Mir-210 slopina nf-κb signalizacijos kelią nukreipdamas dr6 į osteoartritą | mokslinės ataskaitos

Mir-210 slopina nf-κb signalizacijos kelią nukreipdamas dr6 į osteoartritą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių biologija
  • Medicininiai tyrimai

Anotacija

Osteoartritui (OA) būdingas sąnario kremzlės ir sąnarių uždegimo suirimas. Įrodyta, kad mikroRNR vaidina svarbų vaidmenį chondrogenezės reguliavime. Ankstesnis tyrimas parodė, kad mikroRNR-210 (miR-210) greičiausiai buvo susijęs su osteoartritu, o miR-210 funkcija osteoartrito srityje vis dar nežinoma. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti apsauginį miR-210 poveikį osteoartritui. Tyrimų in vitro metu miR-210 lygis chondrocituose sumažėjo po gydymo lipopolisaharidais (LPS). Transfekcija miR-210 mimika slopino LPS sukeltą priešuždegiminį citokinų gamybą, ląstelių gyvybingumo sumažėjimą ir ląstelių apoptozę. Luciferazės aktyvumo tyrimo rezultatai parodė, kad miR-210 nukreipė mirties receptorių 6 (DR6) 3′-UTR, kad slopintų jo ekspresiją. MiR-210 mimika ir DR6 siRNR transfekcija slopino NF-κB kelio aktyvaciją ir chondrocitų ląstelių apoptozę. In vivo tyrimui buvo nustatytas OA modelis žiurkėms priekinio kryžminio raiščio perskirstymo (ACLT) būdu. OA žiurkėms sumažėja MiR-210 ekspresija. Į OA žiurkes buvo suleistas MiR-210 per daug ekspresuojantis lentivirusas. MiR-210 padidinta citokinų gamyba, NF-κB ir DR6 ekspresija OA žiurkėms buvo slopinama. Rezultatai parodė, kad miR-210 sumažino uždegimą OA žiurkių sąnario ertmėje, nukreipdamas į DR6 ir slopindamas NF-κB signalizacijos kelią.

Įvadas

Osteoartritas (OA) yra viena iš labiausiai paplitusių degeneracinių sąnarių ligų, kurioms būdingas sąnario kremzlės irimas ir sąnarių uždegimas 1 . OA 2 nesubalansuota sąnario kremzlės atstatymas ir irimas. MikroRNR (miRNR) yra mažų nekoduojančių RNR, jungiančių prie tikslinių mRNR, grupė, kad trukdytų 3 vertimo procesui. MiRNR atlieka įvairias funkcijas, įskaitant ląstelių diferenciacijos, proliferacijos ir apoptozės reguliavimą, taip pat vėžio inicijavimą ir progresavimą 4, 5 . Keletas miRNR turi specifinį audinio arba vystymosi etapo išraiškos modelį ir yra susijusios su tokiomis ligomis kaip vėžys, širdies liga, diabetas ir reumatoidinis artritas 6, 7, 8, 9, 10 . Neseniai buvo įrodyta, kad miRNR vaidina svarbų vaidmenį chondrogenezėje ir OA 11 . Ankstesnis tyrimas parodė, kad mikroRNR-210 (miR-210) tikriausiai buvo susijusi su OA 12, o miR-210 funkcija vis dar nežinoma.

Kadangi uždegimas yra OA požymis, tai, kad sinoviniame skystyje (SF) yra aukščiau reguliuojamas priešuždegiminių citokinų lygis, rodo ankstyvojo OA 1 sinovitas. Įrodyta, kad MiR-210 slopina uždegimą sukeliančius citokinus 13 . Neseniai paskelbta ataskaita parodė, kad miR-210 susijęs su branduolinio faktoriaus kappa-B (NF-κB) signalizacijos keliu, kuris yra gerai išsaugotas, visur esantis ir pagrindinis imuninio atsako, uždegimo ir ląstelių išgyvenimo reguliatorius. 14, 15, 16, 17 . Tačiau tikslus miR-210 ir NF-κB mechanizmo mechanizmas buvo visiškai iliustruotas. Naviko nektozės faktoriaus (TNF) receptoriai yra pagrindiniai uždegimo ir imuninės sistemos veikėjai. Įrodyta, kad mirties mirties 6 receptorius (DR6), taip pat žinomas kaip TNF receptorių 21 šeimos narys (TNFRSF21), sukelia ląstelių apoptozę ir NF-κB 18 aktyvaciją. Ankstesnis tyrimas pranešė, kad DR6 yra aukščiau sureguliuojamas OA 19, todėl spėjame, kad DR6 gali būti molekulinis tarpininkas tarp miR-210 ir NF-κB kelio.

