Stebimas pd-l1 teigiamų cirkuliuojančių naviko ląstelių skaičius nesmulkialąsteliniame plaučių vėžiu sergantiems pacientams, gydytiems pd-1 inhibitoriumi nivolumabu | mokslinės ataskaitos

Stebimas pd-l1 teigiamų cirkuliuojančių naviko ląstelių skaičius nesmulkialąsteliniame plaučių vėžiu sergantiems pacientams, gydytiems pd-1 inhibitoriumi nivolumabu | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vėžio imunoterapija
  • Nesmulkialąstelinis plaučių vėžys

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Prieštaringi užprogramuoto mirties 1-ojo ligando (PD-L1) statuso prognozuojamos vertės plaučių naviko audinyje rezultatai, reaguojant į imuninio patikros taško inhibitorius, neleidžia įtikinamai apsvarstyti. Skystas biopsija gali leisti realiu laiku imti pacientus dėl PD-L1 ligos eigos metu. Buvo įtraukti dvidešimt keturi IV stadijos NSŠKL pacientai, įtraukti į išplėstinės prieigos programą su Nivolumabu. Cirkuliacinės navikinės ląstelės (CTC) buvo analizuojamos CellSearch naudojant anti-žmogaus B7-H1 / PD-L1 PE konjuguotą antikūną. PD-L1 ekspresuojančios CTC buvo įvertintos pradiniame, praėjus 3 ir 6 mėnesiams nuo gydymo pradžios, ir koreliavo su rezultatu. Pradinio gydymo metu ir po 3 gydymo mėnesių buvo nustatyta, kad CTC ir PD-L1 ekspresija jų paviršiuje yra susiję su blogais pacientų rezultatais. Nepaisant to, didelis PD-L1 ekspresuojančių CTC dažnis kliudė diferencijuoti PD-L1 vaidmenį apibrėžiant prognozę. Ir atvirkščiai, nors CTC buvo nustatyta visiems pacientams praėjus 6 mėnesiams po gydymo, šiuo metu pacientai galėjo būti suskirstyti į dvi grupes, remiantis PDC-L1 ekspresija. Visi pacientai, kuriems nustatyta PD-L1 neigiama KTK, įgijo klinikinę naudą, tuo tarpu visi pacientai, sergantys PD-L1 (+) KTK, patyrė progresuojančią ligą. Tai rodo, kad PD-L1 (+) CTC išlikimas gali atspindėti gydymo pabėgimo mechanizmą.

