Nuo mikrobų priklausomos cd11b + iga + plazmos ląstelės tarpina tvirtas ankstyvosios fazės žarnyno iga reakcijas pelėms | gamtos komunikacijos

Nuo mikrobų priklausomos cd11b + iga + plazmos ląstelės tarpina tvirtas ankstyvosios fazės žarnyno iga reakcijas pelėms | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Humoralinis imunitetas
  • Gleivinės imunologija
  • Plazmos ląstelės

Anotacija

Žarnyno plazmos ląstelės daugiausia gamina imunoglobuliną (Ig) A, tačiau jų funkcinė įvairovė vis dar menkai apibūdinama. Čia parodome, kad pelių žarnyno IgA plazmos ląstelės gali būti naujai suskirstytos į dvi populiacijas remiantis CD11b ekspresija, kurios negalima atskirti pagal dabar žinomus kriterijus, tokius kaip bendrieji plazmos ląstelių žymenys, B ląstelių kilmė ir T ląstelių priklausomybė. CD11b + IgA + plazmos ląstelėms reikalinga Peyer pleistrų limfoidinė struktūra, jos gamina daugiau IgA nei CD11b - IgA + plazmos ląstelės, energingai dauginasi ir joms vystytis bei palaikyti reikalinga mikrobų stimuliacija ir IL-10. Šios savybės leidžia CD11b + IgA + plazmos ląstelėms tarpininkauti ankstyvosios fazės antigeno specifinėms žarnyno IgA reakcijoms, kurias sukelia oralinis imunizavimas baltymų antigenu. Šie radiniai atskleidžia IgA + plazmos ląstelių funkcinę įvairovę pelės žarnyne.

Įvadas

Imunoglobulinas (Ig) A yra antikūnas, daugiausia randamas žarnyno spindyje, kur apsaugo šeimininką nuo patogeninių infekcijų 1, 2 . Tai taip pat vaidina svarbų vaidmenį kuriant ir palaikant imunologinę homoeostazę formuojant homeostatines kommensalinių bakterijų bendruomenes 3, 4, 5 . Iš tiesų, kai kurie pacientai, turintys IgA trūkumą, pasižymi ryškiu patogenų, tokių kaip Giardia lamblia , Campylobacter , Clostridium , Salmonella ir rotavirusas, infekcijomis; jie taip pat turi daugiau žarnyno imuninių ligų, tokių kaip celiakija ir uždegiminės žarnyno ligos 6 .

Peyer pleistrai (PP) yra pagrindinės antigeno specifinio žarnyno IgA gamybos inicijavimo vietos, daugiausia nuo T ląstelių priklausomos 7 . Žarnyno IgA taip pat kilęs iš B1 ląstelių. B1 ląstelės skiriasi nuo B2 ląstelių pagal kilmę, paviršiaus žymenis (pavyzdžiui, B220, IgM, IgD, CD5, CD11b ir CD23), augimo savybes ir VH repertuarą 8, 9, 10 . B1 ląstelės daugiausia yra pilvaplėvės ertmėje (PerC) ir patenka į žarnyno skyrių IgA gamybai nuo T ląstelių nepriklausomų antigenų, tokių kaip DNR ir fosfatidilcholinas 11 . Nuo T ląstelių nepriklausomi antigenui specifiniai IgA atsakai taip pat inicijuojami izoliuotuose limfoidiniuose folikuluose (ILF), kurie yra mažos B2 ląstelių grupės žarnyne 12 .

Ig klasei perėjus iš μ į α, IgA + B ląstelės įgyja 1 tipo sfingozino-1-fosfato receptorių, CCR9 ir α4β7 integrino ekspresiją, leidžiančios joms migruoti iš PP ar PerC ir pereiti į žarnyno lamina propria (iLP). ) 11, 13, 14 . ILP jie toliau diferencijuojasi į IgA išskiriančias plazmos ląsteles (PC), veikiami galinių diferenciacijos veiksnių (pavyzdžiui, IL-6) 15 . Kadangi šie vietoje gaminami IgA antikūnai yra epitelio ląstelių nuolat gabenami ir sekretuojami kaip sekrecinio IgA forma į žarnyno spindį, pakankamam IgA kiekiui palaikyti reikalingas stabiliai didelis IgA kiekis; šią produkciją lemia IgA kompiuterių generavimas, išgyvenimas ir funkcija.

Keli įrodymai parodė, kad AK funkciją ir išgyvenamumą sisteminiuose skyriuose (pavyzdžiui, blužnyje ir kaulų čiulpuose (BM)) lemia ne tik vidiniai veiksniai, bet ir reguliuojamos aplinkos nišos 16 . Kaip ir sisteminių AK, IgA PC diferenciaciją iLP reguliuoja egzogeniniai veiksniai, tokie kaip IgA stiprinantys citokinai (pavyzdžiui, interleukinas (IL) -5, IL-6, IL-10, IL-15, skatinantis proliferaciją) ligandą (APRIL) ir B ląstelių aktyvinimo faktorių (BAFF)), 7, 15 . Be to, norint visapusiškai paveikti žarnyno IgA, reikalinga mikrobų stimuliacija. Iš tiesų pelėms, kuriose nėra gemalų (GF), sumažėjęs žarnyno IgA atsakas, kai nesubrendusios PP ir ILF struktūros yra 17, 18 . Ankstesni monoasocijuotų GF pelių tyrimai parodė, kad tik nedidelė dalis bendro žarnyno IgA reaguoja į monoassocijuotas bakterijas; todėl nuo mikrobų priklausomas IgA gaminimas vyksta per polikloninę stimuliaciją per įgimtus imuninius receptorius, tokius kaip rinkliavos pavidalo receptoriai, o ne per B ląstelių receptorius, specifinius mikrobų antigenams 19, 20 . Kaupiami įrodymai atskleidė įgimto imuniteto sąlygotus IgA gamybos molekulinius ir ląstelinius kelius, įskaitant mieloidinio diferenciacijos pirminio atsako geno 88 (MyD88) dalyvavimą reguliuojant naviko nekrozės faktorių / indukuojamus azoto oksido sintazę gaminančius DC iLP 21 ir folikulų DC PP PP. Tačiau mikrobų stimuliacijos poveikis diferencijuotų IgA + PC reguliavimui dar turi būti ištirtas. Čia mes nustatėme unikalius IgA + PC, priklausomus nuo mikrobų, pogrupius, kurie prideda naują pelių žarnyno IgA sistemos sudėtingumo lygį.

Rezultatai

Žarnyno IgA + ląstelių priklausomybė nuo mikrobų

Norėdami ištirti imunologinius žarnyno IgA gamybos elementus, susijusius su kommensalinėmis bakterijomis, iš pradžių palyginome specifinių patogenų (SPF) ir GF pelių IgA + ląsteles. Srauto citometrinė analizė parodė, kad CD11b + IgA + ląstelės sudarė apie 30% IgA + ląstelių, ir mes nustatėme, kad GF pelių iLP trūko CD11b + IgA + ląstelių (1a pav.). Taip pat sumažėjo žarnyno CD11b + IgA + ląstelių skaičius tiek su antibiotikais gydytomis SPF pelėmis, tiek su MyD88 KO pelėmis (1b – d pav.). Imunohistologinė analizė parodė, kad CD11b + IgA + ląstelės buvo išsklaidytos per laukinio tipo (WT) pelių iLP (1d pav.), Nors jų dažnis atrodė mažesnis, nei tikėtasi iš srauto citometrinių duomenų, tikriausiai dėl skirtingo metodinio jautrumo. Šie duomenys bendrai rodo, kad CD11b + IgA + ląstelės yra unikalus pogrupis, kuriam vystytis ir palaikyti reikia nuo MyD88 priklausomų mikrobų.