Šio tyrimo tikslas buvo įvertinti miR-210 vaidmenį ir jo mechanizmą OA. Mes nustatėme, kad miR-210 nukreipė DR6 ir slopino NF-κB aktyvaciją tiek in vivo, tiek in vitro . Rezultatai parodė, kad miR-210 gali būti medicinos taikinys gydant OA.

Rezultatai

MiR-210 raišką slopino LPS chondrocituose

Išskirti chondrocitai buvo gydomi LPS, kad sukeltų uždegimą in vitro , miR-210 ekspresijos lygis buvo aptiktas RT-PGR. Kaip parodyta 1a pav., LPS sukeltose ląstelėse miR-210 lygis sumažėjo 75%. Norėdami ištirti miR-210 poveikį LPS sukeltam chondrocitų uždegimui, atskirti chondrocitai buvo transfekuoti miR-210 mimika arba neigiama mimika. MiR-210 ekspresija chondrocituose buvo žymiai padidinta po transfekcijos miR-210 mimika (1b pav.).

Image

a ) MiR-210 mRNR lygis chondrocituose, apdorojant LPS / PBS; ( b ) MiR-210 mRNR lygis chondrocituose, perkrautuose neigiama mimika arba miR-210 mimika. Duomenys parodomi kaip trijų eksperimentinių pakartojimų vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

MiR-210 imitacija palengvino priešuždegiminį citokinų gamybą, ląstelių gyvybingumo sumažėjimą ir LPS sukeltą ląstelių apoptozę

LPS paprastai sukelia uždegimą ir sukelia ląstelių apoptozę. Po inkubacijos su LPS, ELISA buvo nustatyti IL-1β, IL-6 ir TNF-α lygiai ląstelių supernatante. Rezultatai parodė, kad LPS sukėlė IL-1β, IL-6 ir TNF-α sekreciją (2a pav.). IL-1β ir TNF-α lygiai sumažėjo miR-210 imituojančiose ląstelėse (2a pav.). Chondrocitų ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas MTT tyrimu. Kaip parodyta 2b pav., Apdorojant LPS, santykinis ląstelių gyvybingumas sumažėjo 55%, tuo tarpu ląstelių gyvybingumas padidėjo 32% po miR-210 transfekcijos. Srauto citometrija buvo naudojama norint įvertinti LPS sukeltų chondrocitų apoptozę. Kaip parodyta 2c pav., D, LPS sukeltų ląstelių ląstelių apoptozės procentas padidėjo iki 39, 1% ( P <0, 01) ir sumažėjo iki 25, 6% po miR-210 mimikos transfekcijos ( P <0, 05). Rezultatai parodė, kad miR-210 apsaugo chondrocitus nuo LPS sukeltos žalos.

Image

a ) IL-1β, IL-6 ir TNF-α gamyba ląstelių kultūros supernatantuose buvo nustatyta ELISA metodu; ( b ) MTT tyrimu buvo nustatytas ląstelių gyvybingumas; ( c - d ) Ląstelių apoptozė buvo matuojama FCM. Duomenys parodomi kaip trijų eksperimentinių pakartojimų vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su kontroline grupe; # P <0, 05 palyginti su LPS grupe.

Visas dydis

„MiR-210“ nusitaikė į DR6 chondrocituose

Norėdami ištirti „miR-210“ molekulinį mechanizmą, „RegRNA“ svetainėje buvo numatyti galimi miR-210 taikiniai. Galiausiai DR6 buvo pasirinktas kaip greičiausias miR-210 taikinys uždegimo metu (3c pav.). DRR mRNR ir baltymų lygis buvo aptiktas atitinkamai RT-PCR ir Western blot metodais. Kaip parodyta 3a, b pav., LPS padidino DR6 baltymo lygį ir slopino miR-210 mimika. Tačiau DR6 mRNR lygio pokytis nebuvo akivaizdus, ​​tai rodo, kad DR6 ekspresijos reguliavimas buvo posttranskripcinis geno nutildymas (PTGS). Norint patvirtinti, ar miR-210 buvo nukreiptas į DR6 3′-UTR, buvo atliktas santykinio luciferazės aktyvumo tyrimas. Santykinis luciferazės aktyvumas reikšmingai sumažėjo, kai ląstelės buvo transfekuotos plataus tipo DR6 3′-UTR ir mR-210 imitacija (3d pav.). Rezultatai parodė, kad DR6 buvo tiesioginis miR-210 taikinys.

