Mitochondrijomis susijęs mir-141-3p prisideda prie mitochondrijų disfunkcijos esant hfd sukeltam nutukimui, slopindamas pteną | mokslinės ataskaitos

Mitochondrijomis susijęs mir-141-3p prisideda prie mitochondrijų disfunkcijos esant hfd sukeltam nutukimui, slopindamas pteną | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Genetikos tyrimai
  • miRNR

Anotacija

Su mitochondrijomis susijusios mikroRNR (miRNR) neseniai atsirado kaip pagrindiniai ląstelių metabolizmo reguliatoriai ir gali modifikuoti mitochondrijų suliejimą ir dalijimąsi. Norėdami ištirti su mitochondrijomis susijusių miRNR vaidmenį nutukime, atlikome išsamią molekulinę analizę in vitro ir in vivo . Remdamiesi riebios dietos (HFD) sukeltomis nutukusiomis pelėmis, mes nustatėme, kad kepenų mitochondrijų funkcija pastebimai pakito. Vėliau mes įvertinome atrinktų su mitochondrijomis susijusių miRNR raiškos lygius ir nustatėme, kad miR-141-3p ryškiai reguliuojamas HFD pelėms. Norėdami toliau patikrinti miR-141-3p vaidmenį nutukime, mes atlikome funkcijos padidėjimo ir praradimo funkciją žmogaus HepG2 ląstelėse. Mes nustatėme, kad miR-141-3p gali modifikuoti ATP gamybą ir sukelti oksidacinį stresą. Atlikdami luciferazės ataskaitos geno analizę, mes nustatėme, kad fosfatazės ir tenzino homologas (PTEN) yra miR-141-3p taikinys. PTEN slopinimas taip pat gali pakeisti mitochondrijų funkciją. Mūsų tyrimas parodė, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p sukėlė mitochondrijų disfunkciją, slopindamas PTEN .

Įvadas

Nutukimas - žemo laipsnio lėtinio uždegimo 1 būklė, yra linkęs į įvairias ligas, įskaitant nealkoholinę riebiųjų kepenų ligą (NAFLD), 2 tipo diabetą, vėžį ir 2 širdies ligas. Nutukimo paplitimas dramatiškai didėja tiek išsivysčiusiose, tiek besivystančiose šalyse visame pasaulyje 3 . Prognozuojama, kad iki 2030 m. Iki 58% suaugusių pasaulio gyventojų turės antsvorį ar nutukimą 3 . Nutukimo priežastis yra energijos suvartojimo ir energijos sąnaudų disbalansas 4, kuriame yra mitochondrijų.

Mitochondrionas, unikalus tarpląstelinis organelis, turi savo žiedinį genomą, koduojantį 13 pagrindinių oksidacinio fosforilinimo baltymų (OXPHOS) 5 . Mitochondrionas dalyvauja daugelyje fiziologinių procesų, įskaitant ATP gamybą, kalcio homeostazę, laisvųjų radikalų rūšis ir laisvųjų riebalų rūgščių (FFA) β-oksidaciją 6 . Per OXPHOS 5 mitochondrionai sukuria ne tik ATP ląstelių energetiniam metabolizmui, bet ir reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS), toksiškus šalutinius kvėpavimo produktus. Per didelis ROS sukelia oksidacinį stresą 7, pažeisdamas ląsteles. Mitochondrijų biogenezės, dinamikos ir funkcijos pokyčiai buvo pastebėti esant daugeliui medžiagų apykaitos sutrikimų, įskaitant nutukimą, diabetą ir NAFLD 8 .

Neseniai nustatyta, kad su mitochondrijomis susijusios mikroRNR (miRNR), užkoduotos mitochondrijų genomo ar branduolinio genomo, daro įtaką mitochondrijų funkcijoms, įskaitant energijos apykaitą, mitochondrijų dinamiką, ROS ir elektronų pernešimo grandinę (ETC) 7, 9 . Kai kurios su mitochondrijomis susijusios miRNR buvo nuodugniai ištirtos progresuojant vėžiui ir invazijai 7 ; Vis dėlto neaišku, ar su mitochondrijomis susijusios miRNR dalyvauja nutukimo etiologijoje. Taigi verta ištirti su mitochondrijomis susijusių miRNR įtaką nutukimui.

Atsižvelgiant į tai, kas išdėstyta, mes iškėlėme hipotezę, kad su mitochondrijomis susijusios miRNR gali turėti įtakos mitochondrijų funkcijai, sukelti energijos apykaitos pusiausvyrą ir ilgainiui sukelti nutukimą. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes taikėme riebios dietos (HFD) sukeltas nutukusias peles, norėdami ištirti su mitochondrijomis susijusių miRNR funkcijas. Norėdami išsiaiškinti galimą su mitochondrijomis susijusių miRNR mechanizmą nutukimo srityje, įvertinome mitochondrijų funkciją žmogaus hepatokarcinomos ląstelėse (HepG2 ląstelėse), perkeltose su mitochondrijomis susijusiose miRNR. Tada buvo atlikti papildomi signalizacijos kelio eksperimentai, skirti ištirti pagrindinį mechanizmą, susijusį su stebėtu mitochondrijų funkcijos pakitimu.

Rezultatai

HFD sukeltas nutukimas ir pakitęs metabolinis sindromas

Po 5 savaičių dietos be riebalų HFD pelės priaugo žymiai daugiau svorio (pav. S1A). 16 savaičių HFD pelės pasirodė riebesnės nei standartinės riebalų dietos (SD) pelės (S1B pav.). Kasdien suvartojamas HFD pelių (S1 pav. C) buvo žymiai didesnis nei SD pelių. Be to, HFD pelių kūno svoris (pav. S1D), Lee rodiklis (pav. S1E) buvo žymiai didesni nei SD pelių. Bendrojo cholesterolio (TC), didelio tankio lipoproteinų cholesterolio (DTL-C) ir mažo tankio lipoproteinų cholesterolio (MTL-C) lygis serume HFD pelėmis buvo žymiai didesnis nei SD pelėse (S2A pav.), Tai rodo, kad HFD pelės išsivystė. glikolipidų apykaitos sutrikimas. Be to, didesnis nevalgiusio gliukozės kiekis kraujyje ir didesnis gliukozės lygis 60, 90, 120 min. HFD pelių OGTT (pav. S2B, C) reiškė, kad HFD pelėms buvo sutrikdytas gliukozės netoleravimas. Panašiai, aukštesnis insulino (S2D pav.), HOMA-IR (S2E pav.) Ir didesnis gliukozės lygis 0, 30, 60, 90, 120 min ITT (S2F pav.) HFD pelėse rodo, kad HFD pelių jautrumas insulinui sumažėjo. Visi aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad pelės buvo nutukusios dėl HFD.

