Pagrindinio depresinio sutrikimo molekuliniai tyrimai: epigenetinė perspektyva | molekulinė psichiatrija

Pagrindinio depresinio sutrikimo molekuliniai tyrimai: epigenetinė perspektyva | molekulinė psichiatrija

Anonim

Anotacija

Pagrindinis depresinis sutrikimas (MDD) yra dažnas ir labai nevienalytis psichinis sutrikimas, apimantis simptomų spektrą, apimantį įvairių pažinimo, psichomotorinių ir emocinių procesų trūkumus. Kaip ir daugumos psichinių fenotipų etiologinių tyrimų norma, ypatingas dėmesys skiriamas genetinių ir aplinkos veiksnių sąveikai. Tačiau yra keletas su MDD susijusių epidemiologinių, klinikinių ir molekulinių ypatumų, kuriuos sunku paaiškinti naudojant tradicinius geno ir aplinkos principus. Mūsų tikslas šiame tyrime yra parodyti tradicinių „DNR + aplinkos“ ir „DNR × aplinkos“ etiologinių paradigmų pranašumą. Epigenetiniai veiksniai - paveldimos ir įgytos DNR ir histonų modifikacijos, reguliuojančios įvairias genomines funkcijas, vykstančias nekeičiant branduolinės DNR sekos, - suteikia naujų įžvalgų apie daugelį nemendelinių pagrindinės depresijos ypatybių ir pateikia tiesioginį mechanistinį kelią, per kurį aplinka gali sąveikauti su genomu. Epigenetikos tyrimas, ypač esant sudėtingoms ligoms, yra palyginti nauja tyrimų sritis, o optimalūs laboratoriniai metodai ir analizės metodai vis dar yra kuriami. Taigi, įtraukiant epigenetinius tyrimus į MDD etiologinius tyrimus, kyla nemažai metodinių ir aiškinamųjų iššūkių, kuriuos reikia išspręsti. Nepaisant šių sunkumų, DNR metilinimo ir histono modifikacijų tyrimas gali pakeisti mūsų supratimą apie sudėtingų ligų molekulinę etiologiją.

Įvadas

Pagrindinis depresinis sutrikimas (MDD) yra apibūdinamas kaip depresinės nuotaikos epizodai, trunkantys ilgiau nei 2 savaites, kartu su papildomais simptomais, įskaitant sutrikusį miegą ir apetitą, susilpnėjusią koncentraciją ir energiją, per didelę kaltę, sulėtintus judesius ir mintis apie savižudybę. 1 Depresija yra labai dažnas sutrikimas, užimantis antrą vietą pagal pasaulinę ligos naštą 2, o bendra MDD rizika visą gyvenimą yra 16, 2% tarp visų JAV gyventojų. 3 Socialinės ir ekonominės depresijos pasekmės yra didžiulės, užtemdamos daugelio kitų psichinių ir somatinių ligų padarinius, todėl visame pasaulyje finansavimo agentūros investavo milžiniškas pinigų sumas į etiologinius tyrimus.

Kaip ir daugumos psichinių fenotipų etiologinių tyrimų norma, ypatingas dėmesys skiriamas genetinių ir aplinkos veiksnių sąveikai. Tačiau naudojant šias tradicines tyrimų paradigmas, MDD neurobiologijos supratimas buvo lėtas. Mes esame šiek tiek nutolę nuo savo pagrindinio tikslo - atskleisti aiškius rizikos veiksnius, kurie gali padėti diagnozuojant, užkertant kelią ir gydant didelę depresiją. Pirmieji depresijos genetikos tyrimai buvo pradėti prieš daugiau nei 30 metų. 4, 5, 6, 7, 8 Nuo to laiko ne kartą buvo įrodyta, kad afektiniai sutrikimai pasireiškia šeimose. Tam tikri genų polimorfizmai ir aplinkos veiksniai sukelia didesnį jautrumą. Nepaisant reikšmingos pažangos suprantant galimas MDD priežastis, mes vis dar šiek tiek stengiamės nustatyti įrodytą etiologinę depresijos riziką ir suprasti jų veiksmų mechanizmus .

Šiuolaikinės teorijos apie depresijos priežastis paprastai atskiria paveldimus biologinius veiksnius nuo pavojingo aplinkos poveikio. Bendra prielaida yra ta, kad „genai“, tai yra, DNR sekos variantai, ir „aplinka“ yra vieninteliai veiksniai, įtakojantys jautrumą, ir kad viskas, ko nesukelia pirmasis, turi priklausyti antrajam. Tik visai neseniai tyrėjai pradėjo atsitraukti nuo šių tradicinių etiologinių modelių ir peržvelgti paprasto priedų genetinio ir aplinkos poveikio vaidmenį. Kohortos tyrimais buvo pradėta spręsti problema, kodėl tik tam tikri asmenys - tam tikrų specifinių genetinių variantų nešiotojai -, veikiami numanomos rizikos aplinkos, iš tikrųjų išsivysto depresija, rasdami įrodymų apie sąveiką tarp konkrečių aplinkos veiksnių ir genotipo. 9

Iš tikrųjų yra daug klinikinių ir epidemiologinių ypatumų, susijusių su didžiausia depresija, kuriuos sunku paaiškinti - ne tik atsižvelgiant į tradicinius genetinius ir aplinkos metodus, bet ir dėl genų bei aplinkos sąveikos. Jei svarbūs branduolinės DNR sekos pokyčiai ir sąlytis su tam tikra „rizikinga aplinka“, kodėl tiek daug vienodų dvynukų vienodai augina depresijos simptomus? Kodėl MDD paplitimas moterims yra maždaug dvigubai didesnis nei vyrų po brendimo? Kodėl depresija seka tokia ryškia moterų vystymosi trajektorija, kai po brendimo staigiai padidėja paplitimas? Kodėl kai kurie genai padidina pagrindinės depresijos riziką tik tuo atveju, jei jie paveldėti iš vieno iš tėvų, bet ne iš kito?

Mūsų tikslas šiame tyrime yra parodyti privalumų, žvelgiant ne tik į įprastas „DNR + aplinka“ ir „DNR × aplinka“ etiologines paradigmas, dominuojančias MDD tyrimuose. Trumpai apžvelgiame dabartinę tradicinių MDD molekulinių genetinių ir aplinkos tyrimų būklę ir parodome, kad (1) gali būti neįmanoma tiksliai įvertinti abiejų genų ar aplinkos santykinio indėlio MDD; 2) riba tarp genetinių ir aplinkos veiksnių nėra tokia aiški, kaip plačiai tikima, o aplinka iš tikrųjų gali būti sudėtingesnio reiškinių, turinčių reikšmingą paveldėtą komponentą, rinkinys; (3) paveldimas biologinis MDD jautrumo komponentas gali apimti daug daugiau nei paprastą DNR sekos variaciją; ir (4) epigenetiniai veiksniai, ty paveldimi ir įgyti mechanizmai, reguliuojantys genų funkciją, vykstantys nekeičiant branduolinės DNR sekos, gali suteikti naujų įžvalgų apie daugelį ne Mendelio MDD požymių, įskaitant identiškų dvynių, lyties ir tėvų kilmės padarinius, taip pat kai kuriuos prieštaringus tradicinių genetinių tyrimų duomenis (žr. 1 lentelę). Mūsų nuomone, sutelkiant dėmesį tik į „genomo“ seką ir „aplinkos“ poveikį, trečiojo etiologinio poveikio rinkinio, būtent tų, kurie veikia „epigenomą“, svarba iš esmės buvo pamiršta.

