Mikroglia, iš anksto paruošta dėl deguonies ir gliukozės trūkumo, skatina išeminių žiurkių funkcinį atsigavimą mokslinės ataskaitos

Mikroglia, iš anksto paruošta dėl deguonies ir gliukozės trūkumo, skatina išeminių žiurkių funkcinį atsigavimą mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Insultas

Anotacija

Ląstelių terapija, kuria remiasi pleiotropiniai mechanizmai, gali palengvinti pacientų, patyrusių insultą, funkcijų atkūrimą. Mes iškėlėme hipotezę, kad ląstelių terapija, naudojant mikroglia, iš anksto kondicionuotą deguonies ir gliukozės trūkumu (OGD), yra terapinė išeminio insulto strategija, nes optimali išemija sukelia priešuždegimines M2 mikroglia. Iš pradžių išeminės žievės angiogenezės pokyčius ir aksonų ataugą apibrėžėme žiurkėmis. Mes nustatėme, kad išeminės šerdies pasienio srityje 7–14 dienų po išemijos buvo suaktyvinta nedidelė angiogenezė be aksonų išaugimo. Toliau mes pademonstravome, kad pirminės mikrogliozės, su sąlyga, kad 7 dienos OGD yra 18 valandų, paskyrimas paskatino funkcinį atsistatymą praėjus 28 dienoms po židininės smegenų išemijos, palyginti su kontroliniu gydymu, kai žymiai atsiskyrė tokie rekonstravimo veiksniai, kaip kraujagyslių endotelio augimo faktorius, matricos metaloproteinazė-9, ir augimo faktoriaus β pavertimą poliarizuotu M2 mikrogliais in vitro / vivo . Apibendrinant galima pasakyti, kad intraveninis M2 mikroglia suleidimas, iš anksto paruoštas naudojant optimalų OGD, gali būti nauja terapinė kovos su išeminiu insultu strategija.

Įvadas

Daugiau nei pusė pacientų, išgyvenusių išeminį insultą, kenčia nuo motorinių sutrikimų 1 . Iki šiol fizinė reabilitacija tebėra vienintelė veiksminga terapinė galimybė paspartinti šių pacientų funkcinį atsigavimą 2 . Todėl būtina nustatyti kitas terapines strategijas, palengvinančias pacientų, patyrusių insultą, funkcinį atsigavimą poūmio ir lėtinio etapais.

Įrodyta, kad angiogenezė yra būtinas funkcinis atsigavimas po širdies išemijos 3, todėl kyla galimybė, kad angiogenezės sustiprinimas yra viena strategijų, palengvinančių funkcinį atsigavimą po išeminio insulto 4 . Iš tikrųjų ankstesnis tyrimas, naudojant graužikų modelį, parodė, kad sustiprėjusi angiogenezė, į veną leidžiant kraujagyslių endotelio augimo faktorių (VEGF) praėjus 2 dienoms po smegenų išemijos, paskatino funkcinį atsigavimą 5 . Tačiau sisteminė VEGF injekcija sukelia neigiamą poveikį, įskaitant hipotenzinį ir tachikardinį įvairių gyvūnų atsaką 6, 7, 8 . Be to, ankstyvas VEGF paskyrimas gali paskatinti kraujo ir smegenų barjero (BBB) ​​sutrikimą, kuris sukelia smegenų edemą ir hemoraginę transformaciją 5 . Todėl pageidautina terapinė strategija, kuri sustiprintų angiogenezę be šių neigiamų padarinių.

„Vieno tikslo“ terapijos gali nepakakti, nes smegenų išeminė trauma yra susijusi su keliais mechanizmais. Buvo pasiūlyta, kad terapinis požiūris turėtų būti nukreiptas į daugelį ląstelių tipų, siekiant sustiprinti apsaugą ir atsistatymą 9 . Ląstelių terapija, naudojant kaulų čiulpų mononuklearines ląsteles arba kaulų čiulpų iš mezenchiminio kamieno / stromos ląsteles, gali būti veiksminga „įvairių taikinių“ terapinė strategija, palengvinanti pacientų, patyrusių insultą, poūmio ir lėtinės fazės funkcijų atsistatymą per pleiotropinius mechanizmus 9, 10 . Vienas iš tokių mechanizmų, stebėtų ląstelių terapijoje, naudojant nervų progenitorines ląsteles, kaulų čiulpų stromos ląsteles ir mezenchimines kamienines ląsteles, buvo angiogenezės sukėlimas išskiriant VEGF arba smegenų išvestą neurotrofinį faktorių (BDNF) 11, 12, 13 . Taip pat pranešta, kad po tokios ląstelėmis pagrįstos terapijos padidėja aksonų užaugimas 13, 14 . Tačiau neseniai atliktas kelių centrų randomizuotas kontroliuojamas tyrimas parodė, kad pacientams, kuriems yra išeminis insultas, kaulų čiulpų mononuklearinių kamieninių ląstelių švirkštimas į veną nebuvo teigiamas 15 . Be to, išlieka keletas klinikinių problemų, įskaitant kaulų čiulpų ląstelių, patenkančių į BBB 16, veiksmingumą ir kaulų čiulpų ląstelių surinkimo techninį saugumą pacientams, kuriems taikoma antikoaguliantų ar antitrombocitinių terapija antrinei insulto prevencijai.

Ląstelių terapija, naudojant mikroglia, gali būti perspektyvi nauja terapinė strategija, nes gliaukinės ląstelės yra pagrindinis aukščiau paminėtų augimo faktorių CNS 9, 17 šaltinis. Nors keli tyrimai parodė, kad mikroglia gali išplėsti smegenų infarkto tūrį ūminėje fazėje 18, 19, žinoma, kad po smegenų išemijos subbautinėje ir lėtinėje fazėse mikrogliagos vaidina apsauginį vaidmenį per audinių ir kraujagyslių rekonstrukciją 19, 20 . Šios išemijos sukeltos apsauginės mikroglijos yra vadinamos M2 mikrogliais, o laikoma, kad jų apsauginis poveikis atsiranda dėl atstatymo veiksnių, tokių kaip VEGF ir BDNF, matricos metaloproteinazės-9 (MMP-9) ir transformuojančio augimo faktoriaus beta ( TGF-β) po išemijos 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, kurios gali palengvinti priešuždegiminį, angiogenezinį ir aksonų augimą po smegenų išemijos. Be to, persodintos mikroglijos gali kirsti BBB, ypač esant išeminei būklei 26, 27, 28 . Todėl mes spėliojome, kad ląstelių terapija, naudojant mikroglia, iš anksto paruoštą pagal išeminę būklę, gali būti ideali ir patogi išeminio insulto gydymo strategija.

Šiame tyrime mes iškėlėme hipotezę, kad mikroglia, iš anksto paruošta dėl deguonies ir gliukozės trūkumo (OGD) ir skiriama į arteriją, gali kirsti BBB, išskirti smegenų parenchimos atstatymo veiksnius ir turėti pleiotropinį terapinį poveikį skatinant angiogenezę ir aksonų augimą prieš židininė smegenų išemija net ir poūmio fazėje. Norėdami patikrinti šią hipotezę, pirmiausia apibrėžėme angiogenezės pokyčius laikinai ir išeminio šerdies bei penumbros aksonų augimą žiurkių pereinamojo židinio smegenų išemijos modelyje. Tada mes ištyrėme, ar pirminės mikrogliacijos, kurias sąlygojo optimalus OGD, paskatino funkcinį atsistatymą, sustiprinant angiogenezę ir aksonų ataugą po židinio smegenų išemijos.