Organinių HFD pelių kepenų ir WAT (baltojo riebalinio audinio) koeficientai buvo žymiai didesni nei SD pelių (1 pav. A). Be to, HFD pelėms buvo pastebėtas ryškus riebalų kaupimasis kepenyse ir padidėjęs lipocitų kiekis pilvo riebalų bloke (1 pav., C). HFD pelėms padidėjo kepenų TC, TG ir serumo alanino aminotransferazės (ALT) (1 D – F pav.) Rodikliai, rodantys, kad HFD pelėms buvo sutrikdyta metabolinė kepenų funkcija.

Image

( A ) HFD pelėms reikšmingai padidėjo organų kepenų ir WAT koeficientas. ( B, C ) Buvo parodytas kepenų ir WAT dažymas HE. Mastelio juosta, 50 μm. ( B ) Difuzinis ir ryškus riebalų kaupimasis HFD pelių kepenyse, palyginti su SD pelių. ( C ) Padidėjęs lipocitų kiekis pilvo riebalų pagalvėje iš HFD pelės, palyginti su SD. Kepenų TC ( D ), TG ( E ) ir ALT ( F ) lygis HFD pelėse buvo žymiai didesnis. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

Visas dydis

Nutukimas sutrikusi kepenų mitochondrijų funkcija

Norėdami išmatuoti kepenų oksidacinį pažeidimą ir antioksidacinį pajėgumą, mes nustatėme reaktyviąsias deguonies rūšis (ROS) ir malonaldehidus (MDA). Įdomu tai, kad mes pastebėjome, kad HFD pelėms stebėtinai padidėjo ROS ir MDA (2 pav., B) gamyba. Nors bendras antioksidantų (T-AOC) ir superoksido dismutazės (SOD) aktyvumas (2 pav. C, D) pastebimai sumažėjo. Norėdami toliau įvertinti mitochondrijų funkciją, mes įvertinome ATP gamybą ir nustatėme, kad HFD pelių kepenų ATP gamyba buvo žymiai didesnė nei SD pelių (2 pav. E). Norėdami išvengti šališkumo, kurį sukelia mitochondrijų DNR (mtDNR) kopijų skaičius, mes taip pat įvertinome mtDNR kopijų skaičių HFD pelių ir SD pelių kepenyse. Kaip ir tikėtasi, reikšmingo skirtumo tarp dviejų grupių nebuvo rasta (2F pav.).

Image

( A ) DCF vidutinis fluorescencinis intensyvumas buvo pateiktas histogramoje, HFD pelėms ROS gamyba žymiai padidėjo. ( B ) MDA gamyba žymiai padidėjo HFD pelėms. Buvo išmatuotas antioksidantų pajėgumas, įskaitant T-AOC aktyvumą ( C ) ir SOD aktyvumą ( D ). Jų abiejų reikšmingai sumažėjo HFD pelėms. ATP gamyba ( E ) reikšmingai padidėjo HFD pelėms. Mitochondrijų kiekis ( F ) buvo panašus tarp HFD ir SD pelių. Su mitochondrijomis susijusio miR-141-3p ( G ) lygis buvo staigiai padidėjęs, o miR-196a-5p, miR-210-3p ir miR-378a-3p lygis reikšmingai sumažėjo kepenyse per 16 savaičių - senų HFD pelių, palyginti su 16 savaičių SD pelėmis. Su mitochondrijomis susijusio miR-141-3p ( H ) lygis žymiai padidėjo 16 sveriančių HFD pelių, palyginti su 8 savaičių amžiaus pelėmis. Kiekvienas duomenų taškas atspindėjo trijų atskirų eksperimentų, kuriuose gydymas buvo atliekamas trimis egzemplioriais, vidurkį ± SE. * P <0, 05.

Visas dydis

MiR-141-3p, labai išreikštas HFD pelių kepenyse

Norėdami toliau įvertinti su mitochondrijomis susijusių miRNR pokyčius nutukime, ištyrėme miR-126a-3p, miR-141-3p, miR-196a-5p, miR-210-3p, miR-378a-3p, miR raiškos lygius. -484 ir miR-499a-5p pelių kepenyse. Kaip parodyta 2G pav., Su mitochondrijomis susijusios miR-141-3p raiška buvo staigiai padidinta, o HFD pelėms sumažėjo miR-196a-5p, miR-210-3p, miR-378a-3p. Tarp HFD pelių ir SD pelių reikšmingo miR-126a-3p, miR-484, miR-499a-5p skirtumo nebuvo. Be to, mes taip pat palyginome atrinktų miRNR raiškos modelį tarp 8 savaičių pelių (prieš dietą su riebiu maistu) ir 16 savaičių HFD pelių (laikantis dietos su labai riebiu pienu). Kaip parodyta 2H pav., Su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p ekspresijos lygis buvo reikšmingai padidėjęs 16 savaičių HFD pelėms nei 8 savaičių pelėms. Kitų su mitochondrijomis susijusių miRNR raiškos lygis buvo mažesnis nei 8 savaičių pelių, nors reikšmingo skirtumo nerasta.

Atsižvelgiant į ryškiausius su mitochondrijomis susijusios miR-141-3p raiškos lygio pokyčius pelėse, miR-141-3p buvo pasirinktas ištirti galimą kepenų mitochondrijų funkcijos mechanizmą.