Image

a ) DR6 mRNR lygiai chondrocituose su skirtingu gydymu; ( b ) DR6 baltymo kiekis chondrocituose, skirtingai gydant; c ) miR-210, nukreipto į DR6 3′-UTR, prognozės rezultatas; d ) santykinis 293T ląstelių luciferazės aktyvumas skirtingai gydant. Duomenys pateikiami kaip trijų eksperimentinių pakartojimų vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su kontroline grupe, # P <0, 05, palyginti su LPS grupe.

Visas dydis

MiR-210 apsaugojo chondrocitus slopindamas NF-κB kelią

Įrodyta, kad DR6 aktyvina NF-κB ir sukelia ląstelių apoptozę 18 . Norint ištirti, ar NF-κB signalizacijos kelias buvo susijęs su apsauginiu miR-210 poveikiu, tyrime buvo naudojama pirolidino ditiokarbamo rūgštis (PDTC), kuri yra NF-κB inhibitorius. Kaip parodyta 4a pav., LPS paskatino NF-κB signalizacijos kelio aktyvaciją, įrodant p65 indukciją ir IκBα sumažinimą, o aktyvacija buvo slopinama PDTC. LPS sukeltą p65 ir IκBα reguliavimą taip pat slopino miR-210 mimika ir DR6 siRNR. Be to, LPS sukeltą ląstelių apoptozę susilpnino PDTC, DR6 siRNR ir miR-210 mimika (4b pav.), Kas rodo, kad miR-210 nukreipė DR6 ir apsaugotus chondrocitus nuo LPS, slopindamas NF-κB signalizacijos kelio aktyvaciją.

Image

a ) IκBα ir p65 raiškos buvo aptiktos atliekant Western blot analizę; ( b ) Ląstelių apoptozė buvo išmatuota FCM. Duomenys parodomi kaip trijų eksperimentinių pakartojimų vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su kontroline grupe; # P <0, 05 palyginti su LPS grupe.

Visas dydis

MiR-210 slopino priešuždegiminius citokinus ir NF-κB raišką OA žiurkėms

MiR-210 vaidmeniui in vivo ištirti, žiurkės OA modelis buvo sudarytas priekinio kryžminio raiščio transekcijos (ACLT) pagalba dešiniajame kelyje. MiR-210 ekspresuojantis lentivirusas buvo suleistas į OA žiurkių sąnarinę ertmę. 20-tą dieną po operacijos žiurkės buvo paaukotos, o analizei surinkti medialinio blauzdikaulio plokščiakalnio sąnariniai kremzliai ir SF mėginiai. Kaip parodyta 5a pav., MiR-210 lygis sąnario kremzlėse sumažėjo 0, 8 karto OA žiurkėms ir padidėjo 5, 4 karto lentivirusiniais virusais užkrėstoms žiurkėms. Uždegiminių citokinų lygis SF mėginiuose buvo išmatuotas ELISA metodu. IL-1β, IL-6 ir TNF-α lygiai reikšmingai padidėjo 3, 2, 5, 1, 5, 1, 7, 1, 8 ir 1, 5 karto OA žiurkėms, palyginti su fiktyvios operacijos grupe. Tačiau miR-210 per didelis ekspresas slopino citokinų gamybą SF mėginiuose (5b – d pav.). IκBα ir p65 raiška OA žiurkėms buvo pakeista, palyginti su fiktyvios operacijos grupe ( P <0, 05), tuo tarpu poveikį galėjo slopinti miR-210 per didelis ekspresas (5e, f pav.).

Image

a ) miR-210 mRNR lygis sąnario kremzlėse buvo aptiktas naudojant RT-PGR; ( b - d ) SF pavyzdžių uždegiminiai veiksniai buvo išmatuoti ELISA metodu; e ) DR6, IκBα ir p65 raiška sąnarinėse kremzlėse buvo nustatyta atliekant Western blot analizę; f ) kiekybiniai duomenys e. Duomenys pateikiami kaip penkių žiurkių kiekvienos grupės vidurkis ± SD. NC, normali kontrolinė grupė; SS, fiktyvios operacijos grupė; OA, OA modelių grupė; OA + miR-210, OA modelis su miR-210 ekspresuojančio lentiviruso gydymu. Duomenys parodomi kaip trijų eksperimentinių pakartojimų vidurkis ± SD. * P <0, 05, palyginti su normalia kontroline grupe; # P <0, 05 prieš fiktyvią operaciją; P <0, 05 palyginti su OA modelių grupe.

