Ciap1 ir ciap2 skleidžiamų molekulinių kvapų molekuliniai determinantai | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Ciap1 ir ciap2 skleidžiamų molekulinių kvapų molekuliniai determinantai | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Dalykai

  • Veiksmo mechanizmas

Anotacija

Apoptozės (IAP) baltymų cIAP1 ir cIAP2 inhibitoriai neseniai atsirado kaip pagrindiniai ubikvitino-E3 ligazės, reguliuojančios įgimtą imunitetą ir ląstelių išgyvenimą. Didžioji dalis mūsų žinių apie šiuos IAP kyla iš tyrimų, kuriuose naudojami IAP farmakologiniai inhibitoriai, vadinami Smac mimetikais (SM). Nors SM skatina CIAP auto-ubiquityliaciją ir skilimą, mažai žinoma apie molekulinius veiksnius, per kuriuos SM aktyvuoja CIAP E3 aktyvumą. Šiame tyrime mes pastebime, kad SM sukeltas greitas CIAP skaidymas reikalauja prisijungimo prie naviko nekrozės faktoriaus (TNF) receptorių susieto 2 faktoriaus (TRAF2). Be to, mūsų duomenys rodo netikėtą skirtumą tarp cIAP1 ir cIAP2. Nors SM sukeltas cIAP1 skilimas nereikalauja cIAP2, cIAP2 skaidymas kritiškai priklauso nuo cIAP1 buvimo. Be to, CIAP2 skilimas taip pat reikalauja, kad CIAP2 ŽIEDAS pirštas galėtų susilpnėti ir prisijungti prie E2. Tai turi reikšmingų padarinių, nes SM sukeliamas CIAP1 skilimas sukelia nekanoninį NF-κB aktyvavimą, kuris sukelia cIAP2 geno ekspresiją. Nesant cIAP1, de novo sintezuotas cIAP2 yra atsparus SM ir slopina TNF α žudymą. Be to, cIAP2-MALT1 onkogenas, kuriam trūksta cIAP2 žiedo, yra atsparus SM gydymui. Mechanizmų, per kuriuos vėžinės ląstelės priešinasi SM gydymui, nustatymas padės pagerinti kombinuotą gydymą, siekiant sustiprinti gydymo atsaką.

Pagrindinis

Tobulėjant mūsų supratimui apie molekulinius mechanizmus, per kuriuos vėžio ląstelės apeina apoptozinę programą, buvo lengviau sukurti naujas, galbūt selektyvesnes ir veiksmingesnes vėžio gydymo strategijas. Smac mimetinių (SM) junginių, skirtų apoptozės baltymo (IAP) inhibitorių šeimos nariams slopinti ir vėžio ląsteles sujaudinti iki mirties, sukūrimas rodo tokį požiūrį. 1

SM junginiai yra mažų farmakologinių molekulių klasė, imituojanti subrendusio Smac (dar žinomo kaip DIABLO), laisvai apibrėžto IAP antagonistų šeimos nario, aminoterminį IAP surišimo motyvą (AVPI). 2 Šie junginiai selektyviai jungiasi su daugelio IAP bakulovirusiniu IAP pakartojimo (BIR) 2 ir BIR3 domenais. 3 Žinduolių IAP, XIAP, cIAP1 ir cIAP2 savo amino galinėje dalyje turi tris tokius domenus. Šie IAP taip pat turi papildomų domenų, tokių kaip RING-piršto domenas, užtikrinantis jiems Ubiquitin (Ub) ligazės (E3) aktyvumą, 4 su Ub susietą domeną, per kurį jie sąveikauja su visur esančiais baltymais, 5, 6 ir esant CIAP1 ir cIAP2, nežinomos funkcijos kaspazės įdarbinimo sritis.

Nors IAP geriausiai žinomi dėl jų gebėjimo slopinti kaspazes, 7 jie taip pat atlieka išgyvenimo signalizacijos funkcijas, nepriklausančias nuo kaspazių valdymo. Visų pirma, cIAP1 ir cIAP2 moduliuoja nuo Ub priklausomus signalinius įvykius, kurie reguliuoja NF-KB. CIAP reikalingi kanoninio kelio suaktyvinimui nuo dirgiklio ir konstituciniam nekanoninio NF- κ B kelio slopinimui. 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15

Nestimuliuojamomis sąlygomis nekanoninis NF-κB signalizavimas yra slopinamas dėl CIAP sukelto NF- κ B indukuojančios kinazės (NIK) skilimo. cIAP sąlygojamas NIK skilimas taip pat reikalauja su naviko nekrozės faktoriaus (TNF) receptoriais susieto faktoriaus (TRAF) 2 ir TRAF3, kurie veikia kaip adapterio baltymai, įdarbinantys NIK į cIAP. Praradę TRAF2, TRAF3 ar cIAP, išvengiama NIK apykaitos ir kaupiasi NIK baltymų lygis bei stimuliuojamas nekanoninis NF- κB signalizavimas. 8 Esant kanoniniam NF-κB keliui, stimuliacija su TNF α lemia, kad CIAP pasikartoja per TRAF2 į plazmos membranų surištą TNF receptorių 1 (TNF-R1) signalizacijos kompleksą, pramintą I kompleksu. Po jo priėmimo CIAP skatina šio komplekso komponentų, tokių kaip receptoriai sąveikaujantis 1 baltymas (RIP1), visapusiškumą. Tai savo ruožtu stimuliuoja kinazės kompleksų TAK1 – TAB2 – TAB3 ir NEMO – IKK α –IKK β įdarbinimą ir galiausiai sukelia branduolinį NF- κ B dimerų perkėlimą. Naujausi tyrimai parodė, kad CIAP reikalingi ne tik norint tinkamai sureguliuoti NF- κB, bet ir norint slopinti ląstelių žūtį per TNF α signalus. 9, 11, 12, 14, 17, 18

Nors SM iš pradžių buvo suprojektuoti XIAP suaktyvinti, jie yra veiksmingiausi naudojant cIAP1 ir cIAP2. Per keletą minučių po poveikio SM sukelia automatinį visuotinį kvapo išsiskyrimą ir proteasominį CIAP1 ir cIAP2 skilimą, nors dažniausiai CIAP2 kinetika yra silpnesnė. 9, 11, 12, 14, 17, 19 Tai sąlygoja NIK stabilizavimąsi ir savaiminį nekanoninio NF-KB aktyvavimą. SM jautriose ląstelėse tai sukelia NF-κB sąlygotą autokrininės TNF α gamybą, per didelis TNF-R1 stimuliavimas, po kurio priklauso nuo RIP1 priklausanti ląstelė.

Per pastaruosius kelerius metus buvo sukurti keli maži šių IAP farmakologiniai inhibitoriai, kurie šiuo metu yra klinikiniai. Nors akivaizdu, kad šie junginiai stimuliuoja cIAP auto-visuotumą ir skilimą, vis dėlto mįslinga, kaip tokios SM skatina šių cIAP E3 ligazės aktyvumo aktyvaciją. Šiame tyrime mes parodėme, kad norint sukelti SM sukeltą cIAP1 ir cIAP2 skaidymą, reikalingas TRAF2. Be to, mūsų duomenys rodo netikėtą skirtumą tarp cIAP1 ir cIAP2 reaguojant į SM gydymą.