MiR-141-3p reguliuoja mitochondrijų funkciją HepG2 ląstelėse

Norėdami patikrinti, ar nenormalus miR-141-3p ekspresas turės įtakos mitochondrijų kvėpavimo funkcijai, atlikome realaus laiko bioenergetinę kinetiką, naudodami Seahorse papildomą ląstelių analizatorių HepG2 ląstelėms, kurios buvo transfekuotos miR-141-3p mimika ir inhibitoriais. . ATP deguonies sunaudojimo procentai buvo stebėtinai padidėję ir sumažėję atitinkamai HepG2 ląstelėse, transfekuotose miR-141-3p imitacijomis ir inhibitoriais (3A, B pav.). Norėdami toliau tirti mitochondrijų funkciją, mes nustatėme mtDNR užkoduotų OXPHOS subvienetų genų ekspresiją. Kelių genų ( COX2, COX3, ND1 ), dalyvaujančių OXPHOS, raiškos lygis reikšmingai padidėjo miR-141-3p mimikos grupėje (3 pav. C). MiR-141-3p inhibitorių grupėje genų ( COX2, COX3 ) ekspresijos lygis buvo staigiai sumažėjęs (3D pav.). Šie radiniai parodė, kad miR-141-3p reguliavo mitochondrijų aktyvumą HepG2 ląstelėse.

Image

( A, B ) HepG2 ląstelių, perkeltų miR-141-3p mimika ar inhibitoriumi, deguonies sunaudojimo procentai, ATP gamyba, protonų nutekėjimas, maksimalus kvėpavimas, atsarginis kvėpavimo pajėgumas ir ne mitochondrinis kvėpavimas buvo išmatuoti ir apskaičiuoti kaip vidutiniai kiekviena fazė. ATP gamyba žymiai padidėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p mimika, tuo tarpu pastebimai sumažėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose miR-141-3p inhibitoriais. ( C, D ) Išmatuotas mtDNR užkoduotų OXPHOS kompleksų ekspresijos lygis. ( C ) mRNR ( COX2, COX3, ND1 ), dalyvaujančio OXPHOS, raiškos lygis žymiai padidėjo HepG2 ląstelėse, transfekuotose miR-141-3p mimika. ( D ) mRNR ( COX2, COX3 ) raiškos lygis reikšmingai sumažėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p inhibitoriumi. * P <0, 05.

Visas dydis

Norėdami toliau tirti HepG2 ląstelių oksidacinį stresą, nustatėme ir oksidacinį pažeidimą, ir antioksidantų gebėjimą. Nustatyta, kad ROS ir MDA gamyba žymiai padidėjo miR-141-3p mėgėjų grupėje (4A pav., C), tuo tarpu abu jie buvo pastebimai sumažėję miR-141-3p inhibitorių grupėje (4 pav. B, D). Jie parodė, kad miR-141-3p galėjo sukelti oksidacinį pažeidimą. Be to, tiek T-AOC, tiek SOD aktyvumas reikšmingai sumažėjo miR-141-3p mimikos grupėje (4 pav. E, G), tuo tarpu T-AOC buvo iš dalies padidintas ir SOD aktyvumas (4 pav. F, H) pastebimai padidėjo. miR-141-3p inhibitorių grupėje, kas rodo, kad miR-141-3p pakenkė antioksidantų gynybos sistemai. Perkėlus „miR-141-3p“ imitacijas ar inhibitorius, reikšmingų pokyčių nei mitochondrijų turinyje (S3A pav., B pav.), Nei TC (S3C pav., D) triglicerido (TG) (S3E pav., F pav.) .

Image

Tiek ROS gamyba ( A ), tiek MDA kiekis ( C ) reikšmingai padidėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p mimika, ir abi žymiai sumažėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose miR-141-3p inhibitoriais ( B, D ). Buvo išmatuotas antioksidantų pajėgumas, įskaitant T-AOC ir SOD aktyvumą. Jų abiejų reikšmingai sumažėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p mimika ( E, G ), ir padidėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose miR-141-3p inhibitoriais ( F, H ). Kiekvienas duomenų taškas atspindėjo trijų atskirų eksperimentų, kuriuose gydymas buvo atliekamas trimis egzemplioriais, vidurkį ± SE. * P <0, 05.

Visas dydis

Norėdami įvertinti HepG2 ląstelių fizinę būklę, srauto citometrija nustatėme mitochondrijų membranos potencialą ir ląstelių apoptozę bei ląstelių proliferaciją CCK8 tyrimo rinkiniu. Perkėlus miR-141-3p imitacijas ar inhibitorius, reikšmingų mitochondrijų membranos potencialo pokyčių (S4A-F pav.), Ląstelių apoptozės (S5A-F pav.) Ir ląstelių proliferacijos (S5G, H pav.) Nepakito. .

MiR-141-3p taip pat dalyvauja reguliuojant priešuždegiminius citokinus. Norėdami nustatyti, ar lipidų kiekis (FFA), gliukozė, insulinas ir priešuždegiminiai citokinai ( interleukinas 6, IL-6 ir naviko nekrozės faktorius, TNF-α ) galėjo paveikti miR-141-3p raišką, HepG2 ląstelės buvo apdorotos aptikta egzogeninė stimuliacija ir miR-141-3p ekspresijos lygis. Kaip parodyta S6A pav., Po gliukozės stimuliacijos terpėje reikšmingai padidėjo mitochondrijų susijęs miR-141-3p išraiškos lygis. Tačiau po FFA, insulino, IL-6 ar TNF-α stimuliacijos terpėje, su mitochondrijomis susijusios miR-141-3p ekspresijos lygis buvo didesnis apdorotose grupėse, nors reikšmingo skirtumo nenustatyta. Apibendrinant, HepG2 ląstelių ekspozicija aukštos gliukozės kiekiui padidino miR-141-3p ekspresijos lygį, o tai rodo, kad miR-141-3p HepG2 ląstelėse reguliavo didelis gliukozės kiekis. Mūsų duomenys rodo, kad miR-141-3p gali sukelti su nutukimu susijusį gliukozės netoleravimą kartu su tuo, kad HFD pelėms yra didesnis gliukozės kiekis plazmoje. Tačiau galimas didelio gliukozės kiekio gliukozės mechanizmas, reguliuojantis miR-141-3p ekspresiją, vis dar nežinomas.