Pilno dydžio lentelė

Genai ir aplinka: tradicinio tyrimo metodo apribojimai

Genetika ir MDD: progresas, tačiau nustatyta mažai įtikinamų rizikos lokusų

Aišku, kad MDD agregatai šeimose ir kiekybinių genetinių tyrimų metaanalizė rodo santykinę 2, 84 riziką paveikto broliuko pirmo laipsnio artimiesiems. 10 Įprastinių dvynių analizių buvo padaryta išvada, kad didelę dalį šios šeimos sankaupų lemia paveldėti veiksniai. Pavyzdžiui, neseniai atliktoje penkių dvynių tyrimų metaanalizėje padaryta išvada, kad depresijos paveldimumas yra 37%, 10 - sunkios, pasikartojančios ir ankstyvos formos sutrikimo formos, įrodančios padidėjusį genetinį indėlį. Kitas būdas nušlifuoti genetinių ir aplinkos veiksnių įtaką MDD etiologijai yra ištirti depresijos paplitimą tarp MDD įvaikių biologinių ir įtėvių giminaičių, palyginti su atitinkamais nepaliestais įvaikiais. Buvo atlikti tik keli įvaikinimo tyrimai dėl depresijos ir, nors jie patiria tam tikrų metodologinių problemų, 10 jie pateikia papildomų įrodymų, patvirtinančių stiprią MDD genetinę etiologiją (pvz., Wender PH ir kt., 11 ). Nors elgesio genetiniai tyrimai paprastai rodo panašų vyrų ir moterų paveldimumą, keli autoriai nurodo žymiai didesnį moterų paveldimumą (žr., Pvz., Bierut ir kt., 12 ir Kendler ir kt., 13 ). Tai gali būti įdomus pastebėjimas, atsižvelgiant į žymiai didesnį MDD paplitimą tarp moterų. . Taip pat atkreiptinas dėmesys į didelę MDD ir kitų afektinių sutrikimų, įskaitant nerimą ir bipolinį sutrikimą, pastebėtą šeiminę gretutinę prielaidą, leidžiančią manyti, kad šios ligos gali būti etiologiškai susijusios ir galbūt turėti bendrų paveldimų rizikos veiksnių. 14

Akivaizdus paveldėtų veiksnių indėlis į MDD paskatino psichiatrinės genetikos tyrimų bendruomenės ankstyvą optimizmą, kad etiologijoje dalyvaujantys lokusai bus lengvai atpažįstami. Kaip ir tiriant kitas psichopatologijos formas, ypač šizofreniją, daug pastangų buvo skirta genetinio ryšio ir asociacijų tyrimams su viso pasaulio tyrinėtojais, kuriuos pakeitė entuziazmas, kurį sukėlė sparti Žmogaus genomo pažanga. Dešimtojo dešimtmečio pabaigos projektas. Netrukus paaiškėjo, kad nebuvo nustatyta jokio pagrindinio MDD geno, naudojant klasikinius metodus „kandidato genas“ arba „viso genomo susiejimas“, kurie dažniausiai buvo naudojami šiuose tyrimuose. Kaip ir kitų psichinių ligų atvejais, plačiai priimtoje etiologinėje doktrinoje genų vaidmuo dabar yra daug sudėtingesnis, apimantis daugybę nedidelio poveikio lokalių, sąveikaujančių tarpusavyje ir su įvairiais aplinkos patogenais. Nors, be jokios abejonės, padaryta tam tikra pažanga nustatant šiuos rizikos lokusus, mes dar turime daug ką nuveikti, kad galėtume iki galo įrodyti specifinių molekulinių veiksnių vaidmenį MDD etiologijoje.

Nepaisant paskelbtų daugybės genetinių ryšių nuskaitymo ir daugybės asociacijų tyrimų, pažanga nustatant MDD rizikos lokusus išlieka lėta. Daugybės genomo masto MDD susiejimo tyrimų rezultatai išryškino galimą jautrumo regioną, nors tarp tyrimų yra daugybė neatitikimų (išsamią apžvalgą rasite „Camp“ ir „Cannon-Albright 15“ ). Tikriausiai iki šiol išsamiausias MDD tyrimas ištyrė 110 didelių išplėstinių kilmės duomenų, susidedančių iš 1890 asmenų ir turinčių didelę šeimos depresijos istoriją, ryšį. 16 Žymeklis D12S1300 nustatė reikšmingą ryšį su pagrindine depresija (daugiataškis heterogeniškumo LOD balas 4, 6; P = 0, 00003), kuris rodo, kad egzistuoja lyties polinkis į didelę depresiją esant 12q22 –2323, 2. Tačiau kiti tyrimai, sudaryti iš mažesnių mėginių rinkinių, išryškino daugybę skirtingų chromosomų sričių, o bendras vaizdas atrodo labai sudėtingas. Trumpai tariant, visa tai, ką galima padaryti iš tyrimų pastangų, atliktų atliekant MDD ryšį, yra keletas didelių chromosomų sričių, kurių LOD balai yra santykinai žemi, tačiau rodo tam tikrą tyrimų sutapimą (pvz., 1p, 2q, 3centr, 8p, 12q, 15q ir 18q). Nors šie regionai gali būti išskaidomi ateityje atliekant padėties klonavimą, turimų duomenų apie ryšį aiškinimas yra sudėtingas dėl didelio tyrimų nevienalytiškumo, atsirandančio dėl skirtumų tarp tyrimo struktūros, imties įdarbinimo ir naudojamų analizės metodų.

Tyrimų, susijusių su MDD tyrimais, a priori kandidatų genų asociacijų tyrimai daugiausia buvo nukreipti į genus, dalyvaujančius serotoninerginėje sistemoje. Šis požiūris grindžiamas tuo, kad nemaži įrodymai rodo šios sistemos, kaip pagrindinės depresijos vystymosi, reguliavimo panaikinimą. Ypač atkreiptinas dėmesys į selektyviųjų serotonino reabsorbcijos inhibitorių (SSRI), kurie blokuoja serotonino pasisavinimą sinapsėse, veiksmingumą gydant depresiją. Tyrimai taip pat parodė didelę serotoninerginės funkcijos sutrikimą daugelyje smegenų sričių asmenims, sergantiems didžiausia depresija. 17 SLC6A4 , esantis 17q chromosomoje, koduoja serotonino pernešėją, pagrindinį SSRI taikinį, ir keliuose tyrimuose dalyvavo MDD etiologijoje. Yra pakartotinių įrodymų apie ryšį tarp SLC6A4 polimorfinių variantų ir MDD, visų pirma su trumpu pakartotinio polimorfizmo aleliu geno promotoriaus regione. Metaanalizė, apimanti kelių tūkstančių MDD sergančių pacientų duomenis, rodo, kad bendras šio polimorfizmo poveikis yra santykinai nedidelis, o bendras homozigotinių asmenų šansų santykis trumpajam aleliui yra 1, 16. 18 Paradoksalu, tačiau šis ryšys su trumpu SLC6A4 aleliu depresijoje prieštarauja tam, kas būtų galima numatyti atliekant polimorfizmo funkcinius tyrimus. Trumpas alelis paprastai susijęs su sumažėjusiu transporterio aktyvumu ir mažesne SLC6A4 ekspresija 19 - būtent SSRI, naudojamų depresijai gydyti, funkciniu poveikiu - nors naujausiame tyrime, tiriančiame alelinę ekspresiją serotonino transporterio gene, nenustatyta koreliacija tarp ekspresijos lygių ir promotoriaus polimorfizmo. . 20 Prie kitų tariamai su MDD susijusių genų priskiriami tie, kurie koduoja triptofano hidroksilazę, 21 iš smegenų išvestą neurotrofinį faktorių, 22, 23 katecholio- O- metilo transferazę, 24, fosfolipazės A2, 25, gliukokortikoidų receptorius 26 ir serotonino receptorius 1A, 27. šie radiniai vis dar laukia įtikinamo pakartojimo kituose mėginiuose (žr . neseniai pateiktą apžvalgą Levinson 28 ).

