Mikrofluidika pagrįsta šoninio vaizdo srauto kamera rodo perėjimą nuo pririšimo prie strypo riedėjančiuose neutrofiluose mokslinės ataskaitos

Mikrofluidika pagrįsta šoninio vaizdo srauto kamera rodo perėjimą nuo pririšimo prie strypo riedėjančiuose neutrofiluose mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių sukibimas
  • Vaizduojama imuninė sistema
  • Lab-on-a-chip
  • Mikroskopija

Anotacija

Neutrofilai, riedantys esant dideliam šlyties įtempiui (virš 6 dyn / cm 2 ), sudaro juostą gale ir priekinius stropus. Čia mes sukūrėme naują foto litografiniu būdu pagamintą silikono (PDMS) pagrindu sukurtą šoninio vaizdo srauto kamerą, skirtą dinamiškai vizualizuoti pririšimo ir diržo formavimąsi. Fluorescenciniu membranos ženklu pažymėti pelių neutrofilai, susukti ant P-selektino substrato, esant 10 dyn / cm2. Dauguma riedėjimo elementų sudarė 5 tvarsčius, kurių ilgis buvo 2–30 μm. Pažeidus vieną juostą, buvo atkuriamas ląstelės mikroįspūdis į priekį, parodant, kad diržas buvo nešantis. Apie 15% visų rišimo įvykių įvyko stropai. Perėjimas nuo pririšimo prie dirželio buvo greitas (<100 ms), o matomos medžiagos nebuvo ištiestos virš riedėjimo langelio, o tai rodo labai mažą juostos lenkimo modulį. Prieš nusileisdamas ant srauto kameros, riedėjimo pasroviui esantis diržas išlygintas pagal srovės kryptis. Šie nauji pastebėjimai paaiškina, kaip stropai formuojasi iš juostų, ir suteikia informacijos apie jų biomechanines savybes.

Įvadas

Neutrofilų granulocitai yra pirmosios imuninės ląstelės, reaguojančios į bakterines ir grybelines infekcijas. Didžioji dalis jų imuninio atsako aktyvumo vyksta už kraujagyslių, todėl jiems reikia ekstravazuoti 1, 2, 3 . Kaip pirmasis ekstravazacijos žingsnis, tekantys neutrofilai pradeda suktis išilgai kraujagyslių sienos. Valcavimą tarpininkauja selektai ir moduliuoja integrinai 4, 5 . Skirtingai nuo naivių limfocitų, neutrofilai sugeba riedėti esant dideliam sienos šlyties įtempiui (WSS) τ 6 . Šis neutrofilų gebėjimas yra glaudžiai susijęs su (i) selekinų sukibimo su jungtimi elgesiu, (ii) neutrofilų deformacija, dėl kurios sumažėja hidrodinaminis pasipriešinimas ir padidėja sąlyčio su siena plotas, (iii) susidaro pynės, ant kurių yra jėgos ir sukimo momento apkrovos 7 ir (iv) stropų, kurie gali tarnauti kaip lipnūs substratai, formavimas 8 .

Plunksnos yra ilgi mikronų skersmens vamzdeliai, ištraukti iš neutrofilų, besisukančių hidrodinaminio pasipriešinimo metu. Plėveliai susidaro už neutrofilų, atsirandančių iš mikrovidurių, ir jungiasi prie kraujagyslės sienelės per P-selekto glikoproteino ligandą -1 (PSGL-1), išreikštą mikrotraumų, jungiančių prie selektyvų, patarimais 8 . Remiantis in vitro eksperimentais, rišiklio tempimo jėga pasieks maždaug 80 pN 6, taigi tikimasi, kad vienas rišiklis smarkiai prisidės prie jėgų, kurios atsparios hidrodinaminiam neutrofilų tempimui (~ 470 pN, esant 10 dyn / cm2). Mechaninės juostų savybės leidžia joms ištiesti iš esmės nepakitusios tempimo jėgos, kai neutrofilas sukasi į priekį 7 . Galų gale jungtys, kurios tvirtina pririšimą prie pagrindo, nutrūksta po besisukančio neutrofilo, kurį mes vadiname pririšimu, nutrūkimu.

Pluoštai pirmą kartą buvo identifikuoti atliekant DIC mikroskopiją srauto kameros eksperimentuose 9, 10 už neutrofilų, besisukančių ant funkcionalizuoto stiklo pagrindo. Neutrofilų, turinčių fluorescenciniu ženklu pažymėtą membraną, juostos buvo pavaizduotos naudojant TIRF mikroskopiją, naudojant kiekybinio dinaminio pėdos atspaudo (qDF) metodą 6, 11 . Aukštos skyros qDF atvaizduose rišamieji tvirtinimo taškai pasirodė kaip ryškūs taškai iki 16 μm už riedėjimo celės, o tai rodo, kad juostos gali būti ne mažesnės kaip 16 μm. Ta pati technika buvo naudojama stropams aptikti, iki 22 μm ilgio konstrukcijų, rastų substrate priešais besisukančius neutrofilus. Tačiau TIRF mikroskopija neleido tiesiogiai stebėti perėjimo nuo pririšimo prie dirželio. Čia mes išbandėme hipotezę, kad stropai kilę iš juostų, besisukančių aplink valcavimo kamerą, atsiribojus nuo selekino substrato.