Norėdami ištirti su mitochondrijomis susijusio miR-141-3p poveikį priešuždegiminiams citokinams, išmatuojome priešuždegiminių citokinų ( IL-6 ir TNF-α ) raišką HepG2 ląstelėse, kaip parodyta S6B pav. nustatė, kad IL-6 mRNR raiškos lygis žymiai padidėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p mimika, ir sumažėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p inhibitoriumi, tačiau reikšmingo skirtumo tarp TNF- α mRNR raiškos lygis HepG2 ląstelėse. Aukščiau pateiktos išvados rodo, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p gali skatinti priešuždegiminį citokinų (IL-6) raišką, skatinti uždegiminį atsaką ir prisidėti prie nutukimo vystymosi.

PTEN kaip „miR-141-3p“ taikinys

Norint toliau tirti miR-141-3p, reguliuojančio mitochondrijas, mechanizmą, buvo išanalizuotas santykinis signalizacijos kelias. Žinoma, kad intelektinė DNR analizė (DIANA) DIANA-miR Path v2.0 yra nukreipta į miRNR 10 tikslo kelio identifikavimą. Naudodamiesi šiuo interneto serveriu, mes nustatėme, kad p53 kelias buvo susijęs su miR-141-3p. Aptikti miR-141-3p tikslinių genų ( PTEN, ZMAT3, CCND2, CCNE2, CDK6, SIAH1 ) ekspresijos lygiai, kuriuose buvo gausu p53 kelio, ir mes nustatėme, kad miEN-141-3p PTEN reikšmingai sumažėjo. imituojančių grupę (5A pav.) ir kontroliuojamą miR-141-3p inhibitorių grupėje (5B pav.). Be to, taip pat buvo nustatyta PTEN mRNR išraiška pelėse, kaip parodyta 5C pav., PTF mRNR išraiškos lygis HFD pelėms reikšmingai sumažėjo. PTEN baltymų lygis taip pat sumažėjo miR-141-3p imitatorių grupėje (5 pav. D) ir padidėjo atitinkamai miR-141-3p inhibitorių grupėje (5 pav. E).

Image

PTEN mRNR ekspresijos lygis p53 kelyje reikšmingai sumažėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p mimika ( A ), o žymiai padidėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose miR-141-3p inhibitoriumi ( B ), ir HFD pelių kepenys ( C ). Parodytas PTEN Western blot atstovas. HepG2 ląstelėse, perkeltose su miR-141-3p mimika ( D ), sumažėjo PTEN baltymų lygis, tuo tarpu padidėjo HepG2 ląstelėse, perkeltose miR-141-3p inhibitoriais ( E ). ( F ) Su mitochondrijomis susijusio miR-141-3p sekos suderinimas su 3'UTR PTEN . Apačia: mutacijos PTEN 3′UTR. ( G ) Židinio ugniažolės luciferazės aktyvumas buvo normalizuotas vartojant Renilla. Kiekvienas duomenų taškas atspindėjo trijų atskirų eksperimentų, kuriuose gydymas buvo atliekamas trimis egzemplioriais, vidurkį ± SE. * P <0, 05, ** P <0, 01, *** P <0, 001.

Visas dydis

Tada atlikome dvigubos luciferazės reporterio testą, kad patikrintume, ar miR-141-3p reguliuoja PTEN tiesiogiai, prisijungdamas prie PTEN 3′UTR srities. Kaip parodyti rezultatai (5G pav.), Santykinis HepG2 ląstelių, transfekuotų su miR-141-3p mimika ir laukiniu pGL3-PTEN tipu, luciferazės aktyvumas buvo žymiai slopinamas, palyginti su HepG2 ląstelėmis, kurios kartu transfekuotos su neigiama kontrole ir pGL3-PTEN laukinis tipas. Jis taip pat sumažėjo, palyginti su HepG2 ląstelėmis, kartu transfekuotomis su miR-141-3p mimika ir pGL3-PTEN mutanto tipu. Tai parodė, kad miR-141-3p reguliavo PTEN , sujungdamas PTEN mRNR 3′UTR sritį.

Mes patvirtinome, kad miR-141-3p sąveikavo su PTEN , prisijungdamas prie jo 3′UTR srities ir paveikė HepG2 ląstelių mitochondrijų funkciją. Norėdami toliau patikrinti, ar miR-141-3p paveikė HepG2 ląstelių mitochondrijų funkciją tiesiogiai per PTEN , mes atlikome eksperimentus su HepG2 ląstelėmis, perkeltomis PTEN siRNR. Stebina, kad mes pastebėjome, kad ATP produkcijos OCR buvo stulbinamai padidėjęs (6A pav.). ROS produkcija buvo didesnė PTEN siRNA grupėje be reikšmingų skirtumų (6B pav.), O MDA kiekis žymiai padidėjo PTEN siRNA grupėje (6 pav.). 6C pav.). Be to, PTEN siRNR grupėje, palyginti su kontroline grupe, buvo pastebėtas reikšmingas T-AOC (6 pav. D) ir SOD aktyvumo (6 pav. E) sumažėjęs reguliavimas. Aukščiau pateiktos išvados parodė, kad PTEN dalyvavo mitochondrijų funkcijose.

Image

( A ) ATP produkcijos OCR buvo išmatuotas HepG2 ląstelėse, perkeltose PTEN siRNR, ir jis buvo žymiai padidėjęs. HepG2 ląstelėse, transfekuotose PTEN siRNR, padidėjo ROS gamyba ( B ) ir MDA kiekis ( C ). Nors T-AOC ( D ) ir SOD aktyvumas ( E ) buvo žymiai sumažėję HepG2 ląstelėse, perkeltose PTEN siRNR. Kiekvienas duomenų taškas atspindėjo trijų atskirų eksperimentų, kuriuose gydymas buvo atliekamas trimis egzemplioriais, vidurkį ± SE. * P <0, 05.