Poveikis aplinkai: nedideli tiesioginio priežastinio poveikio įrodymai

Atsižvelgiant į tai, kad MDD paveldimumo įverčiai yra daug mažesni nei 100%, dauguma kiekybinių genetikų teigė, kad ne tik genetiniai veiksniai, bet ir aplinkos veiksniai gali būti svarbūs sutrikimo etiologijoje. 10 Iš tikrųjų yra netiesioginių įrodymų, kurie sąlygoja daugelio specifinių psichosocialinių aplinkos patogenų poveikį depresijos vystymuisi. Tai apima stresą patiriančius gyvenimo įvykius, sutuoktinio ar artimojo giminaičio mirtį, užsitęsusią medicininę ligą ir sužeidimus, negalią ir funkcinį pablogėjimą bei socialinę izoliaciją. 29 Vienas MDD aplinkosaugos tyrimų tyrimas yra susijęs su faktiniu bendru aplinkos poveikiu. Pagrindinis genetinės genetinės teorijos principas teigia, kad fenotipiniai pokyčiai, nepriskiriami genetiniams veiksniams, turi būti aplinkos kilmės. Tokiu būdu, teigiama, visi fenotipiniai skirtumai, pastebėti tarp monozigotinių (MZ) dvynių, kurių visas genomas yra bendras, turi atsirasti dėl nedalomų aplinkos veiksnių. Atsižvelgiant į tai, kad proporcingai MZ suderinamumas tarp MDD yra tik 31% vyrų ir 48% MZ dvynių 30, ši teorija siūlo labai didelį nepopuliarų aplinkos indėlį į MDD etiologiją. Tačiau neseniai atlikta daugelio elgesio tyrimų, įvertinančių dvynukų ir ne dvynių seserų aplinką, ir susiejanti juos su jų vystymosi rezultatų skirtumais, apžvalga parodė, kad daugiau nei 50% fenotipinio varianto atsiranda dėl veiksnių, priskiriamų „ne - bendroji aplinka “, tikri išmatuoti aplinkos kintamieji sudaro tik labai mažą šio kintamumo dalį. 31 Be to, keliuose kituose tyrimuose daroma nuoroda į tai, kad tarp MZ dvynių pastebėti elgesio skirtumai gali būti ne tik ekologinės kilmės. Pvz., Normalūs MZ dvyniai, auginami kartu, rodo panašų ryšį su įvairiomis elgesio ypatybėmis kaip ir MZ dvyniai, auginami atskirai. 32, 33 įvaikinimo tyrimai taip pat rodo, kad auginimo aplinka gali būti antraeilė dėl paveldimų veiksnių, sukeliančių jautrumą MDD. 11 Tai tikrai pasakytina apie kitus psichinius sutrikimus, dažnai etiologiškai susijusius su depresija, kai buvo atlikti geriau kontroliuojami tyrimai - pavyzdžiui, įrodyta, kad šizofrenijos rizika nemažėja, jei vaikas, gimęs paveikto tėvo, yra auginamas sveikoje šeimoje. 34

Kita problema yra ta, kad nors tam tikri aplinkos veiksniai, tokie kaip sunki liga, skyrybos, smurtiniai nusikaltimai ir seksualinis prievartavimas, yra glaudžiai susiję su MDD, nėra aišku, ar jų veiksmai yra tiesiogiai priežastiniai. Dėl to erzinti jų poveikį, išskyrus genus, gali būti sunkiau, nei dažnai suvokiama. Įrodyta, kad pačiam individualiam aplinkos stresorių poveikiui didelę įtaką daro genetiniai veiksniai, tai yra, linkę asmenys gali pasirinkti „rizikingą“ aplinką. 35, 36 Kai kurių su MDD susijusių aplinkos veiksnių paveldimi rizikos veiksniai, ypač stresiniai gyvenimo įvykiai, iš tikrųjų yra stipriai koreliuojami su veiksniais, darančiais įtaką jautrumui pačiai depresijai 37, nurodant, kad abiejuose gali būti naudojami tie patys genai. Taigi nors stresinių gyvenimo įvykių poveikis ir depresijos vystymasis yra beveik neabejotinai susiję, tačiau galime palyginti nedaug apie šių santykių priežastį. Kitas pavyzdys yra urbanistika, „aplinkos“ veiksnys, paprastai susijęs su MDD, šizofrenija ir kitomis psichopatologijos formomis. 38 Depresijos paplitimas yra akivaizdžiai didesnis mieste gyvenantiems asmenims. Daugybė tyrimų pranešė apie tariamą ryšį tarp gyvenimo mieste ir depresijos priežasties ir pasekmės, dažnai pastebimą dėl socialinės izoliacijos, padidėjusio streso, skurdo ir sumažėjusio šios ligos vaidmens. šeimos vienetas. 39 Tačiau dabar atrodo, kad tai, kur žmonės gyvena, ne visada gali būti laikoma tikru „aplinkos“ veiksniu. Naujausi tyrimai rodo, kad tarp Australijos suaugusiųjų iš tikrųjų yra akivaizdus paveldimas įnašas į tai, kur žmonės nusprendžia gyventi. 40 Įdomu pastebėti, kad ši išvada nėra universali ir gali būti netaikoma kai kuriose tankiai apgyvendintose šalyse, tokiose kaip Nyderlandai 41, pabrėžiant etiologinių tyrimų sudėtingumą atsižvelgiant į kontekstą.

Didelė dilema, su kuria susiduria epidemiologai, tiriantys aplinkos patogenų poveikį sudėtingų sutrikimų vystymuisi, yra ta, kad labai sunku pradėti gerai suplanuotą, visiškai kontroliuojamą tyrimą. Daugybė klaidinančių kintamųjų reiškia, kad sunku ištirti konkrečius aplinkos veiksnius, ypač žmonėms. Galingiausias metodas, padedantis įvertinti aplinkos indėlį į MDD etiologiją, būtų išilginis atsitiktinių imčių tyrimų eksperimentas, kurio metu tiriamieji atsitiktinai veikiami rizikos veiksnių, o jų rezultatas stebimas, palyginti su kontrole. Dėl akivaizdžių etinių priežasčių toks požiūris nėra perspektyvus tiriant kintamuosius, tokius kaip sunkūs stresiniai gyvenimo įvykiai, todėl tvirtų empirinių įrodymų, tiesiogiai siejančių poveikį su rezultatais, nėra. Nors tyrimai su gyvūnais mums suteikė vertingos informacijos apie neurocheminį atsaką į aplinkos veiksnius, nežinoma, kokiu laipsniu šie atradimai gali būti ekstrapolioti iš laboratorinių graužikų realiems žmonėms.

Genų ir aplinkos sąveika: reikalingi priežastiniai mechanizmai

Daugelis elgsenos genetikų sutinka, kad tradicinė „gamtos“ ir „puoselėjimo“ kaip atskirų subjektų idėja yra pasenusi ir nei genai, nei aplinka negali veikti izoliuotai, kad padidintų jautrumą. Genų ir aplinkos sąveikos poveikis vis dar yra pradinėje stadijoje, o Caspi ir kt. Pranešė apie pirmuosius tiesioginius tokios sąsajos su depresijos etiologija įrodymus . 9, kurie nustatė, kad serotonino pernešėjo geno polimorfizmas reguliuoja stresinių gyvenimo įvykių poveikį jautrumui depresijai. Cituodami įrodymus, kad serotonino pernešėjas mažina biologinį atsaką į stresą patiriančius išgyvenimus, jie nustatė, kad stresą sukeliančių gyvenimo įvykių poveikis depresijai yra žymiai stipresnis asmenims, turintiems bent vieną „trumpą“ 5-HTTLPR polimorfizmo alelį dideliu, epidemiologiniu požiūriu. išsiaiškintas gimimo kohortos pavyzdys. Vėliau panašias išvadas pateikė kitos grupės (pvz., Kendler ir kt. , 42 Wilhelm ir kt., 43 ), nors abu tyrimai daugeliu atvejų skiriasi nuo pradinės Caspi ir kt. Ataskaitos . 9

