Amh ir dax1 genų molekulinis klonavimas ir apibūdinimas bei jų raiška lyties inversijos metu ryžių lauko unguryje monopterus albus | mokslinės ataskaitos

Amh ir dax1 genų molekulinis klonavimas ir apibūdinimas bei jų raiška lyties inversijos metu ryžių lauko unguryje monopterus albus | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Reprodukcinė biologija
  • Transkripcija

Anotacija

Šiame tyrime buvo klonuoti ir apibūdinti pilno ilgio amh ir dax1 cDNR, esantys hermafrodite, ryžių lauko unguryje ( Monopterus albus ). Kelių sekų suderinimas parodė, kad Dax1 buvo gerai išsaugotas tarp stuburinių, tuo tarpu Amhas turėjo mažai panašumo tarp skirtingų stuburinių. Ištirti jų raiškos profiliai lytinėse liaukose lytinės inversijos metu ir audiniai. Audiniuose pasiskirstęs amhas buvo išreikštas lytinėmis liaukomis ir sunkiai aptinkamas kituose audiniuose, tuo tarpu dax1 raiška buvo plačiai paplitusi skirtinguose audiniuose, ypač kepenyse ir lytinėse liaukose. amhas beveik nebuvo aptinkamas kiaušidėse, tuo tarpu jis buvo gausiai išreikštas tiek kiaušidėse, tiek sėklidėse. Priešingai, „ dax1“ buvo labai išreikštas kiaušidėse, ypač ♀IV (kiaušidės IV stadijoje), tačiau jis žymiai sumažėjo in / ♂I (ovotestis I stadijoje). Jo raiška vėl padidėjo ♀ / ♂III (ovotestis III stadijoje), o vėliau sumažėjo iki žemo lygio sėklidėse. Šie reikšmingi skirtingi amh ir dax1 raiškos modeliai rodo, kad amh raiškos padidėjimas ir dax1 ekspresijos sumažėjimas yra svarbūs aktyvinant sėklidę, o aukštas amh ir žemas dax1 raiškos lygis yra būtinas sėklidės funkcijai palaikyti. .

Įvadas

Ryžių laukinis ungurys ( Monopterus albus ) yra Synbranchiformes eilės (Neoteleostei, Teleostei, Vertebrata) Teleost šeimos Synbranchidae rūšis. Ši gėlavandenė žuvis, svarbi žuvininkystės produkcijos rūšis, yra geras pavyzdys palyginamiesiems stuburinių gyvūnų genominiams tyrimams, ypač lytiniam vystymuisi, dėl savo ypatingų savybių, įskaitant palyginti nedidelį genomą, palyginti su kitais teleostais, ir natūralią lyties inversiją (iš moters iki patino per interseksą) per jo gyvavimo ciklą 1, 2 .

Anti-Müllerian hormonas (AMH), dar vadinamas Müllerian slopinančia medžiaga (MIS), koduojančiu transformuojančio augimo faktoriaus β (TGF-β) 3, 4 -osios šeimos glikoproteiną, yra lytinių liaukų hormonas, kuris inicijuoja Müllerian regresiją. ortakiai. Müllerian kanalai žinduoliams yra būdingos moters reprodukcinei struktūrai, kuri išsiskiria į kiaušintakius ir gimdą 5, 6 . Vyrams Amh yra vienas iš pirmųjų genų, stipriai ekspresuojamų Sertoli ląstelėse ir sukeliantis Miulerio latakų regresiją, vykstant sėklidžių diferenciacijai 7 . AMH apsaugo nuo FSH stimuliuojamos aromatazės aktyvumo Sertoli ląstelėse. Tai taip pat slopina LH stimuliuojamą testosterono gamybą nesubrendusios sėklidės 8 auginto Leydig vaisiaus ląstelėse. AMH dramatiškai sumažina testosterono konversijos į estradiolį greitį, nes sumažėja aromatazės aktyvumas, kai avių vaisiaus kiaušidės yra veikiamos AMH 9 . AMH veikia per Amh / AmhrII sistemą gonadų diferenciacijai ir vystymuisi 10, 11 . Müllerian latakai išsivysto tik kelioms žuvų rūšims, tokioms kaip eršketai ( Acipenser spp.), O patinai nėra regresuojami 12 . amh ortologų, tačiau, buvo nustatyta įvairių teleosto rūšių, įskaitant Paralichthys olivaceus ( japoninę plekšnę ) 13, Danio rerio (Zebrafish) 14, Oryzias latipes (Medaka) 15, Dicentrarchus labrax (europinis jūrų ešerys ) 16, Squalius alburnoides (Bordalo) 17., Acanthopagrus schlegeli (Juodoji porė) 18 ir Carassius auratus var. Pengze (Pengze karpis) 19 . Ji taip pat dalyvavo šių rūšių lyties diferenciacijoje ir vystymesi.