Visas dydis

Norėdami išmatuoti miR-141-3p mimikos ir inhibitorių transfektinį efektyvumą, mes nustatėme miR-141-3p ekspresijos lygį HepG2 ląstelėse prieš ir po gydymo. Kaip parodyta Fig.S6C, miR-141-3p bazinė išraiška HepG2 ląstelėse buvo palyginti maža. Be to, „miR-141-3p“ išraiškos lygis buvo žymiai padidintas „miR-141-3p“ imitacijų grupėje ir atitinkamai sumažintas „miR-141-3p“ inhibitorių grupėje (S6 pav. D). Šie radiniai rodo, kad miR-141-3p imitacija ir inhibitorius buvo sėkmingai pernešti į HepG2 ląsteles. Panašiai, PTEN mRNR išraiškos lygis buvo žymiai sumažintas (S6E pav.) HepG2 ląstelėse, perkeltose su PTEN siRNR, ir tai rodo, kad PTEN siRNR sėkmingai transfekuota ir į HepG2 ląsteles.

Diskusija

Šiame tyrime mes nustatėme, kad (i) miR-141-3p raiška padidėjo HFD sukeltų nutukusių pelių kepenyse; (ii) miR-141-3p prisidėjo prie pakitusios mitochondrijų funkcijos, įskaitant padidėjusį ATP gamybos, ROS susidarymo, MDA kiekį ir T-AOC aktyvumo, SOD aktyvumo reguliavimą; (iii) nutildžius PTEN , padidėjo ATP gamyba ir sukeliamas oksidacinis stresas. Apibendrinant, mūsų tyrimas pateikė naujų įrodymų, kad miR-141-3p prisidėjo prie mitochondrijų disfunkcijos esant HFD sukeltam nutukimui.

Nutukimas, vienas dažnas medžiagų apykaitos sutrikimas, yra per didelis energijos kaupimasis baltuosiuose adipocituose 11 . Kaupiamose ataskaitose teigiama, kad nutukimas buvo susijęs su mitochondrijų disfunkcija, įskaitant mitochondrijų dalijimosi ir sintezės sutrikimus 12, sutrikusia mitochondrijų biogeneze 4, oksidaciniu stresu ir uždegimu 13, 14 . Pastaruoju metu pranešama, kad su mitochondrijomis susijusios miRNR vaidina svarbų vaidmenį mitochondrijų metabolizme, mitochondrijų sukeltoje apoptozėje, mitochondrijų morfologijoje ir mitofagijoje 7, 9 . Buvo pranešta, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p buvo potencialus įvairių ligų, įskaitant pirminę tulžies cirozę 15, kepenų celiuliozę 16, 16, šlapimo pūslės vėžį 17 ir gaubtinės ir tiesiosios žarnos vėžį, biologinis žymeklis. Tačiau su mitochondrijomis susijusio miR-141-3p vaidmuo nutukimo darbe nežinomas. Taigi galima hipotezuoti, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p gali prisidėti prie mitochondrijų disfunkcijos vystant nutukimą.

Mūsų tyrime miR-141-3p skatino ATP gamybą nukreipdamas PTEN į HFD pelių kepenis ir hepG2 ląsteles. Tačiau Baseler ir kt. , nustatė, kad miR-141 gali sumažinti ATP sintazės aktyvumą, slopindamas savo tikslinį tirpių nešiklių šeimos 25 nario 3 baltymą ( Slc25a3 ) 19 . Tai gali sukelti skirtingi ląstelių tipai ar audiniai. Slc25a3 raiškos lygis buvo gausus 20 širdyje. Neseniai Roe ir kt. , parodė, kad praradęs PTEN , tikslą miR-141-3p, galėjo padidinti ATP lygį 21 . Yang Li ir kt. patvirtino, kad PTEN praradimas gali sukelti mitochondrijų kvėpavimą (OCR) 22 . Taigi, remiantis dviem tyrimais, mūsų rezultatai parodė, kad miR-141-3p per daug ekspresija sumažino PTEN raišką ir skatino ATP gamybą.

Mes taip pat parodėme, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p padidino COX2 ir COX3 raišką . COX1 , COX2 ir COX3 , kurie yra mitochondrijų užkoduoti citochromo c oksidazės (COX) subvienetai, sudaro 23 fermento katalizinę šerdį. Kai padidėjo OXPHOS ATP poreikis, buvo sureguliuota ir COX išraiška 23 . Bendrai atliktas tyrimas parodė, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p gali skatinti OXPHOS procesą ir padidinti ATP gamybą.

Manoma, kad mitochondrijos yra 24, 25 ROS šaltinis ir taikinys. Be to, gaminant ROS 10 buvo sugeneruotas MDA. MDA, galutinis polinesočiųjų riebalų rūgščių skilimo produktas, yra tinkamas lipidų peroksidacijos įvertinimas 26 . MDA nukreipia mitochondrijų kompleksus ir sutrikdo elektronų srautą per elektronų transportavimo grandinę. Nors apsauginius veiksmus nuo ROS atlieka keli fermentai (pvz., SOD, katalazė ir glutationo peroksidazė, kurie yra klasikiniai antioksidantai 25 ). T-AOC, vienas iš antioksidantų biomarkerių, rodo bendrą antioksidantų talpą 27 . Bendrai tariant, mūsų oksidacinio streso tyrimo rezultatai parodė, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p sukėlė oksidacinį pažeidimą, tuo pačiu sumažindamas antioksidantų gebėjimą. ATP ir ROS gamybos pokyčiai paprastai yra susiję su mitochondrijų membranos potencialo pokyčiais, ląstelių apoptozė ir ląstelių proliferacija 28, tačiau šie pokyčiai ne visada pasireiškia vienu metu. Šiame tyrime mes nustatėme, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p neturėjo įtakos mitochondrijų membranos potencialui, ląstelių apoptozei ar ląstelių proliferacijai. Visų pirma, su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p gali prisidėti prie mitochondrijų disfunkcijos. Mes taip pat nustatėme, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p gali skatinti priešuždegiminį citokinų ( IL-6 ) raišką, sukelti uždegiminį atsaką ir prisidėti prie nutukimo vystymosi.

PTEN yra naviką slopinantis genas ir vaidina lemiamą vaidmenį palaikant normalią ląstelių veiklą 29 . Ankstesni tyrimai patvirtino, kad dėl per daug išreikštos PTEN ekspresijos pelėse kūno svoris sumažėjo 30, 31 . Panašiai PTEN haploinfektyvumas žmonėms lėmė nutukimą 32 . Visi šie duomenys rodo, kad yra didelis ryšys tarp sumažėjusio PTEN ir nutukimo. Taip pat buvo įrodyta, kad PTEN praradimas prisidėjo prie mitochondrijų biogenezės, kvėpavimo proceso ir padidino mitochondrijų tūrį bei ROS gamybą, suaktyvindamas insulino suaktyvintą PI3K / AKT kelią, pagrindinį anabolinį kelią 29 . Mūsų tyrime, nutildžius PTEN , padidėjo ATP gamyba ir sukeliamas oksidacinis stresas.