Rezultatai

TRAF2 reikalingas SM sukeltai cIAP1 skaidymui

Nepaisant TRAF2 svarbos CIAP funkcijai, šiuo metu mažai žinoma apie TRAF2 indėlį į SM sukeltą greitą CIAP skaidymą. Naudodami biotiniluotus SM, kurie suriša cIAP1 ir cIAP2, 17 nustatėme, kad TRAF2 yra lengvai išgrynintas su cIAP1 ir cIAP2, tai rodo, kad SM surišti cIAP yra susiję su TRAF2 (1a pav.). Norėdami ištirti TRAF2 poreikį SM sukeltai cIAP1 skaidymui, mes išbandėme tris skirtingus SM: dvivalentį junginį A (junginys A) 11 ir monovalentinį SM junginį. C (RF ir JS, nepaskelbtas stebėjimas) ir LBW242. 14 Nors visi trys SM sukėlė endogeninio cIAP1 išeikvojimą WT pelių embrionų fibroblastuose (MEF) (1b pav.), TRAF2 - / - MEF buvo atsparūs greitam SM sukeltam cIAP1 skilimui. Norėdami atmesti galimybę, kad šis poveikis atsirado dėl genetinio dreifo tarp skirtingų ląstelių linijų, o ne dėl specifinio TRAF2 praradimo, mes naudojome MEF su loxP vietomis abiejose TRAF2 geno pusėse (MEF loxP – T2 – loxP ) ( 1c pav.). Užkrėtus lentivirusą ekspresuojančia Cre rekombinaze, TRAF2 pašalinamas, sąlygiškai išmušant TRAF2 cko - / - MEF, kurie kitaip yra genetiškai identiški tėvystės MEF loxP – T2 – loxP . Apdorojant LBW242, TRAF2 cko - / - MEF buvo atsparūs SM sukeltai cIAP1 skilimui. Tomis pačiomis sąlygomis SM sukėlė cIAP1 skilimą kontroliuojamame MEF loxP – T2 – loxP, kurie išreiškė GFP, o ne Cre rekombinazę (1c paveikslas). Visi šie rezultatai rodo, kad SM yra efektyviausios CIAP1 skaidymui, kai yra TRAF2.

Image

TRAF2 reikalingas Smac mimetinių (SM) sukeltų cIAP1 skilimui. ( a ir e ) Biotiniluotas SM buvo naudojamas SM jungiančius baltymus valyti iš MDA-MB-231 ( a ) ir MEF ( e ) lizatų. Bendrai išgrynintų baltymų buvimas buvo nustatytas imunologiniu būdu aprašant eluatą su nurodytais antikūnais. ( b - d ir g ) WT ir TRAF išmušimo MEF buvo apdoroti 100 nM komp. A, 100 nM komp. C ir 1 μM LBW242 nurodytais laiko taškais (min). Nurodytų baltymų buvimas buvo nustatytas imunoblotuojant lizatus su nurodytais antikūnais. Žvaigždutės nurodo nespecifines juostas. f ) Išskiriamos luciferazės reporterio analizės, naudojant TRAF2 - / -, i − I κ B − SR MEF. Ląstelės nebuvo gydomos arba buvo apdorotos 100 ng / ml doksociklinu (Dox), kad sukeltų I κ B-SR. Po 24 val. Buvo tiriamas terpės luciferazės aktyvumas. Liuciferazės aktyvumas yra parodytas, palyginti su nesuvokta būkle. Klaidų juosta nurodo trigubų eksperimentų SD. ( g ) TRAF2 - / -, i − I κ B − SR MEF nebuvo nurodytos arba sukeltos „Dox“ ir nurodytais laiko momentais buvo gydomos 1 μM LBW242.

Visas dydis

Toliau mes išbandėme TRAF1 ir TRAF3 reikalavimus SM sukeltam CIAP1 skaidymui. TRAF1 gali tiesiogiai surišti CIAP1, tuo tarpu TRAF3 jungia cIAP1 netiesiogiai per TRAF2. 8, 21, 22, 23, skirtingai nei TRAF2, TRAF1 ar TRAF3 praradimas neužblokavo SM sukeltos cIAP1 skilimo (1d pav.), Nors TRAF3 praradimas šiek tiek sulėtino SM stimuliuoto cIAP1 išeikvojimą (1d pav.). Svarbu tai, kad SM nesugebėjimas sukelti CIAP1 skilimo TRAF2 - / - MEF nebuvo susijęs su cIAP1 nesugebėjimu prisijungti prie SM nesant TRAF2 (1e pav.). Visi šie rezultatai rodo, kad SM sukeltam cIAP1 skilimui reikalingas TRAF2, bet ne TRAF1 ar TRAF3.

TRAF2 praradimas sąlygoja nekononinio NF-κB kelio aktyvavimą. 11, 24, 25 Kadangi NF- κB transkripcijos faktoriai sukelia daugybės tikslinių genų, kurių produktai gali turėti įtakos cIAP1 skaidymui SM, ekspresiją, mes sukūrėme TRAF2 - / - MEF, kuriuose NF- κ B sąlygoja indukciją. Tikslinių genų buvo užblokuoti išreiškiant I κ B-superrepresorių (I κ B-SR), kuris nėra skaidus, dominuojanti neigiama NF- KB B inhibitoriaus I κ forma (1f pav. ir papildoma S1 pav.). Pastebėtina, kad I κ B-SR blokuoja genų indukciją reaguodama į kanoninius ir ne kanoninius NF- κ B signalus (papildomas paveikslas S1 ir Vince ir kt., 11 ). Nors I κ B-SR blokavo NF- κ B tarpininkaujamą genų ekspresiją, nepavyko atkurti SM sukeltos cIAP1 skilimo TRAF2 - / - MEF (1g paveikslas). Be to, NIK ar p100 sunaikinimas neturėjo įtakos SM sukeltam CIAP1 skilimui ląstelėse, kuriose trūksta TRAF2 (papildomas paveikslas S1). Tai rodo, kad SM nesugebėjimas sukelti cIAP1 skilimą TRAF2 - / - MEF sukelia ne NIK ar kai kurių numanomų NF- κB tikslinių genų produktų perreguliavimas, o vietoj to yra specifinis TRAF2 praradimas.