Rezultatai

Angiogenezė išeminio šerdies pasienio fazės židinio smegenų išemijos fazėje

Norėdami nustatyti išsamią angiogenezės lokalizaciją ir laikinus pokyčius po trumpalaikės židininės smegenų išemijos, mes atlikome imunofluorescencinį dažymą prieš išeminę Sprague-Dawley žiurkių žievę, naudodami antikūną prieš endotelio ir angiogenezės žymenis, diferenciacijos klasterį (CD) 31 (1A pav.) ir B). Konfokaliniai mikroskopiniai tyrimai atskleidė, kad išeminio šerdies, apibrėžto kaip su mikrotubuliais susieto 2-ojo baltymo (MAP2) neigiama sritis, pasienio srities CD31 tūrio vienetui imunoreaktyvumas sumažėjo per 1 dieną po smegenų išemijos ir pasiekė minimalų lygį praėjus 3 dienoms po smegenų išemija, palyginti su fiktyviai operuotomis žiurkėmis (visos P <0, 001) (1B pav.). Tačiau imuninės reakcijos į CD31 tūrio tūrio vienetą toje pačioje srityje padidėjo praėjus 7 ir 14 dienų po smegenų išemijos, palyginti su 3 dienomis po smegenų išemijos (atitinkamai P = 0, 013 ir P <0, 001). Išeminio penumbra, apibrėžto kaip MAP2 teigiamas regionas (P = 0, 083) (1 pav. 1B), reikšmingų pokyčių, susijusių su CD31 tūrio tūrio vienete, imunoreaktyvumo pokyčių nepastebėta.

Image

( A ) 31 diferenciacijos klasteris (CD31; žalias) / su mikrotubuliu susijęs baltymas 2 (MAP2; raudonas) / 4 ′, 6′-diamidino-2-fenilindolis (DAPI; mėlynas), trigubas smegenų žievės žymėjimas ne išeminiu (fiktyviai operuota) ir išeminė šerdis bei penumbra praėjus 1, 3, 7 ir 14 dienų po smegenų išemijos, ištirtos konfokaline mikroskopija. CD31 ir MAP2 yra atitinkamai angiogenezės ir neuronų dendritų žymenys. Trimatės rekonstrukcijos vaizdai parodo angiogenezės ir neuronų dendritų pokyčius laikinai išeminėje šerdyje ir penumbroje. Tik antrinių antikūnų kontrolė patvirtina jo specifiškumą. Svarstyklės, 15 μm. ( B ) CD31 teigiamo tūrio (μm 3 ) tūrio vienetui (μm 3 ) imunoreaktyvumas 1 (D1), 3 (D3), 7 (D7) ir 14 (D14) dienomis po smegenų išemijos (N = 21). ). * P <0, 05, ** P <0, 01, ## P <0, 01, palyginti su fiktyviai operuotomis žiurkėmis. ( C ) MAP2 (žalia) / Ki67 (raudona) / DAPI (mėlyna) trigubas smegenų žievės žymėjimas išeminiu šerdimi ir penumbra, ištirtas konfokaline mikroskopija. Ki67 yra ląstelių proliferacijos žymeklis praėjus 7 dienoms po smegenų išemijos. Svarstyklės, 20 μm. ( D ) CD31 (žalia) / Ki67 (raudona) / DAPI (mėlyna) trigubas smegenų žievės žymėjimas ne išeminiu (fikciniu būdu operuojamu) ir išeminiu šerdimi praėjus 1, 3, 7 ir 14 dienų po smegenų išemijos. konfokalinė mikroskopija. Rodyklės rodo Ki67 teigiamus angiogeninius endotelio branduolius. Svarstyklės, 20 μm. ( E ) CD31 / Ki67 dvigubai teigiamų kraujagyslių iš išeminės šerdies skaičius per 1 (D1), 3 (D3), 7 (D7) ir 14 (D14) dienas po smegenų išemijos (N = 21). * P <0, 05, ** P <0, 01.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme, kurios ląstelės dalyvavo angiogenezėje po smegenų išemijos. Mes nustatėme, kad Ki67 buvo išreikštas išeminės šerdies pasienio srityje, bet ne išeminėje penumbroje ar žiurkėms, operuotoms netikru būdu (1 pav. C). Be to, Ki67 teigiamos ląstelės išeminės šerdies pasienio srityje šiek tiek padidėjo 3 dieną ir pastebimai padidėjo 7 dienas po smegenų išemijos (1 pav. D ir E). Ki67 raiška buvo stebima endotelio ląstelių, pericitų ir mikrogliaudų branduoliuose, bet ne astrocitų branduoliuose (1 pav. D, papildomas 1 pav.). Ki67 teigiamos endotelio ląstelės išeminės šerdies pasienio zonoje taip pat pastebimai padidėjo praėjus 7 dienoms po smegenų išemijos žiurkių autologiniame tromboemboliniame modelyje su audinių plazminogeno aktyvatoriu (papildomas 2 pav.).

Išeminės šerdies ir penumbros aksonų neaugs iki 14 dienų po židininės smegenų išemijos

Norėdami ištirti neuronų regeneraciją po židininės smegenų išemijos Sprague-Dawley žiurkių išeminėje žievėje, mes atlikome imunofluorescencinį dažymą, naudodami antikūnus prieš aksoninį žymeklį SMI31 ir dendrito žymeklį, atitinkamai, MAP2. 29 Konfokaliniai mikroskopiniai tyrimai parodė, kad išeminėje šerdyje nebuvo SMI31 ir MAP2 imuninio dažymo (1A ir 2A pav.). Be to, imuninės reakcijos į SMI31 tūrio vienetui išeminės penumbros pasienio srityje palaipsniui mažėjo po smegenų išemijos ir nebuvo atkurtos net per 14 dienų po smegenų išemijos (3 diena, P = 0, 018; 7 diena, P <0, 001; diena). 14, P <0, 001) (2A ir B pav.). Priešingai, laikinas MAP2 imunoreaktyvumo sumažėjimas tūrio vienetui buvo pastebėtas tik 1 dieną po smegenų išemijos (P = 0, 06) (1A ir 2C pav.).

Image

( A ) SMI31 (žalia) / 4 ′, 6′-diamidino-2-fenilindolio (DAPI; mėlyna) dvigubas ženklinimas ne išeminiame (operaciniu būdu veikiamame), išeminiame šerdyje ir išeminėje penumbra žievėje 1, 3, 7, ir 14 dienų po smegenų išemijos, ištirtos konfokaline mikroskopija. SMI31 yra neuronų aksonų žymeklis. Tik antrinių antikūnų kontrolė patvirtina jo specifiškumą. Svarstyklės, 15 μm. (B) Imuninės penumbros SMI31 tūrio (μm 3 ) tūrio vienetui (μm 3 ) imunoreaktyvumas 1 (D1), 3 (D3), 7 (D7) ir 14 (D14) dienomis po smegenų išemijos (N = 21). # P <0, 05 ir ## P <0, 01, palyginti su fiktyviai operuotomis žiurkėmis. C) Imuninės penumbros (μm 3 ) tūrio vieneto (μm 3 ) MAP2 tūrio imunoreaktyvumas 1 (D1), 3 (D3), 7 (D7) ir 14 (D14) dienomis po smegenų išemijos (N = 21).