Apibendrinant, šis tyrimas pirmiausia parodė, kad su mitochondrijomis susijęs miR-141-3p slopina PTEN raišką, sukeldamas HepG2 ląstelių mitochondrijų disfunkciją, greičiausiai padidindamas ATP gamybą, oksidacinį stresą ir sumažindamas antioksidantų gebėjimus. Visi šie pokyčiai lėmė energijos disbalansą, ir galiausiai nutukimas buvo išplėstas. Mūsų tyrimas, tikiuosi, pagerino dabartinį supratimą apie mitochondrijų susijusių miRNR įtaką nutukimui.

Medžiagos ir metodai

Gyvūnų priežiūra

Visi eksperimentai su gyvūnais ir audinių mėginiai buvo atlikti griežtai laikantis Nacionalinių sveikatos institutų (NIH) laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo, o visas procedūras gyvūnams patvirtino Nandzingo medicinos universiteto institucinis gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas (IACUC). (ID: 2011082112). Gyvūnai buvo laikomi polikarbonato narve Nanjingo medicinos universitete, drėgmės kontroliuojamoje (23 ± 1 ° C, 53 ± 2%) patalpoje ir buvo palaikomi šviesos cikle (12 val. / 12 val. Šviesoje / tamsoje) su laisvu galimybė gauti maisto ir vandens. Septynių savaičių C57BL / 6J pelių patinai buvo gauti iš „Vital River Laboratories“ (Pekinas, Kinija) ir aklimatizuoti mūsų gyvūnų kambaryje standartine čava dieta 1 savaitę.

Aštuonių savaičių amžiaus pelės buvo suskirstytos į dvi grupes (n = 10 kiekvienoje grupėje): a) kontrolinės pelės, kurioms buvo taikoma standartinė dieta (SD: 12, 1% riebalų, 23, 2% baltymų, 64, 7% angliavandenių pagal energiją; Xietong, Kinija) ) ir b) HFD pelėms 8 savaites buvo skiriama neriebi dieta (HFD: 38, 4% riebalų, 11, 4% baltymų, 50, 2% angliavandenių pagal energiją; Xietong, Kinija). Pagrindinė HFD ir SD energijos sudėtis parodyta S1 lentelėje. Be to, išsami HFD sudėtis buvo parodyta S2 lentelėje. Kūno svoris ir maistas buvo matuojami atitinkamai kas savaitę ir kas tris dienas. Maistui matuoti iš anksto pasvertas maistas buvo dedamas į konteinerį švariame narve, o po trijų dienų likutis surinktas ir pasvertas. Be to, Lee indeksas apskaičiuojamas pagal šią formulę: Lee indeksas = {[kūno svoris (g)] 1/3 } × 1000 / [kūno ilgis (cm)].

C57BL / 6J pelių metabolinių parametrų matavimas

Histologinių ypatumų analizė

Kepenų ir WAT mėginiai buvo fiksuoti 10% buferiniu formalinu, įterptu į parafiną, supjaustyti dalimis ir dažyti hematoksilinu ir eozinu (H&E).

Insulino koncentracijos serume analizė ir homeostazės modelio atsparumo insulinui įvertinimas (HOMA-IR)

Insulino kiekis serume buvo matuojamas atlikus Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELSA). Analizė buvo atlikta naudojant pelės insulino Elisa rinkinį (Elabscience, Kinija). Homeostazės modelio atsparumo insulinui vertinimas (HOMA-IR) buvo apskaičiuotas, kaip aprašė Hosker ir kt. 33 . HOMA-IR = [nevalgius nevalgius (μU / ml) × nevalgius gliukozės (mmol / L)] / 22, 5.

Gliukozės lygio analizė ir geriamojo gliukozės tolerancijos testas (OGTT) bei insulino toleravimo testas (ITT)

OGTT buvo atliktas šešiolikos savaičių amžiaus, po 12 valandų nevalgius C57 buvo įvesta į vidų su makštimi 25% gliukozės tirpalo (2 g / kg kūno svorio). ITT po 6 val. Nepriteklius buvo įšvirkšta insulino (0, 5 vieneto / kg kūno svorio) į pilvaplėvės ertmę (Ip). Abiejų tyrimų metu nurodytu laiku (kas 30 min. Nuo 0 min. Iki 120 min.) Iš uodegos buvo imami kraujo mėginiai ir matuojama gliukozės koncentracija kraujyje, naudojant Roche gliukometrą.

Hormono analizė

TC, TG, DTL-C, MTL-C, ALT, AST serumo hormonai buvo išmatuoti Hitachi 7100 automatiniu biocheminiu analizatoriumi. Kepenų TC ir TG lygis buvo matuojamas atitinkamai naudojant audinių bendrojo cholesterolio tyrimo rinkinį („Applygen Technologies Co. Ltd.“, Kinija) ir audinių trigliceridų tyrimo rinkinį („Applygen Technologies Co. Ltd.“, Kinija).

