Modifikuotas žiurkių nugaros smegenų pažeidimo suspaudimo modelis: funkcinis įvertinimas ir azoto oksido sintazių išraiška | nugaros smegenys

Modifikuotas žiurkių nugaros smegenų pažeidimo suspaudimo modelis: funkcinis įvertinimas ir azoto oksido sintazių išraiška | nugaros smegenys

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių neuromokslas

Anotacija

Studiju dizainas:

Eksperimentinis tyrimas.

Tikslai:

Ištirti suaugusių žiurkių modifikuotą nugaros smegenų pažeidimo (SCI) kompresinį modelį, naudojant kambario oro pripūstą Fogarty balioninį kateterį.

Nustatymas:

Kaosiungas, Taivanas.

Metodai:

Žiurkės buvo suskirstytos į traumas, operacijas atliekančias ir kontrolines grupes. 2 prancūzų Fogarty kateteris buvo perduotas iš juosmens stuburo dalies (L3 – L4) epiduriniu būdu, atliekant mikroskopu mini laminektomiją, iki krūtinės ląstos stuburo lygio (T6 – T7). Faktinė kateterio galiuko vieta buvo patvirtinta rentgeno spinduliais. Tada Fogarty kateterio balionas 10 min. Buvo pripūstas kambario 0, 2 ml oro. Mini laminektomija buvo atlikta neįdedant kateterio į fiktyviai operuojamą grupę. Kiekybiniai neurologiniai rezultatai buvo vertinami naudojant Basso, Beattie ir Bresnahan (BBB) ​​lokomotorių įvertinimo skalę kasdien. Funkcinio įvertinimo pabaigoje buvo tiriama nugaros smegenų azoto oksido sintazių (NOS) genų ekspresija.

Rezultatai:

Vidutiniai BBB lokomotorių balai 1 ir 3 dienomis traumų grupėje buvo atitinkamai 10 ± 1, 85 ir 10 ± 1, 85, o dirbtinai operuotų asmenų grupėje - atitinkamai 21 ir 20, 29 ± 0, 69. SCI grupėje žymiai padidėjo indukuojamų NOS genų ekspresija, palyginti su fiktyviomis operacijomis ir kontroline grupe. Endotelio NOS geno raiška reikšmingai nesiskyrė tarp grupių.

Išvada:

Funkciniai ir molekuliniai įvertinimai rodo, kad ši modifikuota balionų suspaudimo technika yra atkuriamas, paprastas ir nebrangus žiurkių SCI modelis.

Įvadas

Nugaros smegenų pažeidimo (SCI) eksperimentiniai modeliai padidino mūsų supratimą apie patofiziologiją ir suteikia galimybę ieškoti terapinių strategijų in vivo . Minėti ir sukurti modeliai, kuriuose yra svorio kritimas, mechaninis poslinkis su elektromagnetiniu įtaisu, suspaudimas su aneurizmos spaustuku, pjovimo trauma su visiška / dalinė transekcija ir suspaudimo modelis su oro balionų pripūtimu 1, 2, 3 . Daugelį modelių reikia tiksliai nustatyti, o tokie tyrimai reikalauja daug darbo ir reikalauja brangios įrangos. 2 Epidurinis suspaudimas naudojant „Fogarty“ kateterio balioną yra lengvesnis, pigesnis ir atkartojamas modelis. 1, 4 Tačiau reikia mikrofluidinio siurblio. Šio tyrimo tikslas buvo modifikuoti kateterio baliono suspaudimo modelį nenaudojant mikropumpo. Buvo įvertinti kiekybiniai funkciniai rezultatai. Be to, buvo ištirta nugaros smegenų NOS genų ekspresija kaip molekulinis modifikuoto modelio įvertinimas.

medžiagos ir metodai

Šį eksperimentinį gyvūnų tyrimą patvirtino Kaohsiungo medicinos universiteto laboratorinis gyvūnų centras, Kaohsiungas, Taivanas. Dvidešimt viena „Sprague – Dawley“ žiurkių patelė (Taivanio nacionalinis laboratorinių gyvūnų centras, Taipėjus, Taivanas), kurių svoris 300–350 g, buvo suskirstyta į tris grupes: SCI, fiktyvios ir sveikos kontrolinės grupės.