Image

( a - c ) Vieno branduolio ląstelės buvo išskirtos iš SPF ar GF pelių ( a ), modeliais ar antibiotikais gydytų SPF pelių ( b ) arba MyD88 WT arba nokautuotų (KO) pelių plonųjų žarnų ( c ) IgA analizei ir CD11b ekspresija srauto citometrija. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis, o juostos rodo vidutinę. Statistinė analizė atlikta naudojant Manno ir Whitney U testą. ( d ) WT ir MyD88 KO pelių plonojo žarnyno audinių mėginiai buvo dažomi IgA ir CD11b, o prieš juos laikant 4 ', 6-diamidino-2-fenilindolį. Duomenys atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. Svarstyklės, 50 μm.

Visas dydis

Žarnyno CD11b + IgA + ląstelės yra kompiuteriai

Toliau siekėme apibūdinti CDLb + ir CD11b - IgA + ląsteles iLP. Be strategijos, kuria siekiama atmesti galimybę, kad srauto citometrijos būdu aptiktos CD11b + IgA + ląstelės buvo dvigubos (papildomas S1 pav.), Mes dar atlikome citospin analizę ir patvirtinome, kad CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelės turėjo homogeniškas savybes. morfologija buvo tokia pati kaip kompiuterių (pvz., dideli netaisyklingi branduoliai su iškiliais branduoliais), tuo tarpu CD11b hi IgA - ląstelės buvo sudarytos iš skirtingų ląstelių rūšių, įskaitant eozinofilus ir makrofagus (2a pav.). Mes taip pat patvirtinome, kad CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelės neišreiškė makrofagų (F4 / 80), DC (CD11c) ar eozinofilų (CCR3) žymenų (2b pav.). Taigi, CD11b + IgA + ląstelės nėra nei dvigubos, nei mieloidinės ląstelės, papuoštos surištu IgA jų paviršiuose.

Image

( a ) Ląstelės buvo išgrynintos, rūšiuojant ląsteles iš iLP, ir jų morfologija ištirta hematoksilinu ir eozinu dažant po citospino. Duomenys atspindi tris nepriklausomus eksperimentus. ( b ) Ląstelės buvo išskirtos iš iLP, norint analizuoti F4 / 80, CD11c ir CCR3 raišką CD11b - IgA +, CD11b + IgA + ir CD11b + IgA - ląstelėse. Pilka spalva nurodo izotipo valdymą. Panašūs rezultatai buvo gauti iš trijų atskirų eksperimentų. c ) Ląstelės buvo išskirtos iš iLP, kad būtų galima palyginti CD11b + ir CD11b - IgA + ląsteles pagal ląstelių dydį (FSC) ir tankį (SSC) bei CD19, B220, CD138, CD38, CD40 ir Blimp1 išraišką. Pilka spalva nurodo izotipo valdymą. Panašūs rezultatai buvo gauti iš penkių atskirų eksperimentų.

Visas dydis

CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelės buvo identiškos ląstelių dydžiu ir tankiu, atitinkamai nustatant priekinį išsibarstymą (FSC) ir šoninį išsibarstymą (SSC) ir jų paviršiaus išraiškos modelius (CD19 int, B220 -, CD138 +, CD38 labas ir CD40 int ) (2c pav.). Nors PC sisteminiuose skyriuose (pvz., Blužnyje) paprastai mažai arba visiškai neeksploatuoja imunogloblino 23, mes anksčiau patvirtinome, kad CD38 + CD138 + ląstelės iLP ekspresuoja IgA tiek ląstelių paviršiuje, tiek tarpląsteliniame skyriuje (papildomas 1 pav. S2) 13 . Šie duomenys parodė, kad CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelės gali būti klasifikuojamos kaip kompiuteriai. Šią nuomonę dar labiau patvirtino mūsų išvada, kad abi populiacijos išreiškė vienodą Blimp1, pagrindinio kompiuterių transkripcijos faktoriaus, lygį (2c pav.) 23 .

IgA + ląstelių fenotipai iLP skyrėsi nuo IgA + ląstelių blužnyje. Blužninės CD11b - IgA + ląstelės turėjo tik atminties fenotipą (tai yra, B220 +, CD138 -, CD38 int ir CD40 hi ), tuo tarpu blužninėse CD11b + IgA + ląstelėse buvo beveik lygus kiekis B220 + CD138 - CD38 int CD40 hi atminties ląstelių. ir B220 - CD138 + CD38 hi CD40 žemų kompiuterių (papildomas S3 pav.). Šie rezultatai parodė, kad CD11b + IgA + ląstelės iLP buvo unikalūs kompiuteriai, kurių imunologinis statusas buvo kitoks nei blužninių CD11b + IgA + ląstelių.

Žarnyno CD11b + IgA + kompiuteriams reikalinga PP limfoidinė struktūra

CD11b + IgA + kompiuteriai išreiškė CD18 (papildomas S4 pav.), Kuris asocijuojasi su CD11b ir veikia kaip tarpląstelinės adhezijos molekulės-1 (ICAM-1) 24 ligandas. Kadangi ICAM-1 yra endotelio adhezijos molekulė, reguliuojanti ląstelių judėjimą 24, 25, manėme, kad CD11b + IgA + PC buvo neseniai emigravę iš IgA indukuojamų audinių (pvz., PP ir PerC) ir migravo į iLP. Norėdami išbandyti šią galimybę, mes panaudojome FTY720, norėdami užkirsti kelią IgA padarytų B ląstelių gabenimui iš PP ir PerC į iLP. Kaip mes anksčiau pranešėme 11, 13, gydymas FTY720 sumažino žarnyno IgA + PC skaičių, tačiau poveikis nebuvo būdingas CD11b + IgA + PC (3a pav.). Šie duomenys leido manyti, kad CD11b + IgA + kompiuteriai nebuvo neseniai emigravę iš IgA indukcinių audinių (pavyzdžiui, PP ir PerC).

Image

( a ) Pelės buvo gydomos FTY720 kiekvieną dieną 5 dienas. Kitą dieną po galutinio gydymo CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelių proporcijos buvo išmatuotos srauto citometrija. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sd iš keturių pelių. Panašūs rezultatai buvo gauti iš trijų atskirų eksperimentų. ( b ) CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelių dalis WT ir TCRβδ KO pelių iLP buvo išmatuotos srauto citometrija. Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± sd iš keturių pelių. Panašūs rezultatai buvo gauti iš trijų atskirų eksperimentų. ( c ) Po trijų oralinių imunizacijų OVA ir choleros toksinu ląstelės buvo išskirtos iš iLP ir panaudotos ELISPOT tyrime OVA specifinių IgA AFC išvardyti. Kai kuriose pelių grupėse CD11b + arba CD11b - IgA + ląstelės buvo išeikvotos, rūšiuojant ląsteles prieš ELISPOT tyrimo taikymą. Buvo išmatuoti fosforilcholinui būdingi IgA AFC. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis, o juostos rodo vidutinę. Statistinė analizė atlikta naudojant Manno ir Whitney U testą. ( d ) Vienatūrės ląstelės buvo išskirtos iš Peyer pleistro (PP) nenormalių (kontrolinė Ab) ir nenaudojamų (anti-IL-7Rα Ab) pelių iLP, kad būtų galima analizuoti IgA ir CD11b raišką srauto citometrijos metodu. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis. Statistinė analizė atlikta naudojant Manno ir Whitney U testą. ( e ) Vienbranduolės ląstelės buvo išskirtos iš PP, kad būtų galima analizuoti CD11b + ir CD11b - IgA + ląsteles srauto citometrijos metodu. Panašūs rezultatai buvo gauti iš trijų atskirų eksperimentų.

