio ląstelės ir kamieninės ląstelės, iš esmės skiriasi nuo nepolituojančių ląstelių. Warburgas pirmiausia pastebėjo, kad dauguma vėžio ląstelių fermentuoja gliukozę į laktatą, nepaisant deguonies 1 . Šis poveikis, žinomas kaip aerobinė glikolizė, palaiko efektyvią makromolekulinių komponentų, reikalingų greitai dalijamosioms ląstelėms, sintezę. Dauguma proliferacinių ląstelių priklauso nuo aerobinės glikolizės, priešingai nei normalios diferencijuotos ląstelės, kurios pirmiausia priklauso nuo oksidacinio fosforilinimo 2 . Platinimo metu didelis glikolitinio srauto padidėjimas greitai sukuria citozolinį ATP, todėl aukštas ATP / ADP ir NADH / NAD + santykis 2, 3, 4 .

Metabolinis kofermento nikotinamido adenino dinukleotidas (NADH) yra pagrindinis elektronų akceptorius glikolizėje ir elektronų donoras oksidacinio fosforilinimo metu. NADH visur šis koenzimas daro vieną iš naudingiausių ir informatyviausių vidinių biologinių žymenų metabolizmui, mitochondrijų funkcijai, oksidaciniam stresui, senėjimui ir apoptozei gyvosiose ląstelėse ir audiniuose 5 . Nuo tada, kai buvo pradėtas novatoriškas „Britton Chance 6“ darbas, metabolinis NADH lygio ir santykinio redukuoto bei oksiduoto NADH kiekio vaizdavimas yra plačiai naudojamas metabolizmo pokyčiams stebėti. Cheminiai metodai, kurie daro išvadą apie NADH: NAD + santykiai netiesiogiai iš redokso porų, tokių kaip laktatas ir piruvatas 7, koncentracijos, reikalauja naudoti ląstelių ekstraktus ir yra nesuderinami su nepaliestų gyvų ląstelių ir audinių dinamikos tyrimais. Vietoj to, optiniai NADH autofluorescencijos rodmenys leidžia realiuoju laiku ir neinvaziškai stebėti ląstelės metabolinę būseną (pato) fiziologinių pokyčių metu ir pranešti apie oksidacinio fosforilinimo ir glikolizės lygius. Stebint NADH fluorescencijos intensyvumą, gaunama naudingos informacijos apie NADH / NAD + santykį 8, nes NADH praranda fluorescenciją oksidacijos metu į NAD +. Tačiau pagal NADH / NAD + matavimus, susijusius su intensyvumu, yra artefaktų dėl nevienalytės fluoroforų koncentracijos ir skirtingo laisvojo ir surištojo pavidalo NADH kvantinio derlingumo. Šią problemą galima išspręsti naudojant visą gyvenimą trunkančią fluorescencinę vizualizaciją (FLIM), nes gyvenimo trukmė yra nuo koncentracijos nepriklausanti optinė reakcija ir ją minimaliai veikia audinių absorbcija ir išsibarstymas bei sužadinimo intensyvumo svyravimas. FLIM praneša apie fluoroforo mikroaplinką ir gali diferencijuoti laisvą arba baltymų jungiamą NADH. FLIM ir daugiafotoninio sužadinimo derinys suteikia trimačius NADH gyvenimo vaizdus su ląsteline ir tarpląsteline skiriamąja geba gyvuose audiniuose su minimaliu foto pažeidimu ir fototoksiškumu 9, 10. Tai tampa vertinga metodika ląstelių metabolinėms būsenoms, susijusioms su kancerogeneze, įvertinti. ir ląstelių diferenciacija in vitro 11, 12, 13, 14 ir in vivo 15, 16 . NADH turi arba trumpą, arba ilgą komponentą, priklausomai nuo to, ar jis laisvas, ar prisijungęs prie baltymų. Su baltymais sujungtas NADH pasižymi sudėtiniu daugiaeksponentiniu gyvenimo metu vykstančiu skilimu, kuris buvo susijęs su jo prisijungimu prie skirtingų fermentų, tokių kaip malato dehidrogenazė (MDH) ir laktato dehidrogenazė (LDH) 17 . Yra žinoma, kad metabolitai, susiję su kancerogeneze ir diferenciacija, keičia NADH jungimosi vietas, o fermentinis prisijungimas yra tiesiogiai susijęs su NADH ciklu per energijos gamybos kelią 18 . Pavyzdžiui, Bird et al. 2005 m. Parodė, kad laisvojo ir prie baltymų prisijungusio NADH santykio pokyčiai yra susiję su NADH / NAD + redokso santykiu krūties vėžio ląstelėse 11 . Nors dėl technologinės pažangos laiku išspręsta mikroskopija 19, 20 leidžia atlikti jautresnius matavimus, vienas iš pagrindinių NADH metabolinių vaizdų apribojimų išlieka sudėtingų daugiaeksponentinių NADH gyvenimo trukmės interpretacijų aiškinimas. Tradicinis būdas pritaikyti intensyvumą kiekviename taške su dviem eksponentiais mažėja, jei daroma prielaida, kad „trumpo“ ir „ilgo“ komponentų santykis yra lygus laisvojo ir surištojo NADH santykiui. Šis suderinimas yra klaidinantis, nes laisvas ir prie baltymų prisijungęs NADH turi bendrus eksponentinius komponentus, o į NADH surišimo vietas su skirtingais fermentais negalima atsižvelgti. Neseniai pristatėme fazinį požiūrį į fluorescencinių vaizdų analizę, kuris pateikia nepriekaištingą ir nešališką neapdorotų autofluorescencinių FLIM duomenų 16, 21 atvaizdą. Mes įrodėme, kad fazinis FLIM yra labai jautrus įrankis, skirtas apskaičiuoti vidinių fluoroforų santykinę koncentraciją, neatsižvelgiant į gyvenimo trukmės nuosmukio sudėtingumą, ir leidžia diskriminuoti mažus ląstelių redokso santykio skirtumus 16 .