Visas dydis

Diskusija

OA yra sudėtinga daugiafaktorinė viso sąnario uždegiminė liga 20 . Įrodyta, kad daugiau nei 25 miRNR yra susiję su OA, ir daugelis jų yra susiję su ligos patogeneze 11 . MiR-140, išreikštas kremzle, reguliuoja kremzlės vystymąsi ir homeostazę, o jo praradimas prisideda prie su amžiumi susijusių OA tipo pokyčių 21 . Buvo pranešta, kad pacientams, sergantiems osteoartritu, miR-21 yra griežčiau reguliuojamas, o per didelis miR-21 ekspresija susilpnina chondrogenezės procesą 22 . Ankstesni tyrimai parodė, kad miR-210 gali būti susijęs su OA 12, 23 . Šiame tyrime sėkmingai buvo sukurtas OA žiurkės modelis. Rezultatai parodė, kad miR-210 ekspresija OA žiurkių ir LPS imituotų chondrocitų sąnario kremzlėje buvo daug mažesnė nei normalių žiurkių, rodo, kad miR-210 gali atlikti svarbų vaidmenį OA.

MiRNR vaidina svarbų vaidmenį tiek prisitaikančiame, tiek įgimtajame imunitete 24 . MiR-210 perdėta ekspresija slopina TLR4 sukeltą priešuždegiminių citokinų IL-6 ir TNF-α13 sekreciją. Taip pat buvo patvirtinta, kad MiR-210 yra neigiamas LPS sukelto uždegimo reguliatorius 13 . MiR-210 visada yra ekspresuojamas navikose ir slopina ląstelių apoptozę, kad paskatintų vėžio progresą. Įrodyta, kad miR-210 taip pat yra susijęs su hipoksijos keliu ir apsaugo ląsteles nuo hipoksijos sukeltos apoptozės 25 . Per didelis miR-210 ekspresija epitelio kiaušidžių vėžyje skatina naviko augimą, slopindamas ląstelių apoptozę 26 . Šiame tyrime miR-210 mimikos transfekcija parodė priešuždegiminį ir antiapoptozinį poveikį LPS sukeltiems chondrocitams. In vivo tyrimui į OA žiurkes buvo sušvirkšta miR-210 ekspresuojantis lentivirusas, kad būtų galima ištirti miR-210 vaidmenį. Rezultatai taip pat parodė, kad miR-210 turi priešuždegiminį poveikį.

NF-κB vaidina pagrindinį vaidmenį reguliuojant imuninį atsaką. Neteisingas NF-κB reguliavimas buvo susijęs su vėžiu, uždegimu ir netinkamu imuninės sistemos vystymu. Buvo pranešta, kad buvo įrodyta, kad kelios mikroRNR neigiamai reguliuoja NF-κB aktyvaciją ir vėlesnį priešuždegiminių citokinų gamybą 13 . Tačiau tyrimas parodė, kad miR-210 ekspresiją hipoksijos metu reguliuoja NF-κB transkripcijos faktorius p50 23 . Be to, NF-κB siRNR transfekcija taip pat sumažina miR-210 raišką 27 . Rezultatai rodo, kad miR-210 veikia kaip NF-κB kelio grįžtamasis ryšys reguliatorius. IκBα yra ląstelinis baltymas, kuris slopina NF-κB aktyvaciją, užmaskuodamas NF-KB baltymų branduolio lokalizacijos signalus ir laikydamas juos sekvestruotus citoplazmoje neaktyvia būsena. Tai yra gana svarbus NF-κB aktyvacijos žymeklis. Šiame tyrime buvo įvertintas, ar anti-apoptotinis miR-210 poveikis buvo susijęs su NF-κB keliu. Kaip parodyta 4 pav., MiR-210 vaidino panašų vaidmenį su PDTC, slopindamas NF-κB aktyvaciją, mažindamas p65 ekspresiją ir padidindamas IκBα lygį LPS apdorotose ląstelėse. Norint toliau įvertinti molekulinį miR210 mechanizmą, buvo patvirtintas jo tikslinis genas. Kaip parodyta 3 pav., DR6, kuris yra svarbus baltymas, sukeliantis ląstelių apoptozę ir NF-κB aktyvaciją, buvo patvirtintas kaip miR-210 taikinys.