Visas dydis

Terapinis OGD sąlygojamų mikroglijų poveikis židininei smegenų išemijai

Norėdami ištirti pirminės OGD sąlygotos pirminės mikroglijos transplantacijos poveikį židininei smegenų išemijai, palyginome neurologinius rezultatus tarp nekontroliuojamų ląstelių grupės, OGD iš anksto kondicionuotų pirminių astrocitinių transplantacijų grupių ir OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialinių transplantacijų grupių pagal sensomotorinę skalę po židinio smegenų smegenų. išemija. Neurologinis deficitas, išmatuotas atliekant kampinį testą, reikšmingai pagerėjo OGD kondicionuojamų mikroglialų transplantacijos grupėje, palyginti su nekontroliuojamąja grupe be ląstelių ir su OGD kondicionuojamų astrocitinių transplantacijų grupe 28 dieną po smegenų išemijos (atitinkamai P = 0, 006 ir 0, 024) ( 3A pav.). 1, 3, 7, 14, 21 ir 28 dienomis po smegenų išemijos reikšmingų kūno svorio skirtumų tarp trijų grupių nebuvo (P = 0, 281) (papildomas 3A pav.).

Image

( A ) Žymiai geresnis funkcinis atsistatymas atliekant kampinį testą (atliekamas 20 kartų) yra stebimas OGD kondicionuotų mikroglialų transplantacijos grupėje (mikro grupėje), palyginti su nešiklio injekuota kontroline grupe (be ląstelių kontrolinės grupės) ir OGD parengtomis astrocitinėmis transplantacijomis. grupė (astro grupė); ## P <0, 01, palyginti su astro grupe, ** P <0, 01, palyginti su ląstelių kontrolės grupe (N = 4 vienai grupei). ( B ) žymiai geresnis funkcinis atsistatymas atliekant kampinį testą (atliekamas 20 kartų) yra stebimas OGD kondicionuotų mikroglialinių transplantacijų grupėje, palyginti su normoksine mikroglialinio transplantacijos grupe (norma); # P <0, 05 (N = 6). OGD kondicionuotos mikroglijos ( C ), bet ne OGD kondicionuotos astrocitai ( D ) iš GFP pelių (žalios) migruoja į pasienio zoną tarp išeminės šerdies ir penumbros, palyginti su laukinių pelių pelėmis 3 dieną po transplantacijos. Mastelio juosta, 50 μm. ( E ) Tipiniai skaičiai ir juostinės diagramos, rodančios adhezijos receptoriaus makrofago-1 antigeno (Mac-1) (CD11b / CD18; žalia) santykinio signalo intensyvumą pirminėse mikroglionose normoksinėmis ir OGD sąlygomis. Konfokaliniai mikroskopiniai „Mac-1“ (žalios spalvos) / DAPI (mėlynos) vaizdai su dvigubu mikroglijos žymėjimu. Baltos spalvos skalės juostos, 15 μm. Brūkšninis diagrama parodo normoksinių mėginių signalo intensyvumo santykį vienoje ląstelėje su OGD kondicionuotų mėginių santykiu (N = 5). Specifiškumui patvirtinti buvo naudojama tik antrinė antikūnų kontrolė. * P <0, 05.

Visas dydis

Toliau, norėdami ištirti OGD išankstinio kondicionavimo poveikį funkciniam atsistatymui po mikroglialų transplantacijos, išanalizavome neurologinius rezultatus tarp OGD kondicionuotų mikroglialinių transplantacijų grupės ir normoxia-microglial transplantacijos grupės, naudodami sensorimotorinę skalę po židinio smegenų išemijos. Neurologinis deficitas, išmatuotas atliekant kampinį testą, žymiai pagerėjo OGD kondicionuotų mikroglialinių transplantacijų grupėje, palyginti su normoxia-microglial transplantacijos grupe, praėjus 28 dienoms po smegenų išemijos (P = 0, 023) (3B pav.). Po smegenų išemijos 1, 7, 14, 21 ir 28 dienomis reikšmingų kūno svorio skirtumų tarp grupių nebuvo (P = 0, 71) (papildomas 3B pav.). Po transplantacijos nepastebėta jokių alerginių reakcijų ar transplantato ar šeimininko ligų simptomų.

Norėdami patvirtinti, ar OGD paruošti mikroglia ir astrocitai migravo į smegenų parenchimą per BBB, mes skyrėme tiek OGD paruoštus pirminius mikroglionus, tiek astrocitus, gautus iš žaliųjų fluorescencinių baltymų (GFP) transgeninių pelių 28, 30 . Sušvirkštus šias arterijas į arteriją, 3 dienomis po transplantacijos pasienio ruože tarp išeminio šerdies ir penumbros buvo pastebėtos OGD iš anksto kondicionuotos GFP mikroglijos, bet ne praėjus 21 dienai po transplantacijos. Priešingai, nei per 3, nei po 21 dienos po transplantacijos nebuvo pastebėta OGD sąlygojamų GFP astrocitų (3D pav.). Leukocitų adhezijos receptoriaus makrofago-1 antigenas (Mac-1) (CD11b / CD18) yra β2 integrinas, kuris yra konstituciškai ekspresuojamas leukocitų ir mikrogliacijos paviršiuje, taip pat kiekybiškai jį reguliuoja uždegimo mediatoriai ir išemija. „Mac-1“ tarpininkauja tvirtam leukocitų adhezijai prie kraujagyslės, jungdamasis prie savo endotelio ligando, tarpląstelinio adhezijos molekulės-1 (ICAM-1) / CD31. „Mac-1“ trūkumas gali sumažinti jautrumą infiltracijai ir migracijai po smegenų išemijos 31, 32 . Norėdami ištirti OGD išankstinio kondicionavimo poveikį mikrogliozėms, mes palyginome Mac-1 ekspresijos lygius mikroglionose normoksinėmis ir OGD sąlygomis. Mes nustatėme, kad Mac-1 lygiai po pirminio kondicionavimo OGD buvo dvigubai didesni nei normaliomis sąlygomis (P = 0, 038) (3E pav.).

Ryškūs augimo faktorių ir MMP-9 lygio pokyčiai, kuriuos išskiria OGD paruoštos gliaudos ląstelės

Norėdami ištirti OGD išankstinio kondicionavimo poveikį mikrogliozėms, palyginome VEGF ir BDNF lygius mikroglialinėse ir astrocitiškai kondicionuotose terpėse normoksinėmis ir OGD sąlygomis. Kaip aprašyta skyriuje „Metodai“, mes anksčiau nustatėme, kad optimalus inkubacijos laikas esant OGD būklei yra 18 h, nes ši sąlyga sukėlė pakankamą oksidacinį ir hipoglikeminį stresą, nesukeldama ląstelių mirties 33, 34 . Be to, po smegenų išemijos M2 mikroglia buvo aptinkama nuo 12 val., Maksimaliai padidėjo po 24 val., O vėlesniais laiko momentais pastebimai sumažėjo 20 . Todėl 18 valandų prieš transplantaciją inkubavome mikroglia OGD sąlygomis.

Mes nustatėme, kad VEGF lygiai iš mikroglialinių ir astrocitiškai kondicionuotų terpių po pirminio kondicionavimo OGD buvo žymiai didesni nei normaliosiose sąlygose (atitinkamai P = 0, 006 ir <0, 001) (4A pav., Papildomas 4A pav.). Be to, po OGD išankstinio kondicionavimo terpės, gautos iš astrocitinės, bet ne mikroglialinės, terpės BDNF lygis buvo didesnis nei normalios toksinės būklės (atitinkamai P = 0, 004 ir P = 0, 198) (4A pav., Papildomas 4B pav.) .