Šiame darbe mes sukūrėme etiketės neturintį metodą, skirtą neinvaziškai metabolizuoti atskirų ląstelių gyvo audinio fenotipus. Kiekybiškai įvertiname oksidacinio fosforilinimo ir glikolizės greitį atskirose ląstelėse ir susiejame ląstelių metabolinį pirštų atspaudus su jų proliferacijos ir diferenciacijos būsena. Mes apibūdiname natūralaus, gyvo plonojo žarnyno kripto epitelio metabolinį fenotipą, naudodamiesi faziniu požiūriu į FLIM ir laisvojo baltymo jungimosi su NADH biomarkeriu santykiu. Plonoji žarna yra svarbus kamieninių ląstelių biologijos ir vėžio tyrimų modelis, nes epitelio ląstelės dauginasi. Kamieninių ląstelių padėtis ir skaičius yra griežtai reguliuojami, kad būtų palaikoma audinių homeostazė ir būtų išvengta audinių degradacijos ar naviko augimo. Vienas pagrindinių ląstelių proliferacijos, diferenciacijos ir kamieninių ląstelių savarankiško atsinaujinimo žarnyno kriptoje reguliatorių yra Wnt signalinis kelias 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28 . Wnt signalai yra stipriausi kiekvienos kriptos centre, kur Wnt taikinio genas Lgr5 žymi daugiapotencines kamienines ląsteles 29 . Griežtą šių kamieninių ląstelių savaiminio atsinaujinimo ir jų gaminamų progenitorinių ląstelių proliferacijos reguliavimą vėžio ląstelėse paverčia nepaprastai didelis Wnt signalizacijos lygis, sukeliantis piktybinę transformaciją. Konstitutinis Wnt signalizacijos kelio aktyvinimas dažniausiai įvyksta dėl adenomatozinio polipozės coli geno (APC) funkcijų praradimo, o kai šis kritinis įvykis įvyksta Lgr5 + kamieninėse ląstelėse, atsirandantys abejotini proliferacijos ir diferenciacijos modeliai lemia piktybinę transformaciją ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžys 30, 24 .

Nors neseniai atliktas darbas apibūdino vidinį sveikų ir sergančių skrandžio audinių kontrastą 31, mūsų žiniomis, nė viename ankstesniame tyrime nebuvo ištirtas žarnyno audinių metabolizmas per vidinį biomarkerį NADH. Fazinis požiūris į FLIM identifikuoja skirtingus plonojo žarnyno gyvųjų audinių komponentus ir diferencijuoja kripto bazinių epitelio ląstelių (įskaitant Lgr5 + ir Paneth ląsteles) metabolinį aktyvumą nuo galutinai diferencijuotų villus epitelio ląstelių. Mes parodome, kad Lgr5 + kamieninės ląstelės turi unikalų metabolinį pirštų atspaudą; jiems būdingas laisvo / surišto NADH santykis leidžia be etiketės atpažinti ir atskirti juos nuo kaimyninių Paneth ląstelių ir nuo jų diferencijuotų palikuonių. Kartografuodami laisvo / surišto NADH koncentraciją žarnyno epitelyje, mes išmatuojame 3D metabolizmo gradientus nuo kriptos pagrindo iki vilelio galiuko. Pirmą kartą nustatome unikalų proliferatyvių plonosios žarnos kamieninių ląstelių metabolinį pirštų atspaudą ir metabolinę trajektoriją (M-trajektoriją) išilgai kripto-villus ašies, kuri stipriai koreliuoja su Wnt gradientu ir ląstelių proliferacijos bei diferenciacijos lygiu.

