Katp srovių modifikacija žiurkės skilvelių miocituose hipoksijos ir redoksinės reakcijos dėka | acta pharmaologica sinica

Katp srovių modifikacija žiurkės skilvelių miocituose hipoksijos ir redoksinės reakcijos dėka | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Šiame tyrime buvo tiriami galimi redox agentų ir hipoksijos reguliavimo mechanizmai K ATP srovėje ( I KATP ) ūmiškai izoliuotuose žiurkių skilvelių miocituose.

Metodai:

Vieno kanalo ir visos ląstelės patch-clamp metodai buvo naudojami registruoti K ATP srovę ( I KATP ) ūmiškai izoliuotuose žiurkių skilvelių miocituose.

Rezultatai:

Oksiduotas glutationas (GSSG, 1 mmol / L) padidino I KATP, o sumažėjęs glutationas (GSH, 1 mmol / L) gali pakeisti padidėjusį I KATP normoksijos metu. Norėdami dar labiau patvirtinti redokso agento poveikį K ATP kanalui, panaudojome redokso porą DTT (1 mmol / L) / H2O2 (0, 3, 0, 6 ir 1 mmol / L) ir pakartojome ankstesnius procesus, kurie normoksijos metu pateikė panašius rezultatus kaip ir ankstesnė redokso pora GSH / GSSG. H 2 O 2 padidino I KATP priklausomai nuo koncentracijos, kurią pakeitė DTT (1 mmol / L). Be to, mūsų rezultatai parodė, kad 15 minučių hipoksija padidino I KATP, o GSH (1 mmol / L) gali pakeisti padidėjusį I KATP . Be to, norėdami ištirti I KATP signalizacijos kelius, kuriuos padidina hipoksija ir redokso agentas, mes panaudojome baltymo kinazės C (PKC) inhibitorių bisindolilmaleimidą VI (BIM), baltymo kinazės G (PKG) inhibitorių KT5823, baltymo kinazę. A (PKA) inhibitorius H-89 ir Ca (2 +) / nuo kalmodulino priklausomas baltymo kinazės II (CaMKII) inhibitoriai KN-62 ir KN-93. Rezultatai parodė, kad BIM, KT5823, KN-62 ir KN-93, bet ne H-89, slopino I KATP, padidintą hipoksijos ir GSSG; be to, šie rezultatai rodo, kad tiek GSSG, tiek hipoksijos poveikis K ATP kanalams apima PKC, PKG ir CaMK II kelių aktyvavimą, bet ne PKA kelią.

Išvada:

Šis tyrimas pateikia elektrofiziologinius įrodymus, kad hipoksija ir oksiduojanti reakcija yra glaudžiai susijusios su I KATP moduliacija.

Įvadas

ATP jautrūs kalio (K ATP ) kanalai randami dideliu tankiu širdyje 1, 2 . Manoma, kad šie kanalai vaidina svarbų vaidmenį saugant širdį nuo išemijos sukeltos žalos. K ATP kanalų aktyvinimas sumažina veikimo potencialo trukmę, taip sumažindamas susitraukiamumą ir taupydamas energiją išemijos laikotarpiais. Pirmasis K + kanalas, kuris, kaip nustatyta, moduliuoja širdies hipoksija, buvo K ATP 3 kanalas. Be to, buvo įrodyta, kad hipoksija, greičiausiai tokio lygio, kuris gali sukelti metabolinį slopinimą, suaktyvina šiuos kanalus 4 . Keletas tyrimų parodė, kad ląstelės, veikiamos hipoksinių sąlygų, padidina reaktyviųjų O 2 rūšių (ROS) kiekį, gaunamą iš mitochondrijų elektronų pernešimo grandinės (mtROS) 5, 6, 7 . MtROS susidarymas hipoksijos metu greičiausiai pakeis tarpląstelinio redokso būklę 8 . Kiti tyrėjai patvirtino, kad oksidatoriai, tokie kaip vandenilio peroksidas (H 2 O 2 ), gali sustiprinti I KATP 9 . Buvo pranešta, kad gliutationo kiekį sumažina hipoksija tam tikrose 10, 11, 12 tipo ląstelėse. Gliutationas (GSH) veikia kaip tarpląstelinis redokso buferis. Pavyzdžiui, tarpląstelinę ROS, susidariusią veikiant oksidaciniam stresui, sumažina glutationo peroksidazė kartu su GSH virsmu oksiduotu glutationu (GSSG) 13 . Šis procesas efektyviai apsaugo ląstelę nuo oksidacinių pažeidimų. Paprastai GSSG tada paverčiamas į GSH per glutationo reduktazę arba išleidžiamas iš ląstelės ir skaidomas tarpląstelinio glutamiltranspeptidazės 14, 15 būdu . Taigi glutationo oksidacijos būsena ir tarpląstelinė koncentracija yra naudingi ląstelių oksidacinio streso rodikliai. Pranešama apie įvairių kanalų ir audinių redoksinę joninių kanalų moduliaciją 16, 17 . Redokso reguliavimo ir hipoksinių kalio kanalų ryšiui išbandyti buvo pritaikyta daugybė redokso agentų 18 . Tačiau apie GSH / GSSG, pagrindinės tarpląstelinės redokso poros, poveikį K ATP kanalams retai pranešama. Be to, daugelyje ataskaitų nurodoma, kad I KATP yra moduliuojamas dėl daugelio signalizacijos kelių, tokių kaip baltymo kinazė C (PKC), baltymo kinazė A (PKA) ir baltymo kinazė G (PKG) 19, 20, 21 . Tačiau mažai dėmesio buvo skiriama ryšiui tarp redokso reakcijos ir hipoksijos I KATP apie signalizacijos kelius.

Kadangi hipoksija atrodo kaip oksiduojanti medžiaga 22, 23 ir tikėtina, kad ji pakeis tarpląstelinio redokso būklę, norėdami įsitraukti į atitinkamus reguliavimo mechanizmus, pagrindžiančius hipoksijos ir oksidatorių ryšį, GSH / hipoksiją ir GSH / GSSG panaudojome kaip skirtingus. „Redokso sistemos“ stebint jų poveikį I KATP . Šios sistemos buvo naudojamos toliau tirti galimą koreliaciją tarp redokso reakcijos ir hipoksijos poveikio I KATP apie signalizacijos kelius, naudojant kūnelių ir ląstelių įrašus iš visos ląstelės ir vieno kanalo pleistro spaustukus.