SCI ir fiktyvi operacija

Gyvūnai buvo anestezuojami suleidus į pilvaplėvės ertmę 3% natrio pentobarbitalio (20 mg kg – 1 ). Žiurkės buvo dedamos ir pritvirtintos linkusioje padėtyje. Juosmens stuburo L3 – L4 lygiu buvo padarytas tiesinis pjūvis. Mini-laminektomija buvo atlikta mikroskopu. 2 prancūzų Fogarty kateteris (Baxter, Irvine, CA, JAV) buvo epiduriniu būdu perduotas iki krūtinės ląstos stuburo lygio T6 – T7. Faktinė kateterio galiuko padėtis buvo nedelsiant patvirtinta rentgeno spinduliais (1 pav.). Eksperimentas tęsėsi tik tada, kai kateterio galas buvo norimo lygio. Tada Fogarty kateterio balionas buvo pripūstas 0, 2 ml kambario oro, 10 ml naudojant 1 ml švirkštą, o ne fiziologiniu tirpalu ir mikropumpu. Buvo atlikta 1 mini-laminektomija neįdedant kateterio į fiktyviai operuojamą grupę.

Image

Įterptas rentgenograma po Fogarty kateterio. Kateterio galas yra T6 – T7 lygyje. Adata rodo kateterį, įterptą L3 – L4 lygyje.

Visas dydis

Funkcinis neurologinių trūkumų įvertinimas

Kiekybiniai neurologiniai rezultatai buvo įvertinti dieną prieš, 1 ir 3 dienas po eksperimentinės procedūros, naudojant Basso, Beattie ir Bresnahan įvertinimų skalę, kuri buvo nustatyta ir aprašyta anksčiau. 5, 6 Traumos pasekmės buvo užfiksuotos naudojant 21 taško atvirojo lauko lokalizacijos balus.

RNR išskyrimas stuburo smegenų audinyje ir azoto oksido sintazės mRNR ekspresijos nustatymas naudojant pusiau kiekybinę atvirkštinę transkripciją-PGR

Nugaros smegenų azoto oksido sintazių genų ekspresija buvo ištirta funkcinio įvertinimo pabaigoje, tai yra 3 dieną po eksperimentinės procedūros. Gyvūnai buvo užmušti per intrakardinę perfuziją druskos tirpalu. 2 paveiksle parodytas reprezentatyvus horizontalus nugaros smegenų skerspjūvis 1 cm aukštyje, epicentre ir 1 cm žemiau baliono suspaudimo sužalojimo lygio hematoksilino ir eozino dėmėmis. 1 cm ilgio stuburo smegenys, kurių centre yra T7, buvo nuimtos ir užšaldytos skystame azote ir nedelsiant užbarstytos pūsleliu skiedinyje. Visa RNR buvo išskirta naudojant SV bendrosios RNR išskyrimo sistemą (Promega, Madisonas, WI, JAV). Išskirtos RNR vientisumas buvo patvirtintas agarozės gelio elektroforeze. RNR koncentracija buvo nustatyta spektrofotometrijos būdu. Atliekant atvirkštinę transkripciją, 1 μg visos RNR mėginiai buvo atvirkščiai perrašyti į cDNR 20 μl reakcijos mišinių, kuriuose yra 200 vienetų Superscript II (Gibco BRL, Rokvilis, MD, JAV), 0, 5 μg oligo (dT) 12–18, 200 pmol. ditiotreitolio, 10 pmol dNTP ir 40 vienetų ribonukleazės inhibitoriaus (Gibco BRL, Life Technologies, Rockville, MD, JAV) buferiniame tirpale, tiekiamame kartu su fermentais. Atvirkštinės transkripcijos procedūra buvo atlikta pagal gamintojo protokolą (Superscript II; Gibco BRL, Rockville, MD, JAV). Gauta cDNR buvo užšaldyta -20 ° C temperatūroje, kad būtų galima aptikti mRNR. Tiksliniai genai buvo amplifikuoti PGR naudojant Taq DNR polimerazės rinkinį („FastStart Taq DNA Polymerase“; „Roche Diagnostics GmbH“, Manheimas, Vokietija). Iš atvirkštinės transkripcijos 1, 5 μl cDNR tūris buvo pakartotas PGR reakcijose iš viso 25 μl tūrio, kuriame yra Taq DNR polimerazės (0, 63 vienetų), buferio, tiekiamo su fermentais, MgCl2 (50 pmol), dNTP (200 μmol) ir pradmenų ( 20 pmol). Duplex PGR buvo atlikta naudojant glicerraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH), indukuojamo azoto oksido sintazės (iNOS) ir endotelio azoto oksido sintazės (eNOS) geno pradmenis. PGR sąlygos buvo 94 ° C 1 minutę, po to sekė 30 60 ° C (GAPDH ir iNOS) arba 69 ° C (eNOS) ciklų 30 s, o pratęsimas 72 ° C temperatūroje 1 min. GAPDH, iNOS ir eNOS pradmenų sekos buvo suprojektuotos naudojant komercinę kompiuterio programinę įrangą („Lightcycler Probe Design“; „Roche Diagnostics GmbH“). Visus gruntus pagamino „Gibco BRL“. Penki mikrolitrai kiekvieno transkripto reakcijos produktų buvo sumaišyti su 1 μl užpildymo dažų, o po to mišiniai elektroforezuojami 1, 5 arba 2, 0% agarozės gelyje, kuriame yra etidžio bromido (0, 1 μg ml −1 ). Po elektroforezės geliai buvo vizualizuojami ultravioletinių spindulių sukelta fluorescencija. Numatomas GAPDH, iNOS ir eNOS fragmentų dydis buvo atitinkamai 219, 317 ir 588 bazių porų. PGR produktai buvo kiekybiškai įvertinti densitometru, sujungtu su „Bioprofil Image Analysis Software“ (Vilber Lourmat, Marne-la-Vallée, Prancūzija). Rezultatai buvo išreikšti santykiu su GAPDH. 7