Neutrofilą, riedintį ant horizontalaus pagrindo ant įprasto vertikalaus (vertikalaus ar apversto) mikroskopo, užfiksuoti visą juostą ar stropą yra sudėtinga, nes šios struktūros turi didelius išilginius vertikalės (Z-) ašis, o vaizdavimas visada yra horizontali (XY-) plokštuma. Konfokalinis Z ašies optinis pjūvis turi mažą laiko ir erdvės skiriamąją gebą 12, be to, tai gali paskatinti balinimą ir fototoksiškumą. Todėl greitam dinaminiam neutrofilų riedėjimo procesui tai būtų prastos varžybos.

Srauto iš šono kameros anksčiau buvo įgyvendintos naudojant 45 ° pasvirusius veidrodžius 13, 14, 15 arba horizontaliai pritvirtintą objektyvą 16 . Pagal kitą metodą, valcavimo ląstelės buvo pavaizduotos ant vertikalios ~ 0, 6 mm apvalios kapiliarų sienos su agarozės sienelėmis 17, atskleidžiančios žmogaus neutrofilų WSS priklausomą deformaciją. Šios sąrankos neleido vaizduoti naudojant didelę skiriamąją gebą (didelę skaitmeninę diafragmą) ir mažus darbinio atstumo tikslus. Mūsų naujoji šoninio vaizdo srauto kamera gali būti tardoma su dideliais skaitmeniniais apertūros panardinimo tikslais, kad būtų pasiekta maksimali erdvinė skiriamoji geba.

Pirminių pelių neutrofilų, besisukančių ant vertikalios (XZ plokštumos) sienos, tyrimui naudojame mikrofluidinio srauto kamerą, kad visos juostos ir stropai būtų stebimi aukšta skiriamąja geba vienoje XY plokštumoje su dideliais skaitmeniniais apertūros objektyviais. Ši sąranka įgalina pirmąjį tiesioginį stebėjimą, kaip tiksliai apibrėžtame substrate pereinama nuo pririšimo prie stropo esant fiziologiškai svarbioms WSS reikšmėms.

Metodai

Šoninio vaizdo srauto kamera

Mikrofluidinį įrenginį sudarė polidimetilsiloksano (PDMS) mikroschema, kurios paviršiuje išgraviruoti mikro kanalai, ir # 1, 5 dangtelio stiklas, užkimšantis mikro kanalus (1 pav.). Lustai buvo liejami naudojant silicio plokštelę su litografiniu pavidalu pagamintu neigiamo fotorezisto reljefu (SU8-2000, Microchem, Westborough, JAV), ant jo paviršiaus kaip pagrindinį pelėsį 18 . PDMS paviršius buvo funkcionalizuotas reaktyviosiomis aminogrupėmis, naudojant silano chemiją. Mikrofluidiniame įrenginyje buvo vienas įėjimas, vienas išėjimas ir 12 identiškų lygiagrečių perfuzijos kanalų, kurių plotis w = 45 μm, aukštis h = 50 μm ir ilgis 5 mm (1A pav., B). Atliekant eksperimentus su išplautais neutrofilais, neutrofilų suspensija ir buferis buvo laikomi rezervuaruose, sujungtuose atitinkamai su prietaiso įėjimo ir išleidimo anga per PE10 (Becton Dickinson, Naujasis Džersis, JAV) vamzdelius. Perfuziją sukėlė teigiamas slėgio skirtumas ΔP tarp įvado ir išleidimo angos, kuris buvo hidrostatiniu būdu pastatytas įleidimo rezervuarą virš išleidimo rezervuaro. Kanalai pirmiausia buvo nugruntuoti PBS, po to funkcionalizuoti perfuzijos būdu su 1 μg / ml P-selektino-Fc (R&D Systems Inc., Mineapolis, JAV) PBS tirpalu 15 min., Ir galiausiai užblokuoti kazeinu PBS blokuojančiame tirpale (Thermo Fisher Mokslinis, Waltham, JAV) 1 val. P-selektinas - valcavimo priklausomybė nuo PSGL-1 sąveikos buvo tiriama pridedant P-selektino (klonas RB40.34, 5 μg / ml 15 min.) Arba PSGL-1 (klonas 4RB12, 5 μg / ml 15 min.), Blokuojant monokloninį. antikūnas prieš ląstelės suspensiją. Monokloniniai blokuojantys antikūnai buvo išgryninti iš hibridomos supernatantų Virdžinijos universiteto biomolekuliniame įrenginyje (Charlottesville, JAV). Proporcingumo koeficientas tarp ΔP ir WSS perfuzijos kanaluose buvo nustatytas perfuzuojant prietaisą su 500 nm fluorescencinių granulių vandenine suspensija (Polysciences, Warrington, JAV) ir apskaičiuojant jų maksimalų greitį v max, palyginti su ΔP. V max reikšmė buvo apskaičiuota padalijus rutuliukų ruožų ilgį ties kanalo simetrijos ašimi iš ekspozicijos laiko, o WSS kanalo vidurio plokštumoje (25 μm nuo apačios), τ , buvo apskaičiuota kaip τ = 4, 3 ηυ max / w , kur η yra klampumas, o 4, 3 yra koeficientas, išvedamas skaičiuojant modeliavimą.