SM sukeltas cIAP1 skilimas reikalauja jungimosi su TRAF2, bet ne su TRAF2 E3 ligazės aktyvumu

Atsižvelgiant į tai, kad cIAP1 jungiasi prie TRAF2 per BIR1, 21, 22, mes ištyrėme BIR1 domeno vaidmenį SM sukeltam cIAP1 skilimui. Šiuo tikslu mes laikinai transfekavome HEK293T ląsteles su cIAP1 WT ir cIAP1 ΔBIR1, kurioms trūksta BIR1 domeno ir todėl nesugeba prisijungti prie TRAF2 (2a paveikslas ir papildomas S2 paveikslas). SM sukeltas CIAP1 skilimas priklausė nuo prisijungimo prie TRAF2, nes gydymas LBW242 nesugebėjo efektyviai sunaikinti cIAP1 ΔBIR1, o cIAP1 WT greitai suskaidė (2b paveikslas). Pažymėtina, kad cIAP1 ΔBIR1 iš dalies skaido SM junginys tokiomis sąlygomis, nors mažesniu mastu nei laukinio tipo cIAP1. Greičiausiai taip yra dėl perdėtos ekspresijos sąlygų, naudojant HEK293T ląsteles. SM sukeltas cIAP1 skilimas nebuvo išgelbėtas naudojant TRAF2 - / - MEF, ištirpintą su TRAF2 ΔCIM, TRAF2 mutantu, kuriam trūksta cIAP1 sąveikaujančio motyvo (CIM, Δ283–293) 20 (2c paveikslas). Atvirkščiai, TRAF2 - / - MEF rekonstravimas su TRAF2 WT arba TRAF2 ΔRING, kuriam trūksta aminoterminalaus RING-piršto domeno, išgelbėjo SM sukeltą cIAP1 irimą. Kartu su ankstesniais duomenimis, šie rezultatai rodo, kad be funkcinio cIAP1 RING ir SM jungimosi prie BIR2 / 3 domenų, norint sukelti SM sukeltą cIAP1 skilimą, būtina surišti TRAF2 prie cIAP1. Nors TRAF2 turi RING pirštą, šis domenas yra būtinas SM sukeltam cIAP1 skaidymui, atmetant galimybę, kad TRAF2 veikia kaip CIAP1 E3.

Image

SM sukeltas cIAP1 skilimas reikalauja prisijungimo prie TRAF2. ( a ) b ir c naudojamų konstrukcijų schema. ( b ) HEK293T ląstelės buvo laikinai transfekuotos kontroline plazmidė arba plazmidėmis, ekspresuojančiomis arba cIAP1 WT, arba cIAP1 ΔBIR1 . Ląstelės nebuvo apdorotos arba 30 minučių buvo apdorotos 1 μM LBW242. c ) TRAF2 - / - MEF buvo stabiliai užkrėsti plazmidėmis, indukuojančiomis atitinkamai GFP, TRAF2 WT, TRAF2 ΔRING ir TRAF2 ΔCIM . Nurodytų baltymų ekspresija buvo suaktyvinta 2 nM 4-hidroksi-tamoksifenu, o ląstelės prieš analizę 16 valandų nebuvo apdorotos arba apdorotos 1 μM LBW242. Žvaigždutės nurodo nespecifines juostas. ( d ir e ) Rekombinantinis cIAP1 buvo tiriamas dėl jo E3 ligazės aktyvumo in vitro . Nurodyti cIAP1 ir TRAF2 kiekiai buvo inkubuoti su reakcijos mišiniu, kuriame yra Ub, ATP, E1 ir E2 (UbcH5c) fermentai. f ) WT ir TRAF2 - / - MEF nurodytais laiko momentais buvo gydomi 1 μM LBW242.

Visas dydis

Tada mes išsiaiškinome, ar TRAF2 prisideda prie SM sukeltos degradacijos, nes padidina cIAP1 E3 ligazės aktyvumą. Rekombinantinis cIAP1 pasižymi vidiniu E3 ligazės aktyvumu net nesant TRAF2 in vitro . 9, 12 Taigi, cIAP1 skatina auto-ubiquityliaciją in vitro tyrime, priklausomai nuo koncentracijos (2d pav.). Kai reakcijai buvo pridedama vis daugiau TRAF2, TRAF2 nepakeitė cIAP1 sąlygojamo auto-ubiquitylation (2e pav.), Tai rodo, kad TRAF2 šiomis sąlygomis nepadidina vidinio c3P1 E3 ligazės aktyvumo.

Norėdami išnagrinėti galimybę, kad TRAF2 pasisavina visur esančius cIAP1 į skilimo mašinas, mes ištyrėme, ar auto-ubiquitylated cIAP1 kaupiasi, jei nėra TRAF2. Nesant TRAF2, mums nepavyko aptikti jokio pastebimo visur esančio cIAP1 lygio (2f pav.), Todėl mažai tikėtina, kad TRAF2 įdarbins visur esančius cIAP į proteasomą. Apibendrinant, mūsų duomenys atitinka modelį, kuriame TRAF2 veikia kaip pagrindinis CIAP1 E3 aktyvumo, veikiant SM, kofaktorius, nes jis veikia kaip pastoliai, leidžiantys didelę vietinę cIAP1 koncentraciją. Tai gali palengvinti CIAP RING sumažėjimą, kuris reikalingas CIAP E3 veiklai. 26, 27 Pagal šį scenarijų, jei nėra TRAF2, gali būti kliudoma CIAP1 RING mažėjimui.

SM sukeltas cIAP2 skilimas priklauso nuo TRAF2 ir cIAP1

Tada mes išbandėme, ar TRAF2 taip pat reikalingas SM-tarpininkaujant cIAP2 skaidymui. Kadangi šiuo metu nėra gerų antikūnų, kurie nustatytų pelių cIAP2 endogeniniame lygmenyje, mes sukūrėme WT i-cIAP2 ir TRAF2 - / -; i-cIAP2 MEF, turinčius indukuojamą transgeną, koduojantį žmogaus cIAP2, kuriam egzistuoja geri antikūnai. Kaip ir cIAP1, cIAP2 buvo lengvai skaidomas WT MEF (3a pav.). Tačiau MEF, kuriuose trūko TRAF2, sumažėjo cIAP2 skilimas. Įdomu tai, kad kai CIAP2 buvo įvestas į CIAP1 / 2 dvigubo išmušimo (DKO) MEF, gydymas LBW242 nesugebėjo sukelti greito cIAP2 skilimo (3a ir b pav.), Parodydamas, kad cIAP2 skilimas kritiškai priklauso nuo cIAP1 buvimo. Priešingai, CIAP1 skilimas nepriklausė nuo cIAP2, nes DKO MEF ištirpintas cIAP1 buvo veiksmingai skaidomas apdorojant LBW242 (3c paveikslas). Svarbu tai, kad cIAP1 nebuvo reikalingas, kad cIAP2 prisijungtų prie SM junginio, taip pat tai neturėjo įtakos cIAP2 gebėjimui prisijungti prie TRAF2 (3d pav.). Be to, žmogaus ląstelėse taip pat sutriko SM sukeliamas cIAP2 skilimas, kuriame CIAP1 buvo numuštas dėl RNR trukdžių (RNR) (papildomas S3 paveikslas, išsamią informaciją rasite skyriuje „Medžiagos ir metodai“). Šie rezultatai rodo, kad cIAP2, skaičiuodamas SM, priklauso nuo CIAP1 E3 aktyvumo. Šis pastebėjimas atitinka ankstesnes ataskaitas, teigiančias, kad cIAP1 siekia cIAP2 proteasominiam skilimui. 28, 29 Nors cIAP2 tokiomis sąlygomis neskatina savo skilimo, nesant cIAP1, cIAP2 paprastai nėra neaktyvus kaip E3. Nesant cIAP1, cIAP2 lengvai skatino TNF sukeltą RIP1 visapusiškumą, NIK skilimą ir p100 perdirbimo slopinimą (3e – g paveikslai). Todėl cIAP2 yra visiškai kompetentingas skatinti nesąžiningų substratų visur esmę. Tačiau, nesant cIAP1, cIAP2 E3 ligazės aktyvumas neleidžia auto-ubiquilinti reaguojant į SM gydymą.