Rezultatai

K ATP srovių patvirtinimas

Po 15 minučių perfuzijos su 1 mmol / L GSSG, kad būtų gautas stabilus K ATP kanalo aktyvumas, buvo užfiksuotos vieno kanalo K + srovės, o vėliau buvo pritaikytas glibenklamidas, kad būtų patvirtinti šie rezultatai prie ląstelių pritvirtinto pleistro režime (simetriškas 140 mmol / l). LK + ) iš žiurkės skilvelių ląstelių esant įvairiems membranų potencialams (1A pav.). Šio kanalo srovės ir įtampos santykis parodytas 1B paveiksle, o vieningos vidinės srovės laidumas yra 80 ± 3, 6 pS ( n = 6); be to, pastebėtas teigiamas membranos potencialas šiek tiek rektifikuotas į vidų. Atvirojo laiko histogramos (esant –80 mV) buvo sujungtos viena eksponentine kreive, kurios laiko konstanta buvo 1, 321 ± 0, 078 ms ( n = 7, 1C pav.). Šio K + kanalo laidumas ir kinetinės savybės buvo panašios į tas, kurios anksčiau buvo praneštos K ATP kanalu širdies ląstelėms 30, 31 . GSSG poveikis šiems K ATP kanalams buvo tiriamas įvairiomis sąlygomis. Atskiri srovės pėdsakai buvo išprovokuoti 500 ms įtampos impulsu iki +80 mV, laikant –40 mV potencialą, pritvirtintą prie ląstelės. 1 mmol / l GSSG užpilama vonia stimuliavo K ATP kanalus, kurie anksčiau buvo pašalinti 5 μmol / L glibenklamido (1D – 1F paveikslas). Po perfuzijos su 1 mmol / l GSSG, I KATP pastebimai padidėjo ir pasiekė savo maksimumą maždaug per 15 minučių, tuo tarpu srovės amplitudės nepakito. Įlašinus 5 μmol / L glibenklamido (pritaikytas po 15 minučių perfuzijos su 1 mmol / L GSSG), buvo panaikintas padidėjęs GSSG I KATP . Kita vertus, 1 mmol / L GSSG padidino atskirų K ATP kanalų atvirą tikimybę nuo kontrolinės vertės 0, 006 ± 0, 0007 iki 0, 466 ± 0, 044 ( n = 6, P <0, 01 vs kontrolė), kuri buvo sumažinta iki 0, 018 ± 0, 0012, paveikus 1 mmol / L GSH ( n = 6, P <0, 01, palyginti su 1 mmol / L GSSG).

Image

K ATP kanalo srovių laidumas, kinetinės savybės ir poveikis, K ATP srovės stimuliavimas GSSG pridedamas prie ląstelių pritvirtintame pleistre. (A) K ATP kanalo srovės, užfiksuotos prie ląstelių pritvirtintame pleistre (simetriškas 140 mmol / LK + ) iš žiurkių skilvelių ląstelių esant įvairiems membranos potencialams. Po 15 minučių perfuzijos su 1 mmol / l GSSG, K ATP kanalo aktyvumas pastebimai padidėjo. (B) K ATP kanalo srovės ir įtampos santykis. Vieningos vidinės srovės laidumas šlaite buvo 80 ± 3, 6 pS ( n = 6). C) Vieningo K ATP kanalo srovių, veikiančių −80 mV, atvirojo laiko histogramos. Histograma esant –80 mV buvo suderinta su viena eksponentine kreive, kurios laiko konstanta buvo 1, 321 ± 0, 078 ms ( n = 7). (D – F) Glibenklamido poveikis K ATP kanalo veiklai, kurią sukelia GSSG. Individualus srovės pėdsakas buvo išvestas įtampos pakopoje iki +80 mV, laikant –40 mV laikymo potencialą ląstelėje pritvirtintame pleistre. (D) Kontrolė. (E) 15 minučių po perfuzijos su 1 mmol / l GSSG. (F) 1 mmol / L GSSG + 5 μmol / L glibenklamido. Duomenys buvo filtruojami 2 kHz dažniu ir imami 10 kHz dažniu. Atkreipkite dėmesį į skalę.

Visas dydis

Kanalo kinetikos moduliavimas oksiduotu reduktoriumi ir hipoksija

Atskiri srovės pėdsakai buvo išprovokuoti 500 ms įtampos impulsu iki +80 mV nuo −40 mV laikymo potencialo ląstelėje pritvirtintame pleistre. Šešiuose prie ląstelių pritvirtintuose pleistruose prieš naudojant GSSG I KATP buvo labai prastas arba net nematomas (2A pav.). Po perfuzijos su 1 mmol / l GSSG, I KATP pastebimai padidėjo ir pasiekė maksimumą maždaug per 15 min., Tačiau dabartinės amplitudės nepakito. 2B paveiksle parodytas I KATP sprogimas po 15 minučių perfuzijos su 1 mmol / l GSSG. 1 mmol / l GSH užtepimas (taikomas po 15 min. Perfuzijos su 1 mmol / l GSSG) nuslopino padidintą GSSG I KATP (2C pav.). 2 paveiksle pavaizduotos tipiškos srovės, užfiksuotos iš vieno pleistro. Taikant 1 mmol / L GSSG, padidėjo vidutinė atvirų atskirų K ATP kanalų tikimybė nuo kontrolinės vertės 0, 008 ± 0, 0007 iki 0, 463 ± 0, 038 ( n = 6, P <0, 01 vs kontrolė). Po veikimo 1 mmol / L GSH ( n = 6, P <0, 01 vs 1 mmol / L GSSG) jis buvo sumažintas iki 0, 154 ± 0, 009. 2D – 2F paveiksle pateiktas atitinkamų visų taškų histogramų iš kito, prie ląstelės pritvirtinto pleistro, pavyzdys. Norėdami dar labiau patvirtinti redokso agento poveikį K ATP kanalui, panaudojome redokso porą DTT / H 2 O 2 . Panašiai kituose šešiuose prie ląstelių pritvirtintuose pleistruose po perfuzijos su 0, 3 mmol / LH 2 O 2 pastebimai padidėjo I KATP, o dabartinis tipas pamažu pasikeitė iš pradinių foninių srovių į sprogojančias sroves (3B pav.). Po perfuzijos su 0, 6 mmol / LH2O2, K ATP kanalo aktyvumas padidėjo žymiai, tačiau dabartinės amplitudės nepakito (3C pav.). Pritaikius 1 mmol / L DTT, K ATP kanalo veikla buvo pakeista (3D paveikslas). 3 paveiksle pavaizduotos tipiškos srovės, užfiksuotos iš vieno pleistro. H 2 O 2 padidino vidutinę atvirų pavienių K ATP kanalų tikimybę nuo 0, 007 ± 0, 0006 kontrolinės vertės iki 0, 364 ± 0, 032 (0, 03 mmol / LH 2 O 2, n = 6, P <0, 01 vs kontrolė) ir iki 0, 649 ± 0, 060 (0, 06 mmol / LH2O2, n = 6, P <0, 01 palyginti su 0, 03 mmol / LH2O2). Vidutinė atviroji tikimybė buvo sumažinta iki 0, 215 ± 0, 017, veikiant 1 mmol / L DTT (0, 06 mmol / LH 2 O 2 + 1 mmol / L DTT, n = 6, P <0, 01 vs 0, 06 mmol / LH 2 O 2 ). 3E-H pavaizduotas reprezentatyvus atitinkamų visų taškų histogramų iš kito prie ląstelės pritvirtinto pleistro pavyzdys. Taigi iš rezultatų galime daryti išvadą, kad redokso porų veiksmai buvo dvikrypčiai: reduktoriai sumažino K ATP kanalo aktyvumą, o oksidatoriai padidino aktyvumą.