Nors pranešimai apie genų ir aplinkos sąveiką suteikė naują gyvybę etiologiniams tyrimams, aiškinant šių tyrimų rezultatus reikėtų atsižvelgti į keletą svarbių įspėjimų. Pirma, atsižvelgiant į dabartinį didelį susidomėjimą genų ir aplinkos sąveikos analize ir galimą klaidingai teigiamų išvadų galimybę, turėtų būti suteikiama teisė tik kruopščiai suplanuotiems hipotezės pagrįstams tyrimams. Norint padaryti tvirtas išvadas, reikia pakartoti genų ir aplinkos sąveikos duomenis, tačiau tai padaryti bus labai sunku, atsižvelgiant į unikalų mėginių, naudojamų tiksliai nustatyti šį poveikį, pobūdį. Šiuo atžvilgiu svarbu, kad tyrimai, kuriuose pranešama apie genų ir aplinkos sąveiką, būtų tikrinami siekiant užtikrinti tinkamą mokslinį griežtumą ir vadovaujantis aiškiai apibrėžtu strategijų rinkiniu, pavyzdžiui, išdėstytu Moffitt ir kt. 44 Antra, kaip minėta pirmiau, buvo įrodyta, kad genai gali paveikti depresijos išsivystymo riziką, tarpininkaudami asmens jautrumui stresiniams gyvenimo įvykiams. Atsižvelgiant į galimą genetinį indėlį į aplinkos poveikį, yra tikėtina, kad bent jau kai kurios stebimos genų ir aplinkos sąveikos iš tikrųjų yra genų ir genų sąveikos rezultatas, o nagrinėjama aplinka yra paveldimų veiksnių pakaitalas. Kitaip tariant, aplinkos vaidmuo genų ir aplinkos sąveikoje gali būti per menkas, o išvados dėl aplinkos intervencijos strategijų gali būti per ankstyvos. Trečia, svarbu pripažinti, kad statistiniai išmatuoto geno ir išmatuotos aplinkos sąveikos įrodymai nepateikia jokių užuominų apie sąveikos molekulinius mechanizmus. Tikslus (-ų) mechanizmo (-ų), kuriuo (-iais) vykdoma genų ir aplinkos sąveika, valymas yra gyvybiškai svarbus, jei bus gauta diagnostikos, terapijos ar prevencijos naudos. Nors depresijos priežasčių nustatymo pažanga, be abejonės, buvo padidinta tiriant genų ir aplinkos sąveiką, tačiau mes tikime, kad palyginti neištyrinėta epigenetikos sritis gali suteikti naujų įžvalgų ir naujų eksperimentinių strategijų MDD molekuliniams mechanizmams atskleisti (žr. Pav. 1).

Image

MDD atsiranda dėl sąveikaujančių genetinių, aplinkos ir epigenetinių veiksnių derinio.

Visas dydis

Epigenetika: nuo pagrindinių mechanizmų iki žmogaus ligos etiologijos

Epigenetika reiškia paveldimą, bet grįžtamą įvairių genomo funkcijų, kurias daugiausia lemia DNR metilinimas ir chromatino struktūra, reguliavimą. Epigenetiniai procesai yra būtini normaliam ląstelių vystymuisi ir diferenciacijai ir leidžia reguliuoti genų funkciją ne mutageninių mechanizmų pagalba. Ypač įdomus yra citozino metilinimo reiškinys, vykstantis citozino pirimidino žiedo 5-oje vietoje CpG dinukleotiduose. Šis procesas yra neatsiejamai susijęs su genų ekspresijos reguliavimu. Daugelis genų demonstruoja atvirkštinę koreliaciją tarp metilinimo laipsnio ir ekspresijos lygio. Šių CpG vietų metilinimas, per daug atstovaujamas CpG saloms daugelio genų promotoriaus reguliavimo regionuose, sutrikdo transkripcijos veiksnių jungimąsi ir pritraukia metilius surišančius baltymus, susijusius su genų nutildymu ir chromatino sutankėjimu. Histono modifikacija, kita pagrindinė epigenetinio mechanizmo rūšis, tarpininkaujanti genų ekspresijai, veikia chromatino struktūrą histono acetilinimo, histono metilinimo ir histono fosforilinimo procesais. 47 Įdomu tai, kad šie du platūs epigenetinio mechanizmo tipai nėra vienas kito nesuderinami ir sąveikauja įvairiais būdais. Pvz., Metilą rišantis baltymas MeCP2 specifiškai jungiasi su metilintais citozinais, pritraukdamas histonų deacetilazes, kurios hipoacetiliuoja histonus. 48 Transkripciniu požiūriu kompetentingas chromatinas paprastai yra praturtintas acetiliniais histonais, tačiau transkripciniu požiūriu tylusis chromatinas paprastai yra deacetilinamas. 49

Kaip ir DNR seka, somatinių ląstelių epigenetinis profilis paveldimas iš motinos ir dukters chromatidžių mitozės metu. Skirtingai nei DNR seka, kuri yra stabili ir stipriai konservuota, epigenetiniai procesai yra labai dinamiški net ir individo viduje: jie gali būti specifiniai audiniams, vystymosi atžvilgiu reguliuojami ir indukuojami veikiant įvairiems aplinkos veiksniams. Be to, stochastiniai veiksniai yra svarbūs nustatant epigenetinę genomo aplinką. Eksperimentai, stebintys epigenetinių žymių paveldėjimą per genetiškai identiškų ląstelių kartas audinių kultūroje, parodė, kad žinduolių ląstelių metilinimo įpročių palaikymas yra gana neištikimas, o mitozės metu gana dažni metilinimo atvejai. 50 Metilinimo modelio tikslumas skiriasi genome, nes metilintuose regionuose klaidų lygis yra didesnis nei vyraujančiuose metiliniuose regionuose, ypač genomo vietose, esančiose už promotoriaus regionų ribų. 51 Apibendrinant galima pasakyti, kad nors DNR sekos demonstruoja beveik visišką tarpkloninį ištikimybę, ląstelių linijos epigenetinis profilis gali parodyti didelius kartų skirtumus. Kadangi tokie procesai, kaip DNR metilinimas, yra neatsiejami nuo to, kada ir kur išreiškiami tam tikri genai - tikslus genų ekspresijos koordinavimas yra labai svarbus teisingam bet kurio organizmo vystymuisi - šis epigenetinis metastabilumas gali turėti didžiulį poveikį. Nors organizmo DNR seka diktuoja fizinę baltymų struktūrą, epigenetiniai mechanizmai kontroliuoja genų ekspresijos kiekį, vietą ir laiką.

Tradiciškai buvo manoma, kad epigenetiniai profiliai iš naujo nustatomi ir ištrinami gametogenezės metu, taip užkertant kelią meiotiniam epigenetinės informacijos perdavimui iš kartų. Vis daugėja įrodymų, kad bent kai kurių žinduolių genų epigenetiniai ženklai meiozės metu nėra visiškai ištrinami ir todėl gali būti perduodami iš kartos į kartą. 52 Atrodo, kad toks meiotinis epigenetinių alelių perdavimas arba „minkštasis paveldimumas“ gali būti gana dažnas reiškinys daugelyje eukariotinių organizmų. Nors epigenetinio paveldėjimo procesas yra aiškiai ne toks stabilus kaip DNR sekos paveldėjimo, jis suteikia kitą, dažnai ignoruojamą, mechanizmą, per kurį informacija gali būti perduodama kartų kartoms. Tai turi akivaizdžių tradicinio požiūrio į ligos genų žemėlapius padarinių, kai, manoma, kad visi paveldėti požymiai atsiranda dėl DNR sekos pokyčių perdavimo, ir tai iš dalies gali paaiškinti, kodėl tyrėjams sunku nustatyti konkrečius priežastinius geno polimorfizmus, esant akivaizdžiai labai paveldimiems sutrikimams, pvz. MDD.