DAX1 (dozės atžvilgiu jautrus lyties pakeitimas, antinksčių hipoplazijos įgimta, kritinė sritis X-chromosomoje, 1 genas), dar vadinamas NR0B1, yra neįprasto našlaičių branduolinio receptoriaus superšeimos narys 20 . Apskritai, jame yra tipiškas ligandą surišantis domenas (LDB) C-galo srityje ir būdingas DNR surišantis domenas (DBD) N-galo srityje 21 . DAX1 sugebėtų modifikuoti kelių genų, dalyvaujančių antinksčių ir lytinių liaukų audinių vystymesi, ir steroidogeninio aktyvumo, pavyzdžiui, estrogeno receptorių α ir β 22, androgenų receptorių 23, Amh 24, Cyp19 25 ir CYP17 26, transkripciją . Didelė „Dax1“ ekspresija sąlygojo vyrų ir moterų lyties keitimą normaliomis pelių patinėlėmis . Taip pat nustatyta, kad „ Dax1“ yra būtina normaliam sėklidžių vystymuisi ir daro įtaką pelių patinų vaisingumui 28 . dax1 yra konservatyvus genas, o jo ortologai buvo klonuoti žuvyse, įskaitant Oreochromis niloticus (Nilo tilapia) 29, D. labrax 30 ir O. latipes 31 . Naujausi tyrimai parodė, kad dax1 gali dalyvauti lytinių liaukų diferenciacijoje ir vystymesi.

Hermafrodito žuvyje M. albus kada nors buvo išskirti tik keli genai, galintys dalyvauti sekso inversijoje, ir apie lyties inversijos mechanizmus žinių yra nedaug. amhas yra vienas iš genų, apie kuriuos pranešta, kad jie aktyviai dalyvauja nustatant vyrų lytį. dax1 gali būti susijęs su lytinių liaukų diferenciacija ir vystymusi abiejų lyčių kelioms teleosto rūšims. Atsižvelgiant į amh ir dax1 funkciją, kai M. albus inversija lyties atžvilgiu nėra visiškai suprantama, mes klonavome viso ilgio amh ir dax1 cDNR ir išanalizavome jų raiškos modelius skirtingais laikotarpiais sekso inversijos metu bei jų audinius. paskirstymai. Šiuo metodu siekėme išsiaiškinti šių genų vaidmenį lytinių liaukų vystymuisi ir pateikti įžvalgą apie lyties inversijos mechanizmą, esant M. albus .

Rezultatai

Amh ir dax1 klonavimas ir sekų analizė

M. albus amh (KF770790.1) ir dax1 (KF770791.1) pilno ilgio cDNR yra atitinkamai 1985 bp ir 1366 bp, o atitinkami atvirojo skaitymo rėmai (ORF) yra 1647 bp ir 882 bp, kurie koduoja 548. ir 293 amino rūgštys. Amh ir dax1 5 ′ neišversti regionai (5′-UTR) yra atitinkamai 68 bp ir 148 bp, o 3′-UTR yra atitinkamai 270 bp ir 336 bp. Visuose juose yra numanomas poliadenilinimo signalas (AATAAA), esantis tiesiai prieš poli (A) uodegą (1 pav.).

Image

M. albus amh ( A ) ir dax1 ( B ) nukleotidų ir išvestų aminorūgščių sekos. Amino rūgščių seka parodyta standartiniu 1 raidės kodu žemiau nukleotidų sekos. Langelyje nurodomas tipiškas poliadenilinimo signalas. Aminorūgščių liekanų padėtis nurodoma skliaustuose.

Visas dydis

Kelios Amh sekos suderinimas su visomis išvestomis baltymų sekomis tarp M. albus ir kitų stuburinių parodė, kad Amh išsaugojimo lygis tarp skirtingų rūšių yra žemas; pvz., 64, 3% tarp M. albus ir P. olivaceus . Taip pat nustatytas mažas panašumas tarp M. albus ir Mus musculus (Pelė) (18, 2%) bei tarp M. albus ir Homo sapiens (Human) (18, 1%) (2A pav.). C-galo regionas turėjo didesnį tapatumą tarp skirtingų rūšių, palyginti su N-galo regionais. Amh aminorūgščių sekoje yra du domenai, būdingi AMH baltymų šeimai, AMH-N domenas šio baltymo viduryje ir TGF-β domenas C gale. Tai parodė, kad tarp šių dviejų domenų yra dvi numanomos plazmino skilimo vietos (R / K-XX-R / K) (rodyklė 2A pav.). Galiausiai cisteino pasiskirstymo analizė parodė, kad yra devyni cisteino likučiai, išsaugoti tarp skirtingų stuburinių (žvaigždės 2A pav.).