Image

Srauto kamera surenkama vakuuminiu būdu užspaudžiant silikono (PDMS) mikrofluidinį lustą prie virš 1, 5 stiklo. ( A) srauto kameros schema; didelė rodyklė rodo srauto kryptį; valcavimo langelius simbolizuoja (ne masto) raudoni taškai. ( B) Vieno bandymo kanalo skerspjūvis YZ plokštumoje. Žiūrint iš šono ir iš apačios, vaizduojamos ląstelės, besisukančios ant dangtelio stiklo dugno ir šoninės silikono sienos. C) Sienų šlyties įtempių (WSS ) kalibravimas atsižvelgiant į perfuzijos slėgį su ląstelėmis ir be jų. ( D) Mažo padidinimo (20x) ryškių lauko vaizdų riedėjimo leukocitų vaizdas šoninio vaizdo srauto kameroje. Baltos rodyklės nurodo langelius, matomus iš šono, o raudona rodyklė - langelius, matomus iš apačios vaizdo perspektyvos. Mastelio juosta yra 45 μm.

Visas dydis

Neutrofilų paruošimas

Šio tyrimo eksperimentinės procedūros su gyvūnais buvo vykdomos laikantis patvirtintų rekomendacijų. Šias gaires patvirtino La Jolla alergijos ir imunologijos instituto, kuris yra AAALAC tarptautinė akredituota įstaiga, gyvūnų globos ir naudojimo institucinis komitetas. Kiekvienam eksperimentui buvo paimti kaulų čiulpai iš laukinio tipo pelių patelių, pakartotinai suspenduoti PBS ir filtruojami per 40 μm ilgio nailoninių ląstelių kamštį (Biologix, Lenexa, JAV). Iš to mėginio neutrofilai buvo praturtinti kambario temperatūroje neigiamos atrankos būdu pritaikytu neutrofilų sodrinimo rinkiniu („StemCell Technologies“, Vankuveris, Kanada). FACS matavimai parodė, kad> 70% ląstelių buvo neutrofilai (Ly-6G + ), o pagrindinės užteršiančios ląstelės buvo monocitai. Neutrofilų izoliatas buvo pakartotinai suspenduotas 2, 5 mln. Ląstelių / ml RPMI, papildytame 10% veršelio vaisiaus serumu (Dvyniai, Vakarų Sakramentas, JAV) ir 0, 1% penicilino-streptomicino (Gibco - Thermo Fisher Scientific, Waltham, JAV). Ląstelės membranai pažymėti naudojamas 4 μm Vybrant-DiO (Invitrogen, Carlsbad, JAV) arba 1 μm ląstelių kaukė žalia (Invitrogen, Carlsbad, JAV) arba 5 ng / μl (1: 100) anti-Ly-6G antikūnų, konjuguotų su Alexa. Į ląstelių suspensiją buvo įpilta „Fluor 488“ (klonas RB6–8C5, eBioscinece, San Diegas, JAV). Po 10 minučių inkubacijos, plaunant (DiO) arba neplaunant (ląstelių kaukė žalia, Ly-6G-AF488), suspensija buvo perfuzuota per srauto kanalus. Kai tik matėsi besisukančios ląstelės, perfuzijos tirpalas buvo perkeltas į PBS, kad būtų sumažintas foninis signalas, išplaunant tirpalą, kuriame yra laisvų dažų.