Apibendrinant, rezultatai rodo, kad miR-210 ekspresija buvo sumažinta tiek LPS sukeltiems chondrocitams, tiek OA žiurkėms. „MiR-210“ perdėta ekspresija turėjo antiapoptotinį ir priešuždegiminį poveikį. Tada mes nustatėme, kad miR-210 yra nukreiptas į DR6 3′-UTR, kad slopintų jo ekspresiją. „MiR-210“ mimika ir DR6 siRNR slopina NF-κB aktyvaciją ir chondrocitų ląstelių apoptozę. Rezultatai parodė, kad miR-210 palengvino OA žiurkių sąnario ertmės uždegimą nukreipdamas į DR6 ir slopindamas NF-κB signalizacijos kelią. Tai rodo, kad miR-210 gali būti medicininis taikinys OA gydymui.

Metodai

Gyvūnai

Dvidešimt šešios „Sprague-Dawley“ žiurkių patelės („Charles River Laboratories“, 8 savaites po nujunkymo, 210–250 g) buvo laikomos kontroliuojamos temperatūros kambaryje (22–24 ° C) 12–12 h šviesoje ir tamsioje vietoje. ciklas. Gyvūnams buvo suteikta laisva prieiga prie čiulptuko ir vandens. Visas šio tyrimo procedūras patvirtino Ketvirtojo karo medicinos universiteto Gyvūnų priežiūros komitetas, o visi metodai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių.

Pirminių žiurkių chondrocitų išskyrimas ir auginimas

Pirminiai chondrocitai buvo išskirti iš šešių sveikų žiurkių patelių, kaip aprašyta anksčiau 28 . Iš šlaunikaulio condyles ir blauzdikaulio plokščiakalnio buvo pašalintos kremzlės dalys. Pjūviai buvo supjaustyti mažais gabalėliais ir suardyti auginimo terpėje (DMEM, papildyta 10% FCS, 100 μg / ml streptomicino, 2 mmol / l L- gliutamino, 100 V / ml penicilino, nepakeičiamų aminorūgščių (Invitrogen) ir 2, 5 μg / ml amfotericino, turinčio 1% IA tipo kolagenazės (0, 5–3, 0 FALGPA U / mg, Sigma, Dorset, JK). Po inkubacijos 24 valandas 37 ° C temperatūroje, mėginys filtruojamas, kad būtų pašalinta nesuvirškinta kremzlė, o chondrocito ląstelės buvo suberiamos į 2000 g 5 minutes prieš sumaišymą augimo terpėje. LPS buvo naudojama esant 100 ng / ml galutinei koncentracijai. Norint įvertinti NF-κB kelio vaidmenį LPS sukelto uždegimo metu šiame tyrime, ląstelės buvo iš anksto apdorotos pirolidino ditiokarbamatu ( PDTC) (10 μmol / l, Sigma, MO, JAV), kuris yra NF-κB inhibitorius, 1 valandą. Tada ląstelės buvo stimuliuojamos LPS (100 ng / ml) 4 valandas. Supernatantiniai chondrocitų mėginiai buvo imami citokinų analizė.

Transfekcija

„MiR-210“, neigiamos mimikos, DR6 siRNR ir kontrolinės siRNR buvo gautos iš „Genepharma“ (Šanchajus, Kinija). Transfekcijai 0, 4 nmol mimika arba siRNR buvo sumaišyti su 15 μl „Geneporter 2“ transfekcijos reagentu (GTS, San Diegas) ir po to pernešti į chondrocitų ląsteles. Po 6 h supernatantas buvo pakeistas šviežia terpe ir kultivuojamas dar 48 valandas.