Image

M. albus Amh ( A ) ir Dax1 ( B ) aminorūgščių sekų palyginimas su žinomais ortologais. ( A ) Šią baltymų šeimą apibūdinantis AMH domenas (AMH-N vientisos linijos dėžutėje) yra pažymėtas etikete, o TGF-β domenas ties C-galas (TGF-β punktyrinės linijos dėžutėje). Žvaigždutės nurodė konservatyvius cisteinus. Pirmadienis: Monopterus albus ; Par: Paralichthys olivaceus , BAD37138.1; Sal: Salmo salar , AAU85130.1; Ang: Anguilla japonica , BAB93107.1; Danas: Danio rerio , AAX81416.1; Hom: Homo sapiens , AAH49194.1; „Mus“: „ Mus musculus“ , NP_031471.2; Gal: Gallus gallus , NP_990361.1. ( B ) DAX1 buvo rasta keturi į LXXLL panašūs motyvai (plonos linijos dėžutėse). Trys iš jų yra DNR / RNR / branduolio receptorius jungiančiame domene (nenutrūkstamoje eilutėje). Ketvirtasis į LXXLL panašus motyvas ir AF-2 šerdis yra ligandą surišančiame domene (punktyrinėje linijoje). Pirmadienis: Monopterus albus ; Epi: Epinephelus coioides , ADR80691.1; Dic: Dicentrarchus labrax , CAG17628.1; Gegužė: „ Maylandia zebra“ , XP_004551298.1; Rūda: Oreochromis niloticus , AAN17672.1; Tak: Takifugu rubripes , XP_003961802.1; Cyn: Cynoglossus semilaevis , ACZ51263.1; Kry: Kryptolebias marmoratus , ACL00866.1; Ory: Oryzias latipes , BAF74811.1; Onkas: Oncorhynchus mykiss , ACM80361.1; Danas: Danio rerio , AAI33943.1; Hom: Homo sapiens , ADZ17343.1; „Mus“: „ Mus musculus“ , NP_031456.1.

Visas dydis

Daugybinis Dax1 išvestos sekos suderinimas parodė aukščiausią identiškumo laipsnį tarp M. albus ir Epinephelus coioides (apelsinų dėmėtasis grupelis ) (89, 8%). Be to, C-terminalo regione buvo nustatytas aukštesnis išsaugojimo lygis, palyginti su N-terminalo regionais. Žinduolių DAX1 baltymuose buvo rasti keturi į LXXLL panašūs motyvai; trys buvo DNR / RNR / branduolio receptorius rišančiame domene, o vienas - ligandą surišančiame domene. Priešingai nei žinduoliai, „Teleost Dax1“ turi tik du į LXXLL panašius motyvus: vieną - DNR / RNR / branduolio receptorius rišančiame domene, o kitą - ligandą surišančiame domene. Galiausiai AF-2 branduolys buvo rastas žinduolių ir žuvų ligandą rišančiame domene (2 pav. B).

Amilo nukleotidų sekų filogenetinė analizė parodė M. albus klasterius P. olivaceus kloste su aukštu įkrovos palaikymu (100), gerai atskirtus nuo žinduolių ir Gallus gallus (viščiuką) kaip pogrupį (3A pav.). Iš dax1 nukleotidų sekų sudarytas filogenetinis medis parodė, kad M. albus buvo labiausiai susijęs su D. labrax ir E. coioides (bootstrap 87) ir buvo gerai atskirtas nuo žinduolių kaip pogrupis (3B pav.).

Image

Filogenetinis medis, pagrįstas amh ( A ) ir dax1 ( B ) nukleotidų sekomis. Rūšių santrumpos yra tokios pačios, kaip ir 2 pav. Skaičiai yra kiekvieno mazgo palaikymo įkrovos vertės procentinės dalys nuo 1000 replikų, remiantis kaimyno sujungimo metodu.

Visas dydis

Specifinis amh ir dax1 pasiskirstymas audiniuose

amh ir dax1 buvo aptikti smegenyse, raumenyse, žarnyne, inkstuose, blužnyje, širdyje, kepenyse, odoje, kraujyje, akyje ir lytinėse liaukose naudojant RT-PGR, didžiausias lytinių liaukų kiekis (4 pav.). Amm transkripcijos lygį buvo sunku aptikti kituose audiniuose, išskyrus lytines liaukas. Priešingai, „ dax1“ išraiška buvo didžiausia kepenyse ir lytinėse liaukose, po kurių seka širdis, blužnis, kraujas, raumenys, smegenys ir akis (4A pav.). Tarp skirtingų lytinių liaukų vystymosi stadijų didžiausias amh mRNR lygis buvo nustatytas kiaušidėse ir sėklidėse, o didžiausias dax1 mRNR lygis buvo nustatytas kiaušidėse (4 pav. B).

Image

( A ) ekspresijos lygis skirtinguose audiniuose, ( B ) ekspresijos lygis skirtingose ​​lytinių liaukų vystymosi stadijose, K: neigiama kontrolė, rpl17 ir ef1 α: vidinė kontrolė.