Vaizdo gavimas ir duomenų analizė

Besisukančių neutrofilų fluorescencinis vaizdas buvo atliktas naudojant „Leica SP5“ konfokalinį mikroskopą (Leica Microsystems Inc., Buffalo Grove, JAV), naudojant 63 x 1, 3 glicerolio panardinimo objektyvą. Norėdami peržiūrėti vaizdus iš apačios, buvo pavaizduoti apatiniame paviršiuje besisukantys langeliai, o šonuose - šoninėse sienose besisukantys langeliai (1 pav. B). Buvo naudojamas rezonansinis skaitytuvas, skirtas fiksuoti besisukančius neutrofilus 10 kadrų per sekundę greičiu; įprastu skeneriu buvo pavaizduotos fotofiksuotų ląstelių Z-krūvos. Fotofiksavimui 5 sekundes buvo įjungtas epifluorescencinis šviesos šaltinis, dėl kurio ląstelė buvo pertraukiama ar visam laikui sustabdyta, be matomų ląstelės pažeidimų. DIC vaizdas buvo padarytas naudojant Zeiss LSM 780 mikroskopą (Carl Zeiss Microscopy, Thornwood, JAV). Pagrindinis vaizdo apdorojimas ir atstumo matavimas buvo atlikti naudojant nemokamą Fidžio vaizdo analizės programą (svetainė: fiji.sc). Z-kamino rekonstrukcija ir ląstelių sekimas buvo atlikti naudojant „Imaris“ vaizdo analizės programinę įrangą („Bitplane“, Vindzoras, JAV). Statistinei analizei buvo atliktas studento T testas arba koreliacijos analizė.

Rezultatai

Srauto kamera

Pirminiai pelės kaulų čiulpų neutrofilai, sukti 5, 2 ± 1 (SEM) μm / s greičiu, esant WSS = 6–10 dyn / cm2 (n = 28) (1 papildomas filmas). Neutrofilų valcavimas buvo specifinis, nes to nebuvo pastebėta nepadengtuose kanaluose, kanaluose, iš anksto inkubuotuose su P-selektiną blokuojančiais arba PSGL-1 blokuojančiais antikūnais ląstelės suspensijoje.

Pririšimai stebimi iš apačios ir iš šono

Didesniame riedėjimo neutrofilų vaizde, kaip tikėtasi, buvo pritvirtinti tvirtinimo taškai už ląstelės kūno. Dėl riboto optinio profilio storio buvo matomi tik trumpi juostų segmentai (2A pav.). Neutrofilai, besisukantys 6–10 dyn / cm2, turėjo 4–10 pririšimų (mediana 5, n = 12). Pririšimai buvo pasiskirstę pagal didžiąją dalį tariamo neutrofilų pločio (2 pav. C), nes ričių skaičius mažėjo link neutrofilų periferijos (2 pav. D).

Image

(A) Konfokalinių neutrofilų, besisukančių iš kairės į dešinę, mikrografijos iš apačios. Židinio plokštuma yra tiesiai virš dangtelio stiklo, kad būtų galima užfiksuoti pririšimo tvirtinimo taškus, kurie atrodo kaip trumpos linijos (kai kurios pažymėtos baltomis rodyklėmis). ( B) Norint įvertinti rišiklio padėtį išilgai neutrofilų pločio, buvo matuojamas atstumas tarp neutrofilų Y vidurio linijos ir juostos Y projekcijos (D rišiklis ). ( C) Kiekviena pilka juosta parodo atskiro neutrofilo matomą plotį iš apačios vaizdo. Juodi deimantai nurodo juostos D pririšimo reikšmes. Nors juostų padėtys yra plačiai paskirstytos, jų skaičius yra maksimalus centrinėje 2 μm atkarpoje išilgai Y ašies. ( D) D pririšimo verčių histograma (normalizuota iki neutrofilų pusės pločio) vidurkis (± SEM) = 0, 35 ± 0, 03, min = 0, 01, maks. = 0, 96, n = 73. ( E) Neofilų vaizdas iš šono iš karto, paimtas iš karto. po jų arešto, kai vidutinis kelių kadrų vidurkis, siekiant pagerinti signalo ir fono santykį. Matomos tik juostos, esančios 2 μm gylyje. F) tariamo pririšimo ilgio, atstumo tarp pririšimo tvirtinimo taško ir taško, kuriame pririšimas susilieja su ląstelės korpusu, histograma, išmatuota šoniniame vaizde prieš pat juostos pertrauką; vidutinis (± SEM) = 9, 8 ± 0, 41 μm, min = 1, 2 μm, maks. = 30, 1 μm, n = 193. ( G) Neseniai sulaikyto neutrofilo 3D rekonstrukcijos vaizdas. Ant šoninės sienos besisukantis neutrofilas buvo fiksuotas nuotrauka ir paimtas konfokalinis Z-kaminas. ( H) Kai kuriais atvejais ant juostų buvo pastebėtos į vynuogę panašios struktūros (pažymėtos baltomis rodyklėmis). Mastelio juostos yra 8 μm, o atviros rodyklės rodo srauto kryptį.

