Microrna-10b sustiprina kasos vėžio ląstelių invaziją slopindamas tip30 ekspresiją ir skatindamas egf ir tgf-β veiksmus | onkogenas

Microrna-10b sustiprina kasos vėžio ląstelių invaziją slopindamas tip30 ekspresiją ir skatindamas egf ir tgf-β veiksmus | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių invazija
  • Metastazės
  • miRNR
  • Kasos vėžys
  • Šio straipsnio pataisa buvo paskelbta 2017 m. Birželio 12 d

Anotacija

Padidėjusi mikroRNR-10b (miR-10b) ekspresija vėžio ląstelėse kasos latakų adenokarcinomos (PDAC) metu yra ligos agresyvumo žymeklis. Šiame tyrime mes nustatėme, kad PDAC sergančių pacientų miR-10b koncentracija plazmoje yra žymiai padidėjusi, palyginti su įprasta kontrole. Genų profiliavimu nustatėme galimus taikinius, kuriuos sumažino miR-10b, įskaitant Tat sąveikaujantį baltymą 30 (TIP30). Imunoblotų ir luciferazės reporterių tyrimai patvirtino, kad TIP30 buvo tiesioginis miR-10b taikinys. TIP30 sumažinimas dėl miR-10b arba siRNR sukelto TIP30 nutildymo sustiprino nuo epidermio augimo faktoriaus (EGF) priklausomą invaziją. MiR-10b veiksmai buvo panaikinti ekspresuojant modifikuotą TIP30 cDNR, atsparią miR-10b. EGR sukeltas EGF receptorių (EGFR) tirozino fosforilinimas ir tarpląstelinio signalo reguliuojamas kinazės fosforilinimas buvo sustiprintas miR-10b, ir šį poveikį mėgdžiojo TIP30 nutildymas. EGF veiksmus, esant miR-10b, blokavo EGFR kinazės slopinimas erlotinibu ir dvigubas PI3K (fosfatidilinozitolio 3′-kinazės) ir MEK slopinimas. Be to, miR-10b, EGF ir transformuojantis augimo faktorius beta (TGF-β) sujungti, kad žymiai padidintų ląstelių invaziją, ir šį poveikį slopino erlotinibo ir SB505124, I tipo TGF-β receptorių inhibitoriaus derinys. miR-10b taip pat sustiprino stimuliuojantį EGF ir TGF-β poveikį ląstelių migracijai ir epitelio – mezenchiminiam perėjimui (EMT) ir sumažino RAP2A, EPHB2, KLF4 ir NF1 raišką. Be to, miR-10b per didelis ekspresas pagreitino kasos vėžio ląstelių (PCC) proliferaciją ir naviko augimą pagal ortotopinį modelį. Taigi, miR-10b lygis plazmoje gali būti naudojamas kaip diagnostinis žymeklis PDAC, tuo tarpu vidinis navikinis miR-10b skatina PCC proliferaciją ir invaziją slopindamas TIP30, kuris sustiprina EGFR signalizaciją, palengvina EGF – TGF-β kryžminį pokalbį ir sustiprina raišką. EMT reklamuojančių genų, tuo tarpu sumažinant kelių metastazes slopinančių genų ekspresiją. Todėl terapinis miR-10b taikymas PDAC gali nutraukti augimą skatinančią žalingą EGF – TGF-β sąveiką ir pakenkti metastazavimo procesui įvairiais lygmenimis.

Įvadas

Kasos latakų adenokarcinoma (PDAC) yra ketvirta pagrindinė su vėžiu susijusių mirčių priežastis JAV, jos išgyvenimo mediana yra 6 mėnesiai, o 5 metų išgyvenamumas - 6%. 1 Kadangi nėra veiksmingų ankstyvo aptikimo būdų, daugumai PDAC sergančių pacientų yra lokaliai invazinė ir (arba) metastazavusi liga ir jie nėra skirti rezekcijai. 2 Histologiškai PDAC būdingos acinaro-ductal metaplazijos sritys, kasos intraepitelinė neoplazija, vėžinės ląstelės, sudarančios į latakų sistemą panašias struktūras, uždegiminiai infiltratai ir plati desmoplastinė reakcija, trukdanti veiksmingai pristatyti vaistą į kasos naviko masę. 3, 4, 5 Molekuliniame lygmenyje yra didelis pagrindinių vairuotojo mutacijų dažnis pagrindiniuose reguliuojančiuose genuose, įskaitant KRAS , TP53 , CDKN2A ir SMAD4 , daugybė žemo dažnio vairuotojo mutacijų ir nenormalus daugelio signalizacijos kelių, kaip Kelių tirozinkinazės receptorių, tokių kaip epidermio augimo faktoriaus (EGF) receptorių (EGFR) ir jo ligandų, per didelis ekspresija ir perteklinių augimą lemiančių augimo faktoriaus beta (TGF-β) izoformų gamyba. 6, 7

EGFR homodimerizacija ir heterodimerizacija su kitais EGFR šeimos nariais padidina receptorių kompleksų tirozinkinazės aktyvumą ir suaktyvina įvairius signalizacijos kelius, tokius kaip mitogenų suaktyvinta baltymo kinazė (MAPK), p38 MAPK, fosfatidilinozitolio 3′-kinazė (PI3K), Src., Crk ir Nck. 8, 9. Priešingai, TGF-β aktyvina serino-treonino receptorių kinazes, veikiančias per kanoninę, nuo Smad priklausomą signalizaciją, taip pat nekanoninę, nuo Smad nepriklausomą signalizaciją, ir paprastai sukeliančios paracrininį poveikį naviko mikroaplinkai PDAC. 10, 11, 12. Tačiau TGF-β taip pat gali tiesiogiai skatinti kasos vėžio ląstelių (PCC) invaziją ir skatinti PCC proliferaciją 13, parodydamas, kad EGF – TGF-β sąveika yra svarbi atsižvelgiant į ląstelių autonominį poveikį PDAC.

MikroRNR (miRs) sudaro 18–25 nukleotidų nekoduojančių RNR klasę, nukreiptą į specifines mRNR dalis, skirtas transliacijai slopinti ar skaidyti. 14 miR raiška dažnai yra panaikinama sergant vėžiu, o miRs dalyvauja reguliuojant daugelį svarbių biologinių procesų, įskaitant ląstelių išgyvenimą, proliferaciją, migraciją, invaziją ir metastazes. 15, 16 Keletas miRs yra padidinta PDAC, įskaitant miR-10b, miR-21, miR-196a, miR-203, miR-155, miR-210 ir miR-221. 17, 18, 19, 20, 21, 22 Be to, miR-10b yra vienas iš dažniausiai reguliuojamų miRs PDAC, 18, 22, o aukštas miR-10b lygis PDAC vėžio ląstelėse yra susijęs su sumažėjusiu terapiniu atsaku į multimodalumą. Neoadjuvantinis gydymas, trumpesnis metastazių laikas, sumažino bendrą paciento išgyvenamumą ir padidino PCC invaziją. 22, 23, 24 Tačiau neaišku, kaip miR-10b skatina PCC invaziją PDAC.