Image

SM sukeltas cIAP2 skilimas priklauso ir nuo cIAP1, ir nuo TRAF2. ( a ) WT, TRAF2 - / - ir cIAP1 / 2 dvigubo išmušimo (DKO) MEF, stabiliai užkrėsti plazmidėmis, induktyviai ekspresuojančiomis cIAP2 (i-cIAP2), 16 valandų buvo gydomi Dox ir nurodytą laiką veikiami 1 μM LBW242. taškų. Žvaigždutės nurodo nespecifines juostas. ( b ) LBW242 taip pat nesugeba skaidyti cIAP2 vėlesniais laiko momentais (24 val.). c ) DKO i-cIAP1 MEF, induktyviai išreiškiantys CIAP1, buvo naudojami vertinant, ar SM stimuliuoja cIAP1 skilimą, nesant cIAP2. cIAP1 ekspresija buvo indukuota 10 nM 4-hidroksi-tamoksifenu 16 val., po to nurodytais laiko momentais apdorota 1 μM LBW242. ( d - f ) cIAP2 raiška buvo indukuota Dox 16 valandų, po to ląstelės buvo analizuojamos. ( d ) Biotiniluotas SM buvo naudojamas SM jungiančius baltymus valyti iš nurodytų MEF lizatų. Žvaigždutės nurodo nespecifines juostas. ( e ) cIAP2 lengvai skatina RIP1 visuminį išsidėstymą I komplekse po TNF α stimuliacijos. DKO i-cIAP1 MEF nebuvo gydomi arba gydomi Dox, kad sukeltų cIAP2 ekspresiją, ir kompleksas-I buvo išgrynintas naudojant FLAG pažymėtą TNF α . Bendrai išgryninti baltymai buvo analizuojami implantų tyrimais. ( f ) Dėl sukeltos cIAP2 ekspresijos slopinamas p100 skilimas. g ) cIAP1 ir cIAP2 sugeba nukreipti NIK skilimui. NIK buvo kartu transfekuotas su GFP, cIAP1 arba cIAP2 293T ląstelėse

Visas dydis

CIAP2 skaidymui reikalinga RING dimerizacija ir E2 surišimas

Toliau apžvelgėme paties CIAP2 RING piršto vaidmenį SM sukeltai, į CIAP1 nukreiptai cIAP2 degradacijai. Šiuo tikslu mes sutelkėme dėmesį į cIAP2 RRING, kuriam trūksta RING piršto, RING dimerizacijos mutantą cIAP2 V568E ir E2 surišantį mutantą cIAP2 L585A / I590A (RF ir JS, nepaskelbtas stebėjimas). Nors LBW242 lengvai skaidė cIAP2 WT, jis nebuvo efektyvus skaidydamas cIAP2 ΔRING, cIAP2 V568E ar cIAP2 L585A / I590A (4a paveikslas). Tai rodo, kad SM sukeltam skilimui reikalinga CIAP2 RING dimerizacija ir E2 surišimas.

Image

SM nesugeba stimuliuoti cIAP2-MALT1 skilimo. a ) Laukinio tipo cIAP2, bet ne RING-piršto mutantai cIAP2 ΔRING, cIAP2 V568E ir cIAP2 L585A / I590A, yra skaidomi LBW242. cIAP2 RRING trūksta C-galinio RING-piršto domeno, tuo tarpu cIAP2 V568E ir cIAP2 L585A / I590A turi taškų mutacijas, kurios atitinkamai panaikina RING dimerizaciją ir E2 surišimą. HEK293T ląstelės buvo laikinai transfekuotos plazmidėmis, ekspresuojančiomis nurodytas konstrukcijas. Po 24 valandų ląstelės buvo paliktos neapdorotos arba inkubuotos su 1 μM LBW242. b ) Naudotų konstrukcijų schema. ( c ) HEK293T ląstelės buvo laikinai transfekuotos plazmidėmis, ekspresuojančiomis FLAG-cIAP2-MALT1 arba FLAG-cIAP2 N-Term (1–442 aminorūgštys). Eksperimentas buvo atliktas, kaip aprašyta a punkte . ( d ) cIAP2-MALT1 ekspresija skatina NF- κ B aktyvaciją, atsparią SM intervencijai. cIAP2-MALT1 buvo kartu transfekuota su NF-κB reporterio plazmidė HEK293T ląstelėse. Liuciferazės aktyvumas buvo išreikštas lyginant su negydytais kontroliniais bandiniais. Duomenys rodo trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkį, o klaidų juostos rodo trigubų SD SD

Visas dydis

CIAP2 ŽIEDO piršto praradimas dažnai būna cIAP2-MALT1. CIAP2 ir parakapazės MALT1 geno abipusė chromosomų translokacija yra labiausiai paplitusi chromosomų aberacija, susijusi su MALT limfoma (4b paveikslas). 30 cIAP2-MALT1 skatina B-ląstelių transformaciją ir limfomos progresavimą konstituciniu būdu suaktyvindamas kanoninį NF-κB signalizacijos kelią. 31 Sukeltas CIAP2-MALT1 baltymo skilimas SM junginiais gali būti terapinė strategija MALT limfomos pacientams, turintiems šią translokaciją. Įdomu tai, kad cIAP2-MALT1 nebuvo visiškai atsparus SM sukeltai degradacijai (4c paveikslas). Be to, kai buvo išreikšta tik cIAP2-MALT1 cIAP2 dalis (cIAP2 1-442 ), SM gydymas nesukėlė skilimo, atmesdamas slopinantį CIAP2-MALT1 MALT1 dalies vaidmenį (4c paveikslas). Tomis pačiomis sąlygomis viso ilgio cIAP2 buvo lengvai skaidomas (4a paveikslas ir duomenys nepateikti). Remiantis nuostata, kad cIAP2-MALT1 nėra atsparus SM sukeltam skilimui, gydymas SM nesumažino cIAP2-MALT1 gebėjimo skatinti NF-κB aktyvaciją (4d pav.). Visi šie duomenys rodo, kad cIAP2 ŽIEDO pirštas, nors ir nesugeba skatinti auto-ubiquitylation, vis dėlto yra reikalingas SM sukeltai ir cIAP1 tarpininkaujantiems CIAP2 skilimui.