Visas dydis

Antroji galimybė buvo ta, kad CD11b + IgA + PC atsirado iš B1 ląstelių, nes CD11b yra pilvaplėvės B1 ląstelių žymeklis 26 . Norint ištirti šią galimybę, pilvaplėvės CD11b + B1 ląstelės buvo išgrynintos ir pritaikytos sunkių kombinuotų pelių imunodeficitui. Kaip pranešta anksčiau 11, įvaikiai perkeltos CD11b + B1 ląstelės migruoja į žarnyną, kur jos diferencijuojasi į IgA + PC. Nors mes perkėlėme B ląsteles, ekspresuojančias CD11b, jos prarado CD11b raišką iLP (Papildoma S5 pav.). Nors tokiomis eksperimentinėmis sąlygomis iLP buvo aptiktos tik kelios ląstelės, CD11b ekspresija greičiausiai buvo grįžtama B ląstelėse, todėl ji neturėjo būti PC, žyminčio peritonines CD11b + B1 ląsteles, žymekliu.

Kaip trečią galimybę diferencijuoti CD11b + ir CD11b - IgA + kompiuterius, ištyrėme jų diferenciacijos T ląstelių priklausomybę ir IgA gamybą. Tam mes panaudojome TCRβδ peles. Nors TCRβ δ pelėms buvo sumažėjęs žarnyno IgA + ląstelių lygis, santykis tarp CD11b + ir CD11b - IgA + PC nesiskyrė tarp WT pelių ir TCRβ δ pelių (3b pav.).

Taip pat mes ištyrėme IgA susidarymą nuo T ląstelių priklausomų ir nuo T ląstelių nepriklausomus antigenus naudojant CD11b + ir CD11b - IgA + kompiuterius. Nuo T ląstelių priklausomo antigeno analizei pelės buvo imunizuotos per burną ovalbuminu (OVA) ir choleros toksinu (CT). Po trijų oralinių imunizacijų iLP buvo aptiktas didelis kiekis OVA specifinių IgA antikūnus sudarančių ląstelių (AFC), naudojant fermentų susietą imunosorbentinį tašką (ELISPOT); ši produkcija sumažėjo beveik 50%, kai prieš ELISPOT tyrimą buvo pašalintos CD11b + IgA + arba CD11b - IgA + ląstelės (3c pav.). Panašūs rezultatai buvo gauti, kai išvardijome IgA AFC prieš fosforilcholiną, tipišką TI antigeną, sukeltą kommensalinių bakterijų (3c pav.) 27 . Šie rezultatai kartu leido manyti, kad tiek CD11b + IgA +, tiek CD11b - IgA + ląstelėse buvo beveik vienodai IgA AFC, gaminantys IgA antikūnus, būdingus nuo T ląstelių priklausomiems ir nuo T ląstelių nepriklausomiems antigenams.

Tada, norėdami ištirti PP dalyvavimą, mes nustatėme PP-null peles, gydydami gimdą anti-IL-7Rα antikūnu 28, ir nustatėme, kad PP-null pelėms buvo sumažintas CD11b + IgA + PC skaičius iLP (3d pav. ). Be to, CD11b nebuvo ekspresuojamas ant IgA + B ląstelių PP (3e pav.). Pelės su anti-IL-7Rα antikūnais gydėme tik vieną kartą gimdoje ir patvirtinome, kad tai neturėjo įtakos ILF 28 . Nors vis dar įmanoma, kad CD11b + IgA + kompiuteriams reikalingas būtent IL-7, remiantis dabartinėmis išvadomis, patikimiausia išvada yra ta, kad CD11b + IgA + B ląstelėms reikalinga PP limfoidinė struktūra, o CD11b - IgA + B ląstelės įsigyja CD11b išraiška IPL.

Kaip ir antibiotikais gydytose bei MyD88 KO pelėse (1 pav.), CD11b - IgA + kompiuterių skaičius PP-null pelėse mažai pasikeitė (3d pav.), Kas rodo, kad mažai tikėtina, jog CD11b + IgA + kompiuteriai diferencijuotųsi į CD11b - IgA + ląstelės iLP. Šią nuomonę dar labiau patvirtina in vitro analizės rezultatai. Kai išgryninti CD11b + ir CD11b - IgA + kompiuteriai buvo atskirai kultivuojami naudojant įvairių rūšių stimuliatorius (pavyzdžiui, 12-mirotrato 13-acetato forbolas kartu su jonomicinu arba lipopolisaharidu), CD11b raiškos pokyčiai nebuvo pastebimi (papildomas S6 pav.). Nors šių ląstelių kilmė tebėra tvirtai nustatyta, yra tikėtina, kad CD11b + IgA + kompiuteriai veikia kaip atskira linija, kai jie diferencijuojasi iLP.

Didelis CD11b + IgA + kompiuterių proliferacijos aktyvumas

Toliau atlikome genų mikrotraumos analizę, siekdami įvertinti CD11b + IgA + kompiuterių unikalumą iLP. Genų ontologijos praturtinimo balų skaičiavimo analizė parodė, kad su ląstelių ciklu susijusių kelių aktyvumas buvo didesnis CD11b + IgA + kompiuteriuose nei CD11b - IgA + kompiuteriuose (papildoma S1 lentelė). Remiantis šiuo radiniu, CD11b + IgA + PC buvo pastebėta didesnė su ląstelių ciklu susijusių genų ekspresija nei CD11b - IgA + PC; šie genai apėmė ląstelių dalijimosi ciklo šeimos narius (4a pav. ir papildoma S2 lentelė). Vadinasi, šios ląstelės išreiškė aukštesnį proliferacijos žymens Ki67 lygį nei CD11b - IgA + PC (4a pav. Ir papildoma S2 lentelė). Be to, CD11b + IgA + kompiuteriai parodė didesnį bromodeoksiuridino (BrdU) įsisavinimą nei CD11b - IgA + kompiuteriai (4b pav.). CD11b + IgA + kompiuteriai buvo geriau pašalinti apdorojant ciklofosfamidu (CPM), kuris selektyviai nukreipia į proliferuojančias ląsteles (4c pav.). Šie duomenys kartu leido manyti, kad CD11b + IgA + kompiuteriai turėjo didesnį proliferacinį aktyvumą nei CD11b - IgA + kompiuteriai iLP.

Image

( a ) mRNR buvo išgryninta iš plonosios žarnos CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelių ir panaudota mikrotraumos analizei. Parodyti duomenys, susiję su ląstelių ciklu ir proliferacija. Duomenys atspindi du nepriklausomus eksperimentus. ( b ) Pelės buvo gydomos BrdU, o BrdU įsisavinimas CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelėse buvo nustatytas srauto citometrijos metodu. Duomenys atspindi keturis nepriklausomus eksperimentus. c ) Iš pelių, gavusių CPM, žarnos lamina propria buvo išskirtos ląstelės, kad būtų galima analizuoti CD11b + IgA + ląsteles. Panašūs rezultatai buvo gauti iš keturių atskirų eksperimentų. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis. Statistinė analizė atlikta naudojant Manno ir Whitney U testą.