Epigenetiniai tyrimai rodo, kad normaliam genomo funkcionavimui labai svarbus genų aktyvumo reguliavimas. Genai, net ir neturintys mutacijų ar polimorfizmą sukeliančių ligų, gali būti nenaudingi ar net kenksmingi, jei tinkamu kiekiu jų neišreiškiama tinkamu ląstelių ciklo laiku arba dešiniajame branduolio skyriuje. Ląstelės normaliai veikia tik tuo atveju, jei tinkamai veikia ir DNR seka, ir epigenetiniai genomo komponentai. 46 Šiuo atžvilgiu epigenetiniai anomalijos buvo gerai apibūdintos kelioms retoms ligoms, tokioms kaip Prader – Willi, Angelman ir Beckwith – Wiedemann sindromai. Kiti sindromai, kurie, kaip manoma, turi epigenetinę etiologiją, yra šie: imunodeficitas, centromerinio regiono nestabilumas, veido anomalijų sindromas (ICF), kurį sukelia DNR – metiltransferazės 3B (DNMT3B) geno mutacijos; 55 Rett sindromas - neurologinis sutrikimas, kuris pasireiškia moterims ir kurį sukelia metilcitoziną jungiančio baltymo (MeCP2) geno mutacijos; 56 X-sujungta α- taalassaemija / protinio atsilikimo (ATRX) sindromas, kurį sukelia X-chromosomos geno ATR-X mutacijos, dėl kurių hipometiliuojasi pakartotinės sekos; 57 ir Fragile-X sindromas, kurį sukelia tiek genetiniai, tiek epigenetiniai mechanizmai. 58 Vis aiškėja, kad epigenetiniai procesai yra svarbūs vėžiui išsivystyti. Įvairių vėžinių susirgimų atvejais yra tam tikro laipsnio epigenetiškai neteisingas reglamentavimas, įskaitant ir visuotinį viso genomo hipometilinimą, ir CpG salos promotoriaus hipermetilinę navikų slopintuvus. 59 Kompleksinės nepiktybinės ligos, tokios kaip MDD, vis dėlto ištirtos ne epigenetiniu požiūriu. Kaip bus aptarta toliau, dalinis epigenetinių signalų stabilumas mejozės metu ir dalinis jų nestabilumas mitozės metu, atsirandantis dėl daugybės vystymosi, aplinkos ir stochastinių įvykių, daro epigenetiką patraukliu etiologiniu kandidatu į tokias ligas (žr. 2 paveikslą).

Image

MDD epigenetinis modelis. a ) Tradiciniuose etiologiniuose MDD modeliuose buvo atsižvelgiama tik į genetinius polimorfizmus ir aplinkos veiksnius. b ) MDD epigenetinis modelis teigia, kad epigenetiniai pokyčiai gali atsirasti dėl aplinkos, hormoninių ir atsitiktinių stochastinių veiksnių, kad padidėtų jautrumas MDD.

Visas dydis

Epigenetikos reikšmė MDD etiologiniams tyrimams

MZ dvynių neatitikimas ir poveikis aplinkai

Dvynių tyrimai turi didelę reikšmę genetiniams veiksniams MDD etiologijoje, tačiau, kaip ir visų sudėtingų psichinių būklių atveju, stebima, kad MZ dvynių atitikmenys yra žymiai mažesni nei 100%. Taikant klasikinį dvynių tyrimo metodą, kuriame laikoma, kad MZ dvyniai yra genetiškai identiški, bet koks MZ dvynių neatitikimas priskiriamas tik „nebendraujantiems“ aplinkos veiksniams. Tačiau alternatyvus paaiškinimas yra tas, kad kai kuriuos pastebėtus fenotipinius skirtumus tarp MZ dvynių gali lemti epigenetiniai veiksniai. 60, 61 Naujausias Fragos ir kt. Tyrimas . 62 įrodė, kad MZ dvynių gyvenimo metu iškyla gana dideli epigenetiniai skirtumai tarp genomo, pabrėždami dinaminį epigenetinių procesų pobūdį. Įdomu tai, kad buvo pranešta apie MZ dvigubo metilinimo skirtumus CpG vietose daugelyje specifinių genų, susijusių su psichine liga, įskaitant dopamino D2 receptoriaus ( DRD2 ) geną 63 ir katechol- O- metiltransferazės ( COMT ) geną. 64 Panašiai buvo įrodyta, kad genetiškai identiški veisliniai gyvūnai pasižymi dideliais epigenetiniais skirtumais, kurie gali būti susieti su genų ekspresijos skirtumais, sukeliančiais ryškius fenotipinius pokyčius. 65 Vis labiau akivaizdu, kad daugelis stebimų epigenetinių skirtumų tarp MZ dvynių ir inbreduotų gyvūnų gali būti atsitiktinių stochastinių įvykių padarinys. 60 Galima numanyti, kad tokios stochastinės epigenetinės „mutacijos“ gali kauptis per milijonus mitozinių padalijimų, vykstančių per dviejų MZ dvynių gyvenimą, ir gali sukelti rimtus genų ekspresijos pokyčius, jei jie yra reguliuojamuose genomo regionuose. Buvo pasiūlyta, kad toks stochastinis epigenetinis kitimas gali būti svarbesnis esant sudėtingiems psichiniams sutrikimams, nei šiuo metu pripažįstama, galbūt todėl, kad yra tam tikros rizikos, šiuo metu priskiriamos aplinkos veiksniams. 66

Of course, the fact that epigenetic differences exist between MZ twins does not rule out the role of environmental factors in disease susceptibility. In fact, there is growing evidence that the environment can itself influence the epigenetic status of the genome – either globally or at specific loci. 67 It is becoming increasingly apparent, for example, that a range of environmental toxins, both chemical and psychosocial, can lead to long-lasting alterations to the epigenetic profile of the genome or specific genes through processes such as the modification of DNA and histones. The fact that epigenetic marks can directly link environmental factors to gene function makes them attractive targets for a mechanistic role in the gene–environment interaction effects that are increasingly being uncovered in aetiological studies of complex diseases. Many environmentally induced epigenetic changes appear to be related to dietary intake (for a detailed review see Waterland and Jirtle 68 ). It appears that DNA methylation can be affected by the dietary levels of methyl-donor components, for example folic acid, and that maternal dietary methyl supplements can increase DNA methylation and alter methylation-dependent phenotypes in mammalian offspring. One classic example is that of the epigenetic state of the agouti viable yellow locus in mice, which contains a gene determining coat colour and can be manipulated by altering the diet of the pregnant female. 69 Certain drugs may also modify epigenetic regulation – the use of metamphetamine, for example, linked to psychiatric illness in humans, alters the DNA methylation profile of genes expressed in the brain. 70 Intriguingly, and perhaps more pertinent to the aetiology of depression, it appears that the psychosocial environment may also mediate gene expression epigenetically. Research by Meaney and colleagues has shown that postnatal maternal care in rats, as measured by increased pup licking, grooming, and arch-backed nursing, leads to epigenetic modification of a NGF1-A transcription factor binding site in the promoter region of the glucocorticoid receptor gene ( NR3C1 ). 71 This finding is of particular relevance to the study of depression given the likely role of both the early rearing environment and the HPA axis in the aetiology of affective disorders.

Proband sex effects

As discussed earlier, the prevalence of MDD is approximately doubled in females compared to males, and several studies suggest that the heritability of the disorder is significantly higher in women. 12, 72 Furthermore, it appears that the genetic aetiology of MDD may differ between the sexes with the overlap of putative genetic factors involved in the disorder being incomplete. 72 Following the investigation of X-linked Mendelian diseases that exhibit sexual dimorphism, one potential explanation is that the overrepresentation of depression in women results from a MDD risk gene on the X chromosome. Several segregation analyses have suggested involvement of X-chromosome genes in MDD (see eg Vaillant et al. 73 ) and certain X-linked genes, for example, GPR50, have been associated with the disorder, 74 although such conclusions are not ubiquitous (see eg Faraone et al. 75 ) and no firm conclusions can yet been drawn about the involvement of X-linked sequence variants in depression.