Image

( A, B ) Sekretorinių kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF), iš smegenų išvesto neurotrofinio faktoriaus (BDNF) ( A ) ir matricos metaloproteinazės-9 (MMP-9) ( B ) lygiai, gauti iš kondicionuotų pelių pirminių kultivuotų mikrogliaijų iki normoksijos (norma) arba OGD (N = 6–8 kiekviena). ** P <0, 01. ( C ) Sekretorinių priešuždegiminių citokinų, tokių kaip transformuojantis augimo faktorius β (TGF-β) ir interleukinas-10 (IL-10), ir priešuždegiminių citokinų, tokių kaip IL-6, naviko nekrozės faktorius α ( TNF-α) ir IL-1β iš kondicionuotų terpių pelių, auginamų pirminiu būdu išaugintose mikrogliutuose, kuriems buvo atlikta normoksija (norma) arba OGD (kiekviename N = 6). ** P <0, 01. ( D ) TGF-β santykis vienam TNF-α, atspindintis mikroglialinę poliarizaciją po normoksijos ir OGD išankstinio kondicionavimo (kiekviena N = 6). Padidėjęs TGF-β santykis viename TNF-α atskleidžia M2 mikroglionų poliarizaciją po pirminio kondicionavimo OGD. ** P <0, 01.

Visas dydis

Taip pat išmatuojome MMP-9 lygį mikroglialinėse ir astrocitinėmis sąlygose palaikomose terpėse po OGD išankstinio kondicionavimo, nes po smegenų išemijos MMP-9 šaltiniai yra mikroglia 35 ir galimai astrocitai 36 . Mes nustatėme, kad MMP-9 lygis iš mikroglialinių ir astrocitiškai kondicionuotų terpių po pirminio kondicionavimo OGD buvo didesnis nei normalios toksikologinės būklės (atitinkamai P = 0, 001 ir 0, 005) (4B pav., Papildomas 4C pav.).

Galiausiai, norėdami nustatyti OGD iš anksto kondicionuotų mikrogliozių citokinų profilių pokyčius, palyginome kelių citokinų, gautų iš mikroglionų, normoksinėmis ir OGD sąlygomis. Paprastai M2 mikrogliacijos išskiria interleukiną (IL) -10 ir TGF-β, tuo tarpu M1 mikrogliacijos išskiria naviko nekrozės faktorių alfa (TNF-α), IL-1β ir IL-6 19, 20 . Mes nustatėme, kad priešuždegiminis citokino TGF-β kiekis po OGD išankstinio kondicionavimo buvo 25 kartus didesnis nei normalaus toksinio aktyvumo (P = 0, 002) ir kad priešuždegiminis citokino IL-6 lygis po OGD išankstinio kondicionavimo buvo pusė tiek pat, kiek esant normalioms sąlygoms (P <0, 001). Priešingai, priešuždegiminiai citokinai TNF-α ir IL-1β po OGD išankstinio kondicionavimo buvo tris ir keturis kartus didesni nei normalaus toksiškumo sąlygomis (atitinkamai P <0, 001 ir P <0, 001), tuo tarpu lygis nesiskyrė. priešuždegiminio citokino IL-10, gauto iš mikrogliozės, tarp OGD išankstinio kondicionavimo ir normoksinių sąlygų (P = 0, 35) (4C pav.). TGF-β santykis, tenkantis TNF-α, atspindintis M1 ir M2 mikroglijų 3 poliarizaciją iš OGD iš anksto kondicionuotų mikroglionų, buvo šešis kartus didesnis nei santykis, gaunamas mikroglia esant normoksiškoms sąlygoms (P = 0, 009) (4D pav. ). Visi šie rezultatai rodo, kad išankstinis kondicionavimas optimalia OGD sąlyga gali mikrogliais paversti priešuždegiminį M2 potipį.

Mikroglialinis M2 jungiklis, kai į arteriją įvedama 18 h-OGD kondicionuotų mikroglijų

Norėdami ištirti OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantacijos poveikį pažeistoms smegenų parenchimoms, atlikome persodintų žiurkių smegenų imunohistocheminius tyrimus praėjus 3 dienoms po transplantacijos, panaudodami antikūnus prieš indukuojamą azoto oksido sintazę (iNOS, M1 žymeklis) (5A pav.) Ir CD206 (M2 žymeklis) (5B pav.). Konfokalinis mikroskopinis tyrimas atskleidė, kad iNOS teigiamų ląstelių skaičius pasienio ruože tarp išeminio šerdies ir penumbros per 3 dienas po transplantacijos OGD kondicionuotų mikroglialinių transplantacijų grupėje buvo mažesnis nei normoksinės mikroglia transplantacijos grupėje (P <0, 001). ) (5A ir C pav.). Priešingai, CDG-610 teigiamų ląstelių skaičius pasienio ruože tarp išeminio šerdies ir penumbros per 3 dienas po transplantacijos OGD kondicionuotų mikroglialinių transplantacijų grupėje buvo didesnis nei normoksinės mikroglia transplantacijos grupėje (P = 0, 13) (). 5B ir C pav. CD206 teigiamų ląstelių ir iNOS teigiamų ląstelių santykis, atspindintis M1 ir M2 mikroglia 19 poliarizaciją, OGD būklėje buvo dvidešimt kartų didesnis nei normoksinėje būklėje (P = 0, 001) (5 pav. D). Visi šie rezultatai rodo, kad OGD sąlygota mikroglialų transplantacija gali sukelti mikrogliukozės M2 perjungimą.

Image

Reprezentatyvūs skaičiai rodo ląstelių skaičių, kuriame teigiamas M1 specifinis žymeklis (indukuojama azoto oksido sintazė, iNOS) ( A ) ir M2 specifinis žymeklis (diferenciacijos grupė 206, CD206) ( B ) pasienio ruože tarp išeminio šerdies ir penumbros. smegenų žievės, esančios normoksinės mikroglialų transplantacijos grupėje arba OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantacijos grupėje, praėjus 3 dienoms po transplantacijos (10 dienų po smegenų išemijos). Konfokaliniai mikroskopiniai vaizdai, rodantys „iNOS“ arba CD206 (raudona) / 4 ′, 6′-diamidino-2-fenilindolio (DAPI; mėlyna) dvigubą žymėjimą išeminėje žievėje. Svarstyklės, 15 μm. ( C ) Stulpelio diagrama, vaizduojanti iNOS ir CD206 teigiamų ląstelių skaičių sienelėje tarp išeminio šerdies ir penumbros iš normoksinio mikroglijos transplantacijos grupės smegenų žievės arba OGD paruoštos mikroglijos transplantacijos grupės 3 dienas po transplantacijos. ( D ) Stulpelio diagrama, vaizduojanti CD206 teigiamų ląstelių ir iNOS teigiamų ląstelių santykį, atspindintį mikroglialų poliarizaciją po normoksijos ir OGD išankstinį kondicionavimą (N> 21). ** P <0, 01.