Visas dydis

Mikro matricos analizė taip pat nustatė CD150 (dar žinomą kaip signalinės limfocitinės aktyvacijos molekulės šeimos narys 1, SLAMF1) 29, β1 integriną ir CD168 (dar žinomą kaip hialuronano tarpininkaujantis judrumo receptorius) 30 kaip galimus kandidatus, unikaliai išreikštus CD11b + IgA + kompiuteriuose (papildoma lentelė). S3). Srauto citometrinė analizė patvirtino, kad CD11b + IgA + kompiuteriai išreiškė didesnį CD150 kiekį nei CD11b - IgA + kompiuteriai, tuo tarpu CD11b + IgA + ir CD11b - IgA + kompiuteriai identiškai išreiškė β1 integriną ir neturėjo CD168 (papildomas S7 pav.).

IL-10 yra būtinas žarnyno CD11b + IgA + ląstelėms

Toliau siekėme nustatyti pagrindines molekules, sukeliančias ir palaikančias CD11b + IgA + kompiuterius iLP. Kadangi MyD88 pelėse sumažėjo CD11b + IgA + PC skaičius (1c pav.), O MyD88 yra ekspresuojamas ne tik hematopoetinėse ląstelėse, įskaitant B ląsteles, bet ir ne hematopoetinėse ląstelėse, įskaitant epitelio ląsteles 31, atlikome BM chimerinius eksperimentus nustatyti, ar MyD88 ne hematopoetinėse, hematopoetinėse arba abiejose ląstelėse buvo reikalingas CD11b + IgA + ląstelių generavimui. Panašus CD11b + IgA + ląstelių lygis buvo pastebėtas švitintose WT pelėse, gaunančiose WT ar MyD88 BM ląsteles, ir apšvitintose MyD88 pelėse, gaunančiose WT BM ląsteles (papildomas S8 pav.), Kas rodo, kad nuo MyD88 priklausomos molekulės paprastai išreiškiamos ir ne hematopoetinėse, ir kraujodaros ląstelės dalyvauja nuo mikrobų priklausomoje CD11b + IgA + PC indukcijoje.

Tada mes ištyrėme citokinų, kurie, kaip žinoma, sustiprina IgA atsaką, dalyvavimą. Tarp kelių IgA stiprinančių citokinų (pvz., IL-5, IL-6, IL-10 ir APRIL / BAFF) 7, 15 mes nustatėme, kad IL-10 neutralizavimas lemia, kad CD11b + IgA + PC yra sumažintas, tuo tarpu kitų citokinų blokavimas paskatino IgA + ląstelių skaičiaus sumažėjimą, nepaisant CD11b ekspresijos (5a pav.). Be to, IL-10 KO pelėse CD11b + IgA + ląstelių skaičius buvo sumažintas (5b pav.). Kadangi normalus diferenciacija į IgA + B ląsteles buvo pastebėta IL-10 KO pelių PP ir PerC (papildomas S9 pav.), Tikėtina, kad IL-10 siekia palaikyti CD11b + IgA + ląsteles iLP, bet ne IgA + ląstelių indukcija indukciniuose audiniuose, tokiuose kaip PP ir PerC.

Image

( a ) Pelės buvo gydomos antikūnais, kurie blokuoja IL-5, IL-6, IL-10 arba antagonistinį TACI-imunoglobulino (TACI-Ig) sulietą baltymą. Vienkartinės ląstelės buvo išskirtos iš iLP ir panaudotos CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelių analizei srauto citometrija. Duomenys pateikiami kaip vidurkiai ± sd ( n = 4). ( b ) Vieno branduolio ląstelės buvo išskirtos iš WT ar IL-10 KO pelių iLP, kad būtų galima analizuoti IgA ir CD11b raišką srauto citometrijos metodu. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis. Statistinė analizė atlikta naudojant Manno ir Whitney U testą.

Visas dydis

Ankstyvosios fazės tvirtas IgA atsakas dauginant IgA + kompiuterius

Norint ištirti IgA + PC, daugiausiai esančių CD11b + IgA + PC, imunologinę svarbą, pelės buvo imunizuotos per burną OVA ir CT. Atliekant šį tyrimą, imunizacijai viena grupė buvo gydoma CPM, o antra grupė - CPM gydymu praėjus 4 dienoms po galutinės imunizacijos (6a pav.). Dėl didelio ląstelių proliferacijos aktyvumo atliekant burnos imunizaciją CPM buvo veiksmingai užmuštos žemės riešutų agliutinino (PNA hi ) B220 + GC B ląstelės ir tokiu būdu sumažintas IgA + IgM - plazmos blastų skaičius PP (papildomas 1 pav.). S10). Taigi gydymas CPM peroralinės imunizacijos metu OVA specifinių IgA AFC skaičių sumažėjo maždaug 90% (6b pav.); tai buvo siejama su beveik visišku išmatų IgA, gautų prieš OVA, išnykimu (6c pav.). Kita vertus, kai pelės buvo gydomos CPM praėjus 4 dienoms po galutinės imunizacijos, kad būtų pašalintos proliferuojančios ląstelės, daugiausia esančios CDLb + IgA + ląstelėse iLP, OVA specifinių IgA AFC skaičius sumažėjo tik maždaug 50 % (6b pav.). Ši išvada atitiko mūsų dabartinę išvadą, kad CD11b + IgA + kompiuteriai sudarė pusę OVA specifinių IgA AFC skaičiaus (3c pav.). Taigi gydymas CPM po paskutinės imunizacijos, pirmiausia, prarado CD11b + IgA + ląsteles, nedaro įtakos CD11b - IgA + ląstelėms. Pažymėtina, kad šioms pelėms OVA specifinio IgA kiekis išmatose sumažėjo ~ 90%, palyginti su pelėmis, negydytomis CPM (6c pav.). Mes taip pat patvirtinome, kad gydymas CPM praėjus 4 dienoms po galutinės imunizacijos sukėlė IgA, specifinio CT B subvienetui (tai yra CTB), pagaminimo sumažėjimą, kuris buvo susijęs su CTB specifinių IgA AFC gausos sumažėjimu perpus. žarnyne (6d pav.). Kaip ir OVA specifiniai IgA atsakai (3c ir 6b pav.), Panašus CTB specifinių IgA AFC sumažėjimo laipsnis buvo pastebėtas, kai CD11b + IgA + ląstelės buvo išeikvotos prieš ELISPOT tyrimą (6e pav.). Šioms pelėms buvo sumažėjęs atsparumas peroraliniam infekciniam gydymui su CT ir išsivystė vandeningas viduriavimas (6f pav. Ir papildoma S11 pav.).