Skewed X-chromosome inactivation is one X-linked epigenetic process that could potentially cause the excess rates of MDD in women, and also explain female MZ twin discordance. 76 X-inactivation silences gene expression and is initially instigated by expression of the XIST gene and then maintained via DNA methylation and histone modifications. The role of X inactivation is to compensate for the greater dosage of X-linked genes in women (who have two X chromosomes) compared to men (who have one X chromosome). It is generally assumed that in most women X inactivation is stochastic for each cell lineage – either the maternally or paternally inherited X can be silenced – but is maintained throughout subsequent cell divisions. There is, however, increasing evidence that in some cases the selection process is not random. It has been demonstrated, for example, that approximately half the female carriers of X-linked mental retardation exhibit skewed X-inactivation where the activation ratio between the two X chromosomes is 80:20% or higher. 77 Non-random X-chromosome inactivation has been observed in a number of disorders, including several X-linked immunodeficiencies, Lesch–Nyhan disease, incontinentia pigmenti, focal dermal hypoplasia and adrenoleukodystrophy. 78 In the normal population of women without a family history of X-linked disorders, 5–20% of women have constitutional skewing of X inactivation. 79 According to other authors, 30–40% of females exhibit ratios of 60:40% or more, and 10% of normal females demonstrate even more extreme ratios. 78 In studies of MDD, therefore, we propose that the 'skewedness' of the X chromosome should be thoroughly investigated, and if present taken into account when performing genetic studies because the results of linkage and association studies may be mediated by the proportion of females with skewed X-inactivation. Skewed X-inactivation also provides a mechanism for phenotypic discordance between female MZ twins. Male MZ twins will only express X-linked genes inherited from their mothers, but females can express either maternally or paternally inherited genes. Loat and colleagues. 80 have argued that given the random nature of X inactivation, female MZ twin pairs do not necessarily inactivate the same X chromosome and will thus show higher levels of discordance than male MZ twin pairs. To our knowledge, no study has yet tested this theory on individuals with MDD, but analyses on MZ twins assessed at ages 2, 3 and 4 suggests that this pattern is observed for a number of behavioural traits closely related to depression. 80 Another epigenetic phenomenon that may confound X-linked gene studies in MDD is the existence of genes escaping X inactivation. Not all genes on the X chromosome are inactivated, with as many as 15% showing evidence of expression from both X chromosomes. 76, 81 Genes escaping X inactivation are obvious candidates for explaining sexual dimorphism in disease prevalence, especially if no Y-chromosome homologue for those genes exists.

Sex effects have also been recently detected in genetic linkage and association studies of autosomal genes. For example, genome-wide linkage scans of MDD families provide evidence for male-only linkage on chromosome 12q22–q23.2 16 and evidence for female-only linkage on chromosome 2q33–35. 82 There are numerous other examples across the spectrum of psychiatric diseases where autosomal loci exhibit apparently clear-cut sex differences. Sex hormones are the usual 'culprit' used to explain such gender effects in complex disease, based in part on the myriad of data associating hormonal differences with disease states, and their critical involvement in numerous regulatory processes. Little is known, however, about the underlying mechanisms of how sex hormones predispose to or protect from a disease. The gender-specific effects observed in genetic linkage and association studies suggest that chromosomal regions and individual genes may be the target of sex hormone action, but the molecular mechanisms behind these interactions are yet to be elucidated. Although sex hormones cannot change DNA sequence, it is known they can be potent modifiers of epigenetic status and gene expression. There are several reports of the female sex hormone oestrogen altering the chromatin configuration of certain genes. 83, 84 Furthermore, it has been proposed that sex hormones may act to alter the DNA methylation profile of specific loci in the genome, 85, 86 controlling gene expression in a sex-specific manner. It is thus plausible that susceptibly to depression is mediated by the hormone-specific epigenetic modification of genes contained within nominated linkage regions. This may explain some of the sex effects observed widely in genetic linkage and association studies: a specific allele or haplotype may be a risk factor only after epigenetic modification by some aspect of the endocrinological millieu.

Parental origin effects

Another non-Mendelian feature that is commonly observed in studies of psychopathology is a parent-of-origin effect, where disease susceptibility is mediated by parental factors in a sex-specific manner. Parent-of-origin effects are apparent at both a phenotypic level, where the risk to offspring depends on the sex of the affected parent, and also at a molecular level when risk alleles only confer increased susceptibility if they are transmitted from the mother or the father. These effects have been observed in a number of psychiatric phenotypes, including several closely related to major depression. For example, it has been shown that the risk of developing bipolar disorder is higher in offspring with affected mothers than in those with affected fathers. 87 Genome-wide linkage-scans and candidate–gene association studies have also provided some preliminary evidence for parent-of-origin effects in depression. Zill et al. 88 for example, find evidence for a parent-of-origin effect with the GOLF gene, and Schiffer and Heinemann 89 report preferential maternal transmission of a GluR7 gene risk allele to MDD patients. Many other examples, however, have probably gone unnoticed because parent-of-origin effects are not routinely tested in traditional genetic studies. In fact, it is likely that parental origin effects are a much wider phenomenon in psychiatric diseases than it is generally thought given that linkage analyses, as a rule, are performed in a sex-averaged way.

The most likely mechanism behind such parent-of-origin effects is genomic imprinting – the differential expression of the genetic material at either a chromosomal or allelic level depending on whether the genetic material has been transmitted from the paternal or the maternal side. Genomic imprinting involves the epigenetic marking of chromatin, via the modifications of DNA and histones, which results in expression of only one allele at that locus. Genomic imprinting is fundamental to normal mammalian development and growth, and plays an important role in brain function and behaviour. 90 Genomic imprinting is traditionally viewed as an all-or-nothing phenomenon that occurs in only small, clustered regions of the genome. In these imprinted regions only maternally or paternally inherited genes are turned on, but not both, resulting in monoallelic expression, for example, at both H19 and IGF2 . It is estimated that there are between 100 and 200 imprinted loci in the human genome (see //igc.otago.ac.nz/home.html). Recent evidence, however, suggests that imprinting may be more widespread and less clear-cut than originally believed, and this could have important ramifications for our understanding of the aetiology of complex disorders such as depression. Preis et al. 91 used nine transgenic mouse lines to uncover a much more subtle form of imprinting in the murine genome. They found that a high proportion of transgenic lines displayed lower expression of a reporter transgene when it was passed through the maternal line although paternal alleles were expressed as well. It is proposed that these observations may be representative of imprinting patterns across all mammalian genomes, with perhaps the majority of genes demonstrating some degree of skewed allelic expression in a parent-of-origin dependent manner. Conversely, it has also been shown that genes previously believed to exhibit total monoallelic expression as a result of imprinting may actually show considerable heterogeneity. A study examining the allelic expression of three imprinted genes ( SNRPN, IMPT1, IGF2 ) in the normal population found evidence for significant biallelic expression indicating that functional variation at imprinted loci may be a common feature of the mammalian genome. 92

Association of DNA sequence variation with epigenetic variation – epi-alleles, epi-genotypes and epi-haplotypes

As discussed above, few convincing associations between specific polymorphisms and susceptibility to MDD have been revealed by candidate gene studies. One major problem is the heterogeneity apparent in the data generated from these analyses. The pattern of association observed is rarely consistent between studies, and it is not uncommon for different alleles and haplotypes to be associated with the disorder in different study populations. One possible explanation for this heterogeneity comes from the observation that genetic–epigenetic interactions may be commonplace across the genome. 'Epi-alleles' and 'epi-haplotypes' that combine both DNA sequence and epigenetic information may thus be better predictors of the risk for disorders like depression than any of the two components analysed separately. There is increasing evidence that some DNA alleles and haplotypes tend to be associated with a specific epigenetic profile. Of particular interest in this regard is increasing evidence that DNA methylation profiles may be associated with specific DNA alleles in genes putatively linked to mood disorders. For example, the T allele of the C677T polymorphism in the methylenetetrahydrofolate reductase gene ( MTHFR ), recently implicated in depression, 93 is associated with an increased risk of imprinting defects in the Prader–Willi syndrome/Angelman syndrome region of 15q. 94 Furthermore, the C102T polymorphism in the serotonin 5-HT2A receptor gene ( 5HT2AR) , which has been associated with several psychiatric disorders including depression, was found to be methylated specifically on the C allele. 95 Dempster et al. 96 found evidence that methylation in the promoter region of the COMT gene, another locus implicated in numerous psychiatric phenotypes, was associated in a dose-dependent manner with genotype at the val158met polymorphism, with val158 homozygotes exhibiting lower levels of methylation than met158 homozygotes. Finally, a recent epigenetic study of a C/G single nucleotide polymorphism (SNP) in the CDH13 gene in male germline cells revealed that C alleles are predominantly unmethylated, while G alleles are predominantly methylated. 97 The notion that epigenetic changes may be associated with specific DNA sequence changes sheds new light on the inconsistent genetic association studies observed in complex diseases, and suggests that a comprehensive epigenetic analysis of candidate SNPs and haplotypes is warranted.