Image

Reprezentatyvūs horizontalūs stuburo smegenų skerspjūviai 1 cm aukštyje, epicentre ir 1 cm žemiau baliono suspaudimo traumos lygio, nurodant hematoksilino ir eozino dėmes. Virvelių pažeidimas ir audinių praradimas gali būti stebimas nugaros smegenų nugarinėje ir šoninėse pusėse (strėlės). Taip pat pastebėta kavitacija (tuščiavidurė strėlė).

Visas dydis

Statistinė analizė

Visi funkcinio įvertinimo duomenys yra išreikšti kaip vidurkis ± sem Genų išraiškos palyginimas tarp grupių atliktas neparametriniu Kruskal – Wallis bandymu. Buvo įvertinti reikšmingi skirtumai, nes tikimybės reikšmė buvo mažesnė nei 0, 05.

Etikos teiginys

Patvirtiname, kad šio tyrimo metu buvo laikomasi visų taikytinų institucinių ir vyriausybinių taisyklių, susijusių su etišku gyvūnų naudojimu.

Rezultatai

Oro pripūstos baliono suspaudimo sukeltas SCI yra stabilus ir atkuriamas

Įvairių gyvūnų grupių funkciniai įvertinimai yra apibendrinti 1 lentelėje ir 3 paveiksle. Vidutiniai Basso, Beattie ir Bresnahan lokomotorių balai SCI žiurkių grupėje buvo atitinkamai 10 ± 1, 85 ir 10 ± 1, 85 atitinkamai 1 ir 3 dienomis. Vidutiniškai fiktyviai operuotos grupės Basso, Beattie ir Bresnahan balai 1 ir 3 dienomis buvo atitinkamai 21 ir 20, 29 ± 0, 69. Nė viena šios grupės žiurkė nebuvo paraplegiška.

Pilno dydžio lentelė

Image

Basso, Beattie ir Bresnahan lokomotorių balai skirtingose ​​žiurkių grupėse 1 ir 3 dienomis po SCI.

Visas dydis

„INOS“, bet ne „eNOS“ mRNR išraiška padidėja po SCI

SCI grupėje pastebimas reikšmingas iNOS / GAPDH santykio padidėjimas, palyginti su sveikų kontrolinių ir fiktyviai operuotų grupių duomenimis (4 paveikslas). ENOS / GAPDH rezultatai reikšmingai nesiskyrė tarp sveikų kontrolinės, fiktyvios ir SCI grupių (5 paveikslas).

Image

„iNOS mRNR ekspresija“ - parodytas „iNOS“ mRNR ekspresijos santykis su GAPDH skirtingose ​​grupėse. * P <0, 05 lyginant SCI grupę su fiktyviomis ir sveikomis kontrolinėmis grupėmis.

Visas dydis

Image

eNOS mRNR išraiška - parodytas eNOS mRNR išraiškos santykis su GAPDH skirtingose ​​grupėse. Tarp sveikų kontrolinių, fiktyviai valdomų ir SCI grupių reikšmingo skirtumo nėra.

Visas dydis

Diskusija

Turėdami pastovius funkcinio ir molekulinio įvertinimo rezultatus, mes pristatėme modifikuotą SCI balionų suspaudimo metodiką žiurkėms, kuri yra paprasta, atkuriama ir nebrangi.