Visas dydis

Vaizdai iš šono, nufotografuoti iškart po neutrofilų sulaikymo, atskleidė visus pririšimo segmentus tarp ląstelės kūno ir šoninės sienos (2 pav. E). Vaizdai iš šono rodo daug, bet ne visus kiekvieno neutrofilų pririšimus, nes optinio pjūvio storis yra apie 2 μm, o juostos pasiskirsto per ~ 7 μm ląstelės pločio, kaip parodyta apatinio vaizdo vaizduose (2 pav. C). Išanalizavus 193 pririšimo šoninius vaizdus, ​​nustatyta, kad esant 6–10 dyn / cm 2 WSS, vidutinis matomas pririšimo ilgis, nustatomas kaip atstumas tarp taško, kuriame rišiklis pasirodo iš ląstelės korpuso, ir taško, kur pririšimas pasiekia srauto kanalo sienelė buvo 9, 8 ± 0, 4 (SEM) μm; ilgiausio rišiklio ilgis buvo 30, 1 μm, o trumpiausio - 1, 2 μm (2F pav.). Rištuvo ilgis, matuojamas žiūrint iš šono, buvo žymiai (p <0, 0001) ilgesnis nei rišimo ilgis, matuojamas iš apačios (6, 5 ± 0, 4 (SEM) μm, svyruoja nuo 1 iki 24, 8 μm; n = 58), ir tai rodo sistemingą ilgųjų juostų atranką. apatinio vaizdo režimu.

Kai kuriuose eksperimentuose riedintieji neutrofilai buvo fotofiksuoti, kad būtų gautas visos ląstelės vaizdas iš šono Z pav. (2G pav. Ir 2 papildomas filmas). Vaizdai iš šono parodė, kad kai kurios juostos išilgai turi vynuogių pavidalo struktūras (2H pav.). Norėdami parodyti, kad juostos susidarymas nėra artefaktas, atsirandantis dėl membranų ženklinimo membranų tarpusavyje besiplečiančiais dažais (DiO ir „Cell Mask Green“), nepaženklinti riedintys neutrofilai buvo pavaizduoti DIC mikroskopija (papildomas 1 pav.) Arba suvynioti neutrofilai, paženklinti Ly-6G- AF488, fluorescenciškai pažymėtas antikūnas prieš neutrofilų paviršiaus žymeklį, buvo pavaizduotas konfokaline mikroskopija (papildomas 2 pav.). Abu šie metodai rodė pririšimus, panašius į tuos, kurie buvo stebimi naudojant DiO ir „Cell Mask Green“ dažus. Vaizdai iš šono taip pat patvirtino anksčiau praneštas pailgas valcavimo neutrofilų formas esant šlyties įtempiui 19, 20 .

Viršutinis lūžis lemia mikro šuolį

Toliau paklausėme, kokį vaidmenį palaikymo juostos vaidino atliekant neutrofilų sukimąsi. Jei atskiros juostos neša didelę apkrovą, neutrofilų riedėjimas turėtų smarkiai paspartėti iškart sulaužius diržą. Buvo išanalizuotas neutrofilų kadras tarp kadrų tarp paskutinio kadro, kuriame buvo matomas nepažeistas pririšimas (rėmas T), ir dviejų sekančių kadrų (rėmai T + 1 ir T + 2). Poslinkis tarp T ir T + 1 buvo 1, 7 ± 0, 1 (SEM) kartus didesnis nei tarp T + 1 ir T + 2 (n = 22), tai rodo, kad riedėjimo neutrofilas smarkiai pagreitėja, efektyviai atlikdamas šuolį, iškart po strypo pertraukos. . Kai kuriuose riedėjančiuose neutrofiluose buvo galima pastebėti daugybę iš eilės rišamųjų juostų pertraukas (3 pav. A), o iš karto po to sekė dideli neutrofilų poslinkiai (šuoliai). Vienoje ląstelėje (2 langelis 3A, B pav.) Kelios juostos nutrūko per ~ 0, 5 sekundės, todėl buvo padarytas labai didelis šuolis. Šie duomenys rodo, kad atskiros juostos smarkiai prisideda prie pasipriešinimo jėgos, neleidžiančios ląstelei judėti su tėkme.

Image

( A) Ritinių neutrofilų masės centro padėtis buvo stebima iš vaizdo įrašų kaip laiko funkcija. Paskutiniai rėmeliai, kur matomas tam tikras rišiklis, ir pirmieji kadrai, kurių daugiau nematyti, yra paryškinti pilkomis stulpeliais, kurie aiškinami kaip rišimosi pertraukos laiko taškai. Nustatyta, kad didesnio dydžio elementų pertraukimai per nustatytą laiko tarpą tarp kadrų sutampa su didesniais ląstelių poslinkiais, rodančiais reikšmingus trumpalaikius pagreičius ar mikrošuolius. ( B) Parodyti šeši iš eilės kadrai iš 2 langelio sekos (diapazonas pažymėtas raudona punktyrine linija A skyde). Baltos rodyklės nurodo rišamųjų tvirtinimų taškus ant paskutinio kadro, kur matomas pririšimas. Vertikalios linijos nurodo langelio priekį skirtingais laiko momentais. Prieš ilgą rišimo pertrauką įvyksta dvi trumpos pririšimo pertraukėlės, kiekviena pertrauka sukelia mikrošuolį. Pririšimo kaklelis priešais ląstelę sukasi pagal laikrodžio rodyklę kartu su elementu, proceso metu priartėdamas prie pagrindo (šoninės sienos). Masto juosta yra 8 μm.