Visas dydis

Amh ir dax1 išraiška per M. albus inversiją sekso metu

Amšo ekspresijos lygis buvo smarkiai sumažintas, kai lytinė lytinė ląstelė išsivystė į ♀IV (kiaušidės IV stadijoje) iš ♀III (kiaušidės III stadijoje). Bet tai buvo dramatiškai sureguliuota, kai lytinė tauta virsta kiaušidžių ovotestis, o išraiškos lygis buvo labai aukštas per ♀ / ♂II (ovotestis II stadijoje), ♀ / ♂III (ovotestis III stadijoje) ir ♂ ( sėklidės) stadijos (Friedmano ANOVA, P <0, 05; 5A pav.). Lytinių liaukų vystymosi stadijose dax1 išraiška buvo stabilesnė nei amh . Jis žymiai padidėjo oocitų brendimo metu (♀IV) (Friedman ANOVA, P <0, 05; 5B pav.). Po to „ dax1“ raiška dramatiškai sumažėjo, kai degeneravo kiaušialąstes, lygiagrečiai su spermatogoninio proliferacijos pradžia (♀ / ♂I, ovotestis I stadijoje) (Friedmano ANOVA, P <0, 05; 5B pav.). „ Dax1“ išraiška vėl padidėjo (♀ / ♂III), o vėliau sumažėjo iki žemo lygio sėklidėse (♂) (Friedmano ANOVA, P <0, 05; 5 pav. B).

Image

Amh ( A ) ir dax1 ( B ) kopijos skirtingose M. albus lytinių liaukų vystymosi stadijose. ♀III: kiaušidės III stadijoje, ♀IV: kiaušidės IV stadijoje, ♀V: kiaušidės V stadijoje, ♀ / ♂I: ovotestis I stadijoje, ♀ / ♂II: ovotestis II stadijoje, ♀ / ♂III: ovotestis III stadijoje, ♂: sėklidė. Kiekviename etape buvo naudojami du biologiniai pakartojimai, ir kiekvienas mėginys matuojamas tris kartus. Juostos su skirtinga raide rodo reikšmingą skirtumą viena nuo kitos (Friedman ANOVA, P <0, 05). Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SE. ( A ) amh ekspresija reikšmingai sumažėjo, kai kiaušidės išsivystė iš ♀III į ♀IV, ir po to žymiai padidėjo, kai lytinių liaukų vystymasis pasikeitė į ovotestis (Friedman ANOVA, P <0, 05). ( B ) Dax1 išraiška žymiai padidėjo, kai lytinių liaukų vystymasis enteredIV prasidėjo nuo ♀III, o po to žymiai sumažėjo, kai lytinių liaukų išsivystė iš ♀V į ♀ / ♂I (Friedman ANOVA, P <0, 05).

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes išskyrėme iš M. albus amh ir dax1 pilno ilgio cDNR, tada išanalizavome ir apibūdinome jų išvestas aminorūgščių sekas. Kelios Amh sekos suderinimas parodė, kad dėl TGF-β šeimos konservatyvumo C-galinis regionas pasižymi dideliu homologiškumu tarp skirtingų rūšių. Daugeliui šios šeimos narių N-galinis regionas neturi savo biologinio aktyvumo, tačiau labai svarbu sustiprinti C-galo regiono biologinę funkciją 32 . Regiono tarp TGF-β ir AMH-N domeno sekos analizė rodo, kad daugumoje žuvų rūšių, įskaitant M. albus, yra dvi numanomos skilimo vietos (R / K-XX-R / K). Tačiau žmonėms ir galvijams susidaro tik viena skilimo vieta 3 . Amlo filogenetinė analizė parodė reikšmingą skirtumą tarp žuvų ir žinduolių, o tai rodo didelį diversifikacijos laipsnį amh 16 evoliucijos metu. Dax1 daugialypės sekos suderinimas parodė, kad žuvų baltymai yra panašūs. Žinduolių DAX1 buvo rasti keturi į LXXLL panašūs motyvai, tačiau tik du tokie motyvai buvo rasti M. albus Dax1 baltyme, kuris yra labai konservatyvus tarp teleostų 19, 30 . Antrasis ir ketvirtasis į LXXLL panašūs motyvai buvo atitinkamai DNR / RNR / branduolio receptorius rišančiame domene ir ligandą surišančiame domene. Yra užfiksuota, kad šie į LXXLL panašūs motyvai galėjo sąveikauti su SF-1 33, 34 ir kitais branduoliniais receptoriais, įskaitant estrogeno receptorius 22, androgeno receptorius 23 ir progestino receptorius 35 . Šių motyvų mutacija ar ištrynimas sutrikdė DAX1 represuotą aktyvumą prieš SF1 36 . M. albus , D. labrax ir Takifugu rubripes (Pufferfish) atveju pirmasis Dax1 baltymo į LXXLL panašus motyvas buvo poligutamino (poli (Q)) ruožas. T. rubripes buvo septyniolika glutaminų, D. labrax - trylika ir M. albus - tik šeši. Glutaminas buvo dažniausiai pasikartojanti aminorūgštis eukariotiniuose baltymuose. Buvo pranešta, kad tokie pakartojimai yra bendro evoliucinio mechanizmo, skirto pridedant naują aminorūgščių seką, dalis 37 . Kaip ir žinduoliuose, žuvyje AF-2 branduolys yra jungiantis ligandą, o šio likučio mutacija sumažino sf1 branduolio lokalizacijos dažnį , o tai rodo svarbų AF-2 šerdies vaidmenį branduolio lokalizacijos procesuose 21 .