Rezultatai

Vidinio kontrasto plonosios žarnos audinyje kilmė

Dviejų fotonų mikroskopija ir „Phasor FLIM“ klasterinė analizė (žr. Metodus ir 16 nuorodą) yra naudojama vizualizuoti ir identifikuoti vidinį plonosios žarnos kontrastą. 1g paveiksle parodyta plonojo žarnyno struktūros schema. Plonoji žarna yra padengta vienu epitelio ląstelių sluoksniu, suskirstytu į kriptas. Kiekvienoje kriptoje kriptos bazėje yra 8–14 kamieninių ląstelių, kurių palikuonys amžinai juda aukštyn ir yra pametami iš villus galiukų. Visi palikuonys atsinaujina kas 4–6 dienas. Kriptos epitelis sėdi ant sudėtingų miofibroblastų, kraujagyslių endotelijos ir imuninių ląstelių, kurios sudaro villus šerdies laprininę propriją, pastolių. 1 paveiksle parodyta, kad skirtingiems plonojo žarnyno audinių skyriams būdingi unikalūs „Phasor FLIM“ parašai, kurie atitinka specifinius vidinius šaltinius. Dviejų fotonų intensyvumo atvaizduose ir FLIM žemėlapiuose, sužadintuose 740 nm ir 880 nm (1a – d pav.), Gautuose kriptos centre (juoda rodyklė 1g paveiksle), yra apvalios kriptos, turinčios epitelio ląsteles. Čia mes naudojame transgenines peles, ekspresuojančias eGFP Lgr5 + kamieninėse ląstelėse žarnyno kriptos bazėse 29 . Atskiros GFP-Lgr5 + kamieninės ląstelės kerta tarp gretimų Paneth ląstelių (1b pav.) Kripto bazėse, laikydamosi jų anksčiau aprašyto modelio 29 . Dviejų fotonų fluorescencijos intensyvumas, sujaudintas 740 nm, pabrėžia NADH kontrastą atskirų epitelio ląstelių apvalioje kriptos bazėje, parodant tarpląstelines detales, tokias kaip neryškūs branduoliai ir ryškios mitochondrijos. (1d pav.) Efazinių ląstelių, sužadintų esant 740 nm bangos ilgiui, „Phasor FLIM“ signalas (1f pav.) Atitinka tipišką NADH daugialypį eksponentinį pasiskirstymą per visą gyvenimą, esantį 16 fazono paveikslo centre. Plonojo žarnyno storosios žarnos kriptų (smulkiosios smailės spinduliuotės) spinduliuotės spektras su mėlynuoju viršuje ir laisvas NADH kaupimasis blokuojant ląstelių kvėpavimą (SM1a pav.) Patvirtina, kad pirminis epitelio fluorescencijos signalo įnešėjas yra NADH, suderinęs su ankstesniu darbu 31 . Reguliarų atstumą tarp apvalių kriptų sudaro lamina propria. Kai lamina propria sužadinama esant 880 nm bangos ilgiui, būdingas trumpas tarnavimo laikas (1a – c pav.) Ir antrosios harmoninės generacijos (SHG) signalas (SM2), kuris atitinka kolageno pluoštą 16 . Phasor FLIM parametras, sužadintas esant 740 nm bangos ilgiui, yra apibūdinamas kaip ilgesnis tarnavimo laikas (purpurinė 1d – f pav.), Kuris rodo eritrocitų porfirinų 16 mišinį kapiliaruose ir NADH mišinį fibroblastų ir makrofagų viduje.

Image

(ab) Fluorescencijos intensyvumo vaizdai plonosios žarnos kriptų bazėje, sužadintose 880 nm (a) ir 740 nm (b). Vaizdai gaunami juodos rodyklės lygiu g pav. (c – d) Phasor FLIM audinių, sužadintų esant 880 nm (c) ir 740 nm (d), žemėlapiai pabrėžia Lgr5 + GFP kamienines ląsteles (žalia), kolageną (mėlyną), porfirinus lamina propria (purpurinė) ir NADH epitelio ląstelės (cianinės). Fazės grafiko FLIM atvaizdo histograma esant 880 nm (e) ir 740 nm (f). Spalvų skalė (nuo mėlynos iki purpurinės)

Image

) atitinka 64 kontūrų lygius, nurodančius procentinį vaizdo pikselių histogramos pasireiškimą. Fazės pasiskirstyme skirtingomis spalvomis identifikuojami keturi klasteriai, atitinkantys skirtingus audinių komponentus. g) Epitelis organizuojamas diferencijuotomis vyniotinėmis ir kriptomis, turinčiomis kamienines ląsteles (žalia spalva), o lamina propria (punktyrinė sritis) sudaro kiekvieno villus šerdį ir yra sudaryta iš palaidų jungiamojo audinio, kuriame yra limfocitai, miofibroblastai ir kapiliarų tinklas. ir limfiniai vaistai.

Visas dydis

Proliferacinės kamieninės ląstelės plonojoje žarnoje turi unikalų NADH metabolinį pirštų atspaudą

Čia parodome, kad epitelio kamieninės ląstelės, esančios kriptos gale, turi unikalų NADH Phasor FLIM parašą, leidžiantį juos identifikuoti gyvuose audiniuose be jokio išorinio ženklinimo. Kamieninės ląstelės kriptos bazėje keičiasi su Paneth ląstelėmis, diferencijuotomis epitelio ląstelėmis, kurios veikia įgimtu imunitetu 32, ir kaip kamieninės ląstelės „slaugytojos“ ląstelės 33 . Norėdami atskirti Paneth ir kamienines ląsteles, mes naudojame Lgr5-GFP peles, kad pažymėtume Lgr5 + kamieninių ląstelių populiaciją plonosios žarnos (SI) bazėje. (Žr. Medžiagą ir metodus). Ti: safyro lazerio sužadinimo bangos ilgis yra sureguliuotas nuo 880 nm iki 740 nm, kad būtų galima sužadinti GFP ir NADH 9 . 2 pav. Pavaizduoti 2-fotonų sužadinti fluorescenciniai vaizdai ir FLIM žemėlapiai, gauti ex-vivo plonojoje žarnoje iš Lgr5-GFP pelės, sužadintos 740 nm (2a – b pav.) Ir 880 nm (2c – d pav.). Platus gyvenimo trukmės pasiskirstymas kripto epitelio ląstelėse, sužadintose 740 nm bangomis (1.f ir 2.b pav.), Turi būdingą tiesinį pailgėjimą, atspindintį laisvo ir surišto NADH mišinį, gaunant informaciją apie skirtingą metabolinių būsenų ir tos pačios kriptos ląstelių redokso santykis. 2 paveiksle pavaizduota santykinė laisvojo ir surištojo NADH koncentracija epitelio ląstelėse SI kriptų bazėje pagal laisvojo NADH FLIM fazinę vietą, išmatuotą 16 tirpale, ir surišto NADH, išmatuotą epitelio ląstelėse (Fig.SM1). .a). Skirtingi laisvojo ir prie baltymų prisijungusio NADH santykiai atspindi skirtingus glikolizės ir oksidacinio fosforilinimo greičius (SM4 ir SM5), suderinus su nuoroda. 11