CIAP1 sumažėjimas sukelia nuo NF- κB priklausomą cIAP2 geno ekspresijos indukciją vėžio ląstelėse

Stebėjimas, kad SM sukeltas CIAP2 skilimas yra neveiksmingas, nesant cIAP1, turi rimtų pasekmių, nes prognozuojama, kad SM gydymas bus nesėkmingas tokiomis sąlygomis, kai cIAP1 nėra, o CIAP2 yra išreikštas aukštu lygiu. Norėdami ištirti SM junginių efektyvumą vėžio ląstelėse, mes panaudojome HT1080 fibrosarkomos ląsteles (5a pav.). Gydant LBW242, per valandą tiek CIAP1, tiek cIAP2 buvo efektyviai suskaidyti. Tačiau po 24 val. CIAP2 lygis smarkiai padidėjo ir buvo žymiai didesnis, palyginti su kontroliniais (5a pav.), Tuo tarpu cIAP1 lygis liko neaptinkamas. Ląstelių pakartotinis iššūkis SM po pirminio apdorojimo nesukėlė cIAP2 skilimo per 24 val., Atmetant galimybę, kad junginys vėliau taps neefektyvus (5a pav.). Atrodo, kad SM sukeltas cIAP2 reguliavimas yra įprastas reiškinys, nes tai pastebima ir keliose kitose vėžio ląstelių linijose, tokiose kaip MDA-MB-231 (krūties vėžys), A2058 ir Me4405 (melanoma) (5b ir c paveikslai).

Image

Gydymas SM sukelia cIAP2 padidėjusį reguliavimą NF-KB aktyvinant nekanoniškai. ( A - c ) cIAP2 baltymo lygis padidėja po ilgo gydymo SM. ( a ) HT1080 ląstelės buvo inkubuotos su 1 μM LBW242 arba 100 nM komp. A nurodytais laiko taškais. Likus valandai iki derliaus nuėmimo ir ląstelių lizavimo, nurodytose juostose (LBW242 juostoje ir Comp. A juostoje) buvo įpilta (pakartotinai užduoties) šviežių SM junginių. ( b ) MDA-MB-231 ląstelės buvo apdorotos 1 μM LBW242 arba 100 nM junginio. A nurodytais laiko taškais. ( c ) Me4405 ir A2058 ląstelės 16 valandų buvo apdorotos 100 nM junginio. A. ( d ) Ląstelės buvo transfekuotos nurodytomis siRNR oligomis, surinktos ir lizuotos praėjus 2 dienoms po transfekcijos. ( e ) cIAP2 mRNR lygis padidėja, kai sumažėja cIAP1. BE ląstelės buvo transfekuotos nurodytomis siRNR oligomis ir išanalizuotos po 48 valandų, naudojant kiekybinę RT-PGR. ( f ir g ) SM gydymas ir siRNR sąlygotas cIAP1 ir TRAF2 išeikvojimas suaktyvina nekanoninius NF κ B signalus ir indukuoja cIAP2 geno ekspresiją BE ląstelėse. Ląstelės, stabiliai ekspresuojančios luciferazės reporterį, kontroliuojamos cIAP2 promotoriaus ( cIAP2-Luc ), buvo transfekuotos nurodytomis siRNR oligomis ir išanalizuotos dėl luciferazės aktyvumo praėjus 48 val. ( h ) SM gydymo rezultatas - NIK-NB priklausanti NF-KB aktyvacija. HT1080 ląstelės, stabiliai ekspresuojančios NF-KB B luciferazės reporterį, buvo transfekuotos nurodytomis siRNR oligomis ir 48 valandas vėliau buvo ištirtos dėl luciferazės aktyvumo. ( i ir j ) SM- ir TNF α- tarpininkaujama CIAP2 ekspresijos indukcija priklauso nuo NF-κB. ( i ) HT1080 ir HT1080 I κ B-SR ląstelės, kurios ekspresuoja neskaidomą I κ B formą, buvo transfekuotos CIAP2-Luc reporterio plazmidėje ir paliktos neapdorotos arba apdorotos nurodytais deriniais. j ) SM mediacijos sukelto cIAP2 indukcijos slopinimas sukelia padidėjusį NIK lygį. HT1080 ir HT1080 I κB -SR ląstelės nebuvo apdorotos arba 16 valandų buvo apdorotos 1 μM LBW242.

Visas dydis

CIAP2 indukcija įvyko ne tik po gydymo SM, bet ir reaguojant į RNAi tarpininkaujamą cIAP1 numušimą (5d ir e paveikslai). Be to, tai taip pat sukėlė cIAP2-liferiferazės ( cIAP2-Luc ) reporterio geno (5f pav.), Kuriame yra CIAP2 promotoriaus srities NF- κB rišančios vietos, ekspresiją . 32 Panašiai TRAF2 numušimas paskatino ir CIAP2-Luc reporterio ekspresiją. Transkripcinė CIAP2 indukcija priklausė nuo nekanoninio NF- κB kelio, nes tuo pačiu metu NIK nuslopino CIAP2 geno ekspresijos indukciją (5f pav.). Tomis pačiomis sąlygomis RIP1 sustabdymas neturėjo jokios įtakos. Kaip ir RNAi sąlygotas cIAP1 išeikvojimas, SM sukeltas cIAP1 skilimas taip pat sukėlė nekanoninių NF-κB signalų aktyvavimą BE ir HT1080 ląstelėse (5g ir h pav., Išsamią informaciją rasite skyriuje „Medžiagos ir metodai“). LBW242 tarpininkaujama cIAP2 ekspresijos indukcija buvo aiškiai NF-κB priklausoma, nes I κ B-SR slopino cIAP2-Luc reporterio aktyvumą (5i pav. Ir papildoma S1 pav.) Ir cIAP2 baltymo ekspresiją (5j paveikslas). Sutikdami su nuostata, kad CIAP2 ekspresiją kontroliuoja NF-κB transkripcija, 33 stebėjome stiprią CIAP2-Luc reporterio ir cIAP2 baltymo ekspresijos indukciją, gydant TNF α ir LIGHT ar NIK ekspresija (5i paveikslas ir papildomas paveikslas). S1 ir S4 paveikslai), taip pat LBW242 apdorojimas (5j paveikslas). Šie duomenys atitinka ankstesnes ataskaitas, rodančias, kad cIAP1 praradimas sukelia nekanoninio NF-κB kelio 11, 12, 14, 17 ektopinį aktyvavimą, o tai savo ruožtu sukelia cIAP2 padidėjusį reguliavimą. Įdomu tai, kad nors dėl CIAP1 praradimo SM gydymas sąlygoja nedidelį NIK baltymų lygio stabilizavimąsi HT1080 WT ląstelėse, NIK lygis yra žymiai didesnis SM apdorotose HT1080 I κ B-SR ląstelėse, kurios negali indukuoti cIAP2 (5j paveikslas). Tai atitinka nuostatą, kad cIAP2 veikia kaip NIK E3 ligazė, nukreipdama NIK į skilimą net nesant cIAP1. Be to, šie duomenys taip pat rodo, kad cIAP2 indukcija veikia kaip neigiamas grįžtamojo ryšio mechanizmas, slopinantis nekanoninius NF-κB signalus per degraduojantį NIK.

SM sukeltas cIAP2 reguliavimas slopina TNF α žudymą

Kadangi cIAP1 sumažėjimas lemia kompensacinį cIAP2 reguliavimą, mes išbandėme, ar cIAP2 gali modifikuoti jautrumą TNF α sukeltai ląstelių mirčiai. Pirmiausia mes ištyrėme cIAP2 gebėjimą slopinti TNF α sukeltą ląstelių mirtį nepriklausomai nuo cIAP1. Iš tikrųjų, kai buvo atkurta cIAP1 / 2 DKO MEF, sukelta cIAP2 ekspresija, šios ląstelės buvo visiškai apsaugotos nuo citotoksinio TNF α poveikio (6a ir b pav.). Be to, nors koordinuotas cIAP1 ir cIAP2 numalšinimas BE storosios žarnos vėžio ląstelėse paveikė TNF α , RNAi atsparaus cIAP2 gelbėjimo konstrukto ekspresija užtikrino reikšmingą apsaugą nuo TNF α žudymo (6c paveikslas).