M. albus amh ir dax1 mRNR raiška buvo tiriama įvairiuose audiniuose, naudojant RT-PGR. amhas buvo rastas lytinėse liaukose (abiejų lyčių), tačiau kituose audiniuose jokio akivaizdaus signalo nebuvo gauta. Tai rodo, kad amhas yra giminaičių vystymosi genas, susijęs su M. albus . Panašus išraiškos būdas buvo rastas O. latipes 15 ir P. olivaceus 13 . Žinduoliams buvo gerai aprašyta, kad Amh ekspresija vyksta sėklidės Sertoli ląstelėse ir kiaušidžių granulozėse 38, 39 . Aukštas amh ekspresijos lygis buvo pastebėtas kiaušialąstėje ir sėklidėje M. albus , taip pat aptiktas kiaušidėse, bet žemas. Tuo pačiu metu kituose teleose amhas buvo išreikštas vienos arba abiejų lyčių lytinėmis liaukomis, o didžiausias jų lygis buvo sėklidėse - 13, 14, 16, 40 . Šios išvados rodo, kad spermatogoninio proliferacijos ir diferenciacijos reguliavimas gali būti viena iš bendrų amh funkcijų tarp stuburinių. Žindukams didesnis Dax1 kiekis buvo pastebimas skirtinguose audiniuose, apimančiuose lytines liaukas, bet ne kepenyse ar žarnyne. Nepaisant to, dax1 mRNR gausiai buvo ekspresuojama kepenų, nesusijusių su žinduoliais, žinduoliais 43, 44 . „ Dax1 “ išraiška nustatyta kepenyse, taip pat M. albus smegenyse, raumenyse, blužnyje, širdyje, kraujyje, akyje ir lytinėse liaukose. kepenyse išreikštas dax1 gali būti susijęs su vitellogenezės reguliavimu, sąveikaudamas su C. auratus var. Pengze 19 . D. rerio metu dax1 morfolino antisense nukleotido įšvirkšti embrionai nenormaliai vystėsi centrinėje nervų sistemoje, nurodydami, kad tai yra svarbu smegenų vystymuisi45. Todėl platus ir skirtingas stuburinių gyvūnų raiškos būdas parodė, kad dax1 funkcija buvo sudėtinga ir liko neaiški 46 . Be to, buvo manoma, kad „ Dax1 “ veikia kaip „ antivėžinis “ arba „kiaušidžių progenas “ lytinių liaukų vystymosi metu 27, ir jis dalyvavo kiaušidžių steroidogenezės reguliavime slopindamas LRH-1 transkripciją granulosa ląstelių linija 47 . Taip pat nustatyta, kad „ Dax1“ dalyvavo sėklidžių virkštelės organizavime 48 . M. albus lytinių liaukų srityje dax1 raiška buvo nustatyta vyrams ir moterims, o dax1 atskleidimas buvo glaudžiai susijęs su lytinių liaukų vystymusi, įskaitant sėklides ir kiaušides.