Image

a ) Peroralinės imunizacijos ir CPM gydymo grafikas. Pelės buvo oraliniu būdu imunizuotos OVA ir CT 0, 7 ir 14 dienomis. Vienai grupei buvo suteiktas CPM per burną skiepijant (0, 7 ir 14 dienos), o kitai - CPM po paskutinės imunizacijos (18, 19 ir 20 dienos). ( b, c ) Praėjus savaitei po galutinės imunizacijos (21 diena), mononuklearinės ląstelės buvo išskirtos iš iLP, norint ELISPOT ( b ) kiekybiškai įvertinti OVA specifines IgA sudarančias ląsteles. Tuo pačiu metu buvo surenkamos išmatos ( c, d ) ir buvo naudojamos aptikti CT (CTB) specifinio IgA ( c ) OVA arba ( d ) B subvienetą, naudojant fermentų susietą imunosorbentų tyrimą. Duomenys yra gauti iš atskirų pelių, o juostos rodo vidurkį ( b ) ir reiškia vidurkius ± sd ( n = 10) iš dviejų atskirų eksperimentų ( c, d ). * P <0, 001, ** P <0, 01, *** P <0, 05 (dviejų uodegų nesuderinta t- testas). ( e ) Vienkartinės ląstelės buvo išskirtos iš pelių, apdorotų pelėsiais arba CPM, iLP praėjus 1 savaitei po paskutinės imunizacijos, kad ELISPOT būtų galima įvertinti CTB specifines IgA sudarančias ląsteles. Kai kuriose grupėse, apdorotose pelėmis, CD11b + arba CD11b - IgA + ląstelės buvo sunaikintos, rūšiuojant ląsteles prieš pritaikant ELISPOT tyrimą. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis, o juostos rodo vidutinę. ( f ) 21 dieną pelėms buvo užkrėstas 100 μg KT. Po 15 h buvo išmatuotas žarnyno skysčio tūris. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis, o juostos rodo vidutinę. Panašūs rezultatai buvo gauti iš dviejų atskirų eksperimentų. ( g ) CTB specifinių IgA AFC taškų dydžiai buvo išmatuoti naudojant Zeiss KS ELISPOT programinę įrangą. Grafikai rodo atskirų pelių duomenis, o juostos rodo vidutinę. Statistinė analizė atlikta naudojant Manno ir Whitney U testą ( e - g ).

Visas dydis

Šie duomenys paskatino hipotezuoti, kad CD11b + IgA + kompiuteriai gali gaminti daugiau IgA nei CD11b - IgA + kompiuteriai. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes išmatuojome kiekvienos dėmės dydį CTB specifinių IgA AFC ELISPOT tyrime. Ląstelės, praturtintos CD11b + IgA + ląstelėmis (CD11b - IgA + ląstelių išeikvojimas), buvo didesnės nei CD11b - IgA + ląstelėmis praturtintose frakcijose (CD11b + IgA + ląstelių išeikvojimas) (6g pav.). Be to, įvaikinto perkėlimo eksperimentas parodė didesnę žarnyno IgA gamybą sunkioms kombinuotoms imunodeficito pelėms, gaunančioms CD11b + IgA + kompiuterius, nei toms, kurios gauna CD11b - IgA + kompiuterius (papildomas S12 pav.), Greičiausiai dėl tiek didelės IgA gamybos, tiek ir proliferuojančio CD11b veiklos + IgA + kompiuteriai. Nors negalima atmesti kai kurių galimybių (pavyzdžiui, skiepijantis IgA + ląstelių proliferaciją ir CD11b ekspresiją), tačiau tikėtina, kad iš žarnyno spindžio išskiriamo IgA gamyba iš esmės kilo iš CD11b + IgA + PC. ankstyva IgA reakcijos į peroraliai imunizuotą antigeną fazė.

Diskusija

Kompiuteriai gali išskirti antikūnus, kad užtikrintų antigenui specifinius humoralinius imuninius atsakus tiek sisteminiuose, tiek gleiviniuose audiniuose. Čia mes parodėme, kad pelių žarnyno IgA + PC galima suskirstyti į dvi populiacijas remiantis CD11b ekspresija. CD11b yra αM integrinas, kuris nekovalentiškai asocijuojasi su CD18, sudarydamas αMβ2 integriną (Mac-1) ir jungiasi prie ICAM-1 (nuoroda 24). Todėl mes tikėjomės, kad CD11b + IgA + kompiuteriai buvo naujai migruojančios ląstelės, kurių migraciją skatino endotelio ląstelės, ekspresuojančios ICAM-1, tačiau iš tikrųjų jų nebuvo. Taip pat neradome oponizuotų bakterijų įsisavinimo nei CD11b +, nei CD11b - IgA + ląstelėse (papildoma S4 lentelė ir papildoma S13a pav.), Nors CD11b yra komplemento (iC3b) 24 receptoriai. Be to, skirtingai nuo žmogaus CD11b + B ląstelių, kurios stipriai stimuliuoja T ląsteles 32, pagrindinis II klasės histokompatibilumo (MHC) kompleksas (IA d ) ir kostimuliacinės molekulės (pavyzdžiui, CD80) buvo vienodai ekspresuojamos tiek CD11b +, tiek CD11b - IgA. + ląstelės (papildoma S4 lentelė ir papildoma S13b pav.).

Panašus pogrupis CD11b + IgA + ląstelių buvo stebimas sisteminiuose pelių skyriuose (pavyzdžiui, blužnyje), tačiau šių ląstelių imunologinės savybės skyrėsi nuo žarnyno ląstelių. Iš tiesų, žarnyno CD11b + IgA + ląstelės buvo sudarytos tik iš kompiuterių, bet ne į atminties B ląsteles, tuo tarpu blužninės CD11b + IgA + ląstelės apėmė ir kompiuterius, ir atminties B ląsteles. Mes taip pat nustatėme, kad CD11b negalėjo būti naudojamas kaip B1 ląstelių žymeklis žarnyne. Dabartiniai mūsų atradimai pirmą kartą rodo, kad CD11b gali būti specifinis žymeklis, leidžiantis išskirti IgA + kompiuterius, kuriems reikalinga mikrobų stimuliacija ir IL-10, ir turbūt prisideda prie pelių žarnyno IgA atsako ankstyvojoje fazėje.

Pelėms mes nustatėme unikalius CD11b + IgA + kompiuterius; kitas klausimas yra, ar ta pati IgA + AK populiacija egzistuoja žmonėms. Mūsų išankstiniai eksperimentai parodė, kad nė viena žmogaus žarnyno IgA + ląstelė neišreiškia CD11b, tačiau kai kurios IgA + ląstelės ekspresuoja Ki67, dauginančių ląstelių žymeklį (neskelbti duomenys). Vienas iš galimų žmogaus ir pelių skirtumų paaiškinimų yra kommensalinių bakterijų sudėties skirtumas. Šiuo atžvilgiu mes ištyrėme segmentinių gijinių bakterijų (SFB), kurios yra žinomas pagrindinis pelių IgA dirgiklis, dalyvavimą, tačiau jos dar nėra patvirtintos kaip žmogaus mikrobiotos dalis 19 . Kaip ir tikėtasi, SFB stimuliavo IgA gamybą po SFB trūkumų turinčių C57BL / 6 pelių kolonizacijos iš Džeksono laboratorijos (JAX pelių) bakterijų suspensijomis iš SFB monoassocijuotų pelių (JAX + SFB pelės) 33 ; tačiau mes nustatėme, kad CD11b yra ekspresuojamas IgA + ląstelėse nepriklausomai nuo SFB kolonizacijos (papildomas S14 pav.). Gali būti, kad kitos kommensalinės bakterijos, tokios kaip Lactobacillus (gausu pelių) ir Bifidobacterium (gausu žmonių), yra atsakingos už specifinę CD11b raišką IgA + ląstelėse. Svarbu suvokti pelės ir žmogaus imuninės sistemos skirtumus, tačiau akivaizdu, kad dauginančių IgA + ląstelių yra ir pelės, ir žmogaus iLP. Todėl imunologinė žmogaus proliferuojančių IgA + ląstelių funkcija žarnyne bus kito mūsų tyrimo tema.