Visas dydis

VEGF, MMP-9 ir TGF-β ekspresija atliekant OGD kondicionuotą mikroglialinę transplantaciją

Norėdami patvirtinti, ar funkcinis atsistatymas po OGD iš anksto kondicionuotų mikroglionų persodinimo buvo susijęs su VEGF, MMP-9 ir TGF-β reguliavimu pažeistoje smegenų parenchimoje, atlikome transplantuotų žiurkių smegenų imunohistocheminius tyrimus, naudodami antikūnus prieš VEGF, MMP- 9 ir TGF-β praėjus 28 dienoms po smegenų išemijos. Kadangi fiktyviai operuotų žiurkių smegenyse VEGF, MMP-9 ir TGF-β ekspresijos nebuvo aptinkamos, pasienio išeminės šerdies ir penumbros pasienio zonoje pastebėta reikšmingų VEGF, MMP-9 ir TGF-β ekspresijų. 28 dienos po smegenų išemijos (21 diena po transplantacijos). Imunoreaktyvumo intensyvumo analizė parodė, kad šių remodeliavimosi veiksnių išraiškos buvo ryškesnės OGD kondicionuotų mikroglialų transplantacijos grupėje, o ne ląstelių kontrolės grupėje ir OGD sąlygojamų astrocitinių transplantacijų grupėje (abi P <0, 001) (6A – C pav.). ). VEGF ir MMP-9 išraiškos buvo stebimos ne tik mikrogliagliuose, bet ir pericituose, endotelio ląstelėse ir išeminės žievės neuronuose (papildomi 5 ir 6 pav.). Be to, TGF-β ekspresija buvo stebima išeminės žievės mikrogliaose, taip pat pericituose ir neuronuose (papildomas 7 pav.).

Image

( A – C ) Reprezentaciniai skaičiai ir santykinis kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ( A ), matricinės metaloproteinazės-9 (MMP-9) ( B ) ir transformuojančio augimo faktoriaus β (TGF-β) ( C ) signalo intensyvumas ( C). ) iš nekontroliuojamos grupės ir mikroglijų ar astrocitų persodintų grupių smegenų žievės 28 dieną po smegenų išemijos. VEGF ( A ), MMP-9 ( B ) ir TGF-β ( C ) (raudona) / MAP2 (žalia) / DAPI (mėlyna) smegenų žievės žymėjimas trigubu žymeniu tarp išeminio šerdies ir penumbros 28 dienomis po reperfuzija, ištirta konokaline mikroskopija. Tik antrinių antikūnų kontrolė patvirtina jo specifiškumą. Svarstyklės, 15 μm. Brūkšniniai grafikai parodo santykinį išeminių smegenų mėginių signalo intensyvumą, palyginti su ląstelių kontrolės mėginiais (N = 21–28). ** P <0, 01.

Visas dydis

Angiogenezės skatinimas atliekant OGD sąlygojamą mikroglialų transplantaciją

Mes spėliojome, kad VEGF, MMP-9 ir TGF-β ekspresijos atlikus OGD kondicionuotą mikroglialinę transplantaciją gali skatinti angiogenezę. Taigi, ištyrę išeminės žievės imunofluorescenciniu dažymu 28 dienas po smegenų išemijos, mes ištyrėme OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantacijos poveikį angiogenezei, naudodami antikūną prieš angiogenezės žymeklį CD31 (7A pav.). Konfokaliniai mikroskopiniai tyrimai atskleidė, kad OGD mikrogliacijos transplantacijos grupėje išeminio šerdies pasienio rajone esančio CD31 imunoreaktyvumas tūrio vienetui buvo akivaizdesnis nei ląstelių nekontroliuojančioje grupėje ir OGD sąlygotoje astrocitinių transplantacijų grupėje 28 dienas po smegenų išemijos. (praėjus 21 dienai po transplantacijos) (P <0, 001 ir P <0, 001). Vis dėlto reikšmingo skirtumo tarp trijų grupių CD31 tūrio vienetui išeminės penumbros srityje nebuvo reikšmingo.

Image

( A ) Reprezentatyvūs skaičiai ir brūkšniniai grafikai, vaizduojantys imuninės reakcijos į CD31 tūrį vienetui tūrį, išreikštą μm 3 / μm 3, išeminiame šerdyje ir penumbroje iš smegenų žievės, esančios ne ląstelių kontrolės grupėje, OGD-astrocitu ar OGD-mikroglia, persodinto. grupėms praėjus 28 dienoms po smegenų išemijos. Diferenciacijos klasteris (CD31; žalias) / 4 ′, 6′-diamidino-2-fenilindolio (DAPI; mėlynas) dvigubas ženklinimas išeminėse žievėse per 28 dienas po smegenų išemijos, ištirtas konfokaline mikroskopija. Svarstyklės, 15 μm. ( B ) Reprezentatyvūs skaičiai ir brūkšniniai grafikai, atspindintys imuniteto SMI31 ir MAP2 teigiamų tūrio vienetų tūrį, išreikštą μm 3 / μm 3, išeminėje penumbra iš nekontroliuojamos ląstelių grupės smegenų žievės ir OGD paruošto astrocito arba OGD. kondicionuotų mikroglia persodintų grupių 28 dieną po smegenų išemijos. Su SMI31 (žalias) arba su mikrotubuliais susijęs 2 baltymas (MAP2; raudonas) / DAPI (mėlynas) dvigubas žymėjimas išeminės žievės srityje praėjus 28 dienoms po smegenų išemijos, ištirtas konfokaline mikroskopija. Svarstyklės, 7 μm. ( C ) Reprezentatyvūs skaičiai ir brūkšninės diagramos, atspindintys chondroitino sulfato proteoglikano / neuronų-glialinio antigeno 2 (CSPG / NG2; žalia) santykinį signalo intensyvumą iš ląstelių nekontroliuojančios grupės smegenų žievės ir OGD paruošto astrocito arba OGD kondicionuoto. mikroglia persodintos grupės 28 dieną po smegenų išemijos. CSPG / NG2 (žalia) / DAPI (mėlyna) dvigubas smegenų žievės žymėjimas išeminiu penumbra per 28 dienas po smegenų išemijos, ištirtas konfokaline mikroskopija. Svarstyklės, 15 μm. Grafikas parodo santykinį mikrochelijos ar astrocitų, persodintų į išeminius smegenų mėginius, signalo intensyvumą, palyginti su mėginiais iš nekontroliuojamų ląstelių (N = 21–28). Brūkšninė diagrama parodo santykinį išeminių smegenų mėginių signalo intensyvumo santykį, palyginti su fiktyviai operuotų žiurkių mėginiais (N = 21–28). Be to, tik antrinių antikūnų kontrolė patvirtina jo specifiškumą. * P <0, 05, ** P <0, 01.

Visas dydis

Aksono ataugimo skatinimas atliekant OGD sąlygojamą mikroglialų transplantaciją

Mes ištyrėme OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantacijos poveikį aksonų ataugai išeminės žievės imunofluorescenciniu dažymu 28 dienas po smegenų išemijos, naudojant antikūnus prieš neurofilamentinio baltymo žymenį SMI31. SMI31 išraiška išeminiame penumbra OGD kondicionuotų mikroglialinių transplantacijų grupėje buvo ryškesnė nei ląstelių nekontroliuojančioje grupėje ir OGD kondicionuotų astrocitinių transplantacijų grupėje (atitinkamai P <0, 001 ir P <0, 001) (7B pav.) . Be to, kito aksoninio peraugimo žymens - su augimu susijusio baltymo 43 (GAP43) 14 - išraiška OGD kondicionuotų mikroglialų transplantacijos grupėje išeminiame penumbre taip pat buvo labiau pastebima nei ląstelių nekontroliuojančioje grupėje ir OGD iš anksto kondicionuotų astrocitinių transplantacijų grupėje. (Atitinkamai P <0, 001 ir P <0, 001) (papildomas 8 pav.). Priešingai, reikšmingo skirtumo tarp trijų grupių MAP2 išraiškos išeminėje penumbroje nebuvo (7 pav. B).