Image

GSH įtaka GSSG sukeltai K ATP kanalo veiklai. Individualus srovės pėdsakas buvo išvestas įtampos pakopoje iki +80 mV, laikant –40 mV laikymo potencialą ląstelėje pritvirtintame pleistre. (A – C) rodo originalius dabartinius įrašus, o (D – F) rodo visų taškų histogramas. (A, D) valdymas; (B, E) 15 minučių po perfuzijos su 1 mmol / l GSSG; (C, F) 1 mmol / L GSSG + 1 mmol / L GSH. Atkreipkite dėmesį į skalę.

Visas dydis

Image

DTT poveikis K ATP kanalo veiklai, kurią sukelia H 2 O 2 . Individualus srovės pėdsakas buvo išvestas įtampos pakopoje iki +80 mV, laikant –40 mV laikymo potencialą ląstelėje pritvirtintame pleistre. (A – D) rodo originalius dabartinius įrašus, o (E – H) rodo visų taškų histogramas. (A, E) valdymas; (B, F) 10 minučių po perfuzijos su 0, 3 mmol / LH2O2; (C, G) 20 min. Po perfuzijos su 0, 6 mmol / LH2O2; (D, H) 0, 6 mmol / LH2O2 +1 mmol / L DTT. Atkreipkite dėmesį į skalę.

Visas dydis

Norėdami ištirti galimą koreliaciją tarp redokso reakcijos ir hipoksijos I KATP, mes panaudojome hipoksiją / GSH kaip „redokso sistemą“ stebėdami jos poveikį I KATP . Panašiai šeši prie ląstelių pritvirtinti pleistrai buvo perfuzuojami modifikuotu Tyrode tirpalu, prisotintu 95% O2 + 5% CO 2 (kontrolė), ir po to 15 minučių veikiami hipoksijos tirpalu (hipoksija). I KATP prieš hipoksiją buvo labai prasta ar net nematoma (4A pav.). Po 15 minučių hipoksijos I KATP reikšmingai padidėjo ir buvo gautas stabilus K ATP kanalo aktyvumas; tačiau dabartinė amplitudė nepakito. 4B paveiksle parodytas I KATP sprogimas po hipoksijos, kuris pasiekė maksimumą maždaug per 15 min. Įlašinus 1 mmol / L GSH (po hipoksijos 15 min.), Sumažėjo padidėjusi hipoksija I KATP (4C pav.). 4 paveiksle pavaizduotos tipiškos srovės, užfiksuotos iš vieno pleistro. Hipoksija 15 minučių padidino atskirų K ATP kanalų atvirą tikimybę nuo kontrolinės vertės 0, 005 ± 0, 0007 iki 0, 320 ± 0, 027 ( n = 6, P <0, 01 vs kontrolė). Vidutinė atviroji tikimybė buvo sumažinta iki 0, 127 ± 0, 014, veikiant 1 mmol / L GSH ( n = 6, P <0, 01 vs hipoksija). Paveikslėlyje 4D – 4F pateiktas atitinkamų visų taškų histogramų iš kito prie ląstelės pritvirtinto pleistro pavyzdys.

Image

GSH poveikis K ATP kanalo aktyvumui, kurį sukelia hipoksija. Atskiri srovės pėdsakai buvo išprovokuoti įtampos pakopoje iki +80 mV nuo –40 mV laikymo potencialo ląstelėje pritvirtintame pleistre. (A – C) rodo originalius dabartinius įrašus, o (D – F) rodo visų taškų histogramas. (A, D) valdymas; (B, E) hipoksija 15 min .; (C, F) 1 mmol / L GSH užtepimas esant hipoksijai 15 min. (B) rodo hipoksijos sukeltą I KATP tipą nuo kelių iki daugiau, didėjant atvirai tikimybei; tačiau C, 1 mmol / L GSH akivaizdžiai atstatė hipoksijos sukeltą I KATP .

Visas dydis

Buvo išanalizuotas atvirojo ir uždarojo laiko pasiskirstymas, siekiant įvertinti oksiduoto reduktoriaus ir hipoksijos poveikį I KATP kinetinėms savybėms. Eksperimento protokolas iš principo buvo toks pat, kaip parodyta 2, 3 ir 4 paveiksluose. Norint ištirti oksiduoto reduktoriaus poveikį K ATP kanalų judėjimo kinetikai, atvirojo laiko histograma, kuri buvo analizuojama iš esamo įrašo filtruojamas esant 10 kHz ribiniam dažniui, kontrolinės sąlygos metu buvo nustatytas vienas eksponentinis pasiskirstymas, kurio laiko konstanta (τ o ) buvo 1, 688 ms (5A pav.). Esant 1 mmol / L GSSG (5B pav.), Atviro laiko konstanta nesiskyrė nuo kontrolinės vertės (iki 2222 ms). Po veikimo 1 mmol / L GSH (1 mmol / L GSSG + 1 mmol / L GSH) jis vis tiek nesiskyrė nuo to, kai buvo 1 mmol / L GSSG (iki 1, 851 ms). Sulaikymo laikotarpis buvo apibrėžtas kaip atviras laikotarpis, stebimas duomenyse, filtruojamuose 0, 1 kHz ribiniu dažniu. Sutrūkimo trukmės histogramą sudarė vienas eksponentinis pasiskirstymas (5D – 5F paveikslai). Jos laiko konstanta, pažymėta τ, žymiai pailgėjo GSSG (nuo 34, 01 iki 80, 35 ms). Vėlesnė 1 mmol / L GSH (1 mmol / L GSSG + 1 mmol / L GSH) ekspozicija aiškiai sumažėjo (nuo 80, 35 iki 57, 32 ms). Uždarojo laiko tarpsnio histograma geriausiai atitiko vieną eksponentinę funkciją (5G – 5I paveikslas). Ši analizė buvo atlikta po to, kai buvo uždaryta ilgesnė kaip 20 ms trukmė, ir duomenys buvo filtruojami 10 kHz ribiniu dažniu. Uždaryto laiko laiko konstanta pliūpsniuose buvo žymima τ c .f. Τ c .f vertė ryškiai nepakito 1 mmol / l GSSG (nuo 0, 865 iki 0, 711 ms) arba vėlesnio veikimo 1 mmol / L GSH (1 mmol / L GSSG + 1 mmol / L GSH, nuo 0, 711 iki 0, 829 ms). Tarp užpylimų uždarytas laikas buvo analizuojamas naudojant duomenis, filtruotus 0, 1 kHz ribiniu dažniu (5J – 5L paveikslas). Histograma buvo pritaikyta naudojant bieksponentinę funkciją, turint greitojo (τ c. F ') ir lėtojo komponento (τ c. S ) laiko konstantas. Laiko konstanta τ c .f 'buvo lygi τ c. F, filtruojama 10 kHz ribiniu dažniu, kurį iškraipė sunkusis filtravimas. Τ c .f 'vertei įtakos neturėjo nei 1 mmol / L GSSG (nuo 25, 3 iki 24, 6 ms), nei vėlesnis 1 mmol / L GSH (1 mmol / L GSSG + 1 mmol / L GSH, nuo 24, 6 iki 25, 7 ms). Kontrolinės būklės τ cs vertė buvo 266, 1 ms (5J paveikslas). Ši vertė buvo žymiai sumažinta iki 109, 2 ms pagal GSSG (5K pav.). Tačiau, paveikus 1 mmol / L GSH (1 mmol / L GSSG + 1 mmol / L GSH), jis buvo žymiai padidintas iki 221, 3 ms. Taigi atrodo, kad GSSG ir GSH neturi įtakos greitam atidarymo ir uždarymo laikui per sprogimą. Atvirkščiai, GSSG gali padidinti pliūpsnio trukmę ir sutrumpinti pertraukų intervalus, kaip parodyta 5 paveiksle, todėl padidėja kanalo aktyvumas (2 paveikslas). Kita vertus, GSH gali sumažinti sutrumpėjimo trukmę ir pailginti tarpsnių intervalus, kaip parodyta 5 paveiksle, todėl padidėja kanalo aktyvumas (2 paveikslas). Norėdami dar labiau patvirtinti redokso agento poveikį K ATP kanalui, panaudojome redokso porą, DTT / H2O2 ir GSH / hipoksiją (1 lentelė). Eksperimento protokolas iš esmės buvo toks pat, kaip parodyta 5 paveiksle. Mūsų šio tyrimo duomenys rodo, kad τb labai padidino hipoksija arba oksidantas (GSSG ir H 2 O 2 ), tuo tarpu jį sumažino reduktorius (GSH ir DTT). ). Ir atvirkščiai, τ c. S labai sumažino hipoksija arba oksidantas (GSSG ir H 2 O 2 ), o redukuotojai (GSH ir DTT) padidino. Tačiau verta paminėti, kad atviro laiko (τ o ) ir trumpo uždaro laiko (τ c. F ir τ c. F ') metu GSH / GSSG, DTT / H 2 O 2 ar hipoksija nepaveikė, nes šios vertės nebuvo statistiškai reikšmingos tokiomis sąlygomis.