Pradiniame antikūnų atsako į T ląstelių priklausomus antigenus etape B ląstelės aktyvuojamos antigenais ir sudaro GC limfmazgiuose 7 . Kadangi antigenui specifinių GC B ląstelių sunaikinimas CPM apdorojant peroralinės imunizacijos metu, buvo visiškai prarastas IgA atsakas į peroraliai imunizuotą antigeną, tikėtina, kad tiek CD11b +, tiek CD11b - IgA + kompiuteriai prieš T ląstelių priklausomą antigeną yra gaunami iš GC B ląstelių. Mes taip pat nustatėme, kad proliferavusių CD11b + IgA + kompiuterių išeikvojimas apdorojant CPM po galutinės imunizacijos lėmė ankstyvos fazės IgA atsako sumažėjimą, nors įmanoma, kad proliferacijos aktyvumas ir (arba) CD11b ekspresija IgA + ląstelėse gali svyruoti skiepai. Mūsų in vivo duomenys parodė, kad CD11b + IgA + PC skaičiaus sumažėjimas pelėse MyD88 KO, IL-10 KO ir PP-null neturėjo įtakos CD11b - IgA + PC skaičiui (1c pav.). Šie atradimai kartu su mūsų in vitro duomenimis (papildomas S6 pav.) Rodo, kad tikėtina, jog CD11b + IgA + kompiuteriai veikia kaip atskira linija, kai jie išsiskiria iLP.

Dauginantis CD11b + IgA + kompiuterius reikėjo mikrobų stimuliacijos žarnyne. Kadangi proliferacija yra viena iš plazmos blastų savybių, buvo įmanoma, kad CD11b + IgA + ląstelės neseniai buvo atsidavusios PC likimui. Žymiai, žarnyno IgA + ląstelės ekspresuoja II klasės MHC molekules; ši išraiška yra viena iš unikalių plazmos blastų savybių. Todėl tikėtina, kad žarnyno IgA + PC iš dalies išlaiko savo plazmos pūtimo ypatybes. Tačiau mūsų išvados parodė, kad CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelės išreiškė vienodą Blimp-1 ir II klasės MHC lygį. Be to, panašus sumažėjimas pastebėtas CD11b + ir CD11b - IgA + ląstelėse, kai gydymas FTY720 buvo slopinamas ląstelių judėjimui iš IgA indukcinių audinių (pavyzdžiui, PP ir PerC) į iLP. Taigi, mūsų išvados rodo, kad CD11b + IgA + ląstelės vienareikšmiškai pasižymi dideliu proliferuojančiu ir IgA gaminančiu aktyvumu, nors jų, kaip PC, imunologinės savybės yra panašios į CD11b - IgA + PC.

Plazminiai CD138 + kompiuteriai buvo aptikti NZB / W pelių, turinčių sisteminės raudonosios vilkligės požymius, blužniuose, bet ne naiviose pelėse 34 . Priešingai, neplatinančių CD138 + kompiuterių skaičius GF pelių žarnyne nesikeičia, kaip ir NZB / W pelių blužnyje 34 . Šie duomenys rodo, kad nuo MyD88 priklausoma homeostatinė kommensalinių bakterijų stimuliacija lemia CD11b + IgA + CD138 + PC dauginimosi procesą žarnyne. Keli įrodymai atskleidė ląstelių ir molekulinius IgA atsakų inicijavimo nuo mikrobų mechanizmus. Kai kuriuose tyrimuose B ląstelės ekspresuoja kelis į rinkliavą panašius receptorius, o B ląstelių vidinis „MyD88“ perduodamas signalizavimas yra susijęs su padidėjusia antikūnų gamyba 35, 36 . Tačiau dabartiniai mūsų duomenys parodė, kad MyD88 tarpininkaujantis signalas kraujodaros ląstelėse, įskaitant B ląsteles, nebuvo būtinas žarnyno CD11b + IgA + PC gamybai. Be to, mes nustatėme, kad IL-10 yra pagrindinė molekulė, sukelianti CD11b + IgA + PC gamybą. Ankstesni tyrimai parodė, kad IL-10 skatina aktyvuotų B ląstelių dauginimąsi ir vėlesnį IgA gaminimąsi in vitro 37, 38, ir tai atitinka mūsų dabartinius atradimus apie didelio laipsnio CD11b + IgA + PC proliferaciją ir IgA gamybą. Taigi mūsų dabartiniai atradimai įrodė, kad IL-10 veikia IgA gamyboje in vivo ir kad CD11b + IgA + kompiuteriai yra pagrindiniai tikslai šiame kelyje. Nepaisant šių išvadų, mūsų preliminarus tyrimas parodė, kad CD11b + arba CD11b - IgA + PC gydymas vien IL-10 nesukelia jų abipusės diferenciacijos vienas į kitą, o IL-10 KO pelės, sergančios kolitu, turėjo CD11b + IgA + PC (JK)., neskelbtini duomenys). Taigi, kai kuriais atvejais IL-10 yra nereikalingas, o norint išlaikyti CD11b + IgA + kompiuterius, reikia papildomų veiksnių. Dabartiniai atradimai nustatė, kad CD150 yra paviršiaus molekulė, kuri yra labai ekspresuojama CD11b + IgA + kompiuteriuose. CD150 yra 70 kDa glikoproteinas, ekspresuojamas kai kuriose B ir T ląstelėse, timocituose ir makrofaguose 29 . Homofilinė CD150 sąveika skatina B ląstelių proliferaciją ir antikūnų sintezę 39, o ypač IL-10 sinergetiškai skatina CD150 tarpininkaujant B ląstelių proliferacijai 39 . Taigi tikėtina, kad bent iš dalies IL-10 ir CD150 lemia unikalius CD11b + IgA + kompiuterių požymius (pavyzdžiui, proliferaciją ir didelį IgA gamybą) iLP. Be to, sukaupti įrodymai atskleidė svarbią stromos ląstelių imunologinę funkciją kaip išgyvenamumo nišas kompiuteriams, esantiems BM 40 ir žarnyne 41, 42 . Gali būti, kad sudėtingos imunologinės komunikacijos tarp kommensalinės floros, epitelio ir stromos ląstelių bei įgimto ir įgyto imuniteto ląstelių lemia IgA PC diferenciaciją ir palaikymą žarnyne.

Apibendrinant, mūsų rezultatai suteikia naujų įžvalgų apie IgA + PC pobūdį pelių žarnyne ir ypač apie ankstyvosios fazės IgA reakcijų į žarnyno antigenus reguliavimą ir poreikį nuo mikrobų priklausomai stimuliacijai, IL-10 ir PP. limfoidinė struktūra. Šie atradimai suteikia naują pelių žarnyno IgA sistemos sudėtingumo lygį.