Image

CIAP2 indukcija suteikia atsparumą SM sukeltai TNF α žudymui vėžio ląstelėse. ( a ir b ) indukuota cIAP2 ekspresija apsaugo ląsteles nuo TNF α tarpininkaujamų ląstelių žūties, nesant cIAP1. a ) Šviesūs mikrografai, rodantys bendrą DKO i – cIAP2 MEF, apdorotų nurodytais deriniais, morfologiją. b ) Klonogeninio išgyvenimo tyrimas. Ląstelės buvo vizualizuotos, naudojant krištolo violetinę. c ) BE ląstelės, stabiliai ekspresuojančios arba kontrolinę plazmidę, arba siRNR atsparų cIAP2 (cIAP2resc), buvo transfekuotos nurodytomis siRNR oligomis. Po 48 valandų ląstelės nebuvo gydomos arba 18 valandų buvo apdorojamos TNF α . Ląstelių mirtis buvo ištirta naudojant „Cell Death ELISA“ („Roche Applied Science“, Penzburgas, Vokietija) (matuojant suskaidytų DNR ir histono kompleksų (nukleosomų) kiekį citoplazmoje; kairysis skydelis). cNAP2 ekspresija RNAi atspariame gelbėjimo konstrukte buvo ištirta tiriant imunofiltinus lizatus anti-cIAP2 antikūnais (dešinė panelė, 2 juosta). ( d ir e ) RNAi tarpininkaujamas CIAP2 sunaikinimas padidina jautrumą TNF α žudymui po gydymo SM. HT1080 ląstelės, stabiliai ekspresuojančios arba kontrolinę shRNR, arba shcIAP2, buvo arba neapdorotos, arba 16 valandų apdorotos SM. ( d ) CIAP2 ekspresija buvo analizuojama implantų tyrimais. e ) HT1080 shControl ir HT1080 shcIAP2 ląstelių mirties ELISA tyrimas nurodytais deriniais. ( f ir g ) cIAP1 / 2 DKO MEF yra žymiai jautresni TNF α nei atskirai cIAP1 - / - MEF. Nurodyti MEF buvo paveikti TNF α , o kaspazės aktyvumas ir apoptozė buvo nustatyti naudojant DEVDase testus ( f ) ir ląstelių mirties ELISA ( g ).

Visas dydis

Nors kelios vėžio ląstelių linijos yra jautrios SM, dauguma vėžio ląstelių linijų, tokių kaip HT1080 ir BE ląstelės, yra atsparios. Tokios „SM atsparios ląstelės“ išlieka gyvos, nes nesugeba sukurti autokrininės TNF α . Tačiau aprūpintos egzogeniniu TNF α , šios ląstelės taip pat greitai pasidaro TNF-R1 tarpininkaujamai apoptozei. Remdamiesi nuostata, kad indukuota cIAP2 ekspresija apsaugo nuo mirtino TNF α poveikio, nustatėme, kad RNAi sąlygotas cIAP2 numušimas (6d pav.) Padidino jautrumą TNF α žudymui po gydymo SM (6e pav. Ir papildomas S5 pav.). Tai atitinka ankstesnę ataskaitą, įrodančią, kad cIAP2 suteikia atsparumą SM gydymui. 19 Be to, cIAP1 / 2 DKO MEF buvo žymiai jautresni TNF α nei atskirai cIAP1 - / - MEF (6f ir g paveikslai). Visi šie duomenys rodo, kad cIAP2 ekspresija nėra atspari SM skaidymui, jei nėra cIAP1, ir kad indukuota cIAP2 ekspresija gali apsaugoti nuo mirtino TNF α poveikio.

Diskusija

Suvokimas, kad IAP šeimos nariai dažnai yra panaikinami dėl vėžio ir prisideda prie chemorezistencijos bei gydymo nesėkmės 34, paskatino vėl domėtis mažų farmakologinių IAP inhibitorių kūrimu. Atsižvelgiant į požiūrį, kad skirtingų tipų vėžio ląstelės yra priklausomos nuo IAP dėl išgyvenimo, IAP inaktyvinimas, ypač kai jis derinamas su kitais gydymo būdais, lemia daugelio navikinių ląstelių mirtį. 11, 12, 17, 35, 36, 37 Tačiau pagrindinė vėžio gydymo problema yra navikų, jautrių tam tikram gydymui, nustatymas. Be to, atsparumo vystymasis yra pagrindinis iššūkis kovojant su vėžiu. Taigi, norint tinkamai pasirinkti tikslinius pacientus ir apriboti atsparumo išsivystymo tikimybę, būtina geriau suprasti mechanizmus, kuriais SM junginiai veikia.

Šiame tyrime mes atkreipėme dėmesį į molekulinį mechanizmą, per kurį SM daro savo IAP slopinantį aktyvumą. Keista, bet mes pastebime, kad SM sukeltas cIAP1 ir cIAP2 skaidymas priklauso nuo TRAF2 jungimosi. Nors TRAF2 yra būtinas CIAP skilimui ir turi RING-piršto domeną, jis nefunkcionuoja kaip C3P E3 ligazė. Tai akivaizdu, nes TRAF2 RING-piršto sritis yra nepakeičiama SM sukeltai cIAP1 skaidymui. Ši sąvoka taip pat atitinka naujausius struktūrinius tyrimus, rodančius, kad TRAF2 ŽIEDAS neaktyvus, nes jame nėra pagrindinių liekanų, reikalingų E2 surišimui. 38 Be to, nors norint suaktyvinti TNF α tarpininkaujantį NF-κB reikia TRAF2 / TRAF5, jų RING pirštai, taigi ir jų aktyvumas kaip E3 liga, yra nepakeičiami. 20 Therefore, TRAF2 merely seems to fulfil a scaffolding function supporting the E3 ligase activity of cIAPs.

Recent evidence has indicated that SMs stimulate dimerisation of the RING domains of cIAPs, which in turn is required to promote discharging of Ub from the nascent E2. 26 Therefore, TRAF2 is likely to function as a binding platform that facilitates dimerisation of the RING domains of cIAPs. Intriguingly, structural and biochemical studies indicate that a single cIAP1 molecule binds the trimeric TRAF2 coiled-coil domain. 39, 40 As only one IAP molecule binds to each TRAF2 trimer, one is left speculating how cIAP1 RING dimer formation is actually achieved. One possible scenario is that in vivo TRAFs form higher-order oligomers.

Although degradation of cIAP1 depends on TRAF2, degradation of cIAP2 requires both TRAF2 and cIAP1. In the absence of cIAP1 or TRAF2, cIAP2 is no longer depleted by SM treatment. Although cIAP2 promotes ubiquitylation of RIP1 and NIK in the absence of cIAP1 (Figures 3d–f), it seems to be unable to target itself for degradation. Interestingly, cIAP2's own RING finger is essential for SM-induced degradation of cIAP2. The requirement of cIAP2's own RING finger suggests a model in which the RING finger of cIAP2 heterodimerises with the one of cIAP1 to promote ubiquitylation of cIAP2.