Image

Dviejų fotonų fluorescencijos intensyvumo vaizdai, sužadinti plonosios žarnos 740 nm (a) ir 880 nm (d) bangomis iš Lgr5-GFP pelių, kurios kripto bazinėse kamieninėse ląstelėse išreiškia eGFP. Taškinės linijos rodo apvalių kriptų kraštą SI audinyje. b) Phasor (mėlynas), esant 740 nm bangos ilgiui, „Phasor“ spalvų žemėlapiai ir laisvojo NADH bei surišto NADH santykinės koncentracijos lamina propria. Raudonos-violetinės spalvos rodo aukštą laisvojo / surištojo NADH santykį, o violetinė, žalsvai melsva ir balta rodo tiesiškai ir palaipsniui mažėjantį laisvojo ir surištojo NADH santykį, kaip parodyta f. c) „Phasor“ spalvų žemėlapis, esant 880 nm, išryškina GFP (žaliąsias) kamienines ląsteles. e) Fazinė FLIM vaizdo histograma, sužadinta 740 nm. Tiesinis klasteris parodo visas įmanomas laisvojo NADH (purpurinė) ir surišto NADH (baltojo) koncentracijas. f) Fazinė FLIM atvaizdo histograma, sužadinta esant 880 nm, su apvalia grupe, išryškinančia GFP (žalia). g) Visų kamieninių ląstelių (žalsvai briaunotų trikampių) ir Paneth ląstelių (purpuriniai kvadratai) ląstelių fazių išsklaidytasis diagrama, sužadinta 740 nm.

Visas dydis

Metabolinis fazinis FLIM signalas kriptų, sujaudintų 740 nm bangos apačioje (2.b pav.), Akivaizdžiai seka kamieninių ląstelių žemėlapį, sujungtą tarp gretimų Paneth ląstelių. Kamieninėms ląstelėms (cianoms) būdingas mažesnis laisvų ir surištų NADH santykis Paneth ląstelių (purpurinės) atžvilgiu (2.b pav., 2e pav., G). Unikalus kamieninių ląstelių NADH FLIM parašas ir pakaitinis aukštų ir žemų laisvų / surištų NADH ląstelių raštas kriptoje yra visose plonosios žarnos audinių kriptose, neatsižvelgiant į GFP išraišką (2.b ir 2.c pav.) . Mes apskaičiuojame kamieninių ląstelių ir Paneth ląstelių vidutines fazių reikšmes, atlikdami rankinį vaizdo segmentą pagal 2.b ir 2.c pav. Lgr5-GFP teigiamas kriptas (žr. Medžiaga ir metodai). Parenkame dominančias kamienines ląsteles naudodamiesi savavališkos formos žymekliu, kuris 2.c paveiksle paženklina atskirų Lgr5 + GFP kamieninių ląstelių kontūrus. Paneth ląstelės identifikuojamos apvalių kriptų bazėje, nesant Lgr5 + GFP ekspresijos. Vidutinė fazių ląstelių vertė apskaičiuojama žymeklio viduje ir nubraižyta 2g pav. Kamieninių ląstelių vidutinės FLIM fazinės vertės smarkiai skiriasi nuo Paneth ląstelių verčių, rodančios skirtingą metabolizmą (t-testas, p <0, 05, 2g pav.).

NADH metabolinė trajektorija nuo glikolizės iki oksidacinio fosforilinimo yra susijusi su ląstelių proliferacija ir diferenciacija išilgai plonosios žarnos kripto-villus ašies

Čia parodome, kad plonosios žarnos epitelio ląstelės laikosi tikslios metabolinės trajektorijos, susijusios su laisvu ir baltymų turinčiu NADH. Proliferacinėms ląstelėms kriptos bazėje būdingas glikolitinis metabolinis fenotipas, tuo tarpu diferencijuotos ląstelės turi oksidacinį fosforilinimo fenotipą (3 pav., 4 pav., SM4 ir SM5).