Metodai

Pelės

SPF ir GF Balb / c pelės buvo gautos iš Japonijos CLEA (Tokijas, Japonija). MyD88 KO pelės, IL-10 pelės (Balb / c fonas) ir TCRβδ pelės (C57 / BL6 fonas) buvo laikomos SPF sąlygomis Eksperimentinių gyvūnų skyriuje, Medicinos mokslo institute, Tokijo universitete, taip pat buvo naudojami WT pakratų draugai. kaip valdikliai. Žarnyno bakterijų išeikvojimui pelėms buvo skiriami plataus veikimo spektro antibiotikai, būtent ampicilinas (1 g l –1 ; Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO), vankomicinas (500 mg l – 1 ; Shionogi, Osaka, Japonija), neomicino sulfatas (1). gl −1 ; Sigma-Aldrichas) ir metronidazolas (1 g l −1 ; Sigma-Aldrichas) jų geriamajame vandenyje 4 savaites 43 . Norėdami nustatyti chimerines BM peles, į uodegos veną švirkšdavome γ-apšvitintas (960 rad, „Gammacell 40“, „Atomic Energy of Canada Limited“, Ontarijas, Kanada) peles su 5 × 106 BM ląstelėmis ir panaudojome jas eksperimentams praėjus 8 savaitėms po injekcijos. . Mūsų eksperimentinėmis sąlygomis ištirpinimo efektyvumas buvo apie 90–95%. Kad būtų gautos PP null pelės, nėščios BALB / c pelės buvo įšvirkščiamos į veną ir po oda 1 mg anti-IL-7Rα antikūno (A7R34, BioLegend, San Diego, CA) per 14, 5 dienos po bendravimo, kaip aprašyta anksčiau 28 . Mes patvirtinome organizuotų PP sutrikdymą ir ILF egzistavimą palikuoniuose, kaip aprašyta anksčiau 28 . Citokinų neutralizavimui pelės buvo įvedamos į pilvaplėvės ertmę 250 μg monokloninių antikūnų, būdingų IL-5 (TRFK5), IL-6 receptoriams (D7715A7) arba IL-10 (JES5.16E3) (BioLegend, San Diegas, CA); kontrolinis antikūnas (žiurkės IgG2b); arba 100 μg tirpaus TACI-Fc sulieto baltymo (R&D Systems, Mineapolis, MN) kas antrą dieną 2 savaites 44, 45 . Norint įvertinti SFB vaidmenį, pelėms, įsigytoms iš Džeksono laboratorijos, buvo peroralinės bakterijų suspensijos, gautos homogenizuojant vandenyje SFB monoassocijuotų pelių išmatų granules. SFB kolonizacija buvo patvirtinta kiekybine PGR 33 ir CD11b + IgA + ląstelės buvo tiriamos plonojoje žarnoje praėjus 2 savaitėms po gaktos, naudojant srauto citometriją. Visi eksperimentai buvo vykdomi vadovaujantis Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto, Tokijo universiteto ir Kolumbijos universiteto gairėmis.

Burnos imunizacija

Pelėms buvo duotas natrio bikarbonato tirpalas skrandžio rūgšties neutralizavimui 11, 13 . Po trisdešimt minučių pelės buvo imunizuotos 1 mg OVA (Sigma-Aldrich) ir 10 μg CT (List Biological Laboratories, Campbell, CA). Ši procedūra buvo atliekama 0, 7 ir 14 dienomis. Kai kuriose grupėse pelėms buvo duodama intraperitoniškai CPM (35 mg kg –1 kiekvieną kartą, Sigma-Aldrich). Praėjus vienai savaitei po galutinės imunizacijos, iš iLP buvo paimti išmatų mėginiai ir mononuklearinės ląstelės, kad būtų galima suskaičiuoti OVA specifinius antikūnų atsakus, naudojant fermentų susietą imunosorbentų tyrimą ir ELISPOT. In vivo KT testas buvo atliktas peroraliniu būdu nuteikusių arba imunizuotų pelių 100 μg KT, kaip aprašyta anksčiau 46 .

Ląstelių izoliacija

Norėdami atskirti vienbranduolines ląsteles iš PP, audinius išmaišome RPMI-1640 terpėje, kurioje yra 2% veršelio vaisiaus serumo ir 0, 5 mg ml −1 kolagenazės (Wako, Osaka, Japonija) 11, 13 . Norint atskirti vienbranduolines ląsteles nuo iLP, PP buvo atsargiai pašalintos, o likusios žarnos, įskaitant ILF, atidaromos išilgai, plaunamos RPMI-1640, supjaustomos į 2 cm dydžio gabalėlius ir 20 minučių maišomos 37 ° C temperatūroje į RPMI-1640, turinčią 0, 5 mM. EDTA ir 2% veršelio vaisiaus serumas epitelio ląstelėms ir intraepiteliniams limfocitams pašalinti 11, 13 . Tada audiniai buvo maišomi tris kartus 0, 5 mg ml – 1 kolagenazėje 20 min., Po to atliekant nepertraukiamą „Percoll“ gradiento centrifugavimą (40 ir 75%). Pilvaplėvės ląstelės buvo gautos praplaunant pilvaplėvės ertmę 8 ml ledinio fosfato buferiniu tirpalu (PBS) 11, 13 .

Srauto citometrija ir ląstelių rūšiavimas

Vienbranduolės ląstelės buvo iš anksto inkubuotos su 10 μg ml −1 anti-CD16 / 32 antikūnų (BD Biosciences, San Diegas, CA). Tada jie buvo sureaguoti su šiais antikūnais: Ramiojo vandenyno mėlynųjų žiurkių antivirusinės pelės CD45R (B220) (RA3-6B2, 0, 8 μg ml −1 ), fikoeritrinu (PE) -rat anti-pelės CD11b (M1 / 70, 0, 1 μg ml). −1 ), PE-Cy7-žiurkėno anti-pelės CD11c (HL3, 0, 4 μg ml −1 ), PE-žiurkės anti-pelės CD18 (C71 / 16, 0, 8 μg ml −1 ), PE-žiurkės antivirusinės pelės CD19 ( 1D3, 0, 8 μg ml −1 ), PE-žiurkės anti-pelės CD38 (90, 0, 13 μg ml −1 ), FITC-žiurkės anti-pelės IgA (C10-3, 2 μg ml −1 ), PE-Cy7-žiurkė anti-pelių IgM (R6-60.2, 1 μg ml −1 ), PE-anti-pelių IA d (AMS-32.1, 0, 4 μg ml −1 ), APC-Cy7-žiurkių anti-pelių CD11b (M1 / 70, 1 μg ml −1 ), APC-Cy7-anti-pelės β1-integrinas (HMβ1-1, 4 μg ml- 1 ), APC-anti-pelės CD40 (3/23, 2 μg ml −1 ), Ramiojo vandenyno mėlynasis anti- - pelė CD11b (M1 / 70, 1 μg ml −1 ), PE-Cy7-anti-pele F4 / 80 (BM8, 0, 4 μg ml −1 ) ir pelės biotinas anti-CD138 (281–2, 10 μg ml –1) ) (visi antikūnai iš BD Biosciences), po to inkubuojami su streptavidin-APC (1 μg ml −1, BD Biosciences), PE-anti-pele CD150 (TC15 -12F12.2, 0, 1 μg ml −1 ), „Alexa Fluor 647-anti-mouse CD80 (16-10A1, 1 μg ml −1 ) (BioLegend, San Diego, CA), anti-mouse CD267 (TACI) (8F10- 3, 4 μg ml −1 ) („eBioscience“, San Diegas, Kalifornija), PE pelės CCR3 (83101, 0, 5 μg ml −1 ) (tyrimų ir plėtros sistemos) arba biotinifikuoto žemės riešutų agliutinino lektino (1 μg ml −1, Vektorių laboratorijos)., Burlingame, CA), po to dažoma streptavidino PE (1 μg ml −1, BD Biosciences). Blimp-1 dažymui ląstelės buvo fiksuotos ir permeabilizuotos naudojant Cytofix / Cytoperm rinkinį (BD Biosciences) ir dažytos PE konjuguotu anti-Blimp1 ožkos polikloniniu IgG (0, 4 μg ml −1, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). . FSC-H ir FSC-A diskriminacija buvo naudojama norint pašalinti dvigubas ląsteles, o „ViaProbe“ ląstelių gyvybingumo sprendimas (BD Biosciences) buvo naudojamas negyvų ir gyvų ląstelių atskyrimui. Norėdami aptikti proliferuojančias ląsteles, pelėms 24 valandas prieš analizę į veną buvo įšvirkšta 1 mg BrdU; BrdU signalas buvo aptiktas gamintojo protokolu (BD Biosciences). Kaip neigiama kontrolė buvo naudojami su koncentracija suderinti izotipų antikūnai. Srauto citometrinė analizė ir ląstelių rūšiavimas buvo atlikti atitinkamai su FACSCanto II ir FACSAria (BD Biosciences). Mes patvirtinome, kad ląstelių grynumas buvo apie 95% (2a pav.).