Šiame tyrime mes nustatėme, kad miR-10b sustiprino EGF sukeltą invaziją, EGFR fosforilinimą ir tarpląstelinio signalo reguliuojamą kinazės 1 (ERK1) / 2 aktyvaciją PCC, tuo tarpu silpninantis EGFR skilimą ir šis poveikis atsirado dėl miR-10b- sukeltas su Tat sąveikaujančio baltymo 30 (TIP30) sumažėjęs reguliavimas. Be to, aukšto lygio miR-10b, EGF ir TGF-β derinys pastebimai padidino ląstelių invaziją ir pakeitė genų ekspresiją taip, kad atitiktų epitelio ir mezenchiminio perėjimo (EMT) indukciją. Atsižvelgiant į tai, kad miR-10b, EGFR ir TGF-β yra dažnai per daug išreikštas PDAC, 22, 23, 24, 25, 26, šie pastebėjimai rodo, kad taikymas miR-10b gali padėti slopinti metastazes ir nutraukti žalingą EGF – TGF-β sąveiką. PDAC.

Rezultatai

miR-10b yra išreikštas dideliu kiekiu vėžio ląstelių PDAC, 18, 22, ir keli tyrimai parodė miR-10b vėžio metastazėms. 27, 28 Norėdami patvirtinti, kad miR-10b ekspresija padidėja PDAC, pasinaudojome žinomu miRs atsparumu skilimui kraujyje ir ištyrėme miR-10b lygį 20 normalių kontrolinių asmenų, 5 pacientų, sergančių lėtiniu pankreatitu ir 17 PDAC pacientai. miR-10b lygis padidėjo 575 kartus PDAC sergantiems pacientams, palyginti su atitinkamais lygiais normalioje kontrolėje ( P <0, 001) arba pacientams, sergantiems lėtiniu pankreatitu (1a paveikslas; P <0, 001).

Image

„miR-10b“ taikiniai. a ) MiR-10b lygis plazmoje. Palyginti su įprastų kontrolinių pacientų ( n = 20; uždari apskritimai) ir lėtiniu pankreatitu sergančių pacientų (CP; n = 5; pilki apskritimai) plazma, miR-10b lygis yra žymiai padidėjęs ( P <.001) PDAC pacientų ( n = 18; atviri apskritimai). Horizontalios juostos žymi vidutinius išraiškos lygius. b ) Genų ekspresija. qRT – PGR nurodytų mRNR PANC-1 ląstelėse, transfekuotose kontrolinėmis (kietos juostos) arba miR-10b pirmtaku (atviros juostos), patvirtino masyvo rezultatus. c ) TIP30 lygiai. qRT – PGR buvo naudojamas TIP30 mRNR lygiams nustatyti PANC-1 ląstelėse, perkeltose kontroliniu (kietos juostos) arba pirmtako miR-10b (atviros juostos) nurodytu laiku. d ) TIP30 imunoblotai. Tiriant imunoblotus, buvo naudojamas labai specifinis anti-TIP30 antikūnas, kuris atskleidė reikšmingą TIP30 baltymo lygio sumažėjimą esant miR-10b, palyginti su kontrole. ( e ) Liuciferazės reporterio konstrukcijos. Žurnalistės konstrukcijos užkoduotos laukinio tipo (WT) TIP30 3′UTR arba mutanto (M) TIP30 3′UTR, kuriose surišimo vieta buvo pakeista nurodytais nukleotidais. f ) Liuciferazės rodmuo. PANC-1 ląstelės buvo transfekuotos kontrolinėmis (kietomis juostomis) arba miR-10b pirmtaku (atviromis juostomis) 20 h kartu su WT arba M TIP30 3′UTR liuciferazės konstruktais. Duomenys plokštelėse b, c ir f yra trijų bandymų vidurkiai, analizuojami dvipusio ANOVA metodu, po kurio seka Bonferroni. * P <0, 01 ir ** P <0, 001, palyginti su atitinkamais kontroliniais elementais.

Visas dydis

Atsižvelgiant į tai, kad prieš metastazinį procesą buvo invazija, mes siekėme nustatyti su invazija susijusius miR-10b taikinius, kurie galėtų sukelti sustiprintą metastazę PDAC. Atitinkamai buvo atlikti mikrotraumos tyrimai, naudojant RNR iš PANC-1 ląstelių, transfekuotų miR-10b pirmtaku. Penkiasdešimt penki genai buvo sureguliuoti mažiausiai 40%, kai buvo padidinta miR-10b (papildoma S1 lentelė), o trys iš šių genų ( RAP2A , EPHB2 ir TIP30 ) veikia kelius, kurie gali slopinti vėžio ląstelių invaziją. Kiekybinis atvirkštinės transkripcijos PGR (qRT – PGR) patvirtino, kad visų trijų genų mRNR lygis reikšmingai sumažėjo PANC-1 ląstelėse, kurios išreiškė aukštą miR-10b lygį, palyginti su atitinkamomis kontrolėmis (1b pav.). Silicio analizėje naudojant „miRanda“, „PicTar“ ir „TargetScan“ skaičiavimo įrankiai, skirti miRNR taikinio numatymui, patvirtino, kad TIP30 , RAP2A ir EPHB2 yra galimi miR-10b taikiniai.

TIP30 , dar žinomas kaip ŽIV-1 Tat interaktyvusis baltymas 2 (HTATIP2) arba CC3 , buvo ypač įdomus, nes jis slopina metastazes plaučių, krūties ir kepenų ląstelių vėžiuose 29, 30, 31 ir reguliuoja EGF sukeltą EGFR endocitozę. 32 Atsižvelgiant į svarbų EGFR vaidmenį PDAC, 25, 33, mes siekėme patvirtinti, kad miR-10b sumažina TIP30 mRNR ir baltymų lygį. Atitinkamai, qRT – PGR ir imunoblotai buvo atlikti naudojant RNR ir baltymus, ekstrahuotus iš miR-10b-per daug ekspresuojančių PANC-1 ląstelių. Padidėjusi miR-10b ekspresija sumažino TIP30 mRNR (1c paveikslas) ir baltymų (1d paveikslas) lygį 24, 48 ir 72 valandas po transfekcijos. Panašus TIP30 baltymų lygio sumažėjimas buvo pastebėtas ASPC-1, COLO-357 ir T3M4 žmogaus PCC po transfekcijos su miR-10b pirmtaku (papildomas paveikslas S1a), rodantis, kad šis sumažėjęs reguliavimas nebuvo būdingas tik PANC-1 ląstelėms. Be to, transfekcija su miR-10a pirmtaku, turinčiu tą pačią seką su miR-10b, išskyrus vieno nukleotido skirtumą ne sėklų srityje, 34 sąlygojo kintamą, bet atkuriamą TIP30 lygio sumažėjimą visuose keturiuose PCC (Papildomas S1a pav.).