Realaus laiko PGR

Bendra sąnarinių kremzlių mėginių ir pirminių chondrocitų ląstelių RNR buvo ekstrahuota naudojant Trizolio reagentą (Invitrogen, CA, JAV) ir atvirkščiai perrašyta. DR6 ir β-aktino ekspresijai buvo naudojamas SYBR žaliųjų genų ekspresijos tyrimas (Qiagen, Valencia, CA). PGR pradmenys, būdingi DR6, buvo 5′-ACAGAAGGCCTCGAATCTCA-3 ′ (sensacija) ir 5′-TGCATTCTCGGTCAGTCAAG-3 ′ (antisensė); o β-aktinui buvo 5′-CAACTTGATGTATGAAGGCTTTGGT-3 ′ (į priekį) ir 5′-ACTTTTATTGGTCTCAAGTCAGTGTACAG-3 ′ (atvirkščiai). „MiR-210“ analizei buvo naudojamas „TaqMan“ mikroRNR tyrimo rinkinys („Applied Biosystems“, Foster City, CA). Kaip vidinė kontrolė buvo naudojama U6 ribosominė RNR. U6 snRNR pradmenys buvo 5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3 ′ ir 5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3 ′. „MiR-210“ atvirkštinės transkripcijos pradmuo buvo 5′-GTCGTATCCAGTGCGTGTCGTGGAGTCGGCAATTGCACTGGATACGACTCAGCC-3 ′. MiR-210 kiekybiniai RT-PGR pradmenys buvo 5′-ATGCCTGTGCGTGTGA-3 ′ ir 5′-GTGCGTGTCGTGGAGTC-3 ′.

ELISA

Manoma, kad uždegiminiai citokinai, ypač IL-1β, IL-6, TNF-α, tarpininkauja OA 20 progresui. Šių citokinų lygis SF ir supernatanto pavyzdžiuose buvo aptiktas naudojant ELISA rinkinius (R&D Systems, Minneapolis, MN, JAV) pagal gamintojo instrukcijas.

MTT tyrimas

Chondrocitų ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas MTT tyrimu (MTT rinkinys; Sigma, MO, JAV). Ląstelės buvo auginamos 96 šulinėlių plokštelėse, kurių tankis buvo 2 × 105 ląstelių kvadratiniame centimetre. Į ląsteles pridedama MTT (0, 5 mg / ml) ir inkubuojama 4 valandas 37 ° C temperatūroje. Supernatantas buvo pašalintas, ir kristalai buvo ištirpinti 100 μL DMSO. Absorbcija ties 570 nm buvo matuojama naudojant „Bio-Rad“ mikroteklių skaitytuvą (CA, JAV). Kiekvienai grupei buvo nustatyti šeši lygiagretūs šuliniai.

Srauto citometrijos tyrimas

Ląstelių apoptozė buvo patikrinta srauto citometrija, naudojant Annexin V-FITC apoptozės aptikimo rinkinį (Sigma, MO, JAV). Trumpai tariant, ląstelės buvo du kartus plaunamos PBS ir vėl suspenduotos į rišamąjį buferį. Tada ląstelės buvo inkubuojamos su aneksinu V-FITC 10 minučių kambario temperatūroje tamsoje. Galiausiai pridėta ropidžio jodido, kurio galutinė koncentracija yra 1 mg / L. Dažytos ląstelės buvo analizuojamos naudojant FACScalibur (Becton Dickinson, Mountain View, CA, JAV).

Western blot analizė

Chondrocitų ląstelės buvo lizuotos M-PER baltymų ekstrahavimo reagentu (Pierce, Rockford, IL), papildytu proteazės inhibitoriumi. Bendra ląstelinio baltymo koncentracija buvo nustatyta naudojant Bradfordo analizės rinkinį (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV), atskirtas 10% SDS-PAGE ir užplikytas ant polivinilideno difluorido (PVDF) membranos. Po 4 valandų trukmės blokavimo 5% lieso pieno membranoje per naktį 4 ° C temperatūroje buvo inkubuojami pirminių antikūnų prieš DR6, p65, IκBα, β-aktiną (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) santykiu 1: 1000. Membranos buvo praplaunamos ir inkubuojamos 1 valandą su atitinkamais peroksidaze konjuguotais antriniais antikūnais. Chemiliuminescencinis aptikimas buvo atliktas naudojant ECL rinkinį (Pierce Chemical, Rockford, IL, JAV) ir „Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System“. Pilka juostų reikšmė buvo analizuota programinė įranga „Image J2x“.

Liuciferazės aktyvumo tyrimas

DR6 3′-UTR segmentas buvo klonuotas į „pMiR-Report“ („Ambion Inc.“, Austinas, TX, JAV). Dviejų žingsnių PGR metodu į galimą miR-210 surišimo vietą buvo įvestas DR6 mutavęs 3′-UTR. Reporterių vektoriai, turintys plataus tipo arba DR6 3′-UTR mutaciją ir miR-210 mimiką, buvo kotransfekuoti į 293T ląsteles (ATCC, Manassas, VA, JAV). Po 48 valandų luciferazės aktyvumas buvo išmatuotas naudojant dvigubos luciferazės reporterio analizės sistemą (Promega, WI, JAV).