Toliau mes panaudojome absoliučią kiekybinę realiojo laiko RT-PGR, norėdami ištirti amh ir dax1 raišką skirtingose ​​lytinių liaukų vystymosi stadijose lytinės inversijos metu M. albus . Ampos raiška buvo nustatyta tiek sėklidėse, tiek kiaušidėse, sutinkant su amh raiškos modeliu D. rerio 14 . Anguilla japonica (japoninis ungurys) 40 ir P. olivaceus 13 sėklidėse amšo raiška buvo nustatyta Sertoli ląstelėse, supančiose spermatogoniją. Žinduolio vaisiuje AMH yra vienas iš ankstyviausių Sertoli ląstelių baltymų, kurį ekspresuoja lytinė liauka, ir jis buvo atsakingas už Müllerian ortakio regresijos pradėjimą vyriškame vaisiuje 49 . amhas A. schlegeli vaidina svarbius vaidmenis ankstyvojoje sėklidėje 18 . M. albus organizme amh raiška buvo žymiai sureguliuota, kai lytinės liaukos išsivystė į ♀ / ♂I (I stadijos ovotestis), o tai reiškia, kad amhas buvo ekspresuojamas diferencijuojant Sertoli ląsteles ir ankstyvą sėklidžių vystymąsi. amh ekspresija buvo nuolat kontroliuojama reikšmingai at / ♂II (ovotestis II stadijoje). Tai atitiko aukštą amh sekrecijos palaikymą sėklidėse, tai rodo, kad vyriškos lyties vystymuisi ir sėklidėms palaikyti M. albus reikėjo nuolatinio amh išsiskyrimo sėklidėse. D. rerio 14 ir D. labrax 16, cyp19a yra žemai sureguliuojamas amh . Priešingai, AMH reguliuoja kiti transkripcijos faktoriai, tokie kaip SF1, SOX9, DAX1 ir WT1 24, 50, 51 . Ankstesni tyrimai tyrė miRNA-430 ir amh ryšį. Lyginamieji amh ir miRNR-430 ekspresijos lygiai buvo aptikti M. albus , tai rodo, kad amh gali būti miRNR-430 52 taikinys. Amh funkciją nustatant ir diferencijuojant lytinius liaukus , reguliuoja M. albus 52 mikroRNR. Be to, amge ekspresija buvo nustatyta suaugusios moters D. rerio granuliozės ląstelėse oogenezės stadijose. Pirmiausia jis buvo aptiktas vėlyvoje IB stadijoje, sumažėjęs III ankstyvoje stadijoje, o vėlesniuose etapuose nerastas 14 . Mūsų rezultatas M. albus kiaušidėse sutiko su amh raiška D. rerio , kuris reikšmingai sumažėjo decreasedIV ir sunkiai aptinkamas ♀V. AMH yra svarbus normalios folikulogenezės genas, reguliuodamas folikulų skaičių 53 . Naujausiais tyrimais su pelėmis nustatyta, kad AMH ir FOXL2 sąveikauja sąveikaudami, kad būtų išsaugoti kiaušidžių folikulai 54 . Šis atradimas patvirtino amh vaidmenį ankstyvoje kiaušidžių raidoje. Ji taip pat patvirtino svarbų amh vaidmenį natūralioje lyties pokyčių žuvyje A. schlegeli ankstyvoje kiaušidžių raidoje ir vėlyvame kiaušidžių augime (pvz., Vitellogeniniai oocitai) 18 .

Dax1 buvo išreikštas visuose HPG ašies regionuose vystymosi metu. Kiaušidėse granulosa ir theca ląstelės buvo teigiamos DAX1. Sertoli ir Leydig ląstelės parodė DAX1 ekspresiją sėklidėje 55 . Pelės, išbrauktos iš Dax1, galėjo pažeisti kiaušidžių vystymąsi, nes dubliuotas Dax1 sukėlė XY lyties inversiją, tai rodo, kad Dax1 gali būti kiaušidžių nustatymo genas. Netikėtai Dax1 turinčioms pelėms buvo nustatyta sėklidžių disgenezė ir spermosgenezės defektas vyrams dėl netvarkingo sėklidės virkštelės formavimo; tačiau kiaušidžių išsivystymas buvo normalus 48, 56 . Kita vertus, DAX1 ekspresija Sertoli ląstelėse ir Leydig ląstelėse atskirai nebuvo pakankama patologijai išgelbėti, todėl norint įrodyti, kad DAX1 funkcija kitose somatinėse ląstelėse buvo būtina tinkamam sėklidžių vystymuisi, taip pat Sertoli ir Leydig ląstelių 28 ląstelėms, buvo galima manyti . 57 . Moterims DAX1 buvo nustatytas įvairių tipų kiaušidžių ląstelėse, ypač granuliozės ląstelėse. Tai rodo, kad DAX1 turėjo reikšmės genų ekspresijos reguliavimui specifiniame folikulų vystymosi etape 21 . Buvo spėjama, kad DAX1 gali dalyvauti kai kurių pagrindinių fermentų reguliavime, slopindamas SF1 tarpininkaujamą transkripciją steroidų biosintezėje folikulų vystymosi metu 58, tuo tarpu Dax1 nepakankamos pelių patelės buvo normalios ir derlingos, turint nedidelį kiaušidžių folikulo defektą 59 . Šiame tyrime M. albus dax1 buvo aptiktas kiaušidėse, kiaušidėse ir sėklidėse, o jo significantlyIV stadijoje buvo žymiai daugiau, palyginti su kitais vystymosi etapais. Šie rezultatai rodo, kad dax1 funkcija kiaušidžių vystymuisi buvo sudėtinga ir nevisiškai suprantama. Be to, dax1 raiška smarkiai sumažėjo, kai lytinių liaukų vystymasis ♀ / ♂I stadijoje, o tai rodo, kad dax1 žemas reguliavimas buvo vienas iš veiksnių, skatinančių sėklidžių vystymąsi. Mūsų ankstesnis tyrimas parodė, kad foxl2 gali reguliuoti cyp19a1a ekspresiją pagal koreliacijos išraiškos modelį tarp foxl2 ir cyp19a1a kiaušidėse ir smegenyse 60 . Išstūmus „ Foxl2“ , padidėjo „Dax1“ reguliavimas. „ Foxl2“ taip pat buvo laikomas neigiamu Sf1 61 reguliatoriumi. Tiesioginė DAX1 ir SF1 sąveika moduliuoja įvairių tikslinių genų ekspresiją, pavyzdžiui, aromatazės 25 ir MIS 62 . Be to, DAX1 taip pat veikia kaip aromatazės 25 transaktyvatorius ir reguliuoja vitellogeninio išsivystymo laiką protandringiniame A. schlegeli 63 . Todėl DAX-1, FOXL2 ir SF-1 bendradarbiavimo arba antagonistinio reguliavimo santykis yra sudėtingas. Visi jie netiesiogiai ar tiesiogiai reguliuoja aromatazės ekspresiją lytinių liaukų nustatymo ir diferenciacijos metu 64 .