Norėdami patvirtinti, kad TIP30 yra tiesioginis miR-10b taikinys, mes panaudojome TIP30 3 ′ nepersodinto regiono (UTR) luciferazės konstrukciją ir mutantinį konstruktą, kuriame buvo pakeisti 6 nukleotidai potencialioje surišimo vietoje (1e pav.). Bendras PANC-1 ląstelių transfekcija su TIP30 3′UTR konstruktu ir miR-10b pirmtaku luciferazės aktyvumo sumažėjimas 50%, palyginti su neigiama kontrole, ir šis TIP30 ekspresijos slopinimas buvo visiškai panaikintas šešių nukleotidų pakaitalu šerdies rišimo vieta (1f pav.).

EGF ir TGF-β skatina PCC invaziją. 12 Norint nustatyti, ar miR-10b sustiprina žmogaus PCC invaziją ir ar jis moduliuoja EGF, ar TGF-β veiksmus, miR-10b pirmtakas buvo perkeltas į du žmogaus PCC. PANC-1 ir COLO-357 ląstelėse EGF (1 nM) arba TGF-β1 (0, 5 nM) sustiprino invaziją, o jų bendras poveikis buvo didesnis nei atskirų augimo faktorių atskirai (2a ir b paveikslai). Per didelis miR-10b ekspresija padidino invaziją PANC-1 ląstelėse ir sustiprino EGF tarpininkavimą tiek PCC, tiek TGF-β1 sąlygojamą invaziją COLO-357 ląstelėse. Be to, abiejų augimo faktorių derinys padarė žymiai ( P <0, 005) didesnį stimuliavimą invazijai ląstelėse, turinčiose aukštą miR-10b lygį (2a ir b pav.), O tai yra kliniškai potencialiai svarbu atsižvelgiant į tai, kad miR-10b, EGFR ir TGF Visi β yra ekspresuojami PDAC. 22, 23, 24, 25, 26

Image

„MiR-10b“, EGF ir TGF-β1 poveikis invazijai ir migracijai bei TIP30 žemo reglamentavimo pasekmės invazijai. ( a, b ) miR-10b, EGF ir TGF-β1 poveikis invazijai. COLO-357 ( a ) ir PANC-1 ( b ) ląstelės buvo transfekuotos kontroliniais (kietaisiais strypais) arba miR-10b (atviromis juostomis) pirmtakais ir pasodintos (5x104 ląstelės / duobutėje) Matrigel dengtoje Boydeno kameroje. Invazija buvo nustatyta po ląstelių inkubavimo 20 val., Nesant (be serumo: SF) arba neturint EGF (E, 1 nM), TGF-β1 (T, 0, 5 n M) arba tiek EGF, tiek TGF-β1 (E +). T). Ląstelės, kurios įsiveržė į membraną, buvo nudažytos ir suskaičiuotos. c ) TIP30 nutildymas. PANC-1 ląstelės buvo transfekuotos suplakta kontrole arba dviem siRNR (5 ir 6), nukreipiančiomis į TIP30. Ląstelės (5x104 ląstelių kiekvienoje duobutėje) buvo pasodintos Matrigel invazijos tyrimams, neturint EGF (1 nM) 20 val. ( d ) TIP30 mutanto poveikis padidėjusiai miR-10b invazijai. PANC-1 ląstelės 48 valandas buvo transfekuotos naudojant kontrolinį arba pirmtaką miR-10b kartu su tuščiu pCMV-SPORT6 (Tuščias) arba pCMV-SPORT6-TIP30, turinčiu mutavusį TIP30 cDNR (TIP30 mutantas), atsparų miR-10b- sukeltas žemas reguliavimas. Tada buvo nustatytas 1 n M EGF poveikis invazijai. Kiekvienos plokštės duomenys yra trijų eksperimentų vidurkis ± pusė ir buvo analizuojami naudojant dvipusį ANOVA, po kurio buvo pritaikytas Bonferroni. * P <0, 05, ** P <0, 01 ir *** P <0, 001, palyginti su atitinkamais kontroliniais vienetais; # P <0, 05, palyginti su atitinkama kontroline SF; P <0, 01, palyginti su vien EGF, ir P <0, 01, palyginti su vien tik TGF-β1, ląstelėse, perkeltose su miR-10b pirmtaku; P <0, 05, palyginti su tuščiu pCMV-SPORT6, ir * P <0, 05, palyginti su pCMV-SPORT6-TIP30 miR-10b transfekuotoje grupėje. e ) f ) Migracijos testai. COLO-357 ( e ) ir PANC-1 ( f ) ląstelės buvo transfekuotos kontroliniais (kietos juostos) arba miR-10b pirmtakais (atviros juostos). Ląstelės (5x104 ląstelių / duobutėje) buvo naudojamos žaizdų gijimo tyrime ir inkubuojamos 20 valandų, kai nėra (SF) ar nėra EGF (E, 1 nM), TGF-β1 (T, 0, 5 n) M) arba abu EGF ir TGF-β1 (E + T). Žaizdos plotas buvo matuojamas 0 ir 20 val., Naudojant „ImageJ“ programinę įrangą (NIH, Bethedsa, MD, JAV). Migracija buvo apskaičiuota kaip žaizdos ploto pokyčio procentas. Buvo atliktas dvipusis ANOVA, po kurio Bonferroni buvo sureguliuotas. ** P <0, 01 ir *** P <0, 001, palyginti su atitinkamais kontroliniais vienetais; # P <0, 001, palyginti su kontroline SF; P <0, 05 ir ††† P <0, 001, palyginti su vien EGF ląstelėse, perkeltose su miR-10b; P <0, 05 ir ‡‡‡ P <0, 001, palyginti su vien tik TGF-β1 ląstelėse, perkeltose su miR-10b.

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar TIP30 numušimas imituoja miR-10b veiksmus PCC invazijai, PANC-1 ląstelės buvo transfekuotos dviem siRNR, nukreipiančiomis į TIP30. TIP30 nutildymas siRNR sumažino TIP30 lygius (papildomas S1b paveikslas) ir padidino EGF stimuliuotą invaziją (2c paveikslas), parodydamas, kad TIP30 yra neigiamas PCC invazijos reguliatorius. Norėdami patvirtinti, kad TIP30 žemas reguliavimas buvo būtinas miR-10b sukeltai ląstelių invazijos stimuliacijai, mes panaudojome vektorių pCMV-SPORT6-TIP30, kuris koduoja TIP30 cDNR, kurio nereguliuoja miR-10b dėl mutavusio 3′UTR surišimo vietos. . Eksperimentai buvo atlikti esant 1 nM EGF ir nesant ar neperkėlus miR-10b, naudojant ląsteles, ekspresuojančias tuščią vektorių, arba pCMV-SPORT6-TIP30 vektorių. Šis eksperimentinis planas leido konkrečiai įvertinti TIP30, kuris buvo atsparus miR-10b žemynreguliacijai, ekspresijos pasekmes. Kai pCMV-SPORT6-TIP30 buvo perkeltas į PANC-1 ląsteles, miR-10b perkaitimo stimuliuojamasis poveikis EGF sukeltai invazijai buvo visiškai panaikintas (2d pav.). Taigi TIP30 yra funkcinis miR-10b taikinys, kurio sumažėjęs reguliavimas skatina EGF sukeltą invaziją.