Image

GSH poveikis vidutiniam K ATP kanalo atidarymo laikui ir vidutiniam uždarymo laikui, įjungtam GSSG. Individuali srovė buvo iškviesta įtampos pakopoje iki +80 mV, laikant –40 mV laikymo potencialą ląstelėje pritvirtintame pleistre. (A, D, G, J) kontrolė; (B, E, H, K) 15 minučių po perfuzijos su 1 mmol / l GSSG; (C, F, I, L) 1 mmol / L GSSG ir 1 mmol / L GSH. (A – F) rodo GSH poveikį vidutiniam K ATP kanalo atidarymo laikui, įjungtam GSSG. (A – C) atvirojo laiko histogramos, analizuojamos aukštu fc (f c = 10 kHz); Smūgių (D – F) histograma, analizuota mažu fc (f c = 0, 1 kHz). Nurodomas atidarymo laikas ir sprogimų (τ b ), gautų trimis skirtingomis sąlygomis, laikas. (G – L) parodo GSH poveikį vidutiniam K ATP kanalo uždarymo laikui, įjungtam GSSG. (G – I) parodyta uždarojo laiko, trumpesnio kaip 20 ms, analizė, kai fc yra 10 kHz; (J – L) parodo tuos, kurie neviršija 600 ms, esant 0, 1 kHz fc. Perfuzijos su 1 mmol / L GSSG ir 1 mmol / L GSH nekeičia trumpojo (G – I) arba ilgojo (J – L) uždarojo laiko pasiskirstymo greitojo komponento laiko konstantos (τ cf ). Ilgo uždarojo laiko (J – L) pasiskirstymo lėto komponento laiko konstanta (τ cs ) sutrumpėja 1 mmol / l GSSG, o pratęsiama 1 mmol / L GSH. Duomenys buvo gauti iš to paties pleistro, kaip (A – F), parodantys tik vieną kanalo aktyvumo lygį visomis trimis sąlygomis. Atvirojo ir uždarojo laiko pasiskirstymų analizė atlikta naudojant ilgus įrašus iš vieno tokių pavyzdžių.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Todėl iš rezultatų galime daryti išvadą, kad kinetiniu požiūriu kintanti tendencija, pagal kurią hipoksija ir oksidantai (GSSG ir H 2 O 2 ) moduliuoja K ATP kanalo kinetiką, yra panaši, tuo tarpu kintanti tendencija, pagal kurią oksidantas (GSSG ir H 2 O 2 ) ir reduktorius (GSH ir DTT) moduliuoja K ATP kanalo kinetiką, priešingą viena kitai. Taigi mes teigiame, kad redokso reakcija neabejotinai vaidina I KATP moduliavimą. Be to, darome prielaidą, kad hipoksija ir oksiduojanti reakcija yra glaudžiai susiję su I KATP moduliavimu.

Todėl mes dar labiau patvirtinome savo ankstesnius rezultatus kinetine perspektyva, nes kintanti hipoksijos ir oksidanto GSSG / H 2 O 2 moduliavimo K ATP kanalo kinetika tendencija yra panaši, tuo tarpu kintanti tendencija, pagal kurią oksidantas GSSG / H 2 O 2 ir reduktorius GSH / DTT moduliuoja K ATP kanalo kinetiką, priešingą viena kitai. Todėl mes pakartojame, kad redokso reakcija neabejotinai vaidina I KATP moduliavimą. Be to, darome prielaidą, kad hipoksija ir oksiduojanti reakcija turi glaudų ryšį su I KATP moduliacija.

Tiek hipoksijai, tiek GSSG nepavyko padidinti K ATP srovės eksperimento „iš vidaus“ metu

Pleistro membranos iškirpimas į tirpalą, kuriame nėra ATP, leido tvirtai atidaryti tas vieno kanalo sroves, kurios buvo jautrios glibenklamidui (5 μmol / L). Nesant vidinio ATP, kanalai bėgo palaipsniui, tai rodo, kad vieno kanalo įvykiai buvo K ATP kanalų angos. Priešingai, nei hipoksija 15 minučių (tik 5, 2% padidėjęs kontrolinis rodiklis, n = 6), nei 1 mmol / L GSSG, uždėta ant vidinės pleistro membranos pusės, nesudarė panašaus efekto (tik 4, 9% padidėjo kontrolė, n = 5). Todėl šie radiniai leidžia manyti, kad tiek hipoksija, tiek GSSG nedaro tiesioginio poveikio K ATP kanalams, o veikia juos netiesiogiai, aktyvuodami signalizacijos kelią.