Apibendrinant, iš hermafroditinių gėlavandenių žuvų M. albus buvo išskirtos amh ir dax1 cDNR ir nustatytas šių dviejų genų specifinis pasiskirstymas audinyje. amh yra su lytinėmis liaukomis susijęs genas, ekspresuojamas daugiausia lytinėse liaukose, o dax1 yra plačiai paplitęs įvairiuose audiniuose. Tiriant M. albus lyties inversiją, buvo tiriami amh ir dax1 lytinių liaukų raiškos modeliai. Amžiaus kiekis pastebimai padidėja esant ovotestiui ir išlaikomas aukštas lygis sėklidėse, o dax1 yra labai išreikštas ♀IV. Jis žymiai sumažėja in / ♂I. Po to jo išraiška vėl padidėjo ♀ / ♂III, o vėliau sumažėjo iki žemo lygio sėklidėse. Šiame tyrime pateikta informacija praplės mūsų supratimą apie lytinių liaukų vystymosi molekulinius mechanizmus hermafroditinėse žuvyse.

Metodai

Eksperimentinė žuvis

M. albus buvo gauti iš Wuhan Kinijoje ir 7 dienas buvo auginami akvariume (kūno ilgis nuo 34 iki 54 cm; kūno svoris nuo 50 iki 120 g). Žuvis buvo patepta MS-222. Tada jie buvo paaukoti atlikus stuburo amputaciją, o lytinių liaukų segmentai pritvirtinti Bouin-Holland skystyje histologiniam įvertinimui. Seksualinės stadijos nurodo ankstesnį mūsų tyrimą 65 . Įvairūs M. albus lytinių liaukų ir audinių (lytinių liaukų, kraujo, raumenų, odos, kepenų, akių, blužnies, žarnyno, inksto, širdies ir smegenų) vystymosi tarpsniai buvo užšaldyti skystame azote ir laikomi –80 ° C. Lytinių liaukų analizei: kiekviename etape buvo pasirinktos dvi žuvys, o kiekvienas mėginys buvo analizuojamas trimis egzemplioriais. Audinių pasiskirstymo analizei: vienos rūšies audiniai iš atsitiktinių trijų žuvų buvo sujungti į vieną mėginį. Visi eksperimentai buvo atlikti gavus Huazhongo žemės ūkio universiteto (Wuhan, Kinija) Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto (IACUC) patvirtinimą, be to, jie buvo atlikti laikantis Tarptautinių pagrindinių principų, susijusių su biomedicininiais tyrimais, susijusiais su gyvūnais, kuriuos paskelbė draugija. reprodukcijos tyrimas.

RNR ekstrahavimas ir atvirkštinės transkripcijos PGR (RT-PGR)

Visa RNR buvo ekstrahuota naudojant TRIzol ® reagentą (Takara, Dalian) pagal gamintojo instrukcijas. Kokybė buvo įvertinta agarozės-gelio elektroforezės būdu, remiantis 18 S ir 28 S rRNR juostų ir NANODROP 2000c („Thermo Scientific“, JAV) vientisumu, kai A 260 mm / A 280 mm santykis buvo nuo 1, 8 iki 2, 1. 1 μg RNR pavyzdys buvo naudojamas atvirkščiai transkripcijai naudojant „PrimeScript® RT“ reagentų rinkinį su „gDNA Eraser“ (Perfect Real Time) (Takara), kurio galutinis reakcijos tūris buvo 20 μL.