The observation that SM-induced degradation of cIAP2 requires cIAP1 has significant implications as it predicts that SM treatment will be less effective in cancers that lack cIAP1 and express high levels of cIAP2. Importantly, loss of cIAP1 not only removes the E3 ligase for cIAP2 but also results in deregulated activation of non-canonical NF- κ B signalling, which in turn leads to induction of cIAP2 gene expression. The NF- κ B-dependent increase in the levels of cIAP2 protein decreases the sensitivity of cancer cells to SM and TNF α -induced apoptosis. 19 Consistent with the notion that cIAP2 protects from the lethal effects of TNF α , depletion of cIAP2 renders cancer cells more susceptible to treatment with TNF α and SM. Similarly, cIAP1/2 DKO MEFs are also significantly more sensitive to TNF α than singly cIAP1 −/− MEFs.

Induced expression of cIAP2 seems to protect cells from the lethal effects of TNF α by two distinct mechanisms: First, after TNF-R1 engagement, it promotes the ubiquitylation of components of complex-I, such as RIP1, thereby limiting the formation of a secondary, RIP1-dependent death-inducing complex. Second, cIAP2 also seems to protect cells by targeting NIK for degradation. This decreases the constitutive activation of non-canonical NF- κ B signalling that drives the production of autocrine TNF α .

The identification of potential mechanisms through which cancer cells can resist SM treatment will not only help to choose patient populations that will respond to the SM but also device better treatment combinations that boost treatment sensitivity. As cIAP2 gene induction critically depends on NF- κ B signalling, combined treatments of SM and IKK inhibitors, which block activation of NF- κ B activation, are promising avenues that are expected to dramatically improve treatment outcome and patient survival.

Nuorodos

  1. 1.

    Chen DJ, Huerta S . Smac mimetics as new cancer therapeutics. Anticancer Drugs 2009; 20 : 646–658.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  2. 2.

    Vaux DL, Silke J . Mammalian mitochondrial IAP binding proteins. Biochem Biophys Res Commun 2003; 304 : 499–504.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  3. 3.

    Cossu F, Mastrangelo E, Milani M, Sorrentino G, Lecis D, Delia D et al . Designing Smac-mimetics as antagonists of XIAP, cIAP1, and cIAP2. Biochem Biophys Res Commun 2009; 378 : 162–167.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  4. 4.

    Yang YL, Li XM . The IAP family: endogenous caspase inhibitors with multiple biological activities. Cell Res 2000; 10 : 169–177.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  5. 5.

    Gyrd-Hansen M, Darding M, Miasari M, Santoro MM, Zender L, Xue W et al . IAPs contain an evolutionarily conserved ubiquitin-binding domain that regulates NF- ∣ [kappa] ∣ B as well as cell survival and oncogenesis. Nat Cell Biol 2008; 10 : 1309–1317.

      • „Google Scholar“
  6. 6.

    Blankenship JW, Varfolomeev E, Goncharov T, Fedorova AV, Kirkpatrick DS, Izrael-Tomasevic A et al . Ubiquitin binding modulates IAP antagonist-stimulated proteasomal degradation of c-IAP1 and c-IAP2(1). Biochem J 2009; 417 : 149–160.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  7. 7

    Pop C, Salvesen GS . Human caspases: activation, specificity, and regulation. J Biol Chem 2009; 284 : 21777–21781.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  8. 8.

    Vallabhapurapu S, Matsuzawa A, Zhang W, Tseng PH, Keats JJ, Wang H et al . Nonredundant and complementary functions of TRAF2 and TRAF3 in a ubiquitination cascade that activates NIK-dependent alternative NF-kappaB signaling. Nat Immunol 2008; 9 : 1364–1370.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  9. 9.

    Bertrand M, Milutinovic S, Dickson K, Ho W, Boudreault A, Durkin J et al . cIAP1 and cIAP2 facilitate cancer cell survival by functioning as E3 ligases that promote RIP1 ubiquitination. Mol Cell 2008; 30 : 689–700.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  10. 10.

    Varfolomeev E, Goncharov T, Fedorova AV, Dynek JN, Zobel K, Deshayes K et al . c-IAP1 and c-IAP2 are critical mediators of tumor necrosis factor alpha (TNFalpha)-induced NF-kappaB activation. J Biol Chem 2008; 283 : 24295–24299.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  11. 11.

    Vince J, Wong W, Khan N, Feltham R, Chau D, Ahmed A et al . IAP antagonists target cIAP1 to induce TNFalpha-dependent apoptosis. Cell 2007; 131 : 682–693.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  12. 12.

    Varfolomeev E, Blankenship J, Wayson S, Fedorova A, Kayagaki N, Garg P et al . IAP antagonists induce autoubiquitination of c-IAPs, NF-kappaB Activation, and TNFalpha-dependent apoptosis. Cell 2007; 131 : 669–681.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  13. 13.

    Mahoney D, Cheung H, Mrad R, Plenchette S, Simard C, Enwere E et al . Both cIAP1 and cIAP2 regulate TNF{alpha}-mediated NF-{kappa}B activation. Proc Natl Acad Sci USA 2008; 105 : 11778–11783.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  14. 14

    Gaither A, Porter D, Yao Y, Borawski J, Yang G, Donovan J et al . A Smac mimetic rescue screen reveals roles for inhibitor of apoptosis proteins in tumor necrosis factor-alpha signaling. Cancer Res 2007; 67 : 11493–11498.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  15. 15.

    Bonizzi G, Karin M . The two NF-kappaB activation pathways and their role in innate and adaptive immunity. Trends Immunol 2004; 25 : 280–288.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  16. 16.

    Bianchi K, Meier P . A tangled web of ubiquitin chains: breaking news in TNF-R1 signaling. Mol Cell 2009; 36 : 736–742.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  17. 17.

    Petersen S, Wang L, Yalcin-Chin A, Li L, Peyton M, Minna J et al . Autocrine TNFalpha signaling renders human cancer cells susceptible to Smac-mimetic-induced apoptosis. Cancer Cell 2007; 12 : 445–456.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  18. 18.

    Wong W, Gentle I, Nachbur U, Anderton H, Vaux D, Silke J . RIPK1 is not essential for TNFR1-induced activation of NF-kappaB. Cell Death Differ 2009; 17 : 482–487.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  19. 19.

    Petersen SL, Peyton M, Minna JD, Wang X . Overcoming cancer cell resistance to Smac mimetic induced apoptosis by modulating cIAP-2 expression. Proc Natl Acad Sci USA 2010; 107 : 11936–11941.

      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  20. 20.

    Vince J, Pantaki D, Feltham R, Mace P, Cordier S, Schmuckle A et al . TRAF2 must bind to cIAPs for TNF to efficiently activate NF-{kappa}B and to prevent TNF-induced apoptosis. J Biol Chem 2009; 284 : 35906–35915.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  21. 21.