GSSG arba hipoksija padidina K ATP srovę per PKC, PKG ir CaMK II kelius, nesusiję su PKA keliu.

Norėdami toliau ištirti signalizacijos kelią, kuriuo GSSG ar hipoksija padidino I KATP, mes panaudojome PKC inhibitorių BIM, PKG inhibitorių KT5823, kalcio / kalmodulino priklausomą baltymo kinazės II (CaMK II) inhibitorius KN-62 ir KN-93 bei PKA. inhibitorius H-89, norėdamas ištirti jų poveikį vidutinei atvirai K ATP kanalų tikimybei, kurią sukelia hipoksija arba GSSG (6A – 6E pav.). Atvira tikimybė (P o ) buvo apskaičiuota kaip bendro laiko ilgio dalis, kad kiekvienas kanalas per visą įrašymo trukmę būtų atviroje būsenoje. 6A – 6E pav. Parodytas išorinis inhibitorių pritaikymas žiurkės skilvelių miocituose. Po 15 minučių hipoksijos arba naudojant 1 mmol / L GSSG, kad būtų gautas stabilus K ATP kanalo aktyvumas, užfiksuotos ląstelės buvo veikiamos didėjančia inhibitorių doze (PKC inhibitorius BIM, PKG inhibitorius KT5823, CaMK II inhibitoriai KN-62). ir KN-93 ir PKA inhibitorius H-89). Dauguma inhibitorių sumažino vidutinę atvirą K ATP kanalų tikimybę. Išplovus inhibitorius, blokai buvo pakeisti. Mūsų duomenys parodė, kad PKC inhibitorius BIM, PKG inhibitorius KT5823 ir CaMKII inhibitoriai KN-62 ir KN-93 sukėlė nuo koncentracijos priklausomą slopinamąjį poveikį hipoksijos ir GSSG sukeltam K ATP kanalo aktyvumui (6A – 6D pav.). Tačiau H-89 neturėjo įtakos vidutinei atvirai tikimybei hipoksijos metu arba esant 1 mmol / l GSSG (6E pav.). Keista, bet šie radiniai rodo, kad tiek GSSG, tiek hipoksijos poveikis K ATP kanalams yra susijęs su PKC, PKG ir CaMK II signalizacijos kelių aktyvacija, bet ne dėl PKA kelio.

Image

BIM, KT-5823, KN-62, KN-93, H-89 įtaka ATP jautrių kalio (K ATP ) kanalų, suaktyvintų Hypoxia / GSSG, vidutiniam atviram sklidimui ir srovės amplitudėms. (A – E) rodo BIM, KT5823, KN-62, KN-93 ir H-89 poveikį vidutiniam atviram ATP jautraus kalio (K ATP ) kanalų, suaktyvintų Hypoxia / GSSG, skleidžiamam įtampos žingsniui iki +80 mV nuo −40 mV sulaikymo potencialo ląstelėje, pritvirtintame prie žiurkės skilvelių miocitų. Atidarymo tikimybė (P o ) buvo apskaičiuota kaip bendro laiko, kurį kiekvienas kanalas buvo atviroje būsenoje, per visą įrašymo trukmę, dalis. (F) pateikia hipoksijos ir oksiduoto glutationo (GSSG) poveikį K ATP kanalams, esant atitinkamai BIM, KT5823, KN-62, KN-93 ir H-89. K ATP srovės amplitudė buvo išmatuota pasibaigus 500 ms bandymo impulsams esant 0 mV nuo laikymo potencialo –40 mV. Kontrolė reiškia K ATP srovės padidėjimą kartotinėmis priemonėmis, po 15 min. Įlašinus 1 mmol / L GSSG, arba hipoksija 15 min., Be jokių inhibitorių pleistro pipete. (F) (kairysis skydelis) siūlo palyginti hipoksijos poveikį K ATP kanalams, esant PKC inhibitoriui BIM (1 μmol / L), PKG inhibitoriui KT5823 (3 μmol / L), CaMK II inhibitoriams KN-62 (10). μmol / L), KN-93 (5 μmol / L) ir PKA inhibitorius H-89 (10 μmol / L) pleistro pipetės viduje. (F) (dešinė skydinė dalis) siūlo palyginti glutationo (GSSG) poveikį KATP kanalams, esant PKC inhibitoriui BIM (1 μmol / L), PKG inhibitoriui KT5823 (3 μmol / L), CaMK II inhibitoriams KN-62. (10 μmol / L), KN-93 (5 μmol / L) ir PKA inhibitorius H-89 (10 μmol / L) pleistro pipetės viduje visos ląstelės konfigūracijoje. Reikšmės yra vidurkis ± SD. n = 10–21. c P <0, 01, b P <0, 05; Santrumpos: Con, kontrolė; Hipė, hipoksija; W, Washout; BIM, bisindolilmaleimidas VI; NS, nereikšmingas, P > 0, 05.

Visas dydis

K ATP srovės stimuliavimas

Rampos impulsai buvo taikomi kas 15 s nuo –100 iki +100 mV (esant 40 mV / s). Išorinę srovę greitai padidino GSSG. Vidutinis atvirkštinis potencialas (V aps. ) Buvo −78, 6 ± 0, 6 mV ( n = 6), kuris buvo artimas pusiausvyros potencialui K + (E K ) (-83 mV) [E K = -59 mV × log (140). /5.4)], teigdama, kad didžioji dalis GSSG stimuliuojamos srovės buvo K + srovė. Šis poveikis paprastai pasireiškė praėjus 1 - 5 minutėms po GSSG ekspozicijos ir pasiekė maksimalų per 1 - 2 minutes nuo atsako pradžios. Glibenklamidas (20 μmol / L), palyginti specifinis K ATP kanalų inhibitorius, pašalino GSSG stimuliuotą srovę ( n = 6), kaip parodyta 7F paveiksle. Todėl GSSG stimuliuojama srovė yra panaši į I KATP .

Image

GSH / GSSG, DTT / H 2 O 2, GSH / hipoksijos poveikis žiurkių skilvelių miocitų išorinių membranų srovių ir įtampos santykiams. Laikymo potencialas buvo laikomas –40 mV. Komandos įtampos impulsai, kurių trukmė 500 ms, įvairaus potencialo nuo –100 iki +100 mV, buvo pritaikyti ląstelėms 0, 2 Hz dažniu. (A – E) rodo įtampos protokolą ir mėginio srovės pėdsakus. (A) įtampos protokolas; (B) kontrolė; (C) 1 mmol / l GSSG; (D) 1 mmol / l GSSG ir 1 mmol / l GSH; (E) 1 mmol / L GSSG + 1 mmol / L GSH + 20 μmol / L glibenklamido. (F) rodo, kad žiurkių skilvelių ląstelėse GSSG stimuliuoja K + srovę. Išorinę srovę greitai padidino GSSG ir susikerta su abscisiu esant −78, 6 mV. Atvirkštinis potencialas (V aps. ) Buvo artimas E K (–83 mV), kas rodo, kad didžioji dalis GSSG stimuliuojamos srovės buvo K + srovė. Glibenklamidas (20 μmol / L) panaikino GSSG stimuliuojamas sroves. (G – I) apibendrina GSH / GSSG, DTT / H 2 O 2 ir GSH / hipoksijos poveikį. Kiekvienas taškas reiškia ± SD iš 6 skirtingų ląstelių.