Epigenetic studies in MDD: technological and methodological complexities

While epigenetics provides a new perspective on the aetiology of major depression, it would be naïve to expect that applying epigenetic theory to molecular-based studies of MDD psychopathology is a straightforward task that can be achieved without encountering a number of technological and methodological complexities. The study of epigenetics, especially in complex diseases, is a relatively new field of research, and optimal laboratory techniques and analysis methods are still being developed. It is vital that laboratory approaches are refined and verified before sweeping conclusions are drawn from experimental data. This is particularly important because epigenetic experiments need to overcome a number of inherent complexities that are not encountered when investigating simple DNA sequence variation. Potential problems surrounding the epigenetic studies can be subdivided into several groups, which will be discussed briefly in the sections below: (1) the technological limitations in identifying epigenetic variation; (2) sample- and target tissue-related issues; (3) the confounding effects of DNA sequence variation; and (4) the interpretation of a cause-effect relationship between epigenetic changes and disease aetiology.

Technological limitations

Whilst it is easy to theorize about the role of epigenetic processes in mediating susceptibility to psychiatric disorders, actually investigating these modifications at a molecular level is not so straightforward. To date, only a few empirical studies have been performed, and it is clear that a number of methodological difficulties need to be overcome before large-scale epigenetic studies can be viably executed.

A number of approaches to investigate DNA methylation have been developed (see Figure 3). Currently, the 'gold standard technique' for fine mapping of methylated cytosines is based on the treatment of genomic DNA with sodium bisulfite, which converts unmethylated cytosines into uracils (and subsequently, via polymerase chain reaction (PCR), to thymidines), whereas methylated cytosines are resistant to bisulfite and remain unchanged. 98 After sodium bisulfite treatment, one crude method to examine DNA methylation is via methylation-specific PCR (MSP). In this approach two PCR reactions are performed on bisulfite-treated DNA with primer sets specific to (i) methylated DNA and (ii) unmethylated DNA. Such an approach can only investigate methylation at a very small number of CpG sites and gives no quantitative information about the degree of methylation. Furthermore, data from experiments utilizing MSP should be treated with caution given the numerous confounding factors that can affect PCR efficiency on bisulfite-treated DNA. A more rigorous method to investigate DNA methylation is bisulfite genomic sequencing. DNA regions of interest are amplified and sequenced to identify C>T transitions or stable C positions, respectively corresponding to unmethylated and methylated cytosines in the native DNA. Typically, PCR amplicons are either sequenced directly to provide a strand-specific average sequence for the population of DNA molecules, or cloned and sequenced to provide methylation maps of single DNA molecules. 98, 99 An alternative to the laborious and expensive sequencing of cloned bisulfite-PCR products is the use of pyrosequencing to accurately quantify the degree of CpG methylation. Pyrosequencing is a sequencing-by-synthesis method that relies on the luminometric detection of pyrophosphate release upon nucleotide incorporation via an enzymatic cascade. Because there is a direct correlation between sequence data and the amount of nucleotides incorporated during the reaction, it provides an accurate method for detecting the precise methylation level at any CpG site giving truly quantitative data that are not achievable using standard bisulfite-sequencing protocols. 100 A major problem with the sodium bisulfite approach is that it results in considerable DNA degradation, and large quantities of genomic DNA material are needed if numerous genomic regions are to be profiled – obviously an issue if valuable, relatively inaccessible tissues such as the brain are to be profiled. One potential method to overcome problems associated with tissue availability is the use of whole-genome amplification of bisulfite-treated DNA. 101 In addition, no consensus has yet been reached on how to best statistically analyse bisulfite-sequence data. Such analyses are unlikely to be straightforward, especially if the differences observed across individuals are subtle as would be expected for disorders such as MDD. One possibility is to use an approach based on epigenetic distance, which reduces bisulfite-sequencing data from cloned PCR products to a binary code for each DNA molecule, and allows patterns of 'epigenetic drift' to be easily ascertained. 102

Image

Experimental approaches to investigate DNA methylation. ( a ) Microarray-based methylation profiling using microarrays can investigate DNA methylation changes at a genome-wide level. In this example the unmethylated fraction of genomic DNA is enriched using methylation-sensitive restriction enzymes and adaptor-ligation PCR and subsequently hybridized on microarrays (see Schumacher et al. 103 ); ( b ) locus-specific methylation analysis using sodium bisulfite treatment and PCR-based sequence analysis.

Visas dydis

These traditional, locus-specific techniques limit the number of the CpG sites that can be feasibly assessed, and thus exclude the possibility of performing a genome-wide 'epigenome-scan' to identify novel regions of importance. In recent years, a number of novel, high-throughput microarray-based methods have been developed, which should enable future epigenetic studies to overcome many of these issues. 103, 104 At present these methods have not been widely used and are relatively untested. Two general methods exist for treating and enriching DNA samples before array hybridization: the digestion of genomic DNA with restriction-sensitive enzymes, and the use of antibodies to specifically pull-down methylated cytosines. The enzyme approach cannot be used to interrogate every potential methylated cytosine in the genome, whereas the antibody approach can only examine the methylated fraction of the genome, which is far less informative than the unmethylated fraction. 103 As we have learnt from the use of gene expression microarrays in psychiatry, differences in sample preparation, microarray type, sample labeling and data analysis procedures pose a tremendous challenge to the field, 105 and some degree of standardization is needed across epigenetic studies. A major hurdle to the widespread use of methylation microarrays is cost – for example it is currently prohibitively expensive to scan the entire genome using DNA from a large sample of MDD patients and controls, especially if tissue-specific effects are important and numerous brain regions need to be assessed. Finally, until recently, the resolution of the available low-density arrays has been relatively crude, and the available methodology has not been particularly sensitive to subtle methylation differences. Current genome-wide methylation studies have been biased by the fact that current microarray designs focus primarily on cDNA, promoters, and 5′ regulatory sequences of known genes only. As array technology advances, however, with the development of commercially produced whole-genome 'tiling' arrays containing millions of features allowing an unbiased assessment of the entire genome, microarray studies have the potential to rapidly advance our understanding of the epigenetic mileau of the genome, and provide novel insights into the aetiology of MDD.

This article has been primarily dedicated to the role of DNA methylation in MDD aetiology. This focus partly reflects the fact that methods to examine other epigenetic processes such as histone modifications in psychiatric disorders are a step behind those currently available for DNA methylation analysis. The method used to examine the epigenetic state of histones is chromatin immunoprecipitation (ChIP). One limitation to this approach is the large number of cells needed for each experiment, although recent methodological advances may permit ChIP analysis on as few as 100 cells. 106 Another major problem with ChIP analysis is that, compared to DNA methylation marks, histone modifications are far less stable in post-mortem tissues. In this regard, specific immunoprecipitation protocols applicable to post-mortem brain tissue need to be developed, and the impact of potential confounds such as autolysis time or tissue pH need to be thoroughly examined. Some promising data come from recent investigations that suggest the immunoprecipitation of micrococcal nuclease-digested tissue extracts is a feasible approach to profile histone methylation at defined genomic loci in post-mortem brain. 107 Once histone-stability problems have been addressed, the development of powerful microarray-based 'ChIP-on-chip' methods, in which DNA isolated from ChIPs is hybridized to a microarry chip, should allow genome-wide analysis of histone modifications and provide additional epigenetic information to complement data from genome-wide DNA methylation studies.

Sample and target tissue

To identify epigenetic changes associated with depression, the ideal experiment would investigate prospectively the dynamics of genome-wide epigenetic changes in the brains of individuals who eventually become affected with MDD compared to unaffected control individuals. At the present time, however, limitations with our current range of epigenetic methodologies render such an approach impossible. As it is not yet possible to perform in vivo epigenetic studies, particularly for tissues like the brain, only retrospective study designs using post-mortem brain samples are viable.