Image

Dviejų fotonų fluorescencinio intensyvumo vaizdai (a) ir laisvųjų / surištųjų NADH FLIM žemėlapiai (b) ex-vivo plonosios žarnos kriptų, sužadintų 740 nm bangos ilgio skirtingame audinio gylyje (z), pradedant nuo kriptos pagrindo. c) „Phasor FLIM“ pasiskirstymas skirtinguose gyliuose (z). Žiedinis apvalus skiltelė naudojama porfirinui išryškinti lamina propria. Linijinis klasteris parodo santykinę laisvo NADH (purpurinė) ir surišto NADH (balta) koncentraciją. Raudonai violetinė spalva rodo aukštą laisvo / surišto NADH santykį, o violetinė, žalsvai melsva ir balta rodo tiesiškai ir palaipsniui mažėjantį laisvo / surišto NADH santykį. d) Kamieninių ląstelių fazoro ir diferencijuotų epitelio ląstelių skirtingo gylio sklaidos diagrama, išsiskirianti iš bazinės membranos kolageno skaidulų (SM3 paveikslas), sužadinta 740 nm. Cianinis deimantas, kai Z = 55 µm, juodos žvaigždės, kai Z = 44 µm, raudoni trikampiai, kai Z = 34 µm, žali kvadratai, kai Z = 24 µm, ir mėlyni apskritimai, kai Z = 14 µm). Išilgai Z ašies ląstelių fazė pasislenka ilgesnio gyvenimo periodo link, tai rodo surišto NADH padidėjimą laisvojo NADH atžvilgiu. ty NADH / NAD + santykio sumažėjimas. e) Plonojo žarnos epitelio schema rodo laisvo / surišto NADH gradientą išilgai SI kriptos epitelio ląstelių.

Visas dydis

Image

Dviejų fotonų fluorescencinio intensyvumo vaizdai (a) ir laisvųjų / surištųjų NADH FLIM žemėlapiai (b) iš ex vivo plonosios žarnos gleivinės, sužadintos 740 nm bangos ilgio skirtingame audinio gylyje (z), pradedant nuo virkštelės galiuko. c) „Phasor FLIM“ pasiskirstymas skirtinguose gyliuose z. Žiedinis apvalus skiltelė naudojama porfirinui išryškinti lamina propria induose. Linijinis klasteris parodo santykinę laisvo NADH (purpurinė) ir surišto NADH (balta) koncentraciją. Violetinė spalva rodo aukštą laisvo / surišto NADH santykį, o violetinė, žalsvai melsva ir balta spalva rodo tiesiškai ir palaipsniui mažėjantį laisvojo ir surištojo NADH santykį. d) Kamieninių ląstelių fazių ir diferencijuotų epitelio ląstelių išsidėstymas skirtinguose gyliuose nei virkštelės galas. Išilgai Z ląstelių fazė keičiasi trumpesnio gyvenimo laikotarpio link, tai rodo padidėjusį laisvojo ir surištojo NADH santykį. e) Plonojo žarnos epitelio schema parodo laisvo / surišto NADH gradientą išilgai SI villi epitelio ląstelių. (f) Metabolinė trajektorija (M trajektorija) nuo laisvojo prie baltymų prisijungusio NADH rodo perėjimą nuo glikolitinio fenotipo prie oksidacinio fosforilinimo fenotipo.

Visas dydis

3 ir 4 paveiksluose mes išmatuojame plonosios žarnos trimatį NADH FLIM ženklą ir suskaidome epitelinių ląstelių metabolinius gradientus plonojoje žarnoje nuo kriptos pagrindo iki villus galiukų. Kamieninių ląstelių fondas yra žarnyno kriptoje, kur jos atsinaujina ir sukuria diferencijuotas ląstelių rūšis (1g pav.). Kai kamieninės ląstelės dalijasi, jos dažnai dalijasi asimetriškai, sudarydamos naują kamieninę ląstelę ir atsidavusią dukterinę ląstelę. Kamieninių ląstelių ciklas sukuria greitai augančias „atsidavusių progenitorių“ (CP) ląsteles, galinčias diferencijuotis pagal visas ląstelių linijas. Tada CP ląstelės dalijasi ribotą skaičių ląstelių, kol jos galutinai diferencijuojasi ant villus paviršiaus.

3 paveiksle mes pavaizdavome ex-vivo plonosios žarnos audinį iš išorės, naudodami nepažeistą plonosios žarnos skyrių. (3e pav. Ir Medžiaga bei metodai). Pradėję nuo nepažeisto plonojo žarnyno išorinio serosalinio paviršiaus, pirmiausia pavaizdavome submucosalines kolageno skaidulas, tada kripto bazes ir tarpslankstelinę lamina propria. (SM1 pav.). 4 paveiksle atidarome SI mėgintuvėlį, kad pavaizduotume gleivinės paviršių nuo villus galiukų link SI kripto bazių (4e pav. Ir Medžiaga ir metodai).