Invazija dažnai siejama su padidėjusiu vėžio ląstelių judrumu. Todėl toliau siekėme išsiaiškinti, ar miR-10b moduliavo PCC migraciją. COLO-357 ląstelėse miR-10b, EGF (1 nM), TGF-β1 (0, 5 nM) arba EGF ir TGF-β1 derinys taip pat padidino ląstelių migraciją (2e paveikslas). Be to, esant miR-10b, bendras EGF ir TGF-β1 poveikis migracijai buvo žymiai didesnis nei vartojant atskirai bet kurį augimo faktorių (2e pav.). Priešingai, PANC-1 ląstelėse EGF padidino migraciją tik po miR-10b transfekcijos, tuo tarpu TGF-β1 ir EGF bei TGF-β1 derinys žymiai padidino migraciją kontrolinėse ląstelėse, ir šis poveikis sustiprėjo esant miR-10b (2f pav.).

Buvo naudojami konkretūs inhibitoriai, siekiant patvirtinti, kad EGF ir TGF-β veikė per atitinkamus receptorius, atsižvelgiant į jų individualų ir bendrą stimuliuojantį poveikį invazijai, esant miR-10b. EGFR inhibitorius erlotinibas (2 μM) visiškai užblokavo EGF sukeltą invaziją esant miR-10b tiek COLO-357, tiek PANC-1 ląstelėse (3a ir b paveikslai). Nors PI3K inhibitorius LY294002 (10 μM) ir MEK inhibitorius UO126 (1 μM) iš dalies blokavo šį poveikį, LY294002 ir UO126 derinys buvo toks pat efektyvus kaip erlotinibas slopindamas EGF sukeltą invaziją (3a ir b paveikslai). Be to, miR-10b poveikį bendram EGF – TGF-β1 poveikiui invazijai žymiai susilpnino EGFR kinazės slopinimas erlotinibo ir TβRI kinazės slopinimu kartu su SB505124 ir panaikino dėl jų bendro poveikio (3c ir d pav.), Rodantis, kad EGF ir TGF -β1 veikia per savo atitinkamus receptorius, kad galėtų susikalbėti ir sustiprinti invaziją.

Image

Signalizacijos inhibitorių poveikis invazijai ir miR-10b poveikis signalizacijai. ( a, b ) EGFR inhibitoriaus erlotinibo ir pasroviui skirtų inhibitorių poveikis invazijai. COLO-357 ( a ) ir PANC-1 ( b ) ląstelės buvo transfekuotos miR-10b pirmtaku, buvo inkubuotos 20 valandų be EGF (SF) arba su EGF (1 nM), jei jo nebuvo (D: DMSO) ar nebuvo 2 μM erlotinibo (E), 10 μM LY294002 (LY: PI3K inhibitorius) arba 1 μM UO126 (U: MEK inhibitorius). ( c, d ) Erlotinibo ir TβRI slopinimo su SB505124 poveikis invazijai. COLOR-357 ( c ) ir PANC-1 ( d ) ląstelės, perkeltos miR-10b pirmtaku, buvo inkubuojamos 20 valandų be augimo faktoriaus (-) arba su 1 nM EGF ir 0, 5 n M TGF-β1 (+), jei jos nebuvo. (D: DMSO) arba erlotinibo (E, 2 μM) arba SB505124 (SB, 10 μM) buvimas ir poveikis invazijai. Visų plokščių duomenys yra trijų eksperimentų vidurkiai, analizuoti ANOVA, po to pritaikant Bonferroni. A ) ir ( b ) skyduose * P <0, 05, ** P <0, 01 ir *** P <0, 001, palyginti su vien EGF; ( c ) ir ( d ) skyduose *** P <0, 001, palyginti su EGF ir TGF-β1 deriniu, ir P <0, 05, palyginti su atitinkamomis serumo laisvo (SF) reikšmėmis. ( e, f ) „miR-10b“ perraiškos ir TIP30 numušimo poveikis EGFR signalizavimui. ( e ) PANC-1 ląstelės, perkeltos kontroliniu arba miR-10b pirmtaku, buvo inkubuojamos, kai nurodytu laiku nebuvo 1 n M EGF. Tada buvo atliktas nurodytų baltymų imunoblotas. ERK2 buvo naudojamas juostų apkrovai įvertinti. f ) TIP30 nutildymo poveikis EGFR signalizavimui. PANC-1 ląstelės, transfekuotos kontroline siRNR arba siRNR, nukreipta į TIP30, buvo inkubuojamos, jei nurodytu laiku nebuvo arba nėra 1 n M EGF. Tada buvo atliktas nurodytų baltymų imunoblotas, ERK2 naudojamas juostų apkrovai įvertinti.

Visas dydis

TIP30 yra svarbus komplekso komponentas, kuris reguliuoja endocitotinį EGFR kaupimąsi krūties ir kepenų vėžio ląstelėse ir gali pratęsti signalizaciją pasroviui. 31, 32 Todėl mes siekėme nustatyti, ar miR-10b moduliuoja EGFR raišką ir signalizaciją PANC-1 ląstelėse. Kontroliniu būdu transfekuotose ląstelėse EGF sukėlė laipsnišką EGFR baltymų lygio sumažėjimą, o šis poveikis buvo susilpnintas miR-10b per daug ekspresuojančiose ląstelėse (3e pav.), Tačiau nebuvo susijęs su jokiais EGFR mRNR lygio pokyčiais (nerodyta). EGF taip pat greitai padidino EGFR (Tyr 1148) ir ERK1 / 2 fosforilinimą (Thr-202 / Tyr-204), ir abu šiuos padarinius sustiprino miR-10b (3e pav.). EGR sukeltas AKT fosforilinimas (Ser 473) ir p38 MAPK fosforilinimas (Thr-180 / Tyr-182) miR-10b nepakeitė (3e pav.).

Norint įvertinti, ar vien TIP30 sureguliavimas yra pakankamas norint modifikuoti EGFR signalizaciją PCC, TIP30 lygiai buvo slopinami siRNR 6 (papildoma S1b pav.). TIP30 numušimas susilpnino EGF sukeltą EGFR reguliavimą ir sustiprino EGFR ir ERK1 / 2 fosforilinimą nekeisdamas p38 MAPK fosforilinimo (3f pav.). Priešingai nei miR-10b veiksmai, siRNR taikymas į TIP30 sustiprino EGF sukeltą AKT fosforilinimą (3f pav.), Kas rodo, kad TIP30 gali slopinti išgyvenimo signalus, nepriklausomai nuo savo veiksmų, susijusių su EGFR žemyn reguliavimu.