Žiurkių osteoartrito modelio sukūrimas

Dvidešimt žiurkių buvo atsitiktinai suskirstytos į keturias grupes: normalioji kontrolinė grupė (NC; n = 5), fiktyvios operacijos grupė (SS; n = 5), OA modelio grupė (OA; n = 5) ir OA modelis gydant miR -210 ekspresuojantis lentivirusas (OA + miR-210; n = 5). Žiurkės OA modelis buvo sudarytas atliekant priekinį kryžminio raiščio perrišimą (ACLT) dešiniajame kelyje, kaip aprašyta anksčiau 29 . Visos žiurkės anestezijos būdu buvo įšvirkštos į pilvaplėvės ertmę 7 mg / kg ksilazino (Rompun; Bayer, Stambulas, Turkija) ir 60 mg / kg ketamino hidrochlorido (Ketalar; Parke-Davis, Stambulas, Turkija). Dešiniai žiurkių keliai buvo sterilizuoti polivinilo jodu (Betadine, Eczacibasi, Turkija), o medialinėje sąnario pusėje padarytas parapateliarinis odos pjūvis. Norint išplėsti operacijos vaizdą, buvo padarytas įpjovimas medinės girnelės sausgyslės pusėje, o girnelė buvo išnirusi į šoną su koja. Priekinis kryžminio raištis buvo perskirstytas naudojant # 11 chirurginį mentę. Siekiant užtikrinti visišką raiščio pjūvį, buvo atliktas teigiamas priekinio stalčiaus testas. Medialinė tinklainė buvo pataisyta, o oda uždaryta atskirai. Visos operacinės procedūros buvo atliktos naudojant padidinimo kilpą. SS grupės žiurkėms buvo atlikta anestezija ir chirurginis pjūvis sąnario kapsulėje, tačiau be ACLT. MiR-210 ekspresuojantis lentivirusas (Hanheng Bio-Tech Co., Ltd., Shang hai, Kinija) buvo švirkščiamas į žiurkių, esančių OA + miR-210, sąnarinėse ertmėse. Pooperaciniam analgezijai po poodį du kartus per parą 3 dienas po operacijos buvo skiriama 0, 02 mg / kg fentanilio citrato (Fentanilis; Abbott, Čikaga, Ilinojus). Tuo pačiu metu į kontrolinę grupę buvo įšvirkštas toks pat tūris sterilaus fiziologinio tirpalo.

Mėginių rinkimas

Dvidešimtą dieną po operacijos penkios žiurkės iš kiekvienos grupės buvo paaukotos per mirtiną anestetiko perdozavimą. Medialinio blauzdikaulio plokščiakalnio sąnariniai kremzliai buvo surinkti ir laikomi –80 ° C temperatūroje tolimesnei miR-210, DR6, p65 ir IκBα ekspresijos analizei.

SF žiurkių mėginiai buvo surinkti ir perdirbti, kaip aprašyta anksčiau 30 . Surinkta SF praskiedžiama 2 ml sterilaus 0, 9% NaCl ir po to praleidžiama per 1, 2 μm filtrą. Pridedama 10% (v / v) proteazių ir fosfolipazių inhibitorių. Mišinys buvo centrifuguojamas 16 000 g 45 minutes kambario temperatūroje (RT), o supernatantas buvo surinktas ir užšaldytas –80 ° C temperatūroje citokinų analizei.

Duomenų analizė

Eksperimentai buvo atlikti tris kartus, išskyrus modelio sudarymą. Visi duomenys yra išreikšti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Statistinė analizė buvo atlikta naudojant nesuporuotą T testą (1 pav.) Ir vienpusį ANOVA (2, 3, 4, 5 pav.) Naudojant „GraphPad Prism 6“ programinę įrangą („GraphPad Prism Software, Inc.“). P <0, 05 buvo laikomas reikšmingu skirtumu.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Zhang, D. et al . MiR-210 slopina NF-κB signalizacijos kelią nukreipdamas DR6 į osteoartritą. Mokslas. Atstovas 5, 12775; „doi“: 10.1038 / srep12775 (2015).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.