NADH gyvenimo trukmės pasiskirstymas epitelio ląstelėse, sužadintose 740 nm bangos ilgiuose, yra skirtingas įvairiais gyliais (z) išilgai kripto / villus ašies (3c – d ir 4c – d pav.). Jų trimatis FLIM fazonas yra paskirstytas išilgai tiesinės trajektorijos fazės grafike, kuris atitinka laisvo ir surišto NADH mišinį (SM1.a pav. Ir nuoroda 16 ). „M-trajektorija“ (metabolinė trajektorija) apibūdina trajektoriją iš glikolitinio fenotipo, turinčio aukštą laisvo / surišto NADH santykį, iki oksidacinio fosforilinimo fenotipo, turinčio aukštą laisvo / surišto NADH santykį (4g pav., SM4 ir SM5). Atlikus laisvųjų ir surištųjų NADH santykinės koncentracijos atvaizdavimą SI kriptų ir villi epitelio ląstelėse, parodomas poslinkis link mažesnio laisvo / surišto NADH santykio, diferencijuojant nuo kriptos pagrindo iki villuso galiuko (3b ir 4b pav.). Mes apskaičiuojame kamieninių ląstelių ir diferencijuojančių palikuonių vidutines fazines vertes, atlikdami rankinį vaizdo segmentą. (Žr. Medžiagą ir metodus). Vidutinė epitelio ląstelių fazinė vertė skirtinguose gyliuose apskaičiuojama žymeklio viduje ir nubraižyta 3g ir 4g paveikslų sklaidos schemoje. Kamieninių ląstelių FLIM fazinės vertės statistiškai skiriasi nuo diferencijuotų epitelio ląstelių skirtinguose gyliuose (t-testas, p <0, 05 3d pav.), Rodančios laipsnišką laisvo / surišto NADH santykio sumažėjimą kriptoje. Kamieninėms ląstelėms (z = 14 um ir z = 24 um) (3d pav.) Ir Paneth ląstelėms (2b pav.), Esančioms Wnt turtingoje aplinkoje kriptos bazėje, būdingas glikolitinis metabolinis fenotipas M trajektorijoje ( 4g pav., SM4 ir SM5), turinčios trumpiausią eksploatavimo laiką ir didžiausią laisvojo / surištojo NADH (ty NADH / NAD +) santykį. Judėjimas kriptos aukštyn į užduoties palikuonių skyrių (3b – d pav.) Ir į visiškai diferencijuotų ląstelių vietas gleivinės paviršiuje (4b – d pav.) Atitinka judėjimą išilgai M trajektorijos, mažinant laisvą / surištą NADH ( ty NADH / NAD +) santykiai (balti 3b – d pav.), parodantys metabolinį poslinkį nuo glikolizės prie oksidacinio fosforilinimo (SM4 ir SM5). Ta pati tendencija stebima penkiuose skirtinguose gyvūnuose (SM6 ir SM7).

Diskusija

Čia mes sukūrėme neinvazinį, etiketės neturintį optinį metodą, skirtą išmatuoti ir nustatyti NADH metabolinį parašą, susijusį su glikolize ir oksidaciniu fosforilinimu gyvuose audiniuose. Mūsų metodas leidžia nustatyti metabolinę būseną, susijusią su ląstelių proliferacija ir diferenciacija gyvojoje pelės plonojoje žarnoje, ir identifikuoja proliferacines žarnyno kamienines ląsteles pagal unikalų metabolinį pirštų atspaudą.

Atlikdami ex-vivo dviejų fotonų sužadintą fluorescencinę gyvenimo trukmės mikroskopiją ir „Phasor“ analizę, parodome, kad galime nustatyti skirtingas SI ląstelių populiacijas ir struktūras pagal jų unikalius FLIM parašus (1 pav.). Kolageno skaidulos (1 pav., SM2 ir SM3) yra atvaizduojamos kriptų, palaikančių kamieninių ląstelių nišą, apačioje, o lamina propria atpažįstama pagal savitą ilgą tarnavimo laiką, rodantį porfirino buvimą kapiliarų kraujagyslių tinkle (1 pav. 1d, f). Mes parodome, kad pagrindinis epitelio vidinio kontrasto šaltinis yra metabolinis koenzimas NADH (1d – f ir SM1 pav.). Šie duomenys atitinka matavimus, susijusius su vidinio kontrasto atlikimu atliekant skrandžio audinio hiperspektrinę mikroskopiją 31 . Mūsų metodas suteikia tiesioginį būdą nustatyti ir nukreipti vidinį žarnyno audinio kontrastą, priskiriant FLIM kontrastą tarpląsteliniams ir tarpląsteliniams fiziologiniams fluoroforams (1 pav.). Dar svarbiau, kad mūsų metodas suteikia fiziologinės informacijos, susijusios su atskirų ląstelių metabolizmu audinyje. Parodome, kad epitelinių ląstelių „Phasor FLIM“ parašas suteikia informacijos apie laisvųjų ir baltymų turinčių NADH formų turinį, susijusį su glikolize ir oksidaciniu fosforilinimu (SM4 ir SM5) bei su ląstelių proliferacija ir diferenciacija (3 ir 4 pav.).