Norėdami nustatyti mechanizmą, pagal kurį OGD sąlygota mikroglialų transplantacija skatina aksonų išsiveržimą, įvertinome chondroitino sulfato proteoglikano (CSPG) išraišką, nes jis slopina aksonų 37 augimą ir yra skaidomas bei skaidomas MMP-9 38 . Norėdami patvirtinti mūsų hipotezę, kad padidėjus MMP-9 ekspresijai dėl OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantacijos, gali sumažėti CSPG, dėl to gali atsirasti aksonų atauga, mes atlikome dažymą imunofluorescenciniu būdu, naudodami anti-CSPG / neuronų-glijų antigeno 2 (NG2) antikūną (NG2). yra pagrindinis CSPG komponentas) (7 pav. C). Palyginome CSPG / NG2 ekspresijos intensyvumą žiurkėmis operuotoms žiurkėms ir transplantuotoms žiurkėms 28 dieną po smegenų išemijos. Konfokaliniai mikroskopiniai tyrimai atskleidė, kad CSPG / NG2 raiška išeminiame OGD kondicionuotų mikroglialų transplantacijos grupės penumbra buvo daug mažesnė nei ląstelių nekontroliuojančioje grupėje (P <0, 001) ir OGD sąlygojamų astrocitinių transplantacijų grupėje (P = 0, 038). praėjus 21 dienai po transplantacijos (28 dieną po smegenų išemijos).

Diskusija

Pirmiausia mes ištyrėme laikinus pokyčius ir išsamią angiogenezės ir aksonų ataugimo (neuronų regeneracijos) vietą po smegenų išemijos, nes buvo manoma, kad angiogenezė ir aksonų užaugimas peri-infarkto srityje skatina funkcinį atsigavimą 13, 39 . Mes įrodėme, kad endotelio proliferacija ir vėlesnė angiogenezė buvo aktyvuota pasienio zonoje, esančioje MAP2 neigiamos išeminės šerdies srityje, bet ne išeminėje penumbroje, praėjus 7 dienoms po smegenų išemijos. Šias išvadas patvirtinome naudodami kitokį išeminį modelį. Nors yra keli išeminės šerdies apibrėžimai, išeminė šerdis gyvūnų modeliuose paprastai apibrėžiama kaip MAP2 neigiamas pažeidimas 40, 41 . Tačiau šis tyrimas pirmą kartą parodė, kad MAP2 neigiama išeminė šerdis nėra homogeniška; angiogenezė buvo stebima tik pasienio zonoje, esančioje MAP2 neigiamame plote (8A pav.). Mes spėliojome, kad pasienio zona, esanti MAP2 neigiamos išeminės šerdies srityje, gali būti nauja terapinė tikslinė sritis prieš smegenų išemiją. Atvirkščiai, nei išeminės šerdies, nei penumbros aksonų atauga nebuvo stebėta praėjus 14 dienų po smegenų išemijos. Šis rezultatas atitiko ankstesnę ataskaitą, kad aksonų atauga nebuvo pastebėta praėjus 28 dienoms po smegenų išemijos 42 . Šie duomenys rodo, kad gali būti sunku skatinti aksono ištvermę, kuri yra būtina funkcinio atsigavimo sąlyga, netaikant jokių intervencijų po smegenų išemijos.

Image

( A ) Angiogenezės po smegenų išemijos schema. Išeminė šerdis apibūdinama kaip MAP2 imunoneigiama išeminė žievė. Angiogenezė (raudonos linijos) šiek tiek suaktyvėja išeminės šerdies pasienio srityje, kurią ląstelių terapija apibūdiname kaip „teigiamą angiogenezės branduolį“ (tamsiai pilką). Taigi MAP2 neigiamas išeminis branduolys susideda iš teigiamo angiogenezės ir angiogenezės neigiamo šerdies (juodojo), kuris sukuria negrįžtamus pokyčius. ( B ) Angiogenezės ir aksonų ataugų (regeneracija, žaliosios ląstelės; neuronai) schema, atliekant OGD iš anksto kondicionuotą mikroglialų transplantaciją (mėlynąsias ląsteles) po smegenų išemijos. OGD sąlygota mikroglialų transplantacija ryškiai suaktyvino angiogenezę (raudonos linijos) angiogenezėje teigiamame branduolyje (išeminėje pasienio srityje). Be to, smegenų išemijoje po smegenų išemijos pastebėtas chondroitino sulfato proteoglikano (CSPG, pilkosios ir įstrižinės srities), kuris, kaip žinoma, yra aksonų užaugimo inhibitorius, išraiškos sumažėjimas. Išeminėje penumbroje buvo pastebėtas aksoninis neuronų ląstelių (žalių) užaugimas atliekant OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantaciją. ( C ) OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantacijos terapinis poveikis po galvos smegenų išemijos. Transplantuota OGD, iš anksto kondicionuota, mikroglia tiesiogiai išskiria kraujagyslių endotelio augimo faktorių (VEGF), transformuodama augimo faktorių β (TGF-β) ir matricos metaloproteinazę-9 (MMP-9). Šie veiksniai taip pat gali būti siejami su vietinių endotelio ląstelių, astrocitų, pericitų, neuronų ir mikroglionų pokyčiais, atsirandančiais dėl paracrininio OGD sąlygojamo M2 mikrogliozės poveikio. Šie veiksniai tiesiogiai skatina angiogenezę teigiamoje angiogenezėje (išeminėje pasienio srityje). Mikroglionų MMP-9 gali suskaidyti aksonų užaugimo inhibitorių CSPG. Angiogenezė gali palengvinti aksonų užaugimo indukciją. Be to, VEGF, TGF-β ir MMP-9 taip pat gali tiesiogiai sukelti aksonų išretėjimą.

Visas dydis

Mes pademonstravome akivaizdų funkcinį atsigavimą atlikdami OGD kondicionuotą mikroglialinę transplantaciją, bet ne atlikdami OGD kondicionuotą astrocitinę transplantaciją. Mes taip pat nustatėme, kad OGD kondicionuoti mikrogliozės, bet ne OGD kondicionuoti astrocitai gali kirsti BBB, kad pasiektų sužeistą smegenų parenchimą. Ši išvada atitiko keletą pranešimų, rodančių, kad pirminės mikroglionos galėjo kirsti BBB 27 ir pasiekti sužeistą smegenų parenchimą 22, 26, 28 . Kadangi „Mac-1“ tarpininkauja leukocitų ir mikroglijų sukibimui su endotelio paviršiumi, tai gali būti svarbu šių ląstelių infiltracijai į paveiktą smegenų parenchimą 31, 32 . Padidėjus „Mac-1“ lygiui atlikus pirminį OGD kondicionavimą, mikroglia gali pereiti BBB ir pasiekti sužeistą smegenų parenchimą. Keletas tyrimų parodė, kad chemokinų stromos išvestas faktorius-1 (SDF-1, taip pat žinomas kaip CXCL12) vaidina svarbų vaidmenį nustatant kaulų čiulpų gautas ląsteles, ypač mikroglia, monocitus ir kamienines ląsteles, išeminėms sritims. trauma 43, 44, 45 . SDF-1 gali atlikti tam tikrą vaidmenį nustatant mikrogliais išeminės smegenų parenchimos sritis. Įdomu tai, kad kaulų čiulpų gautų ląstelių sulipimas buvo pastebėtas išeminėje sienoje tarp išeminės šerdies ir penumbros, panašiai kaip mūsų rezultatuose, ir SDF-1 raiška buvo stebėta išeminėje penumbroje 44 . Šis OGD iš anksto kondicionuotų mikroglionų gebėjimas yra nepaprastai svarbus šios ląstelėmis paremtos terapijos sėkmei, nors mechanizmas, kuriuo OGD iš anksto paruoštos mikroglijos pasiekia sužeistą smegenų parenchimą, dar turi būti išaiškintas.