C57BL / 6J pelių mitochondrijų funkcijos matavimas

Kepenų oksidacinio streso analizė

Kepenų SOD, T-AOC ir MDA buvo matuojamos spektrofotometriškai, naudojant parduodamus tyrimo rinkinius (Jiancheng, Kinija), remiantis gamintojo protokolu 34 . T-AOC, vieno iš lipidų peroksidacijos produktų, lygis buvo matuojamas naudojant Fe 3+ disoksidacijos metodą 26, SOD aktyvumas buvo nustatytas pagal ksantino oksidazės 35 metodą, o MDA buvo nustatytas pagal tibabiturio rūgšties reaktyviosios medžiagos testą (TBARS). ). Vertės buvo normalizuotos iki baltymų koncentracijos, naudojant bendro baltymo kiekybinio tyrimo rinkinį (Jiancheng, Kinija). ROS buvo matuojamas taip, šviežios kepenys buvo įpilamos 1, 5 ml 2% FBS-DSB (2 ml FBS, sumaišytos su 98 ml PBS) ir sumalamos. Po filtravimo ląstelių suspensija buvo centrifuguota esant 10 000 sūkių per minutę 10 minučių, o supernatantas išmestas. Vienos ląstelės suspensijai paruošti buvo pridėta 1 ml 2% FBS-DSB, tada vienos ląstelės suspensija buvo inkubuota 37 ° C temperatūroje su 1 μl 1 μg / ml oksidacijai jautriu zondu DCFH-DA (Sigma-aldrich, MO, JAV). be šviesos. Galiausiai ląstelių fluorescencijos intensyvumas buvo išmatuotas naudojant FACS kalibro srauto citometriją (BD Biosciences, NJ, JAV). Visas oksidacinio streso eksperimentas buvo atliktas, kai C57BL / 6J pelės buvo šešiolikos savaičių.

Kepenų ATP analizė

Kepenų ATP lygis buvo matuojamas, kai C57BL / 6J pelėms buvo šešiolika savaičių, naudojant žvakidės luciferazės ATP tyrimo rinkinį (Beyotime, Kinija) pagal gamintojo instrukcijas. Į 100 mg kepenų lizę buvo įpilta 1 ml lizės buferio, kiekvienas mėginys buvo surinktas ir 5 minutes centrifuguotas esant 12 000 aps / min 4 ° C temperatūroje. Supernatantas buvo perkeltas į naują mėgintuvėlį ATP tyrimui. 100 ml mėginio liuminescencija buvo ištirta 96 šulinėlių luminometru (Berthold Detection System, Pforzheim, Vokietija) kartu su 100 ml ATP aptikimo buferiu iš ATP aptikimo rinkinio.

Kepenų mitochondrijų kopijų skaičiaus analizė

Šešiolikos savaičių amžiaus buvo išmatuotas mitochondrijų kepenų skaičius. MtDNR buvo kiekybiškai įvertintas apskaičiuojant mitochondrijų koduoto geno ( 16s rRNR ) santykį su branduoliu koduotu genu ( heksokinazė 2) ir išreiškiant jį kaip mtDNR kopijos skaičių gyvūnui. Grunto sekos parodytos S3 lentelėje.

Su mitochondrijomis susijusių miRNR parinkimas

Iki šiol buvo pranešta, kad daugelis su mitochondrijomis susijusių miRNR daro įtaką mitochondrijų energijos apykaitai 6, 9 . Norėdami nustatyti su mitochondrijomis susijusias miRNR, mes apžvelgėme susijusius tyrimus, kurie pranešė, kad kai kurios miRNR gali vaidinti svarbų vaidmenį palaikant mitochondrijų funkciją. Šios su mitochondrijomis susijusios miRNR dalyvavo atitinkamai ATP gamyboje, mitochondrijų metabolizme, mitochondrijų ROS, mitochondrijų dinamikoje, mitofagijoje, apoptozėje ar mitochondrijų Ca 2+ homeostazėje. Išsamus šių su mitochondrijomis susijusių miRNR sąrašas pateiktas S4 lentelėje 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65 .

Tolesniame tyrime miRNR ir mitochondrijų funkcijai tirti panaudojome HepG2 ląsteles, kurios yra žmogaus kepenų ląstelių karcinomos ląstelės, todėl pirmiausia palyginome šių miRNR išsaugojimą tarp žmogaus ir pelių. Tada, remiantis „mirbase“ svetaine, 7 miRNR (įskaitant miR-141-3p, miR-196a-5p, miR-499a-5p, miR-126a-3p, miR-210-3p, miR-378a-3p ir miR- 484), kurie turėjo konservuotą seką tiek žmonėms, tiek pelėms, buvo pasirinkti tiriant jų vaidmenį nutukime.

Su mitochondrijomis susijusių miRNR matavimas

Kiekybinis RT-PGR buvo naudojamas matuoti su mitochondrijomis susijusių miRNR raišką 16 savaičių amžiaus pelių kepenyse. RNR buvo išskirta naudojant TRIZOL reagentą (Invitrogen, Carlsbad, CA), vadovaujantis gamintojo instrukcijomis, ir bendros RNR koncentracija buvo nustatyta išmatuojant absorbciją esant 260 nm, naudojant „NanoDrop 2000“ („Thermo Fisher Scienti“, Wilmington, DE). . Realiojo laiko PGR buvo atlikta naudojant SYBR Green PCR Master Mix (Takara, Japonija). Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. Grunto sekos parodytos S3 lentelėje.

Ląstelių kultūra, transfekcija ir gydymas

HepG2 ląstelės (ATCC, HB-8065) ​​buvo gautos iš ATCC (Manassas, VA, JAV) ir kultivuojamos visaverčio augimo terpėje DMEM (Gibco, JAV), papildytos 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) (Gibco, JAV), 100. U mL −1 penicilino (Gibco, JAV) ir 100 μgmL- 1 streptomicino (Gibco, JAV), esant 37 ° C, 5% CO 2 . Ląstelės buvo šeriamos kas 2–3 dienas.

MiR-141-3p imituoja, imituoja neigiamą kontrolę, miR-141-3p inhibitorių, inhibitorių neigiamą kontrolę ir PTEN oligonukleotido (Genepharm, Kinija) siRNR buvo laikinai perkeltos į HepG2 ląsteles naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, JAV). pagal gamintojo instrukcijas. Ląstelės buvo plaunamos PBS ir surinktos su tripsinu / EDTA eksperimentams po 24 valandų transfekcijos.

Prieš gydymą HepG2 ląstelės buvo pasėtos į 24 šulinėlių plokštelę. Kai buvo pasiekta ~ 80% santaka, ląstelės buvo inkubuojamos FBS neturinčioje terpėje 24 valandas, tada ląstelės buvo apdorotos FFA (100 mM) 66, TNF-α (10 ng / ml) (Sigma) 67, IL-6. (30 ng / ml) (Sigma) 68, atitinkamai insulinas (50 μU / ml) 69, gliukozė (5 mg / ml) 69 .