Mūsų rezultatai rodo, kad „Phasor FLIM“ identifikuoja labai dauginančias žarnyno kamienines ląsteles pagal jų metabolinį parašą, nereikalaujant jokio išorinio etiketės ar genetinio žymens. Mes parodėme, kad Lgr5 teigiamos kamieninės ląstelės turi unikalų NADH FLIM parašą, išskiriantį jas tiek iš kaimyninių Paneth ląstelių (2 pav.), Tiek iš diferencijuotų epitelio ląstelių išilgai kriptos (3 pav.) Ir villi (4 pav.). Laisvo ir surišto NADH (2b ir 3b pav.) Ir „Phasor FLIM“ metabolinių pirštų atspaudų (2g ir 3d pav.) FLIM žemėlapiai rūšiuoja žarnyno kamienines ląsteles ir diferencijuojamas palikuonis pagal jų metabolinę būseną. Žarnyno kamieninių ląstelių metabolinei būklei (3 pav.) Būdingas didelis laisvų ir surištų NADH santykis, rodantis, kad jos daugiausia priklauso nuo glikolizės, kaip tikimasi labai proliferacinėse ląstelėse 2, 3 . Mes pademonstravome, kad plonosios žarnos „Phasor FLIM“ trimatis parašas leidžia nesunkiai atvaizduoti laisvojo ir surištojo NADH santykinę koncentraciją ir pateikia informaciją apie metabolizmo gradientus, susijusius su proliferacija ir diferenciacija (3c ir 4c pav.). Ląstelių fazinio pirštų atspaudų evoliucija nuo kriptos pagrindo iki virvelės viršaus (3d pav. Ir 4d pav.) Rodo laisvo NADH sumažėjimą, palyginti su baltymais sujungto NADH, ties M trajektorija (4 g pav.). Taigi mūsų išvados rodo, kad sumažėja santykinis glikolitinio metabolinio kelio indėlis į oksidacinį fosforilinimą epitelinių kamieninių ląstelių diferenciacijos metu gyvojoje plonojoje žarnoje (3 pav., 4 pav., SM4 ir SM5). Stebimas poslinkis nuo glikolizės prie oksidacinio fosforilinimo atitinka padidėjusį NADH tarnavimo laiką, išmatuotą suaugusiųjų kamieninių ląstelių diferenciacijos metu in vitro 12, 13 ir gyvuose audiniuose 16 . NADH FLIM pirštų atspaudų pasikeitimas diferenciacijos metu (3 ir 4 pav.) Taip pat gali reikšti, kad pasikeičia NADH jungimosi vietos su skirtingais fermentais, tokiais kaip malato dehidrogenazė (MDH) ir laktato dehidrogenazė (LDH) 17 . Metabolinis gradientas virbalo gale (4d pav.) Gali parodyti FAD indėlį, tuo tarpu metabolizmo ląstelių nevienalytiškumas virbalo galiuko gale (4b pav.) Gali parodyti ląstelių tipus, turinčius skirtingą funkciją, pavyzdžiui, serbentų ląsteles., enterocitai arba enteroendokrininės ląstelės. Arba tai galėtų reikšti epitelio ląsteles, kuriose vyksta oksidacinis stresas ir apoptozė.

Įdomu tai, kad laisvas / surištas NADH FLIM gradientas, kurį matuojame (3 ir 4 pav.), Yra glaudžiai susijęs su Wnt gradientu išilgai kripto-villus ašies, kuris rodo didžiausią signalinį aktyvumą kriptos dugne, kur jis kontroliuoja ląstelių dauginimąsi, kamieninės ląstelės. savarankiškas atsinaujinimas ir ląstelių likimas 24, 34 . Epitelio ląstelės kriptos bazėje (Lgr5 + kamieninės ląstelės ir Paneth ląstelės) pasižymi dideliu Wnt signalizavimu 26, 35, ir mes pastebime, kad jų laisvojo / surištojo NADH santykis yra didžiausias (2 pav. Ir 3 pav.), Ty didžiausia glikolizė. / oksidacinio fosforilinimo santykis (SM4 ir SM5). Įdomu tai, kad Paneth ląstelės pasižymi didesniu laisvų ir surištų NADH santykiu nei Lgr5 + kamieninės ląstelės, tai rodo, kad jos savo funkcijoms naudoja stiprų, aktyvų glikolitinį metabolizmą. Nors Paneth ląstelės yra diferencijuotos ląstelės, jos ekspresuoja keletą Wnt taikinių genų, tokių kaip defensinai ir kriptidinai 26, 36, ir suteikia svarbius nišos signalus kamieninių ląstelių palaikymui ir savęs atsinaujinimui, tokius kaip EGF, Wnt3, R-Spondin ir Notch 33, 37 .

Mūsų žiniomis, tai yra pirmas kartas, kai žarnyno kamieninės ląstelės gyvuose audiniuose buvo atpažįstamos be etikečių, remiantis jų metaboliniu pirštų atspaudu. Išmatuojamos atskirų ląstelių metabolinės būsenos ir gyvajame audinyje nustatomas glikolizės ir oksidacinio fosforilinimo greitis. Pirmą kartą pranešame, kad metabolinis gradientas, susijęs su laisvu ir prie baltymų prisijungusiu NADH, yra susijęs su ląstelių proliferacija, diferenciacija ir Wnt signalizavimu plonojoje žarnoje. Gebėjimas identifikuoti žarnyno kamienines ląsteles ir atskirti labai proliferuojančių ląstelių, susijusių su didelio Wnt signalo perdavimu, metabolinę būklę be jokių išorinių žymenų, gali turėti didelę įtaką kamieninių ląstelių biologijai, vėžio tyrimams ir klinikinei diagnozei. Mūsų metodai leistų neinvaziškai vaizduoti medžiagų apykaitos poslinkius bet kuriame ląstelių skyriuje, susijusius su epitelio augimo disreguliacija bet kuriame gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio modelyje. Mutavusias ląsteles, turinčias konstituciškai aktyvius onkogeninius kelius, leidžiančius metabolinį biosintezės fenotipą, nepriklausomą nuo normalių fiziologinių sąlygų, būtų galima išskirti ir aptikti ankstyvosiose ligos stadijose. Ateityje planuojame apibūdinti storosios žarnos ir plonosios žarnos audinių metabolinius parašus transgeniniuose gyvūnų uždegiminės žarnos ligos ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžio modeliuose. Kadangi mūsų metodas yra be etikečių ir neinvazinis, mūsų metodas galėtų būti nepaprastai naudingas diagnozuojant ir valdant vėžį, leidžiant sukurti „metabolinės histologijos“ parašus ir galiausiai in vivo bei in situ endoskopinę mikroskopiją38. Miniatiūriniai optinio pluošto metodai buvo pritaikyti intravitalinei mikroskopijai ir endoskopiniam klinikiniam vaizdavimui 39, pastaruoju metu tobulinant visą gyvenimą trunkančią fluorescencinę vaizdo endoskopiją 40 . FLIM endoskopai leistų atlikti in vivo diagnostinius vaizdus, ​​nustatant vėžines ląsteles ir, galbūt, kamienines ląsteles pagal molekulinį kontrastą ir be etikečių, remiantis jų metabolinėmis būsenomis.