Toliau mes pademonstravome, kad optimalus OGD išankstinis kondicionavimas gali sukelti priešuždegiminius M2 mikroglionus, kurie, kaip manoma, turi apsauginį poveikį, išskirdami tokius atstatomuosius veiksnius, kaip VEGF ir TGF-β, po smegenų išemijos 19, 25, 46 . Išeminių gyvūnų mikroglialinių fenotipų laikinoji analizė parodė, kad M2 mikroglionai buvo aptinkami nuo 12 val., Laikinai padidėjo per 1–3 dienas, o po kelių dienų po smegenų išemijos sumažėjo 19, 20 . Šiame tyrime pasirinkome 18 valandų inkubaciją kaip optimalią OGD būklę, nes 18 valandų inkubacija daugiausia sukėlė M2 mikroglia, o 24 valandų inkubacija sukėlė ląstelių mirtį 33, 34 . Tiesą sakant, ši OGD sąlyga padidino VEGF, MMP-9 ir TGF-β sekreciją in vitro , tai rodo M2 mikroglia poliarizaciją (4 pav.). Įdiegus OGD kondicionuotą mikrogliją, buvo padidinta tokių rekonstravimo veiksnių kaip VEGF, TGF-β ir MMP-9 ekspresija. Šie rezultatai parodė galimą OGD gydymo poveikį mikroglialiniam M2 jungikliui. Šių remodeliavimosi veiksnių reguliavimas taip pat buvo stebimas in vivo, tiksliau pažeistose smegenų parenchimose po OGD iš anksto kondicionuotų mikroglialų transplantacijos.

Manome, kad rekonstravimo veiksnių sekrecija iš OGD kondicionuotų mikroglionų buvo ribota, nes 21 dieną po transplantacijos išeminiame pažeidime nebuvo pastebėta jokių pagal GFP teigiamų OGD kondicionuotų mikroglionų. Tačiau mes pastebėjome šių rekonstrukcijos veiksnių raišką ne tik mikrogliozose, bet ir kitose ląstelėse praėjus 28 dienoms po transplantacijos, ir tai rodo, kad vietinių endotelio ląstelių, astrocitų, pericitų, neuronų ir mikrogliacijos pokyčius gali sukelti paracrine iš OGD kondicionuotų M2 mikroglia.

Mes spėjame, kad OGD sąlygojamų M2 mikroglionų pleiotropinis poveikis, įskaitant paracrininius atstatymo veiksnių veiksmus ir CSPG skilimą MMP-9, gali skatinti angiogenezę ir aksonų augimą (ty neuronų regeneraciją). Mes parodėme, kad angiogenezė buvo suaktyvinta pasienio zonoje, esančioje MAP2 neigiamos išeminės šerdies srityje, kurią mes apibrėžėme kaip „teigiamą angiogenezės branduolį“ (8 pav. B). In this region, we observed diminished expression of CSPG, one axonal outgrowth inhibitor 37, which might be degraded by MMP-9 38 (Fig. 8C). We also demonstrated that axonal outgrowth was observed only in the ischemic penumbra, especially around the region exhibiting angiogenesis. We consider that VEGF, MMP-9, and TGF-β might promote not only angiogenesis but also axonal outgrowth in vivo (Fig. 8B and C), because several studies have reported that these angiogenic factors are also involved in axonal outgrowth 23, 47, 48 . Interestingly, Lyden and others had proposed a 'clean-up hypothesis' whereby newborn vessels serve to facilitate macrophage/microglia infiltration and clear cellular debris from pan-necrotic tissue to facilitate angiogenesis and remodelling 49, 50 . OGD-preconditioned microglia might induce this phenomenon in the “angiogenesis-positive core” and its surrounding tissue (ie, penumbra) after cerebral ischemia. Based on these findings, we consider that cell-based therapies that cause a switch from M1- to M2-dominant microglia/macrophages might be promising.

In conclusion, we demonstrated that transplantation of microglia preconditioned by OGD may be a novel therapeutic strategy for ischemic stroke. We consider that the following therapeutic mechanisms might be involved: (i) migration of OGD-preconditioned microglia into the “angiogenesis-positive core”, (ii) secretion of remodelling factors from the M2 microglia stimulated by optimal OGD preconditioning, (iii) changes in resident native endothelial cells, astrocytes, pericytes, neurons, and microglia by paracrine actions of the M2 microglia, and (iv) angiogenesis and axonal outgrowth.

Metodai

This study was carried out in strict accordance with the recommendations from the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals of the National Institutes of Health (Bethesda, MD, USA). The protocol was approved by the Niigata University Administrative Panel on Laboratory Animal Care. All surgeries were performed under inhalation of halothane and according to ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments) guidelines 51 . Rats and mice were maintained under controlled light (lights on, 5:00–19:00), temperature (23 ± 1 °C), and humidity (55 ± 10%) conditions and given free access to food and water.

Focal cerebral ischemia

Transient focal cerebral ischemia was induced in male Sprague-Dawley rats weighing 290–320 g using an intraluminal filament suture technique 52, 53 . After 90 min of ischemia, the suture was withdrawn to restore blood flow. This model provides an area of the ischemic core and penumbra determined by the presence of MAP2 with a high degree of reproducibility, and demonstrates that the time window for salvage of penumbral tissues by reperfusion was 90 min. Focal cerebral ischemia also was induced using a different model of focal embolic ischemia using an autologous thrombi technique 54, 55, 56 . Tissue plasminogen activator was administered intravenously in the form of Alteplase (Mitsubishi Tanabe Pharma Co., Osaka, Japan) at a dose of 10 mg/kg per animal at 4 h after cerebral ischemia for recanalization and reperfusion. Core body temperature, which was monitored via rectal probe, was maintained at 37.0 ± 0.5 °C using a heating pad.

Eksperimentinis dizainas

Sample size calculations were performed prior to the experiments to determine the number of animals needed to detect differences between cell-based therapy and control conditions. Based on a pilot study of N = 4 animals in the treatment group, we determined the sample size needed to detect differences in motor outcomes between the OGD-preconditioned microglial transplantation group and the control and normoxia groups (α, 0.05; one-sided analysis). Rats were randomly assigned to various experimental groups, and analyses were performed by an investigator blinded to the treatment.

Immunofluorescence staining and confocal microscopy

The rats that survived for 1, 3, 7, 14, and 28 days after cerebral ischemia were euthanized with an overdose of halothane, followed by transcardial perfusion with cold normal saline followed by perfusion with cold 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate-buffered saline (PBS; pH 7.4). Brains were removed and embedded in paraffin wax. Serial sections (4-μm thick) were cut from the paraffin blocks and stained using antibodies as described previously 53 . We also stained free-floating sections (50-μm thick) 53 . Sections were mounted with Vectashield 4′, 6′-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Information about the primary antibodies is described in Supplementary Table 1. The sections were examined under a confocal laser-scanning microscope (LSM510 META; Carl Zeiss, Oberkochen, Germany). Cortical tissues corresponding to the ischemic core or penumbra were defined by MAP2 staining as described previously 52, 53 .