Amh ir dax molekulinis klonavimas1

Daliniai tikslinių genų cDNR fragmentai buvo amplifikuoti naudojant išsigimusius pradmenis (1 lentelė), suprojektuotus remiantis konservuotais kitų rūšių regionais, naudojant „Primer Premier 5.0“ programinę įrangą. PGR buvo atlikta naudojant 2 μL cDNR šabloną 25 μL reakcijos tūryje, kuriame buvo 0, 5 μL 10 mM kiekvieno pradmens ir 12, 5 μl Premix Taq (Takara). PGR produktai buvo klonuoti į PMD-19T vektorių (Takara) ir sekos sudarytos Pekino genomikos institute. Genų specifiniai pradmenys (1 lentelė) buvo suprojektuoti taip, kad būtų galima gauti 5 'ir 3' kiekvienos cDNR galus, remiantis šių dalinių fragmentų sekomis, remiantis gamintojo instrukcijomis, pateiktomis SMART RACE rinkinyje (Clontech, Amerika).

Pilno dydžio lentelė

Sekos analizė ir filogenetinė analizė

Amh ir Dax1 aminorūgščių sekos buvo išvestos naudojant „BioEdit“ programinę įrangą ir suderintos su kitomis rūšimis, naudojant „ClustalW“. Baltymų procentinė sekos tapatybė buvo apskaičiuota pagal „DNAtar“ programinės įrangos „MegAlign“ programą. Filogenetiniai medžiai buvo sukonstruoti naudojant kaimyninių jungčių (NJ) metodą, MEGA 5.05 programinę įrangą, ir kiekvienos šakos patikimumas buvo įgytas naudojant 1000 įkrovos replikų.

Audinių amh ir dax1 pasiskirstymas naudojant RT-PGR

Genui būdingi pradmenys (1 lentelė) buvo sukurti norint analizuoti amh ir dax1 raiškos modelius skirtinguose audiniuose (smegenyse, raumenyse, žarnyne, inkstuose, blužnyje, širdyje, kepenyse, odoje, kraujyje, akyje ir lytinėse liaukose). 25 μL PGR tūryje buvo 2 μL 10 kartų koncentruoto cDNR šablono, o protokolas buvo toks: 3 minutes kaitinkite 94 ° C temperatūroje, po to sekė 35 ciklai 94 ° C 30 s, 60 ° C 30 s, 72 ° C. 30 s, o paskutinis pratęsimo žingsnis 72 ° C temperatūroje 10 min. Ef1α (KC011266) ir rpl-17 (KC011267) pamatiniai genai buvo gydomi atitinkamai 28 ir 25 ciklais. Etaloninių genų stabilumas buvo analizuotas ankstesniame mūsų tyrime 65 . Visi PGR produktai buvo elektroforezuoti 1% (m / t) agarozės gelyje ir DNR buvo nudažyti GelRed.

amh ir dax1 raiškos modeliai lytinių lytinių organų inversijos metu

Genų ekspresijai nustatyti skirtingose ​​lytinių liaukų vystymosi stadijose buvo naudojamas absoliutus kiekybinis realaus laiko RT-PGR. Šiame eksperimente naudojami genų specifiniai pradmenys buvo tokie patys, kaip aprašyta aukščiau, ir kiekvienos pradmenų poros specifiškumas buvo patikrintas naudojant vienintelę lydymosi kreivės smailę. 25 μL reaktyvioji sistema, turinti 2 μL cDNR, 0, 5 μL 10 mM kiekvieno grunto ir 12, 5 μL SYBR® Premix Ex Taq ™ II (tobulas realus laikas) (Takara), o protokolas buvo: šiluma 95 ° C temperatūroje 30 s po to 30 ciklų, kuriuose 95 ° C 5 s, 55 ° C 60 s amh arba 56 ° C 50 s Dx1 , ir paskutinis pratęsimo žingsnis 72 ° C 30 s. Į kiekvieną tyrimą be cDNR buvo įtraukta neigiama kontrolė ir mėginiai buvo analizuojami trimis egzemplioriais naudojant „Rotor-Gene Q“ instrumentą. Kiekvieno mėginio išraiška buvo apskaičiuota kaip kopijos / ml pagal standartinę serijinių skiedimų kreivę.

Statistinė analizė

Kiekvienoje lytinių liaukų stadijoje buvo naudojami du biologiniai pakartojimai, ir kiekvienas mėginys buvo matuojamas tris kartus. Visi eksperimentiniai duomenys buvo nurodyti kaip vidutinė ± standartinė paklaida ir išanalizuoti neparametrinio Friedmano ANOVA. P reikšmė, kuri buvo mažesnė nei 0, 05, buvo pasirinkta kaip reikšmingas lygis.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Hu, Q. et al . Amh ir dax1 genų molekulinis klonavimas ir apibūdinimas bei jų raiška sekso inversijos metu ryžių lauko unguryje Monopterus albus . Mokslas. Atstovas 5, 16667; „doi“: 10.1038 / srep16667 (2015).

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.