Mūsų metodas suteikia tiesioginį ir kiekybinį oksidacinio fosforilinimo ir glikolizės metabolizmo greičio (SM4 ir SM5) matavimus ir susieja metabolinius fenotipus su proliferacija ir diferenciacija M trajektorijoje (3 ir 4 pav.). Pateikdamas didelį jautrumą laisvam / saistomam NADH molekuliniam gradientui, mūsų metodas yra perspektyvus įrankis stebėti (pato) fiziologinius procesus, susijusius su metaboliniais pokyčiais. Mūsų metodai galėtų būti naudojami pavienėms labai proliferuojančioms kamieninėms ir vėžio ląstelėms nustatyti ir metaboliniams gradientams bei dinaminei metabolinei adaptacijai prie deguonies ir maistinių medžiagų sunaudojimo lygio išmatuoti vystymosi ir vėžio progresavimo metu įvairiuose gyvuose audiniuose.

Metodai

Gyvūno modelis ir procedūros

We used Lgr5+GFP mice that express GFP within the stem cells of the small intestine and colon epithelium (Jackson Labs strain 008875). E x-vivo tissue imaging is performed immediately after mice euthanasia. Selected freshly excised small intestine is cleaned by flushing with Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) (Thermo Scientific Part NumberSH30031.02). To image the SI crypt, images were acquired from the outside (serosal) surface. To acquire images of the SI villi, a length of SI tissue was opened flat, gently rinsed and imaged, villi up, in a Mat-Tek dish with a #1 coverslip. Tissue was bathed in HBSS while imaging and all imaging occurred immediately after isolation. All procedures followed were reviewed and approved by the Irvine University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC animal protocol number 2002-2357-3).

We block the respiratory chain of the DLD-1 colon cancer cells by means of potassium cyanide (KCN) to inhibit the Oxidative phosphorylation and increase the mitochondrial concentration of NADH. KCN in PBS was added to the culture medium with a final concentration of 4 mM. Cells were imaged immediately after the addition of KCN.

DLD-1 colon cancer cells are treated for 24 hours with 50 mM Sodium dichloroacetate (Sigma #34779) to inhibit glycolysis.

NIH3T3 fibroblasts are treated for one hour with Low Glucose (4.4 mM glucose) and High Glucose (22 mM glucose) media. Low Glucose medium ( Invitrogen Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM), # 11885-092, no Fetal Bovine Serum). High Glucose medium ( Invitrogen Dulbecco's Modified Eagle Medium (D-MEM) # 11965-092, no Fetal Bovine Serum).

Vaizduojamasis

Fluorescence lifetime images are acquired with a Zeiss 710 microscope coupled to a Ti:Sapphire laser system (Spectra-Physics Mai Tai) and a ISS A320 FastFLIM system 20 . A 40×0.8 NA water immersion objective (LUMPlanFl Olympus.) is used. For image acquisition the following settings are used: image size of 256×256 pixels or 1024v1024 pixels and scan speed of 25 μm/pixel. A dichroic filter (690 nm) is used to separate the fluorescence signal from the laser light and the fluorescence. For the acquisition of FLIM images, fluorescence is detected by a photomultiplier (H7422P-40 of Hamamatsu) and a 610 nm short pass filter is placed in front of the detector. FLIM data are acquired and processed by the SimFCS software developed at the Laboratory of Fluorescence Dynamics. The excitation wavelengths used were 880 nm and 740 nm. An average power of about 5 mW was used to excite the live tissue. FLIM calibration of the system is performed by measuring the known lifetime of the fluorescein with a single exponential of 4.04 ns. FLIM data are collected until 100 counts in the brightest pixel of the image are acquired. Typically the acquisition time was of the order of few seconds.

FLIM Phasor data analysis

Every pixel of the FLIM image is transformed in one pixel in the phasor plot as previously described in ref 16, 21 . The coordinates g and s in the phasor plot are calculated from the fluorescence intensity decay of each pixel of the image by using the transformations defined in ref 16, 21 . The analysis of the phasor distribution is performed by cluster identification. Clusters of pixel values are detected in specific regions of the phasor plot. The cluster assignment is performed by taking in account not only the similar fluorescence properties in the phasor plot but also exploiting the spatial distribution and localization in cellular substructures or tissues, as described in ref 16 . Fractional intensities of chemical species in every pixel of the image are evaluated with a graphical analysis in the phasor plot as described in ref 21 . We perform image segmentation on the FLIM data by selecting the region of interest of cells within the tissue. The region of interest of cells is selected by using a cursor with arbitrary shape. We calculate the phasor average value within these regions of interest. When measuring the cell phasor, all pixels of the cell (about 1000) are taken in account and the signal to noise ratio of the FLIM signature of cells is higher than in single pixels. All phasor transformation and the data analysis of FLIM data are performed using SimFCS software developed at the LFD.

All procedures followed were reviewed and approved by the Irvine University Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC animal protocol number 2002-2357-3).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.