Visas dydis

Perėjimas nuo pririšimo prie diržo

Ši srauto kamera iš šono „pirmą kartą“ leidžia vizualizuoti stropų susidarymą. Tiksliau, mes išbandėme hipotezę, kad stropai kilo iš juostų, todėl reikėjo išsamiai stebėti, kaip formuojasi diržai ir stropai. Iš šono (4A pav. Ir 3 papildomas filmas) ir iš apačios (papildomas 1 pav. Ir papildomas filmas 4) įrašų buvo pastebėta, kad stropai, pritvirtinti prie substrato priešais kamerą, po rišiklio pertraukų, siūlantys pririšti prie - vyksta lėtas perėjimas. Tačiau dėl didelio vėlavimo (3, 2 ± 0, 8 (SEM) sek.) Tarp dviejų įvykių eksperimentai iš pririšimo prie stropo iš apatinės apžvalgos kameros nebuvo tokie įtikinami ir taip pat tapo sunku nustatyti, kuris konkretus pririšimas tapo stropu. Skirtingai nuo apatinės vaizdo kameros, kurioje diržas tampa matomas tik po to, kai jis pritvirtinamas prie pagrindo, šoninis vaizdas leido stebėti stropas rėmuose iškart po juostelėmis, kurių pakaušis pertrauktas, maždaug per 100 ms nuo jų susidarymo ir dar ilgai, kol juos buvo galima pamatyti lauke. vaizdas iš apačios. Per tą laiko tarpą buvo galima pamatyti stropas, ištemptus išilgai srauto linijų priešais kamerą (4 pav. B). Skaičiuojamoji skysčio dinamika (CFD), parodanti Y greičio žemėlapį aplink riedėjimo elementą, patvirtino, kad iš pradžių stropai patiria greitį link sienos (4 pav. C). Kai ląstelė toliau riedėjo, priartindama stropo pritvirtinimo prie kameros vietą prie substrato, ištemptas diržas taip pat priartėjo prie pagrindo. Šoninio vaizdo laiko eilutės parodė, kad apie 15% visų laužymo juostų (28 iš 193) sudarė stropai. Taip pat stropai buvo stebimi ant „Ly-6G-AF488“ pažymėtų valcavimo neutrofilų (papildomas 2 pav.), Patvirtinantys, kad diržų susidarymas nėra artefaktas, kurį sukelia membranų ženklinimas DiO arba „Cell Mask Green“.

Image

( A) Pagrindiniai perėjimo nuo pririšimo prie stropo rėmai iš įrašo iš šono. Perėjimas įvyksta per 100 ms, tačiau užtrunka 1, 2 sek., Kol šis diržas pasieks pagrindą. Tuo laikotarpiu diržas nebus matomas žiūrint iš apačios. ( B) Vaizdai iš šono leido išmatuoti kampą tarp apatinio paviršiaus ir rišamosios medžiagos („ pririšti“ ) arba stropų („ diržo“ ). Parodyti du iš eilės kadrai su perėjimu nuo pririšimo prie stropo. C) Kompiuterinis skysčio dinaminis srauto aplink neutrofilą sąlygų modeliavimas esant 10 dyn / cm 2 sienos šlyties įtempiui. Šilumos žemėlapis rodo srauto komponento kryptį ir dydį statmenai dugno paviršiui (V Y ). Dešiniajame viršutiniame langelio kvadrante V Y yra nukreipta žemyn (pažymėta balta rodykle), o dešiniajame apatiniame langelio kvadrante V Y nukreipta į viršų (pažymėta raudona rodykle). Keturios baltos linijos, esančios dešinėje langelio pusėje, rodo, kaip stropai pasiskirstys modeliuojamo srauto sąlygomis. ( D) Paskutinės pririšimo / pirmosios stropo kampo poros buvo matuojamos perėjimais nuo pririšimo prie stropo. Kampų poros parodytos kaip juostinės dvigubos, kur pilka juosta žymi rišimo kampą, o juoda juosta rodo slinkties kampą. Vidutinis (± SEM) paskutinio rišimo kampas = 22, 3 ± 1, 2 °, min = 11, 8 °, max = 38, 7 °. Vidutinis (± SEM) pirmasis stropo kampas = 6 ± 1 °, min = 0 °, max = 24, 3 °. ( E) Atskirų juostų galutinis ilgis (pilkos juostos, min = 1, 8 μm, maks. = 25, 6 μm) ir pradinis stropų, kilusių iš tų juostų, ilgis (juodos juostos, min = 2, 3 μm, maks. = 31, 5 μm) skirtingoms juostoms. perėjimai prie stropo. ( F) Vidutinis (± SEM) visų juostų, juostų iki perėjimo prie diržo (perėjimo juostos) ir pradinio ilgio ilgių ilgių ilgis (± SEM). Mastelio juostos rodo 8 μm, didelės rodyklės rodo srauto kryptį.