Dviejų liuciferazių reporterio tyrimas

Norint patvirtinti, ar miR-141-3p reguliuoja PTEN , prisijungdamas prie PTEN mRNR 3'UTR srities, buvo atliktas dvigubos luciferazės reporterio tyrimas. Prognozuojama, kad PTEN 3'UTR srities seka, sąveikaujanti su miR-141-3p, buvo įterpta į pGL3 promotoriaus vektoriaus XbaI vietą (Generay, Kinija). Šios konstrukcijos buvo atitinkamai pavadintos pGL3- PTEN laukiniais ir pGL3- PTEN- mututais.

Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo surinktos, kad būtų galima išmatuoti luciferazės aktyvumą naudojant „Dual-Luciferase Reporter Assay System“ (Promega, WI), ir pRL-SV40 plazmidės buvo naudojamos kaip normalizuojanti kontrolė. Visi eksperimentai buvo atlikti atskirai trimis egzemplioriais.

HepG2 ląstelių mitochondrijų funkcijos matavimas

HepG2 ląstelių mitochondrijų deguonies suvartojimo ir papildomo srauto analizė

Ląstelės buvo pasėtos iki 4000 ląstelių / duobutėje XF96 duobučių ląstelių kultūros mikrotinklelyje (Seahorse Bioscience) su 80 µl augimo terpės DMEM. Stebėti OCR nepažeistose HepG2 ląstelėse buvo naudojamas „Seahorse Bioscience XF96 Extra“ ląstelinio srauto analizatorius (Seahorse Bioscience, Šiaurės Billerica, MA, JAV). OCR buvo matuojamas naudojant 3/2/4 min. Sumaišymo / laukimo / matavimo laiką. Atlikus pradinius OCR matavimus, OCR buvo matuojamas po kiekvieno šulinio pridedant oligomicino (1, 5 μM), karbonilo cianido-ptrifluormetoksifenilhidrazono (FCCP) (0, 5 μM) ir Rotenono / antimicino A (0, 5 μM) iki nurodytos galutinės koncentracijos, naudojant prievadus XF96 kasetėse. Tolesnė šių eksperimentų analizė buvo atlikta, kaip aprašyta 25 .

HepG2 ląstelių oksidacinio streso analizė

HepG2 ląstelių metodai buvo tokie patys kaip ir gyvūnų.

HepG2 ląstelių mitochondrijų kopijų skaičiaus analizė

Kiekybinis mtDNR įvertinimas buvo atliktas apskaičiuojant mitochondrijų užkoduoto geno (COX1 ) ir branduolio koduoto geno ( 28sRNR ) santykį ir išreiškiant jį kaip mtDNR kopijų skaičių vienoje ląstelėje. Grunto sekos parodytos S3 lentelėje.

OXPHOS kompleksų, p53 kelio genų ir HepG2 ląstelių priešuždegiminių citokinų mRNR lygio analizė mtDNR koduojamuose subvienetuose

MtNR koduotų OXPHOS subvienetų, p53 kelio mRNR lygiai buvo analizuojami naudojant SYBR PCR Master Mix reagentų rinkinius (Takara, Tokijas, Japonija) pagal gamintojo instrukcijas. Visi oligo nukleotidų pradmenys buvo sintezuoti Invitrogen (Šanchajus, Kinija). Visos realaus laiko PGR reakcijos buvo atliktos naudojant „ABI7900 Fast Real-Time System“ („Applied Bio“ sistemos, Foster City, CA, JAV) pagal gamintojo instrukcijas. Visi eksperimentai buvo pakartoti bent tris kartus. Grunto sekos parodytos S3 lentelėje.

HepG2 ląstelių PTEN baltymų lygio analizė

Visi ląsteliniai baltymai (60 μg) buvo ištirpinti mėginio buferyje ir po to frakcionuojami elektroforezės būdu 10% poliakrilamido-SDS gelyje esant 60 V įtampai 3 valandas. Tada baltymai buvo perkelti į polivinilidendifluorido membraną (PVDF, Bio-Rad, Hercules, CA). Membrana su perneštais baltymais buvo inkubuota buferiniame tirpale, kuriame yra specifiniai triušių polikloniniai antikūnai, skirti PTEN (Abcam, Kendall kvadratas, MA, JAV, skiedimas santykiu 1: 1000), po to inkubuojama su ožkos anti-triušiu, antriniu antikūnu, konjuguotu su arklio kultūros plokštelėmis peroksidaze. 1: 1 000. Specifiniai signalai buvo aptikti sustiprinta chemiliuminescencija (ECL Western blotting detection reagents, Amersham Life Science Limited). GAPDH (34 kDa) kiekis kiekvienoje juostoje buvo naudojamas kaip kontrolė PTEN baltymo (47 kDa) ekspresijai koreguoti.

HepG2 ląstelių mitochondrijų membranų potencialo analizė

Ląstelės buvo inkubuojamos su 2 ml terpės, turinčios JC-1 dažymo zondą, 20 minučių 37 ° C temperatūroje ir vieną kartą plaunamos dažymo buferiu. Some cells were suspended in 1 mL of PBS and analyzed by flow cytometry to detect green and red fluorescence. The wavelengths of excitation and emission were 488 nm and 530 nm, respectively.

Analysis of cell proliferation and cell apoptosis of HepG2 cells

The cell proliferation was measured by using the CCK-8 cell counting kit (Vazyme, China). The absorbance was detected at 450 nm.

Cells were washed with cold PBS, stained with propidium iodide (PI) and annexin V for 30 min protected from light. The fixed/stained cells were analyzed by FACS Calibur Flow Cytometry (BD Biosciences, NJ, USA) to quantify the cell apoptosis.

Statistinė analizė

Results are expressed as means ± standard error (SE). Statistical analyses were performed using STATA11 and presented with GraphPAD prism software (San Diego, CA). One-way analysis of variance (ANOVA), rank sum test and student's t test were used to compare quantitative data among groups.

Papildoma informacija

How to cite this article : Ji, J. et al. Mitochondria-related miR-141-3p contributes to mitochondrial dysfunction in HFD-induced obesity by inhibiting PTEN . Mokslas. Rep. 5, 16262; doi: 10.1038/srep16262 (2015).

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.