Imunocitochemija

Microglial cells on coverslips were washed with PBS and fixed with 100% methanol for 10 seconds. After fixation, the cells were incubated with the primary fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated anti-Mac-1 monoclonal antibody (Supplementary Table 1). Sections were mounted with DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA).

Quantitative analysis of brain tissue structures and Mac-1 expression by immunostaining

To perform quantitative analyses of brain tissue structures, tissue sections were immunostained with antibodies against CD31 (a marker of endothelial cells and angiogenesis), MAP2 (a marker of neuronal dendrites), SMI31 and GAP43 (markers of neuronal axons), VEGF, TGF-β, and MMP-9 (Supplementary Table 1), and counted as described previously 55 . Briefly, seven randomly chosen non-overlapping high-power fields (630× or 1260×) at the level of the anterior commissure of the sham-operated or ischemic cortex in the MCA territory were examined. Data were acquired from stereotaxically identical 0.03-mm 3 regions of interest (ROIs). Three-dimensional reconstructions and z-sections collected at 0.15-μm z-intervals were created and automatically quantified in blinded fashion as the intensity of total immunoreactive structure volumes (immunoreactive volume/examined ROI volume) using IMARIS imaging software (BitplaneAG, Zurich, Switzerland) 55, 56, 57 . The results were confirmed in three or four independent samples (N > 21–28).

For comparing the expression levels of Mac-1 in microglia under normoxic and OGD conditions, high-power fields (630×) were examined. Two-dimensional reconstructions were created and the intensity of total immunoreactivity per cell was quantified in a blinded manner using the IMARIS imaging software 34 (N = 5).

Cell counting protocol

To determine the frequency of cells positive for Ki67, a proliferative marker 39, after cerebral ischemia, seven randomly chosen non-overlapping high-power fields (630×) at the level of the anterior commissure of the sham-operated or ischemic cortex (ie, the border area of the ischemic core and penumbra) were examined at 1, 3, 7, and 14 days after cerebral ischemia (N = 21) 53, 58 .

To determine the numbers of cells positive for M1 microglia-specific marker (iNOS) and M2-specific marker (CD206) 19, 20, seven randomly chosen non-overlapping high-power fields (630×) at the level of the anterior commissure of the ischemic cortex (ie, the border area between the ischemic core and penumbra) were examined at 3 days after transplantation (10 days after cerebral ischemia (N > 21) 53, 58 .

Primary cell cultures

Primary murine microglia and astrocytes were obtained as previously described 33 . Primary mixed glial cultures were established from the forebrains of postnatal C57Bl/6 mice by dissociating isolated cerebral cortices in papain and then growing the resulting cell suspension for 10 days in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM) supplemented with 10% foetal bovine serum (FBS). After 10 days, flasks were shaken for 15 min to remove loosely attached microglia. The purity of these microglial cultures was 99% as determined by Mac-1 (CD11b/CD18) immunoreactivity in flow cytometry 33 . For astrocytes, flasks were then shaken overnight to remove microglia and oligodendrocyte precursors. The remaining monolayer was determined as >95% astrocytes by glial fibrillary acidic protein (GFAP) immunoreactivity 33 .

Oxygen–glucose deprivation

The standardized conditions for OGD have been described in detail elsewhere 33, 35 . The cultures containing low-glucose medium were placed in a hypoxia chamber (Billups-Rothenburg, Del Mar, CA, USA), which was flushed with a mixture of 95% N 2 and 5% CO 2 for 1 h, and then closed for 18 h. Twenty-four h incubation under OGD conditions promoted cell death, whereas 18 h incubation under OGD conditions did not cause cell death as evaluated by propidium iodide 33 and lactate dehydrogenase assays 34 . Additionally, M2 microglia were detectable starting from 12 h, maximally increasing at 24 h, and markedly decreased at later time points 20 . Given these findings, we chose 18 h for the OGD condition in this study.

Su fermentais susijęs imunosorbentų tyrimas (ELISA)

After overnight incubation under OGD conditions, we measured the levels of VEGF, BDNF, TNF-α, TGF-β, IL-1β, IL-6, and IL-10 in the conditioned media using the VEGF Quantikine ELISA Kit (RRV00), BDNF Quantikine ELISA Kit (DBD00), TNF-α Quantikine ELISA Kit (MTA00B00), TGF-β Quantikine ELISA Kit (MB100B), IL-1β Quantikine ELISA Kit (MLB00C), IL-6 Quantikine ELISA Kit (M6000B), and IL-10 Quantikine ELISA Kit (M1000B) (all R&D Systems, Minneapolis, MN, USA), respectively, according to the manufacturer's instructions (N = 5–6).

Active MMP-9 assay

The Fluorimetric SensoLyte TM 520 (AnaSpec Corp. San Jose, CA, USA) was used to quantify the specific enzymatic activity of active MMP-9 using a fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptide containing a fluorescent donor and quenching acceptor 55, 59 . We measured MMP-9 activities of the samples according to the manufacturer's instructions. The protein concentrations of the samples were determined using a bicinchoninic acid protein assay kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Samples (170 μg) were placed in a 96-well plate containing 50 μl of assay buffer. The proteolytic activities of MMP-9 were quantified using the FRET peptide.

Ląstelių transplantacija

We excluded rats that weighed 2 SD below the mean at 7 days after cerebral ischemia to include only rats in the same physiological condition. Cells (1 × 10 6, microglia or astrocytes) were diluted with 300 μL of PBS 13 . Rats subjected to transient MCA occlusion at 7 days after cerebral ischemia were randomly assigned to one of the cell-treated groups, in which transplantations of microglia or astrocytes were slowly infused through the stump of the external carotid artery over the course of 3 min (microglia group and astrocyte group, respectively), or the no cell control group. The same volume of PBS was injected in all groups.

Sensorimotor assessment

Sensorimotor assessments were performed at 0, 1, 4, 7, 10 (3 days after transplantation), 14 (7 days after transplantation), 21 (14 days after transplantation), and 28 days (21 days after transplantation) after cerebral ischemia using the corner test 60 . Analyses of therapeutic effects were performed by an investigator blinded to treatment.

Green fluorescent protein (GFP) mice

To determine whether transplanted microglia and astrocytes can translocate from the blood into the brain parenchyma to exert their beneficial effects after intra-arterial administration, we used primary microglia and astrocytes from GFP mice 30 . GFP transgenic mice were produced by breeding heterozygous pairs in the Genome Information Research Centre, Osaka University, Japan and maintained in the Department of Comparative and Experimental Medicine, Brain Research Institute, Niigata University. After preconditioning primary microglia and astrocytes from GFP mice by the OGD condition, we administered these cells intra-arterially at 7 days after cerebral ischemia. We performed confocal microscopic examination at 3 and 21 days after transplantation.

Statistinė analizė

All data are presented as the mean ± standard error of the mean (SEM). Differences in the parameters were analysed using one-way or two-way ANOVA followed by Bonferroni's post hoc test or unpaired t -test. Statistical analyses were performed using IBM SPSS Statistics for Windows, Version 21.0 (Armonk, NY, USA). Differences in frequencies were assessed with Fisher's exact test. All tests were considered statistically significant at a P value < 0.05.

Papildoma informacija

How to cite this article : Kanazawa, M. et al . Microglia preconditioned by oxygen-glucose deprivation promote functional recovery in ischemic rats. Mokslas. Rep. 7, 42582; doi: 10.1038/srep42582 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.