Visas dydis

Mes išmatuojome kampą tarp pririšimo ir apatinio paviršiaus (ther pririšimas ). Vidutinis rišiklio ilgis ir neutrofilų skersmuo buvo 22, 3 ± 1, 3 (SEM) ° (4D pav.), Svyruojantis nuo 12 ° iki 38 °. Vidutinis kampas tarp diržo ir linijos, lygiagrečios sienelei, buvo 6 ± 1 (SEM) ° (Φ diržas ) (4B pav., D). CFD parodė, kad srovės judesiai priešais valcavimo kamerą buvo pakreipti žemyn. Tačiau kai ląstelė pasisuko ir stropas priartėjo prie substrato, CFD numatė aukštyn kylantį kampą (4 pav. C). Tai buvo eksperimentiškai patvirtinta apžiūrint trumpus stropus prie sienos (4B pav., Apatinė plokštė).

Palyginome rišamosios juostos ilgį prieš pat ir diržus iškart po perėjimo nuo pririšimo prie diržo (4 pav. E). Vidutinis galutinis pririšimo ilgis buvo 14, 6 ± 1 (SEM) μm, žymiai trumpesnis (p <0, 05) nei vidutinis pradinis diržo ilgis 12, 3 ± 1 (SEM) μm. Sruogelius formuojančios juostos buvo žymiai (p <0, 0001) ilgesnės (14, 6 μm) nei vidurkiai (9, 8 ± 0, 41 (SEM) μm) (4F pav.), Kas rodo, kad stropai yra geriau formuojami iš ilgesnių tvarsčių. Vidutiniškai stropai sudarė 81 ± 7% jų surištų juostų ilgio.

Diskusija

Čia mes pristatėme naują mikrofluidinę šoninio vaizdo srauto kamerą, suderinamą su didelės skiriamosios gebos mikroskopija, leidžiančią pirmą kartą tiesiogiai pastebėti perėjimą nuo pririšimo prie dirželio, kuris yra labai svarbus leukocitų sukibimui esant dideliam šlyties įtempiui. Ankstesniuose tyrimuose buvo teigiama, kad pririšimai sudaro stropus [6], tačiau tiesioginių įrodymų apie tai nebuvo. Dyžinės pertraukos negalėjo būti patikimai suderintos su stropų formavimu, nes pagal TIRF mikroskopiją stropai yra nematomi, kol jie yra labai arti pagrindo.

Mūsų duomenys rodo, kad apie 15% visų juostų sudaro stropai. Tai gali būti nepakankamai įvertinta, nes šoninio vaizdo srauto kamera fiksuoja tik ~ 2 μm atkarpą XZ plokštumoje ir todėl gali praleisti stropas, kurie galbūt iš židinio plokštumos pasislinko Y kryptimi. Tai gali sukelti atsitiktinis riedėjimo neutrofilų judėjimas Y kryptimi, kuris tikimasi, kai rakto tvirtinimo taškas bus 21, 22 centro viduryje. Kai strypas nutrūksta ir kitas necentrinis diržas tampa nešantis, ląstelė pasisuks apie Y ašį, kol ląstelės centras pasroviui nuo naujojo juostos. Kadangi atsegtas (prieš pasiekdamas sieną) stropas negali užtikrinti jokio mechaninio stabilumo, stropas pasyviai pasisuks Y kryptimi, jį privers J kaklo judėjimas ten, kur jis pritvirtinamas prie riedėjimo elemento 23, 24, 25 .

Perėjimas iš juostos, esančios už langelio, į stropą priešais celę, yra baigtas per mažiau nei vieną kadrą (100 ms). 28 perėjimuose nuo pririšimo prie dirželio galėjome pamatyti tik stropus ant pagrindo arba išlygintus išilgai srauto srovės priešais riedėjimo elementus ir niekada aukščiau riedėjimo elemento. Šis pastebėjimas atitinka numatomas fizikines stropų, sub mikronų skersmens vamzdžių, kurių atsparumas lenkimui yra 7, 26, 27, 28, fizikines savybes, kurios išilginio įtempio metu gali būti stabilios (kaip reikia norint sukurti pakankamai aštrius vaizdus esant 100 ms ekspozicijai)., bet ne veikiant skersinėms jėgoms. Iš tiesų, kai stropai yra priešais valcavimo elementus, prieš nusileisdami ant pagrindo, jie yra glaudžiai išlyginti palei srovę.