Visas dydis

Norėdami ištirti GSH / GSSG, GSH / Hipoksijos ir DTT / H 2 O 2 įtaką išorinių srovių srovės ir įtampos santykiams, pritaikėme 500 ms komandų įtampos impulsus, kurių trukmė −40 mV su įvairiomis laikomosiomis galimybėmis. membranos potencialai (nuo –100 iki +100 mV) skilvelių ląstelėms esant 0, 2 Hz. Po 15 minučių perfuzijos su 1 mmol / l GSSG, pastebimos išorinės srovės žymiai padidėjo. Tačiau pritaikius 1 mmol / l GSH (pritaikytas po 15 minučių perfuzijos su 1 mmol / L GSSG), nuslūgo padidėjęs GSSG I KATP (7G pav.). 7H paveiksle pateiktas srovių ir įtampos santykis, atsirandantis dėl skirtingų H 2 O 2 dozių (0, 3, 0, 6 ir 1 mmol / L) ir 1 mmol / L DTT, kurios galėtų pakeisti padidintą K ATP kanalo srovę po H2O2 , tada buvo naudojamas pridėjus 1 mmol / LH2O2. Po 15 minučių hipoksijos, matomos išorinės srovės grįžo (7I pav.), Kai į hipoksijos tirpalą buvo įpilta 1 mmol / L GSH, galinčio pakeisti padidėjusį I KATP, (hipoksija + GSH).

Norėdami ištirti signalizacijos kelią, susijusį su I KATP hipoksijos ir GSSG sukeltu poveikiu, mes panaudojome PKC inhibitorių BIM ​​(1 μmol / L), PKG inhibitorių KT5823 (3 μmol / L) ir CaMK II inhibitorių KN. -62 (10 μmol / L) ir KN-93 (5 μmol / L) pipetės viduje, kad būtų galima įsikišti I KATP, kurį sukelia hipoksija 15 min., Arba naudojant 1 mmol / l GSSG. Padidėjusios vertės buvo 4, 67 ± 0, 42 (BIM, P <0, 01 vs kontrolė, n = 17), 6, 53 ± 0, 68 (KT5823, P <0, 01 vs kontrolė, n = 15), 7, 47 ± 0, 83 (KN-62, P <0, 05 vs. kontrolė, n = 16) ir 5, 79 ± 0, 63 (KN-93, P <0, 01 vs kontrolė, n = 21), atitinkamai (6F pav., kairysis skydelis). Šios vertės reikšmingai skyrėsi nuo tų, kurios nebuvo gautos be šių inhibitorių, ir tai rodo, kad I KATP padidėjimas hipoksijos būdu 15 minučių gali reikšti PKC, PKG ir CaMK II aktyvaciją. Tačiau esant selektyviajam PKA inhibitoriui H-89 (10 μmol / L), padidėjus IpoAT sukeltam I KATP laikui 15 minučių buvo 9, 73 ± 1, 24 (H-89, P > 0, 05, palyginti su kontroline, n = 15). ) (6F pav., Kairysis skydelis). Šios vertės reikšmingai nesiskyrė nuo tų, kurios buvo gautos be šių vaistų, ir tai rodo, kad hipoksijos sukeltas I KATP padidėjimas gali nesukelti PKA aktyvavimo. Be to, esant atitinkamam PKC inhibitoriaus BIM (1 μmol / L), PKG inhibitoriaus KT5823 (3 μmol / L) ir CaMK II inhibitorių KN-62 (10 μmol / L) ir KN-93 (5 μmol / L), keletą kartų padidėjęs GSSG pagamintas I KATP (1 mmol / L) buvo 4, 27 ± 0, 19 (BIM, P <0, 01 vs kontrolė, n = 18), 7, 25 ± 0, 48 (KT5823, P <0, 05, palyginti su kontroline, n = 16), 8, 53 ± 0, 59 (KN-62, P <0, 05 vs kontrolė, n = 19) ir 4, 91 ± 0, 51 (KN-93, P <0, 01 vs kontrolė, n = 16) (6F paveikslas, dešinė plokštė). Šios vertės reikšmingai skyrėsi nuo tų, kurios gautos be šių inhibitorių, ir tai rodo, kad GSSG sukeltas I KATP padidėjimas gali reikšti PKC, PKG, CaMK II aktyvaciją. Tačiau esant selektyviajam PKA inhibitoriui H-89 (10 μmol / L), padidėjęs GSSG gaminamo I KATP laikas (1 mmol / L) buvo 10, 71 ± 1, 22 (H-89, P > 0, 05, palyginti su kontroline), n = 17) (6F pav.). Šios vertės reikšmingai nesiskyrė nuo tų, kurios buvo gautos be šių vaistų, ir tai rodo, kad GSSG sukeltas I KATP padidėjimas gali nesukelti PKA aktyvavimo. Šie rezultatai iliustruoja, kad GSSG sukeltas I KATP padidinimas apima PKC, PKG ir CaMK II aktyvavimą, tačiau tai nėra tarpininkaujant PKA aktyvavimui.

Norėdami toliau ištirti signalizacijos kelią, susijusį su GSSG tarpininkaujamu I KATP poveikiu, ištyrėme PKC inhibitoriaus BIM, PKG inhibitoriaus KT5823, CaMK II inhibitorių KN-62 ir KN-93 bei PKA inhibitoriaus H-89 poveikį. ant I KATP, sukeltą GSSG. 8 paveiksle parodyta, kad BIM (8B paveikslas), KT5823 (8C paveikslas), KN-62 (8D paveikslas) ir KN-93 (8E paveikslas) slopino I KATP priklausomai nuo koncentracijos. Mūsų tyrime šių vaistų vartojimo procedūra iš esmės buvo tokia pati, kaip parodyta 6A – 6E paveiksle, o dabartinė K ATP kanalų amplitudė išliko nepakitusi, kai žiurkės skilvelių miocitams išoriškai nebuvo taikomas GSSG. visa ląstelė (duomenys nepateikti). Įdėjus 1 mmol / L GSSG, kad būtų gautas stabilus I KATP, užfiksuotos ląstelės buvo veikiamos didėjančia inhibitorių doze (PKC inhibitorius BIM, PKG inhibitorius KT5823, CaMK II inhibitoriai KN-62 ir KN-93 bei PKA inhibitorius). H-89). Daugeliui inhibitorių sumažėjo I KATP . Išplovus inhibitorius, blokai buvo pakeisti. Tačiau blokai taip pat buvo iš dalies pakeisti laikui bėgant, tikriausiai dėl didelio GSAT sukelto KATP aktyvumo. Mūsų duomenys rodo, kad GSSG sukeltas I KATP padidėjimas apima PKC, PKG ir CaMK II aktyvaciją, bet ne tarpininkaujant PKA aktyvavimui. Taigi tiek GSSG, tiek hipoksijos poveikis K ATP kanalams apima PKC, PKG ir CaMK II aktyvavimą, bet ne PKA kelio aktyvavimą. Šie rezultatai atitinka vieno kanalo patch-clamp metodus (6A – 6E pav.) Ir visos ląstelės registravimo pleistro spaustuko techniką (6F pav.).