Vėžio ląstelių invazija dažnai siejama su sustiprintu EMT, o TGF-β1 sukelia EMT PCC. 35 Todėl mes toliau siekėme išsiaiškinti, ar miR-10b moduliavo TGF-β ir EGF poveikį su EMT susijusių genų ekspresijai (4 paveikslas). Tiek COLO-357, tiek PANC-1 ląstelėse miR-10b reikšmingai sumažino E-kadherino kiekį, ir šis poveikis ryškiausias buvo esant TGF-β1 ir EGF deriniui (4a paveikslas). Abiejose ląstelių linijose EGF ir TGF-β1 padidino N-kadherino ir vimentino ekspresiją, tačiau tik esant aukštam miR-10b lygiui (4b ir c paveikslai). Be to, esant miR-10b, N-kadherino ekspresiją padidino vien TGF-β1 COLO-357 ląstelėse ir vien EGF PANC-1 ląstelėse, kur EGF ir TGF-β1 taip pat padidino N-kadheriną. pridėto miR-10b (4b paveikslas). Sraigės ir Zeb1 raiška padidėjo COLO-357 ląstelėse, reaguojant į bet kurį arba abu augimo faktorius, esant miR-10b, taip pat esant abiems augimo faktoriams, nepridedant miR-10b (4d ir e paveikslai). . Priešingai, PANC-1 ląstelės padidino sraigės kiekį tik reaguodamos į abu augimo faktorius, o šį poveikį šiek tiek padidino miR-10b (4d pav.). „Zeb1“ ekspresijos padidėjimas PANC-1 ląstelėse buvo panašus į pastebėtus COLO-357 ląstelėse, išskyrus tai, kad TGF-β1 buvo veiksmingas net ir nepridedant miR-10b (4e paveikslas).

Image

MiR-10b poveikis genų, susijusių su EMT, ekspresijai. ( a, e ) qRT – PGR. Kontrolinės (kietos juostos) arba miR-10b pirmtako (atviros juostos) transfekuotos COLO-357 ir PANC-1 ląstelės buvo inkubuotos, jei nėra (serumo nėra: SF) arba nėra EGF (E, 1 n M), TGF-β1 ( T, 0, 5 nM) arba abu, ir EGF, ir TGF-β1 (E + T) 24 valandas, o po to imami RNR ekstrakcijai ir qRT – PCR E-kadherinui ( a ), N-kadherinui ( b ), Vimentinui ( c )., Sraigė ( d ) ir zeb1 ( e ). Duomenys yra keturių eksperimentų vidurkis. Buvo atliktas dvipusis ANOVA, po kurio Bonferroni buvo sureguliuotas. * P <0, 05, ** P <0, 01 ir *** P <0, 001, palyginti su atitinkamomis kontrolinėmis transfekuotomis ląstelėmis; # P <0, 05, ## P <0, 01 ir ### P <0, 001, palyginti su atitinkamomis ląstelėmis SF būklės.

Visas dydis

Toliau mes ištyrėme miR-10b poveikį kelių žinomų miR-10b taikinių genų, 27, 36, 37, 38, 39, 40, HOXD10 , TIAM1 , KLF4 , SDC1 ir NF1 , ekspresijai AsPC-1, COLO-357 ir 27 PANC-1 ląstelės. Atliekant qRT – PGR, KLF4 , SDC1 ir NF1 raišką sumažino miR-10b visose trijose ląstelių linijose (5a pav.), Tuo tarpu NF2 raiška nepakito (5a paveikslas). Be to, miR-10b nepakeitė nei HOXD10, nei TIAM1 ekspresijos (neparodyta).

Image

„miR-10b“ taikiniai žmogaus PCC ir TIP30 ekspresija PDAC. a ) qRT – PGR. AsPC-1, COLO-357 ir PANC-1 ląstelės buvo transfekuotos kontrolinėmis (kietomis juostomis) arba miR-10b pirmtaku (atviromis juostomis) 48 valandas, po to surinktos RNR ekstrakcijai ir qRT – PGR nurodytoms mRNR. ( b, c ) TIP30 išraiška PDAC. TIP30 imunohistochemija žmogaus PDAC audiniuose rodo, kad TIP30 pasižymi dideliu imunoreaktyvumu PCC sergant gerai ar vidutiniškai diferencijuotu vėžiu ( b ). Priešingai, mažai diferencijuotų PDAC PCC pasižymi silpnu TIP30 imunoreaktyvumu ( c ). Intarpai rodo padidintus dėžučių sričių vaizdus. Parodomi reprezentaciniai vaizdai. Strypai = 50 μm. * P <0, 05, palyginti su atitinkamomis kontrolinėmis transfekuotomis ląstelėmis.

Visas dydis

Toliau mes siekėme nustatyti, ar TIP30 yra ekspresuojamas žmogaus PDAC mėginiuose, naudojant tą patį labai specifinį antikūną, kuris buvo naudojamas imunoblotavimo eksperimentuose. TIP30 buvo lengvai matomas daugelio vėžio ląstelių citoplazmoje, bet ne gretimoje stromoje. Be to, aukšta TIP30 ekspresija iš esmės buvo matoma gerai ar vidutiniškai diferencijuotoje PDAC (5b pav.), Tuo tarpu maža TIP30 ekspresija buvo pastebima blogai diferencijuotame PDAC (5c pav.)

Norėdami patvirtinti miR-10b indėlį į PDAC biologinį agresyvumą, mes atlikome in vivo tyrimą ortotopiniu modeliu, naudodami atletines peles (6 pav.) Ir T3M4 ląsteles, sukurtas stabiliai ekspresuoti miR-10b. Šiems tyrimams buvo naudojamos T3M4 ląstelės, nes jos ekspresuoja aukštą 41 EGFR lygį ir žemą miR-10b lygį (nerodyta). Ir kontrolinės, ir miR-10b per daug ekspresuojančios T3M4 ląstelės sudarė kasos vidinius navikus visoms pelėms, tačiau didelis miR-10b kiekis sąlygojo greitesnį augimą ir didesnius navikus (6a ir b paveikslai). Nors abi navikų grupės histologiškai buvo panašios, miR-10b per daug ekspresuojančiuose navikuose buvo daug Ki67 teigiamų ląstelių, atspindinčių daugybę ląstelių vėlyvoje G1, S, G2 arba M fazėje (6c paveikslas). Be to, palyginti su kontroliniais navikais, pastebimai padidėjo fosfo-histono H3 teigiamų vėžinių ląstelių, kurioms atliekama mitozė miR-10b per daug ekspresuojančiuose navikuose, skaičius (6c paveikslas). Taigi, miR-10b daro daugybę žalingų veiksmų PCC, tarp kurių yra EGFR signalo padidinimas, NF-1 sumažėjęs reguliavimas ir sumažėjusi metastazes slopinančių genų ekspresija, taip prisidedant prie padidėjusio PCC proliferacijos ir invazijos (6d pav.).