Given the role of epigenetics in mediating when and where genes are expressed, an obvious confounding factor in epigenetic studies is tissue heterogeneity. Because different cell types exhibit quite different epigenetic profiles across different genomic regions, specific tissues – that is, the primary sites of disease manifestation – are deemed preferable for aetiological studies. It is likely that for studies of psychiatric disorders such as MDD, the primary focus of aetiological studies will be the numerous brain regions implicated in the disorder. Even within specific-tissue types, however, there is considerable cellular heterogeneity. Tissues like the cortex, for example, consist of numerous different types of neuronal and glial cells, and the detection of cell-type specific epimutations is likely to be difficult unless the epigenetic profile of specific cells can be investigated. This point is highlighted by a recent study identifying epigenetic changes occurring specifically in cortical interneuron cells, suggesting that different cell populations within a single tissue-type can have quite distinct epigenetic profiles. 108 An increasingly popular solution in the epigenetics research field is to apply 'Laser Capture Microdissection' technology, which enables the isolation of specific cell types or single cells from whole tissue avoiding the confounding effects of cell type variation. 109

Despite the problems of tissue specificity, because the availability of fresh brain tissue from well-phenotyped individuals with disorders like MDD is non-existent, one compromise is to use other, more accessible tissue sources like leukocytes for epigenetic profiling in the hope that the patterns observed will reflect those of the real tissue of interest. There is increasing evidence that many epimutations are not limited to the affected tissue or cell type, but can also be detected in other tissues. Good examples are the epimutations at IGF2 110 in lymphocytes and MLH1 in sperm cells, 111 observed in colon cancer patients and epimutations at KCNQ1OT1 in the lymphocytes and skin fibroblasts in Beckwith–Wiedemann syndrome. 112 In fact, peripheral blood-based studies may be useful in revealing epigenetic changes resulting from early embryogenesis, or even highlighting inherited epigenetic variation. The study of peripheral cells may even have some advantages over the use of brain tissue in that they are likely to accumulate fewer epigenetic changes induced by disease-related external factors, such as medications, recreational drugs and stress, which could all be confounding factors to epigenetic studies. The use of peripheral cells would also allow the longitudinal study of epigenetic changes throughout the lifecourse of individuals diagnosed with MDD, providing information about the epigenetic factors associated with the development, remission and relapse of the disorder. Finally, because there have been no thorough epigenetic studies in MDD to date, it is not known how large a sample needs to be investigated. At this stage the degree of any potential epigenetic differences between cases and controls is unknown, although the effects observed are likely to be small.

Defining a 'normal' epigenetic profile and proving a cause–effect relationship between epigenetic differences and MDD

Despite the current interest in the possible role of epigenetic processes in disorders like MDD, very little empirical research has been performed to characterize what actually comprises a 'normal' epigenome. Before we can systematically investigate the epigenetic changes associated with disease, we must first catalogue the genome-wide DNA methylation patterns in all major tissues. This is one of the targets of the Human Epigenome Project (www.epigenome.org), which aims to map all methylation variable positions in the genome. 113 Producing a reference map of the entire human epigenome is going to be a gargantuan task, especially given the huge epigenetic differences that are likely to occur both between tissue/cell types, and within a specific tissue/cell type over the course of development. To date, this private/public consortium has released DNA methylation profiles of the major histocompatibility complex 114 and chromosomes 6, 20 and 22. 115

As is the case for all non-DNA sequence based (neurochemical, pathophysiological and environmental) studies, proving a direct causal link between epigenetic factors and disease is not straightforward. For example, the observation of a different epigenetic profile between depressed and non-depressed individuals does not necessarily indicate a causal relationship between these epigenetic changes and depression. It is possible that any epigenetic changes in depressed individuals are not a cause of, but actually the result of MDD-induced changes in the brain. Given that several exogenous chemicals have been linked with processes like DNA methylation, it is also possible, for example, that the medications used to treat depression may cause epigenetic changes. In this regard, tissues that are not the disease site or directly affected by antidepressant medications, for example peripheral blood cells, could be very useful in elucidating inherited epigenetic changes associated with MDD. The ideal study design to identify causal relationships between epigenetic factors and MDD would be a prospective longitudinal study in which individuals at risk for depression are investigated before they develop the disease.

Confounding effects of DNA variation

A major issue in epigenetic studies is that putative epigenetic differences can be masked by the thousands of DNA sequence variants that exist between individuals. Owing to the nature of the technology currently employed to examine epigenetic changes, DNA sequence polymorphisms are not always easy to differentiate from epigenetic differences. This problem applies to all DNA methylation technologies currently utilized in aetiological studies. Cut sites for methylation-sensitive restriction enzymes, for example, can be created or removed by sequence changes. Sodium-bisulfite conversion reduces methylation status to standard sequence information, and can thus be confounded by SNPs. Two possible study designs can be used to address these problems. First, methylation differences in MZ twins discordant for MDD can be examined. MZ twins have identical genomes, so phenotypic differences cannot be accounted for by DNA sequence changes. However, a potential limitation of using MZ twins is that unaffected co-twins may also be carriers of epigenetic changes that may not be too far from a hypothetical 'threshold' of epigenetic misregulation, above which the twin would present with a clinical diagnosis of MDD. Typical microarray experiments are based on relative differences between two individuals, rather than the absolute size of a putative epigenetic change. It is possible that this difference, between an affected twin (a little bit above the 'threshold') and an unaffected co-twin (a little bit below the 'threshold') may be relatively small and difficult to differentiate from experimental errors. A second approach is to instigate a longitudinal study of epigenetic changes during the course of disease in MDD patients, using DNA taken from easily accessible tissue (eg peripheral blood cells). In such an experiment, the epigenetic profile of DNA samples taken at various time-points could be compared (eg at first diagnosis, remission and relapse). A similar approach has been suggested as a substitute to twin studies in pharmacogenetic investigations. 116 Such a design is powerful as it can inform us about the extent that epigenetic status fluctuates in peripheral blood cells, and may provide an insight into relapse-associated epigenetic changes.

Epigenetics and MDD: vogue, hassle or necessity?

So what is the role of epigenetics in aetiological studies of MDD: vogue, hassle or necessity? The answer is probably a bit of all three. Largely neglected until very recently, the study of epigenetics has become increasingly 'mainstream'. There is a certain buzz amongst the molecular psychiatry research community about the potential role of DNA methylation and histone modifications in a range of psychiatric phenotypes. It is now generally accepted that these epigenetic factors may sit alongside DNA sequence polymorphisms and environmental factors in mediating susceptibility to disorders like MDD. In this article we have discussed the benefits of including epigenetic theory into models of disease aetiology, highlighting how epigenetic mechanisms can account for the many features of MDD that are unexplainable using traditional genetic and environmental approaches (see Table 1).

Theoretical notions about a role for epigenetic processes in the development of MDD do not prove such a link, however. There is a need to move from theory into empirical laboratory-based research, and this is where the current 'vogue' for epigenetics becomes more of a 'hassle'. The study of epigenetics, especially in complex diseases, is a relatively new field of research, and optimal laboratory techniques and analysis methods are still being developed. We should be under no illusion that such experiments are going to be easy. If we are to really fulfill the novel heuristic opportunities that epigenetics provides, the development of novel high-resolution genome-wide methods to scan the epigenome for DNA methylation and histone modifications are vital.

Despite these difficulties, it is also clear that studies investigating epigenetic factors in MDD (as well as various other complex diseases) are a 'necessity'. Years of research effort have been spent attempting to identify the specific genes and environmental factors that were traditionally believed to determine individual susceptibility to MDD. While some progress has been achieved, our focus on only genes, environments and the interactions between them, has left many questions unanswered. Although it would be premature to conclude that epigenetics will lead to revolutionary discoveries in non-Mendelian biology, the study of DNA methylation and histone modifications has the potential to transform our understanding about the molecular aetiology of complex diseases.