Daugelyje šoninių vaizdų perėjimo įrašų stropą galima patikimai suderinti su sulaužyta virve. Prieš nusileidimą stropai praleidžia kelis šimtus milisekundžių „kabėdami“ skysčio sraute. Tai paaiškina vėlavimą tarp juostos pertraukimo ir stropo susidarymo, stebimo naudojant qDF. Pakabinamų stropų apatinis paviršiaus kampas yra vidutiniškai 6 ± 1 (SEM) °. Tai atitinka nuostatą, kad stropai seka srauto profilį prieš ląstelę, ir ankstesnį intravitalinį mikroskopijos tyrimą su dalelių sekimo greičiu 29 . Plūduriuojantis stropas nepasiekia sienos, kol valcavimo neutrofilas nėra pakankamai pasisukęs, taigi stropo kilmė (kaklas) yra prie sienos. Šis stebėjimas atitinka stropų tvirtinimą prie citoskeleto 30, 31, tačiau šio tvirtinimo pobūdis šiuo metu nežinomas ir laukia tolesnių tyrimų.

Šoninio vaizdo kamera leidžia tiksliau išmatuoti rišiklio ilgį, palyginti su apatine vaizdo kamera. Tačiau akivaizdus ričių ilgis šoninio vaizdo srauto kameroje vis dar yra nepakankamai įvertintas, nes ryškesnę ląstelę kliudys rišiklio segmentas, esantis arti jo kaklo, kai kaklas nėra langelio pusiaujo plokštumoje. Jei juostos kilmė kilusi iš ląstelės kūno plokštumoje, kuri skiriasi nuo pusiaujo plokštumos, juostos dalis, esanti „už“ arba „priešais“ ląstelės pusiaujo, yra nematoma ir nebus išmatuota. Tai yra reikšminga, kaip parodyta (2 pav.), Kur daug juostų kyla ne iš pusiaujo plokštumos, o iš kitų plokštumų. Taigi, visiškai suprasti valcavimo su juostomis ir kilpais įmanoma tik vaizduojant iš šono ir iš apačios (arba iš viršaus), kaip aprašyta čia.

Vaizdai iš šono parodė, kad kai kurios juostos turi vynuogių pavidalo struktūras išilgai ilgio, ir tai rodo, kad vynuogės, stebimos fiksuotų neutrofilų su virvėmis 6 elektronų mikroskopu, nėra fiksacijos artefaktai. Panašios į vynuogę panašios struktūros buvo pastebėtos ant trinančių trombocitų juostų 32 . Šių struktūrų pobūdis nežinomas; viena teorija yra tai, kad tai yra mikrovilnių likučiai, kurie ištraukiami iš ląstelės kartu su membrana į juostą.

Mes pastebėjome, kad kiekviena rišiklio pertrauka lemia trumpalaikį ląstelės riedėjimo pagreitį (mikrotraumą). Tai rodo, kad prieš pat lūžį kiekvienas diržas yra nešantis apkrovą ir smarkiai prisideda prie jėgų, priešingų hidrodinaminiam elemento tempimui, ir tai patvirtina ankstesnės ataskaitos 6, 10 .

Dabartinėje konfigūracijoje šoninio vaizdo srauto kamera gali parodyti daugybę besisukančių ląstelių perfuzijos būdu su 250 μl ląstelių suspensija, kurioje yra 500 000 ląstelių. Reikalingas ląstelių suspensijos tūris gali būti dar labiau sumažintas įrenginyje su mažesniu perfuzijos kanalų skaičiumi. PDMS sienas galima lengvai padengti baltymais, todėl srauto kamera iš šono yra naudinga tiriant neutrofilų sustojimą ir kitų rūšių leukocitų 33, 34 ar trombocitų 35, 36 sąveiką .

Čia mes ištyrėme neutrofilus, besisukančius ant P-selektino, neturintį integrino ligando. Dydžių ir diržų susidarymas sudėtingesniuose substratuose nebuvo ištirtas. Neutrofilai, besisukantys ant E-selelino, taip pat sudaro diržus ir rišiklius 6 . Apie kitų leukocitų pririšimą ir dirželių susidarymą mažai žinoma, išskyrus tai, kad T-helper 1 (Th1) CD4 limfocitai, bet ne naivūs CD4 T limfocitai, besisukantys ant P-selekino, sudaro stropas ir virves 6 .

Apibendrinant, mes tiesiogiai parodome ant neutrofilų, besisukančių ant P-selektino, kad kai kurios juostos suformuoja stropas, kurios prieš nusileidžiant ant substrato yra išlygintos išilgai srovės krypties prieš ląstelę; juostos yra kilusios iš beveik bet kurios leukocitų pločio vietos; juostos yra nešančiosios ir todėl tiesiogiai susijusios su ląstelių valcavimu. Padarome išvadą, kad naujoji šoninio ir apatinio srauto kamera yra universali priemonė ląstelių riedėjimui, sukibimui ir migracijai srautui tirti.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Marki, A. et al. Šoninio vaizdo srauto kamera, pagrįsta mikrofluidika, rodo perėjimą nuo pririšimo prie strypo riedėjančiuose neutrofiluose. Mokslas. Rep. 6, 28870; „doi“: 10.1038 / srep28870 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas filmas

  2. 2.

    2 papildomas filmas

  3. 3.

    3 papildomas filmas

  4. 4.

    4 papildomas filmas

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.