Image

„miR-10b“ per didelė ekspresija skatina naviko augimą. ( a, b ) „miR-10b“ ekspresijos poveikis T3M4 augimui in vivo . a ) Aukštos skiriamosios gebos ultragarsiniai vaizdai, gauti praėjus 3 savaitėms po PCC injekcijos į kasą, rodo, kad miR-10b transdukcija, palyginti su ląstelėmis, kurių transdukcija atlikta su tuščiu vektoriu (kontrolė), žymiai padidina naviko augimą. Navikai nubrėžti ir parodyti kaip reprezentatyvūs vaizdai iš dviejų iš penkių kontrolinių arba miR-10b padidėjusių navikų. ( b ) Šių navikų kiekis, apskaičiuotas atliekant trimatį pilvo vaizdą, rodo, kad miR-10b per didelis ekspresija (atvira juosta) žymiai padidina naviko tūrį. Duomenys yra visų penkių kontrolinių (Sham) ir miR-10b perduodamų navikų vidurkis ± sem. T- testas buvo naudojamas reikšmingiems skirtumams patikrinti. * P <0, 05. c ) „MiR-10b“ per didelis ekspresijos poveikis proliferacijai in vivo. Kontrolės ir miR-10b perneštų navikų imunohistochemija rodo, kad per didelis miR-10b ekspresija padidina proliferaciją, ką patvirtina padidėjęs Ki67 ir fosfo-histono H3 imunoreaktyvumas, palyginti su kontroliniais navikais. Parodytos reprezentatyvios H&E dėmės, o Ki67 ir fosfohistonas H3 imuniniai dažai, gauti iš vieno iš penkių kontrolinių ar miR-10b perduodamų navikų. Strypai = 50 μm. ( d ) MiR-10b veiksmų schematinis vaizdas PCC.

Visas dydis

Diskusija

Iš pradžių buvo pranešta, kad miR-10b yra metastazių skatintojas sergant krūties vėžiu 27, o vėliau susijęs su metastazių sustiprinimu stemplės, 37 storosios žarnos, 42 kepenų 43 ir kasos 24 vėžiuose bei invazijos į glioblastomą atvejais. Sergant krūties vėžiu, miR-10b sumažina HOXD10 reguliavimą, todėl padidėja metastazes skatinančios RhoC ekspresija. 27 Be to, singeneiniame ortotopiniame pelės krūties vėžio modelyje miR-10b antagonistai reikšmingai sumažino metastazių dažnį plaučiuose. 28

Šiame tyrime mes nustatėme, kad miR-10b koncentracija plazmoje yra ženkliai padidėjusi PDAC sergantiems pacientams, palyginti su normaliais asmenimis arba pacientais, sergančiais lėtiniu pankreatitu, ir tai rodo, kad miR-10b tyrimas gali būti naudingas diagnostinis biomarkeris. Be to, miR-10b perviršis PCC padidino EGF stimuliuotą invaziją. Atlikus genų profiliavimą, imunoblotų nustatymą ir luciferazės reporterių tyrimus, TIP30 buvo identifikuotas kaip taikinys, tiesiogiai sureguliuojamas dėl miR-10b per didelės ekspresijos. Keturios įrodymų eilutės rodo, kad miR-10b skatino EGF tarpininkavimą invazijoje sumažindamas TIP30 ir sustiprindamas EGFR signalizaciją. Pirmiausia, TIP30 cDNR, kuris yra atsparus tylėjimui miR-10b, ekspresija panaikino miR-10b veiksmus invazijai. Antra, dėl SIPR sukelto TIP30 nutildymo padidėjo EGF tarpininkavimas. Trečia, tiek aukštas miR-10b lygis, tiek TIP30 numušimas sustiprino EGF sukeltą EGFR tirozino fosforilinimą ir ERK fosforilinimą, tuo tarpu silpninantį EGFR žemąjį reguliavimą. Ketvirta, EGF sukelta invazija esant dideliam miR-10b lygiui buvo užblokuota erlotinibo ir PI3K inhibitoriaus LY294002 bei MEK inhibitoriaus UO126, veikiant dviem pagrindiniais keliais paskui EGFR aktyvaciją, bendrų veiksmų.

PCC ir PDACs išreiškia aukštą EGFR, žinomo apskritai mitogeninių signalų tarpininko ir PCC invazijos bei metastazių skatintojo, kuris yra būtinas PDAC inicijavimui ir progresavimui, lygį. 44, 45, 46 PDAC taip pat išreiškia aukštą žmogaus EGFR 2 (HER2) ir HER3 lygį, kurie heterodimerizuojasi su EGFR, taip paįvairindami ir sustiprindami signalizacijos kaskadas. 47, 48 Be to, PDACs išreiškia aukštą TGF-βs, 14-3-3sigma, MUC1, β1-integrinų ir delta-N p63 lygį - visa tai padidina EGFR gebėjimą suaktyvinti nukrypimo kelius, prisidedančius prie PCC invaziškumo. 26, 33, 49, 50, 51, 52 Šiame tyrime mes taip pat nustatėme, kad TGF-β padidino EGF tarpininkautų ląstelių invaziją ir kad šį poveikį pastebimai sustiprino aukštas miR-10b kiekis. Įspūdinga, kad EGF, TGF-β ir miR-10b derinys ženkliai padidino vėžio ląstelių invaziją ir į EMT panašius genų ekspresijos pokyčius. Taigi miR-10b palengvino žalingą kryžminį ryšį tarp EGF ir TGF-β tokiu būdu, kuris skatina PCC invaziją. Atsižvelgiant į tai, kad miR-10b, EGFR ir TGF-β dažnai yra per daug ekspresuojami PDAC, 22, 23, 24, 25, 26, šie pastebėjimai rodo, kad miR-10b slopinimas gali užkirsti kelią invazijai ir galbūt metastazėms PDAC, tuo pačiu nutraukiant žalingą EGF – TGF-β. sąveikos, galinčios prisidėti prie PCC proliferacijos in vivo .

EGF prisijungimas prie EGFR suaktyvina daugybę signalinių signalų perdavimo būdų PCC, tokiuose kaip Ras / Raf / MAPK ir Rac / JNK / MAPK-38, 51 ir EGF, tada greitai išgydoma endocitozė. 53 EGF / EGFR kompleksai iš pradžių patenka į ankstyvasias endosomas, kur EGFR kinazė tebėra aktyvi 54, 55, ir eina į vėlyvąją endosomą, prieš patenkant į lizosomą, kur EGFR skaidomas. TIP30 pagreitina EGFR progresavimą nuo ankstyvųjų iki vėlyvųjų endosomų, tuo tarpu TIP30 nutildymas sukelia EGF – EGFR kompleksų susilaikymą ankstyvojoje endosomoje, taip susilpnindamas EGFR irimą ir pailgindamas jo signalizaciją. 31, 32, 57 Tiek, kiek PDAC siejamas su kelių EGF šeimos narių, įskaitant TGF-α, į hepariną surišančio EGF tipo augimo faktoriaus, amfiregulino ir beta -celiulino, ekspresija, 44, mūsų išvados rodo, kad TIP30 praradimas PDAC gali sukelti EGFR padidėjusį reguliavimą, esant dideliam EGFR ligandų kiekiui, kuris kitaip paskatintų EGFR skilimą. Be to, TIP30 praradimas padidina jautrumą navikogenezei 29 ir buvo susijęs su metastazavusiu krūties vėžiu. 58 Apibendrinant, šie pastebėjimai rodo, kad padidėjęs PDR miR-10b gali skatinti PCC proliferaciją ir metastazes bei padidinti ligos agresyvumą slopindamas TIP30 ir padidindamas EGFR. Pagrįsdami šią išvadą, žemesnis TIP30 lygis buvo susijęs su silpniau diferencijuota histologija, o T3M4 ląstelės, perkeltos į miR-10b ekspresiją, parodė pagreitintą PCC proliferaciją ir kasos viduje esančio naviko augimą.