SCI daro didelį poveikį asmeniui tiek fiziškai, tiek psichologiškai. Nors tai nėra dažna negalios priežastis, apytiksliai skaičiuojant maždaug 40 atvejų milijonui JAV, socialinės ir ekonominės SCI išlaidos nėra proporcingos jos dažniui. 8

Eksperimentiniai SCI modeliai yra labai svarbūs kuriant terapines strategijas klinikinėms problemoms gydyti. Iš esmės sužalojimo modelis turėtų būti nuoseklus ir turėti atkuriamus rezultatus, anatominius ir elgesio, netgi fiziologinius ar molekulinius. Buvo stengiamasi integruoti ir standartizuoti gyvūnų modelius ir eksperimentinius rezultatus. 9 Tačiau naudojant įvairius modelius taip pat skatinama daugiau sužinoti apie skirtingų sistemų regeneravimo galimybes ir plastiškumą. 3

Balioninio suspaudimo technika, norint gauti SCI suaugusioms žiurkėms, yra paprasta ir atkartojama, naudojant skysčio pavidalo mikropumpą arba mikromanipuliatorių. 1, 10 Šiame tyrime balionas buvo pripūstas kambario oro, o ne fiziologiniu tirpalu ir mikropumpu. Funkcinis įvertinimas atskleidė, kad suspaudimas sukėlė nuolatinę žalą. 3 dieną fiktyvios grupės pacientams buvo pastebėti kai kurie nedideli sužalojimai / motorikos trūkumai (1 paveikslas ir 1 lentelė), nors procedūros metu buvo naudojamas mikroskopas. Norint atlikti optimalų eksperimentą, visada reikia kruopštaus chirurginio darbo ir reikia įvertinti pooperacinių komplikacijų galimybę, pavyzdžiui, uždelstą epidurinės hematomos suspaudimą ar infekciją.

Procedūros metu taip pat atsižvelgiama į oro baliono pripūtimo greitį ir tūrį. Lėtas balionų pripūtimas neleidžia vystytis neurogeninei plaučių edemai. 10 Šiame tyrime buvo naudojamas 0, 2 ml kambario oro tūris. Tolesni tyrimai, sukurti su skirtinga infliacijos apimtimi, yra reikalingi, kad būtų galima apibūdinti sužalojimo laipsnį ir nustatyti submaksimalų sužalojimą, kuris bus naudingas tiriant galimo gydymo patofiziologiją ir poveikį. 1

Azoto oksidas (NO) dalyvauja įvairiuose centrinės nervų sistemos fiziologiniuose procesuose, o jo apsauginis ir žalingas poveikis pastebimas keliose centrinės nervų sistemos ligos būsenose, įskaitant SCI. Azoto oksido sintazės sukuria NO konvertuodamos L-argininą į L-citrulliną. 11

Pastebėta, kad „iNOS“, viena iš trijų azoto oksido sintazės izoformų, vaidina pagrindinį vaidmenį sukeliant / paūmėjant uždegiminėms / degeneracinėms CNS sąlygoms, tokioms kaip SCI, išemija, išsėtinė sklerozė, Alzheimerio liga ir paveldimoms peroksizominėms bei lizosomų sutrikimai. „INOS“ ir NO aktyvacija buvo pripažinta kaip šių ligų žymeklis ir terapinis taikinys. 12 pelių be iNOS geno turėjo geresnį funkcinį rezultatą nei laukinio tipo pelės po SCI. 13 Šiame tyrime, palyginti su fiktyviai operuotomis ir sveikomis kontrolinėmis grupėmis, reikšmingai padidėjo iNOS mRNR išraiška eksperimentinės SCI grupėje. Rezultatas suderinamas su ankstesniais 14, 15, 16 tyrimais, ty parodyta, kad modifikuota balionų suspaudimo technika yra atkuriama ir patikima molekulinės analizės procedūra.

„eNOS“ atlieka neuroprotekcinį vaidmenį po smegenų išemijos ir hemoragijos. 7, 17, 18 Tačiau duomenų apie „eNOS“ raišką ir aktyvumą po SCI nėra pakankamai ir kintamų. 16, 19, 20, 21 Tyrimo su žiurkėmis metu 30 minučių po sužalojimo eNOS aktyvumas normalizavosi ir laikinai sumažėjo. Pokytis gali būti susijęs su praneštais kraujagyslių pokyčiais. 16 Nustatyta, kad jaunų žiurkių eNOS aktyvumas yra santykinai didesnis nei suaugusių žiurkių, kurioms atlikta SCI, turinti nervų apsaugos funkciją. Tyrimas su pelėmis parodė, kad dėl sunkios SCI eNOS susilpnėjo, o švelnios SCI suaktyvintos eNOS suaktyvėjo. 17 Šiame tyrime eNOS mRNR išraiška nepadidėjo 3 dieną po eksperimentinio SCI, o rezultatas buvo pastovus, palyginti su fiktyviomis ir sveikomis kontrolinėmis grupėmis. Tolesnis tyrimas, sutelkiantis dėmesį į ankstesnę „eNOS“ išraišką / veiklą, gali padėti išsiaiškinti įvairovę.

Išvada

Funkciniai ir molekuliniai įvertinimai rodo, kad ši modifikuota balionų suspaudimo technika yra atkuriamas, paprastas ir nebrangus žiurkių SCI modelis.

Duomenų archyvavimas

Nebuvo duomenų, kuriuos būtų galima įnešti