Image

Inhibitory action of BIM, KT5823, KN-62, KN-93, and H-89 on K ATP currents induced by 1 mmol/L GSSG respectively. Currents were evoked by a voltage step to +80 mV from a holding potential of −40 mV. (A) Control. (B) Inhibitory action of BIM (0.1–1 μmol/L) on K ATP currents. BIM suppressed K ATP currents induced by 1 mmol/L GSSG in a concentration-dependent fashion. (C) Inhibitory action of KT5823 (0.1–1 μmol/L) on K ATP currents. KT5823 suppressed K ATP currents induced by 1 mmol/L GSSG in a concentration-dependent fashion. (D) Inhibitory action of KN-62 (1–10 μmol/L) on KATP currents. KN-62 also suppressed K ATP currents induced by 1 mmol/L GSSG in a concentration-dependent fashion. (E) Inhibitory action of KN-93 (1–5 μmol/L) on K ATP currents. KN-93 also suppressed K ATP currents induced by 1 mmol/L GSSG in a concentration-dependent fashion. (F) Effect of H-89 (0.1–3 μmol/L) on the K ATP channel current. H-89 failed to suppress K ATP currents induced by 1 mmol/L GSSG. The arrows in the figure mean continuous application for drugs.

Visas dydis

Diskusija

In the present study, we have demonstrated the possible regulatory mechanisms of a redox agent and hypoxia on the I KATP in rat ventricular myocytes. Oxidants and reductants have been used as various redox systems to investigate the link between the redox state and the K ATP channels. In our study, we employed the redox couple GSH/GSSG, DTT/H 2 O 2 directly. Under normal conditions, cellular defenses against hypoxia include a high intracellular content of GSH and a low content of GSSG, which remains protein thiol groups in a reduced state. During hypoxia, the content of GSH is decreased, while GSSG is increased. Glutathione, the major cytosolic redox buffer in cardiomyocytes, is mainly reduced under normal physiological conditions, and the ratio of GSH to GSSG is generally >10 32 . However, under pathological conditions, the cytosolic GSH/GSSG ratio, whose maintenance is a critical factor in antioxidant defense, can decrease significantly 33 . The changes in the redox state of proteins play an important role in many cellular functions. Typically, the SH groups of cysteine residues are potential targets for the redox modification of ion channel proteins. The alteration in the redox state of the SH groups of two neighboring cysteine residues can lead to the formation or breaking of disulfide bonds. This redox modification of disulfide bonds affects the structure and function of ion regulatory proteins. Moreover, it is well established that the activity of various ion regulatory proteins can be modulated by redox dependent mechanisms 34, 35, 36 . Since hypoxia is one of the general problems that any tissue can encounter, many investigators have studied the sensing mechanism of the hypoxic response in various tissues. However, little attention has been paid to the relationship between the effects of redox reactions and hypoxia on I KATP . To examine the possible regulatory mechanisms of redox agents and hypoxia on the K ATP current ( I KATP ) and the underlying relationship between them, we used GSH/Hypoxia, GSH/GSSG, and DTT/H 2 O 2 as the different “redox systems” to observe their effects on I KATP and to explore further the possible correlation between the impacts of the redox reaction and hypoxia on I KATP. Our results suggest that hypoxia, quite unexpectedly, acts as an 'oxidizing agent', probably indirectly via the modulation of or a conformational change in a K ATP channel regulatory protein, thereby triggering K ATP channel activity. It is perhaps surprising that lower O 2 levels translate into an oxidizing reaction. However, other experiments also support this idea. From the kinetic perspective, it can be seen that the changing tendency by which hypoxia and the oxidants GSSG and H 2 O 2 modulate the K ATP channel kinetics are similar. Currently, several studies on the increase in I KATP during hypoxia involve O 2 sensing, whose possible mechanisms implicate redox modulation and/or oxygen sensing by membrane-bound and iron-containing structures 37 . The mechanism by which the K ATP channel senses O 2 levels still remains unclear, but it is clear that the O 2 sensor is attached to the plasma membrane, and a redox reaction is involved 22 . Hypoxia may prevent electron transfer through the electron transport systems 38 . Consequently, electron donors may accumulate in the chain, which may affect the redox state of the K ATP channels. In addition to its direct effect on the cellular membrane, hypoxia can potentially influence the cellular redox state indirectly. It has become increasingly evident that ROS and reactive nitrogen species (RNS) are overproduced from metabolic processes during hypoxia 39, 40 . However, the regulation of the channel appears to be more complex than that and may involve the modulation by PKC, G proteins and changes in the redox potential of the cell 41, 42 . In order to determine whether the increase in the K ATP channel activity triggered by hypoxia or oxidants involved cytosolic second messenger(s), we exposed excised inside-out patches to hypoxia or the representative GSSG, but both of them failed to activate the K ATP channels to increase I KATP . Therefore, this suggests that neither hypoxia nor GSSG acts upon the K ATP channels directly but rather affect them indirectly by activating the signaling pathway. However, to our knowledge, it has been reported that I KATP are subjected to dual modulation by PKC and PKA 43, 44 . Further, the activities of the K ATP channels have been shown to be modulated by PKA- and PKC-mediated phosphorylation 19, 45, 46 . In addition, it has also been reported that other protein kinases, such as tyrosine protein kinase and AMP-activated kinases, are involved in the modulation of K ATP channels 47, 48, 49, 50 . However, it still remains unclear whether the signaling pathway is activated in the process when the redox agent acts upon I KATP . To investigate the signaling pathway involved in the regulatory mechanisms of the redox agent on I KATP, we employed an oxidizing agent, the representative GSSG, to mediate the action of I KATP . We employed the PKC inhibitor BIM, the PKG inhibitor KT5823, the CaMK II inhibitors KN-62 and KN-93 and the PKA inhibitor H-89 to intervene I KATP in whole-cell experiments (the drugs in the patch pipette, Figure 6F) and cell-attached experiments (external application of inhibitors to rat ventricular myocytes, Figure 6A–6E), which were induced by GSSG. The results suggest that the GSSG-induced increase in I KATP involves the activation of PKC, PKG and CaMK II but is not mediated by the activation of PKA. Therefore, several signaling mechanisms are related to the K ATP channel modulation, with fluctuations in the oxidant/antioxidant balance influencing the activation of protein kinases and phosphatases 51, 52, 53 . In our experiment, GSSG increased the open probability of the K ATP channel, which can be increased by PKC activation in cardiomyocyte membrane patches 24 . PKC, which is sensitive to redox modifications 54, 55, can be activated by oxidative stress 54, 56, 57 and inhibited by antioxidants 54 . Certainly, there is evidence that the K ATP channels have potential phosphorylation sites, including serine/threonine residues 58, 59, 60, 61 and that the channels are activated by the phosphorylation of these residues 62 . Since PKG is a serine/threonine protein kinase, it is likely that PKG leads to the phosphorylation of the K ATP channels. In this study, we examined the signal transduction pathways involved in the PKG-dependent phosphorylation. Han and coworkers 63 investigated the surface K ATP channel activity in adult rabbit ventricular myocytes using the patch-clamp technique. Their study showed that the K ATP channel activation in these cells can occur through a signal transduction pathway that involves guanylyl cyclase activation, increased production and accumulation of cGMP, and activation of PKG; moreover, they proposed that the K ATP channel phosphorylation and activation was the result. However, since PKG and PKA share some similarities in protein substrate sequence specificity, it is possible that PKG can phosphorylate PKA-selective sites. To determine which are the more potent kinase in activating the K ATP channels, we applied the PKA inhibitor H-89 to intervene in the K ATP currents, which were induced by GSSG. The results suggest that H-89 had an effect on the K ATP channels at concentrations up to 10 μmol/L (Figure 8). These findings strongly suggest that the K ATP channels are stimulated by PKG but not by PKA. As previously described, PKA is inhibited by the oxidation via either glutathionylation of Cys199 in the activation loop or the formation of an internal disulfide bond between Cys199 and Cys343 64 . CaMK II can phosphorylate and alter the function of many substrates 65, 66 . CaMK II, the predominant isoform in the heart 67, 68 and initially identified in the nervous system, is found in most tissues 67, 69 . Our study demonstrated that GSSG could activate the CaM kinase II in rat ventricular myocytes. Furthermore, previous work suggested that Ca 2+ /calmodulin kinase (CaMK) can be activated by H 2 O 2 and is sensitive to redox 70 .