„miR-10b“ skatina invaziją keliuose vėžio tipuose, slopindamas įvairių metastazių slopintuvų ekspresiją. Sergant krūties vėžiu, miR-10b, ne tik nukreipdamas į HOXD10, sustiprina invaziją nukreipdamas į sindekaną-1 (SDC1), kuris, kaip žinoma, slopina metastazes. 39 Be to, miR-10b gali veikti slopindamas KLF4 - cinko piršto transkripcijos faktorių, kuris taip pat gali slopinti metastazių susidarymą, 37, 59 ir NF-1, 40, kuris silpnina rasą. Šiame tyrime miR-10b nepakeitė HOXD10 ar TIAM-1 ekspresijos, tačiau sumažino SDC1, NF1 ir KLF4 raišką. Šis selektyvus taikymas leidžia manyti, kad papildomi veiksniai gali prisijungti prie netikslinių mRNR fragmentų PCC, paversdami jų vietas neprieinamomis miR-10b, kaip buvo pranešta apie miR-34a. 60

Genų profiliavimas nustatė du naujus galimus taikinius, kuriuos nereglamentavo miR-10b, RAP2A ir EPHB2. Bioinformatinė analizė numatė, kad abu genai turi bent vieną miR-10b surišimo vietą, ir tai rodo, kad jie yra tiesioginiai miR-10b taikiniai. RAP2A yra susijęs su ląstelių adhezija ir yra indukuojamas LKB1, kurio funkcijos praradimas yra susijęs su pakitusiu ląstelių poliškumu ir sustiprintomis metastazėmis plaučių vėžyje. 61, 62 Panašiai EPHB2 praradimas buvo susijęs su padidėjusia gaubtinės ir tiesiosios žarnos bei skrandžio vėžio metastazėmis. 63, 64 miR-10b taip pat padidino EGT ir TGF-β sukeltą su EMT susijusių genų ekspresiją, mažindami E-kadherino lygį, tuo pačiu didindami N-kadherino, vimentino, Tvist, sraigės ir Zeb1 lygius. Visi šie duomenys rodo, kad miR-10b moduliuoja PCC genų repertuarą, kurio sumažėjęs reguliavimas pagerina metastazavimo procesą, kartu skatindamas EMT, o tai dar labiau padidina šių ląstelių judrumą ir metastazavimo galimybes.

Nemažai pranešimų atkreipė dėmesį į abipusę moduliacinę sąveiką tarp specifinių miR ir EGF receptorių šeimos narių. Taigi, dėl EGFR aktyvacijos padidėja miR-21, 65 miR-221 ir miR-222 ekspresija. 66 Priešingai, miR-7 ir miR-133b slopina EGFR ekspresiją, 67, 68, 69, tuo tarpu miR-125a ir 125b slopina HER2 / HER3, o miR-205 nukreipia į HER3, bet ne į kitus HER. 70, 71 Mūsų žiniomis, tai yra pirmasis tyrimas, parodantis galimą miR-10b ir EGFR signalizacijos ryšį.

Mūsų išvados taip pat rodo, kad miR-10b palengvina galimą žalingą sąveiką tarp EGFR ir TGF-β kelių. Nors tikslūs mechanizmai, kuriais miR-10b sustiprina šią sąveiką, nėra žinomi, yra keletas potencialiai vienas kitą papildančių galimybių. Pirmiausia, TGF-β receptoriai patiria endocitozę ir perdirbimą, o padidėjęs jų išlaikymas ankstyvojoje endosomoje gali padidinti TGF-β receptorių signalizaciją. 72 Taigi yra įmanoma, kad bendras susilaikymas ankstyvojoje endosomoje gali palengvinti kryžminius šių receptorių pokalbius. Antra, tiek MAPK aktyvinimas, tiek Smad signalizavimas yra būtini TGF-β sukeltai EMT, 73 ir miR-10b padidino EGF gebėjimą suaktyvinti MAPK. Trečia, endosomos viduje EGFR sukelia AGO2 fosforilinimąsi į AGO2-Y393, taip sumažindamas AGO2 prisijungimą prie Dicer ir susilpnindamas pirmtakų miRNR perdirbimą į subrendusias miRNR. 74, 75. Priešingai, TGF-β skatina Drosha medijuojamo miRNR brendimą 76, 77 ir padidina EMT sukeliančių miR raišką. 35 Šie pastebėjimai iškelia galimybę, kad TGF-β gali iš dalies veikti trukdydamas EGFR veiksmams „Dicer“.

Apibendrinant, mūsų išvados rodo, kad cirkuliuojantis miR-10b lygis gali būti naudojamas kaip diagnostinis biologinis žymeklis PDAC, ir rodo, kad taikymas miR-10b gali būti svarbus terapinis požiūris į šį mirtiną vėžį, kuris galėtų pakeisti daugybę žalingų šio oncomir veiksmų.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūros

ASPC-1 ir PANC-1 žmogaus PCC buvo gauti iš ATCC (Manassas, VA, JAV), kurie patvirtino jų autentiškumą. COLO-357 ir T3M4 žmogaus PCC buvo Dr RS Metzger dovana Duke universitete. Jų autentiškumas buvo patvirtintas chromosomų analize. ASPC-1 ląstelės buvo auginamos RPMI 1640, o PANC-1 ir COLO-357 ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje. Terpė buvo papildyta 5% vaisiaus vaisiaus serumu, 100 V / ml penicilino ir 100 μg / ml streptomicino (visa terpė) 37 ° C temperatūroje sudrėkintame 5% CO 2 inkubatoriuje. Terpė be serumo buvo papildyta 0, 1% galvijų serumo albumino, 5 μg / ml apotransferrino ir 5 ng / ml natrio selenito. EGF (Millipore, Billerica, MA, JAV) ir TGF-β („Genentech, Inc.“, Pietų San Franciskas, CA, JAV) buvo pridedami nurodytomis koncentracijomis.

RNR išskyrimas ir kiekybinis nustatymas

Bendra RNR buvo ekstrahuota naudojant TRIZOL reagentą (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV). Brandžių miRNR tyrimai buvo atlikti naudojant „TaqMan miRNA qRT – PCR“ rinkinį (Life Technologies, Gaithersburg, MD, JAV), naudojant vidinę kontrolę RNU6B. Norint ištirti mRNR, RNR (500 ng) buvo atvirkščiai perrašyta į cDNR naudojant didelės talpos RNR į cDNR pagrindinį mišinį, o qRT – PGR buvo atlikta naudojant „Power SYBR Green Master Mix“ (abu iš „Life Technologies“). Gruntai buvo sukurti naudojant internetinį įrankį „Prime-BLAST“.