Imunohistologinė analizė

Žarnynas buvo fiksuojamas 4% paraformaldehide 15 valandų 4 ° C temperatūroje, plaunamas PBS ir 12 valandų nuosekliai apdorojamas 10 ir 20% sacharoze esant 4 ° C 13 . Audiniai buvo įterpti į UŠT junginį (Sakura Finetechnical Co., Tokijas, Japonija). Kriostato sekcijos (7 μm) iš anksto užblokuotos anti-CD16 ir CD32 antikūnais 15 minučių kambario temperatūroje ir dažytos 15 valandų 4 ° C temperatūroje su FITC žiurkės antivirusiniu IgA (C10-3, 2 μg ml −1). ) ir biotino anti-pelės CD11b antikūnas (M1 / 70, 1 μg ml −1 ). Po to inkubacija su krienų peroksidaze (HRP) konjuguotu streptavidinu (Pierce, Rockford, IL) 30 min. 4 ° C temperatūroje ir fluorescencinio signalo amplifikacija Cy3-tiramidu (TSA-Direct rinkinys; PerkinElmer, Waltham, MA). 13 . Mes patvirtinome, kad signalas nebuvo aptiktas, kai bandiniai buvo dažomi koncentracijos atitikties izotipo antikūnais. Tada jie buvo išlyginti 4 ', 6-diamidino-2-fenilindoliu (Sigma-Aldrich). Bandinių dekonvoliuoti fluorescenciniai vaizdai buvo gauti fluorescencine mikroskopija (BZ9000, Keyence, Osaka, Japonija).

Antikūnų reakcijų aptikimas naudojant fermentų imunosorbentų analizę ir ELISPOT

Norint išmatuoti OVA arba CTB specifinį IgA kiekį išmatų ekstraktuose, išmatos buvo homogenizuotos PBS, intensyviai sukant 11, 13 . Po ekstraktų centrifugavimo (9000 g 15 min.) Supernatantai buvo naudojami kaip išmatų ekstraktai. Plokštelės buvo padengtos 1 mg ml −1 OVA arba 2 μg ml −1 CTB PBS; po to 1 valandą kambario temperatūroje blokavo 200 μl PBS, turinčio 1% (m / t) galvijų serumo albumino. Po to, kai buvo plaunami plokštelės su PBS, turinčiu 0, 05% Tween 20, buvo pridėti serijiniai mėginių skiediniai, skirti inkubuoti per naktį 4 ° C temperatūroje. Tada mėginiai buvo inkubuojami 1 valandą kambario temperatūroje su optimaliai atskiestu HRP konjuguotu ožkos anti-pelės IgA (SouthernBiotech, Birmingham, AL). Po mėginio plovimo spalvinė reakcija buvo vystoma kambario temperatūroje naudojant 3, 3 ′, 5, 5′-tetrametilbenzidiną (Moss, Pasadena, MD) ir nutraukiama pridedant 0, 5 M HCl. Spalvos reakcija buvo matuojama kaip optinis tankis (bangos ilgis 450 nm).

ELISPOT tyrimas buvo naudojamas IgA gaminančių AFC išvardyti iLP 11, 13 . Trumpai tariant, įvairios koncentracijos mononuklearinės ląstelės 4 valandas buvo kultivuojamos 37 ° C temperatūroje 96 šulinėlių nitroceliuliozės membranos plokštelėse (Millititer HA; Millipore, Bedford, MA), padengtose 1 mg ml –1 OVA ir 5 μg ml – 1 galvijų serumo albuminu. -konjuguotas fosforilcholinas (Biosearch Technologies, Novato, CA). Po intensyvaus plovimo plokštelių PBS ir PBS, turinčių 0, 05% Tween 20, buvo pridėta HRP konjuguoto ožkos anti-pelės IgA; tada plokštelės buvo inkubuojamos per naktį 4 ° C temperatūroje. AFC dėmės buvo sukurtos naudojant 2-amino-9-etilkarbazolą (Polysciences, Warrington, PA). Kiekvienos dėmės dydis buvo matuojamas naudojant Zeiss KS ELISPOT programinę įrangą (Oberkochen, Vokietija).

In vitro kultūra

CD11b + IgA + arba CD11b - IgA + PC (104 ląstelių kiekvienoje duobutėje) buvo išgryninti iš iLP ir kultivuojami 100 ng ml −1 forbolio 12-myristate 13-acetato ir 300 ng ml −1 jonomicino arba 10 μg ml - 1 lipopolisaharidas (visi iš „Sigma-Aldrich“) 24 valandas.

Bakterijų įsisavinimo tyrimui fluorescencinis Staphylococcus aureus buvo parinktas pagal gamintojo protokolą (Molecular Probes). Iš iLP išskirtos vienbranduolės ląstelės (2x105 ląstelės) buvo inkubuojamos su 1x105 oponizuotų bakterijų 90 min. Po plovimo ląstelės buvo dažytos PE-IgA (mA-6E1, 0, 5 μg ml −1, eBioscience) ir Ramiojo vandenyno mėlynojo CD11b antikūnais, o kiekvienos populiacijos bakterijų įsisavinimas buvo tiriamas srauto citometrijos metodu.

Mikro matricų analizė

Kaip jau anksčiau pranešėme 47, atlikta mikrotraumos analizė. Trumpai tariant, CD11b + IgA + ir CD11b - IgA + ląstelės buvo išskirtos iš iLP ir iš jų RNeasy rinkiniu (Qiagen, Diuseldorfas, Vokietija) buvo ekstrahuota visa RNR. cRNR buvo hibridizuota su DNR zondais „GeneChip Mouse Genome 430 2.0“ masyve (Affymetrix), išplauta ir pažymėta fluorescencija pagal standartinį amplifikacijos protokolą, kurį sukūrė „Affymetrix“. Kiekvieno zondo fluorescencijos intensyvumas buvo parodytas neapdorotos ekspresijos lygiui ir buvo kiekybiškai įvertintas naudojant „GeneChip Operating“ programinę įrangą (Affymetrix). Du nepriklausomų eksperimentų duomenys buvo analizuojami naudojant „GeneSpring 7.3.1“ programinę įrangą (Silicon Genetics). Visi mikrotraumų duomenys buvo deponuoti Nacionaliniame biotechnologijų informacijos centro „Gene Expression Omnibus“ duomenų bazėje (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/), prisijungimo Nr. GSE37225.

Statistika

Rezultatai buvo lyginami naudojant neparametinį Manno – Whitney U- testą ir neporinį t- testą (dviejų uodegų) („GraphPad Software“, San Diegas, CA).

Papildoma informacija

Prieigos kodai: „ Microarray“ duomenys buvo saugomi Nacionaliniame biotechnologijų informacijos centro Gene Expression Omnibus duomenų bazėje, serijos prisijungimo kodu GSE37225.

Kaip pacituoti šį straipsnį: Kunisawa, J. et al . Nuo mikrobų priklausomos CD11b + IgA + plazmos ląstelės tarpininkauja tvirtoms ankstyvosios fazės žarnyno IgA reakcijoms pelėms. Nat. Bendruomenė. 4: 1772 doi: 10.1038 / ncomms2718 (2013).

Prisijungimai

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE37225

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi S1-S14 paveikslai ir papildomos lentelės S1-S4

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.