Surprisingly, our findings show that the effects of hypoxia on the K ATP channels involve activation of the PKC, PKG, and CaMK II signaling pathways, but not that of the PKA pathway; similar results were also found for the oxidant GSSG. Judging from these results, we speculate that hypoxia and the redox reaction are closely related to the modulation of I KATP. In general, hypoxia-increased I KATP may result from the direct effect of hypoxia on the K ATP channel protein 71, 72 . However, in our present study, the results suggest that the impact of hypoxia on the K ATP channels involve the activation of PKC, PKG, and CaMK II, but it is not mediated by the activation of PKA (Figure 8). During hypoxia, the generation of mtROS is likely to alter the intracellular redox status, thus activating PKC, PKG, and CaMKII indirectly and finally resulting in the phosphorylation of the K ATP channels and an increase in I KATP .

K ATP channels are thought to play a key role in cardioprotection. When the concentration of ATP decreases and the Ca 2+ concentration increases by metabolic stress such as hypoxia, the K ATP channels are activated in the cardiac myocytes 73, 74 . The activation of the K ATP channels protects the myocardium from Ca 2+ overloading and mediates preconditioning 75 . In early preconditioning research, K ATP channels were proposed to play an important role in preconditioning-mediated cardioprotection 76 . Intracellular ROS formed under oxidative stress has also been presumed to be involved in preconditioning 77, 78, 79, 80 . Although it is well established that high levels of ROS are detrimental 81 moderate levels of H 2 O 2 have been shown to elicit a cardioprotective effect similar to that observed with ischemic preconditioning 77, 78 . Cellular antioxidant capacity has been observed to fall during preconditioning, as the total tissue glutathione levels drop to below 70% of the initial preischemic values 80, suggesting thiol oxidation in the course of ischemic preconditioning. Furthermore, previous studies 77, 78, 80 suggest that a pro-oxidant environment before ischemia such as ischemic preconditioning is important for cardioprotection. Thus, we believe that oxidizing agents or oxidants should be considered in the future as new therapeutic regimens or targets for clinical ischemic heart diseases. For example, diazoxide, a selective opener of the mitochondrial K ATP channel, has been shown to elicit tolerance to ischemia in cardiac myocytes and in perfused hearts.

Although we are curious about how GSH, GSSG, DTT, and H 2 O 2 permeate the cell membranes and take effect, their extracellular applications do affect the intracellular redox state. The underlying mechanisms remain to be studied further.

In our study, single K ATP channels were recorded in 320–340 of 430−470 patches under our experimental conditions. Furthermore, this channel was sensitive to glibenclamide (a relatively specific inhibitor of I KATP ). It seems that the K ATP channel was the dominant type of channel. Although there are several kinds of potassium channels in ventricular myocytes, such as transient outward potassium channels, delayed rectifier potassium channels and calcium activated potassium channels, in addition to the K ATP channel, the current due to these potassium channels can be ignored because it is comparable to the significant I KATP (Figure 7).

However, in our experiment, there were no specific potassium channel blockers in the bath solution or the pipette solution because these blockers may affect other ion channels. Further, in many previous studies that recorded I KATP, there was nothing special in the formula for the extra/intracellular solution or for the voltage protocols used in whole-cell patch clamp experiments 50, 75, 82, 83, 84, 85 .

The effects of GSSG or hypoxia on the I KATP are similar both under whole-cell and single-channel recording models due to the changing tendency between them, the channel kinetics and the signaling pathways that modulate I KATP . Furthermore, our experimental results demonstrated that the mechanisms by which hypoxia and the oxidants GSSG or H 2 O 2 modulate the K ATP channel kinetics are similar, whereas the mechanisms by which the oxidants GSSG or H 2 O 2 and the reductants GSH or DTT modulate the K ATP kinetics are opposite to each other. Therefore, we assume that the K ATP channel activities may exist during hypoxia and even during a redox reaction, depending on the different cellular redox environments. Furthermore, we also suggest that the hypoxia-induced K ATP channel activities are closely associated with the redox reactions and that the cellular redox state regulates the properties of the K ATP channels. At present, we can adequately prove that the increased I KATP induced by hypoxia is intimately related to oxidization, but we can only interpret the underlying mechanism by proposing the assumption that hypoxia and the oxidizing reaction are closely related to the modulation of I KATP based on our current findings. To discern the concrete mechanisms, we need to study the properties of the K ATP channels further.

Autoriaus indėlis

Ji-hua MA and Xi-sheng YAN designed the research; Xi-sheng YAN and Pei-hua ZHANG performed the research; Xi-sheng YAN analyzed the data; Xi-sheng YAN and Ji-hua MA wrote the paper.