Transfekcija

Ląstelės buvo transfekuotos 20–60 n M miR-10b pirmtaku (žinomu kaip pre-miR hsa-miR-10b pirmtaku, prasmė: 5′-UACCCUGUAGAACCGAAUUUGUG-3 ′, Life Technologies) arba kontroliniu pirmtaku (žinomu kaip pre-miR non - Tikslinė neigiama kontrolė, pojūtis: 5′-UGUACUGCUUACGAUUCGGTT-3 ′) esant 50% santakai. Transfekuotos ląstelės buvo pasodintos MTT (3- [4, 5-dimetiltiazol-2-il] -2, 5 difeniltetrazolio bromido) (24 val. Po transfekcijos) arba transvero invazijos (48 val. Po transfekcijos) tyrimams. TIP30 nutildyti buvo naudojamos netaikomos siRNR arba siRNR (ON-TARGET ir siRNR, Dharmacon, Lafayette, CO, JAV), skirtos TIP30 nutildyti COLO-357 (60 n M) ir PANC-1 (20 n M) ląstelėse. TIP30 gelbėjimo eksperimentams PANC-1 ląstelės buvo transfekuotos 20 nM miR pirmtaku ir 250 ng pCMV-SPORT6-TIP30 cDNR ir Lipofectamine 2000 (abu iš „Invitrogen“), kurie buvo naudojami visuose transfekcijos tyrimuose.

Transdukcija

Norėdami stabiliai ekspressuoti miR-10b PCC, MDH1-PGK-GFP mikroRNR-10b retrovirusinis konstruktas. 28 Addgene plasmid No. 16070) or an empty MDH1-PGK-GFP construct (Addgene plasmid No. 11375) were transfected into Phoenix cells, a 293 T-based retroviral packaging cell line (Life Technologies). Viruses were harvested, and PCCs were transduced as described. 78 After 48 h, GFP-positive cells PCCs were isolated (Flow Cytometry Facility, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, IN, USA), re-plated and cultured as described above.

MTT, invasion and migration assays

MTT assays were performed in 96-well plates. 49 miR-10b precursor and precursor control transfected cells (5 × 10 4 ) were plated in Matrigel pre-coated transwell chambers (BD Biosciences, San Jose, CA, USA), and invasion assays were performed as previously reported. 49, 78 UO126 (1 μ M ) were from Alexis Biochemicals (San Diego, CA, USA). Erlotinib (2 μ M ; Genentech, Inc.) and LY294002 (10 μ M ; Calbiochem, San Diego, CA, USA) were added to serum-free medium in the lower chamber in the absence or presence of 1 n M EGF and/or 0.5 n M TGF-β1. Wound-healing assays were performed as previously reported 49, 78 24 h after cell transfection with pre-miR-10b oligonucleotides.

Microarray and data analysis

miR-10b precursor or control transfected PANC-1 cells were harvested at 20 h post transfection. Total RNA (three replicates per condition) was extracted using TRIZOL reagent. Microarray analysis for microRNAs was performed by the Genomics and Microarray Core Facility at Dartmouth Medical School. Array data were registered with GEO (accession No. GSE40189) for public access.

Imunoblotai

Whole-cell extracts were prepared in ice-cold lysis buffer consisting of 20 m M Tris-HCl (pH 7.5), 150 m M NaCl, 1 m M EDTA, 1 m M EGTA (ethylene glycol tetraacetic acid), 1% Triton, 2.5 m M sodium pyrophosphate, 1 m M beta-glycerophosphate, 1 m M Na 3 VO 4, 1 m M PMSF and one tablet of complete protease inhibitor/10 ml. Lysates (25 μg/lane) were subjected to 10-12% SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) and transferred to PVDF (polyvinylidene difluoride; Millipore) and immunoblotted. 33 Antibodies directed against the following antigens were used: EGFR, Phospho-EGFR Tyr1148, phospho-AKT Ser473, AKT, phospho-p44/42 MAPK Thr202/Tyr204, p44/42 MAPK, phospho-p38 MAPK Thr180/Tyr182, p38 MAPK (all from Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), and ERK2 (C-14, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). The anti-TIP30 antibody was a kind gift from Dr Hua Xiao at the Michigan State University.

Konstruoja

The LightSwitch TIP30 3′UTR Reporter (Switchgear Genomics, Menlo Park, CA, USA) was utilized to assess whether there is a direct interaction between miR-10b and TIP30 3′UTR. Site-directed mutagenesis kits (Stratagene, La Jolla, CA, USA) were used to introduce a six-base pair mutation in the seed-binding site of TIP30 3′UTR. The pCMV-SPORT6 TIP30 cDNA construct used in the TIP30 rescue experiment was purchased from Open Biosystems, Huntsville, AL, USA.

Liuciferazės žurnalisto tyrimas

Cells in 24-well plates (50% confluency) were co-transfected with miR-10b precursor (20 n M ) and TIP30 3′UTR Reporter (200 ng). Luciferase activity was measured 24 h later using the Dual-Glo luciferase assay system (Promega, Fitchburg, WI, USA).

Circulating miR-10b quantitation

Plasma from 20 normal, 5 chronic pancreatitis and 17 PDAC patients was obtained from the Indiana University Simon Cancer Center Solid Tissue Bank (Indianapolis, IN, USA). RNA was isolated from 100 μl of plasma using Trizol LS (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) according to the manufacturer's recommendations. qRT–PCR for miR-10b was performed in duplicate with a Taqman micro RNA reverse transcription kit and a miR-10b-specific primer/probe set (Life Technologies). Ct values were obtained using a Viia 7 Real-time PCR System (Life Technologies). miR-10b levels were normalized to miR-16 levels, a stable and abundant circulating microRNA 79 that is a suitable endogenous control for analyzing circulating microRNAs in PDAC plasma. 80 Fold increases were calculated relative to miR-10b levels in normal plasma.

Orthotopic model

Sham- and miR-10b transduced T3M4 cells were injected into the tail region of each pancreas (500.000 cells/injection) of five 8-week-old male athymic mice. Tumors were imaged 3 weeks later with a Vevo2100 high resolution ultrasound (Visual Sonics Inc., Toronto, ON, Canada). Tumor volumes were calculated using the three-dimensional abdominal images and the Vevo2100 System software. Tumors were harvested, fixed, embedded, sectioned and hematoxylin and eosin stained. 81

Imunohistochemija

Paraffin-embedded human PDAC tissues were obtained from the Indiana University Simon Cancer Center Solid Tissue Bank, and 5-μm sections were stained for TIP30 using the anti-TIP30 antibody as described. 82 For the orthotopic tumors, immunohistochemistry was performed on 5-μm sections using Ki67 (Novocastra, UK) and phospho-Histone H3 (Cell Signaling Technology, Inc.) antibodies. 81, 82

Statistinė analizė

Results are presented as mean±sem Statistical differences between groups were assessed using one sample t -test analysis, one-way or two-way ANOVA, as indicated, followed by Bonferroni post-test analysis. P <0, 05 buvo laikomas statistiškai reikšmingu.

Prisijungimai

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE40189

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)