    Samuel T, Welsh K, Lober T, Togo S, Zapata J, Reed J . Distinct BIR domains of cIAP1 mediate binding to and ubiquitination of tumor necrosis factor receptor-associated factor 2 and second mitochondrial activator of caspases. J Biol Chem 2006; 281 : 1080–1090.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  22. 22.

    Varfolomeev E, Wayson SM, Dixit VM, Fairbrother WJ, Vucic D . The inhibitor of apoptosis protein fusion c-IAP2.MALT1 stimulates NF-kappaB activation independently of TRAF1 AND TRAF2. J Biol Chem 2006; 281 : 29022–29029.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  23. 23

    Zarnegar BJ, Wang Y, Mahoney DJ, Dempsey PW, Cheung HH, He J et al . Noncanonical NF-kappaB activation requires coordinated assembly of a regulatory complex of the adaptors cIAP1, cIAP2, TRAF2 and TRAF3 and the kinase NIK. Nat Immunol 2008; 9 : 1371–1378.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  24. 24

    Grech AP, Amesbury M, Chan T, Gardam S, Basten A, Brink R . TRAF2 differentially regulates the canonical and noncanonical pathways of NF-kappaB activation in mature B cells. Immunity 2004; 21 : 629–642.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  25. 25

    Gardam S, Sierro F, Basten A, Mackay F, Brink R . TRAF2 and TRAF3 signal adapters act cooperatively to control the maturation and survival signals delivered to B cells by the BAFF receptor. Immunity 2008; 28 : 391–401.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  26. 26

    Feltham R, Moulin M, Vince JE, Mace PD, Wong WW, Anderton H et al . Tumor necrosis factor (TNF) signaling, but not TWEAK (TNF-like weak inducer of apoptosis)-triggered cIAP1 (cellular inhibitor of apoptosis protein 1) degradation, requires cIAP1 RING dimerization and E2 binding. J Biol Chem 2010; 285 : 17525–17536.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  27. 27

    Mace P, Linke K, Feltham R, Schumacher F, Smith C, Vaux D et al . Structures of the cIAP2 ring domain reveal conformational changes associated with E2 recruitment. J Biol Chem 2008; 283 : 31633–31640.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  28. 28.

    Conze D, Albert L, Ferrick D, Goeddel D, Yeh W, Mak T et al . Posttranscriptional downregulation of c-IAP2 by the ubiquitin protein ligase c-IAP1 in vivo . Mol Cell Biol 2005; 25 : 3348–3356.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  29. 29

    Wang L, Du F, Wang X . TNF-alpha induces two distinct caspase-8 activation pathways. Cell 2008; 133 : 693–703.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  30. 30.

    Isaacson PG, Du MQ . Gastrointestinal lymphoma: where morphology meets molecular biology. J Pathol 2005; 205 : 255–274.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  31. 31

    Zhou H, Du MQ, Dixit VM . Constitutive NF-kappaB activation by the t(11;18)(q21;q21) product in MALT lymphoma is linked to deregulated ubiquitin ligase activity. Cancer Cell 2005; 7 : 425–431.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  32. 32.

    Hong SY, Yoon WH, Park JH, Kang SG, Ahn JH, Lee TH . Involvement of two NF-kappa B binding elements in tumor necrosis factor alpha-, CD40-, and Epstein-Barr virus latent membrane protein 1-mediated induction of the cellular inhibitor of apoptosis protein 2 gene. J Biol Chem 2000; 275 : 18022–18028.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  33. 33.

    Wang CY, Mayo M, Korneluk R, Goeddel D, Baldwin A . NF-B antiapoptosis: induction of TRAF1 and TRAF2 and c-IAP1 and c-IAP2 to suppress caspase-8 activation. Science 1998; 281 : 1680.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  34. 34.

    Hunter AM, LaCasse EC, Korneluk RG . The inhibitors of apoptosis (IAPs) as cancer targets. Apoptosis 2007; 12 : 1543–1568.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  35. 35.

    McManus DC, Lefebvre CA, Cherton-Horvat G, St-Jean M, Kandimalla ER, Agrawal S et al . Loss of XIAP protein expression by RNAi and antisense approaches sensitizes cancer cells to functionally diverse chemotherapeutics. Oncogene 2004; 23 : 8105–8117.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  36. 36.

    Hu Y, Cherton-Horvat G, Dragowska V, Baird S, Korneluk RG, Durkin JP et al . Antisense oligonucleotides targeting XIAP induce apoptosis and enhance chemotherapeutic activity against human lung cancer cells in vitro and in vivo . Clin Cancer Res 2003; 9 : 2826–2836.

      • CAS
      • PubMed
      • „Google Scholar“
  37. 37.

    Shaw TJ, Lacasse EC, Durkin JP, Vanderhyden BC . Downregulation of XIAP expression in ovarian cancer cells induces cell death in vitro and in vivo . Int J Cancer 2008; 122 : 1430–1434.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  38. 38.

    Yin Q, Lamothe B, Darnay B, Wu H . Structural basis for lack of E2 interaction in the RING of TRAF2. Biochemistry 2009; 48 : 10558–10567.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  39. 39.

    Zheng C, Kabaleeswaran V, Wang Y, Cheng G, Wu H . Crystal structures of the TRAF2: cIAP2 and the TRAF1: TRAF2: cIAP2 complexes: affinity, specificity, and regulation. Mol Cell 2010; 38 : 101–113.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  40. 40.

    Mace PD, Smits C, Vaux DL, Silke J, Day CL . Asymmetric recruitment of cIAPs by TRAF2. J Mol Biol 2010; 400 : 8–15.

      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“
  41. 41.

    Hosokawa Y, Suzuki H, Nakagawa M, Lee TH, Seto M . API2-MALT1 fusion protein induces transcriptional activation of the API2 gene through NF-kappaB binding elements: evidence for a positive feed-back loop pathway resulting in unremitting NF-kappaB activation. Biochem Biophys Res Commun 2005; 334 : 51–60.

      • CAS
      • PubMed
      • Straipsnis
      • „Google Scholar“

Atsisiųskite nuorodas

Padėkos

We thank the members of the Apoptosis Lab for support and critical reading of this manuscript. We are indebted to Leigh Zawel and Novartis for LBW242 and TetraLogic for Comp. A and Comp. C. Furthermore, we also thank Xiaodong Wang for the biotinylated SM, Olivier Micheau for the HT1080 I κ B−SR cells and Lee Tae for the pGL2-1400 construct. We acknowledge NHS funding to the NIHR Biomedical Research Centre.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

  3. 3.

    Papildomas S3 paveikslas

  4. 4.

    Papildomas S4 paveikslas

  5. 5.

    Papildomas S5 paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos figūros legendos

Žodynas

SM

Smac mimetic

IAP

apoptozės baltymo inhibitorius

BIR

Baculoviral IAP repeat

RING

Really Interesting New Gene

TNF α

tumour necrosis factor- α

NIK

NF- κ B inducing kinase

TRAF

TNF receptor-associated factor

RIP1

receptor-interacting protein 1

MALT

mucosa-associated lymphoid tissue

MEF

mouse embryonic fibroblast

DKO

double knockout

Ub

ubiquitin

Papildoma informacija pridedama prie dokumento apie ląstelių mirtį ir diferenciaciją svetainėje (//www.nature.com/cdd)