Įvadas

Pirmiausia buvo aprašytas adaptacinio imuninio atsparumo procesas, siekiant paaiškinti, kaip vėžinės ląstelės išvengia kitaip veiksmingo imuninio atsako per molekulių, kurios aktyviai išjungia citotoksines navikams specifines T-ląsteles1, raišką. Inhibitoriniai imuninės kontrolės taškai vaidina lemiamą vaidmenį palaikant imuninę homeostazę, švelninant autoimunitetą. Tarp jų PD-1 / PD-L1 ašis neseniai sulaukė nemažo dėmesio, atsižvelgiant į priešvėžinę imunoterapiją 2 . PD-1 (užprogramuotas ląstelės mirties baltymas 1) ir jo ligando (PD-L1) sąveika dalyvauja periferiniame T-ląstelių aktyvacijos etape ir lemia periferinę imunologinę toleranciją. Tvirtas imuninės kontrolės taško slopinimo, kaip priešvėžinio gydymo, pagrindas sudarė pagrindą daugybei tyrimų, atliktų siekiant ištirti šio terapinio metodo veiksmingumą sergant įvairiomis vėžinėmis ligomis. Po III fazės „CheckMate-017“ tyrimo, kuriame buvo įvertintas PD-1 inhibitorius Nivolumabas metastazavusiame nesmulkialąsteliniame plaučių vėžyje (NSCLC) po išankstinės chemoterapijos platinos pagrindu, JAV maisto ir vaistų administracija (FDA) greitai stebėjo, kaip patvirtinti Nivolumabas skirtas išplėsti jo naudojimą pacientams, kuriems anksčiau buvo gydytas metastazavęs NSLK, nepaisant PD-L1 ekspresijos 3 . Pastarasis punktas yra susijęs su akivaizdžia biologine problema, ribojančia PD-L1 raiškos patikimumą naviko mėginiuose, kaip numatomą biomarkerį atsakui į Nivolumabą. Nors PD-L1 galima aptikti naviko ar imuninių ląstelių imunohistochemija (IHC), jos raiška yra prieštaringa prognozuojant, kuriam pacientui gali būti naudinga 4 terapija. Šiuo atžvilgiu pastebėtina, kad dauguma pacientų, turinčių teigiamą naviką PD-L1, nereaguoja į PD-1 kelio blokadą, kas rodo, kad norint pasiekti objektyvų atsaką, PD-L1 ekspresija gali būti nereikalinga. Iki šiol dėl nedidelės teigiamos PD-L1 testo numatomosios vertės vėžio biopsijos metu biologiniam žymeniui tampa nepriimtinas pasirinkimas parenkant gydymą 5 . Be to, padidėjęs PD-L1 reguliavimas yra dinamiškas biomarkeris ir jo negalima tinkamai parodyti statiniu vaizdu, kaip tai daroma naviko audinio biopsijos pavyzdyje. Pastebėjimas, kad PD-L1 būklė yra dinamiškas parametras, taip pat dėl ​​to, kad trūksta standartizacijos prieinamuose tyrimuose, apsunkina jo naudojimą kaip idealų prognozuojamą biomarkerį naviko biopsijoje dėl techninių ir biologinių problemų, nes jo išraiška yra labai kintanti atsižvelgiant į laiką ir biopsija 6 . Skystos biopsijos, prieinamos ir pakartojamos navikinių ląstelių išskyrimas į kraują 7, priešingai, galėtų sudaryti sąlygas dinamiškai apibūdinti PD-L1 raišką, kurią galima stebėti ligos eigoje. Kadangi cirkuliuojančios navikinės ląstelės (CTC) susidaro iš navikinių ląstelių, įsivaizduojama, kad esant evoliuciniam slėgiui jos gali pasidalinti kai kuriais imuninio pabėgimo mechanizmais, būdingomis navikinėms ląstelėms. Šiuo požiūriu PD-L1 išlaikymas gali būti vienas iš mechanizmų, kuriuos KTK naudoja išgyvendami imuninės sistemos / imunoterapijos priepuolį. Šio tyrimo tikslai buvo 1) ištirti PD-L1 raišką CTC, išskirtuose iš pacientų, sergančių NSCLC, gydomų PD-L1 inhibitoriumi Nivolumabu 2), ištirti bet kokius PD-L1 (+) CTC pokyčius gydymo metu ir 3) ) išsiaiškinti, ar PD-L1 (+) CTC gali būti numatomas anti-PD-1 nukreipto gydymo numatomasis žymeklis.

Rezultatai

Paciento savybės

Į tyrimą įtrauktų 24 metastazavusių NSŠP pacientų charakteristikos apibendrintos 1 lentelėje. CTC būklė buvo įvertinta prieš pradedant gydymą (pradinis rodiklis) ir praėjus 3 ir 6 mėnesiams po gydymo pradžios (pirmųjų dviejų pakartotinių radiologinio tyrimo metu įvertinus ligos statusas). Iš viso 24, 15 ir 10 pacientų kraujo tyrimas buvo įvertintas pradiniu, atitinkamai, 3 ir 6 mėnesiais po gydymo pradžios. Iš tikrųjų nuo pradinės iki trijų mėnesių kraujo paėmimo mirė šeši pacientai ir trys pasitraukė iš tyrimo (kraujo mėginys buvo nepakankamas „CellSearch“ analizei), tuo tarpu po pirmojo kraujo tyrimo trys pacientai mirė, o du pasitraukė iš tyrimo (vienas lašas) netaikant terapinio vaisto toksiškumo, vienas kraujo mėginys netinkamas „CellSearch“ analizei). CTC būklė buvo koreliuojama su pacientų baigtimi praėjus 6 mėnesiams nuo gydymo pradžios (2 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Pilno dydžio lentelė

CTC išvardijimas ir PD-L1 statusas CTC pradžioje

CTC būklė tyrimo pradžioje buvo teigiama 20/24 (83%) ir neigiama 4/24 (17%) pacientų. Aptiktų KTK skaičius svyravo nuo 1 iki 20 (vidutinis KTK skaičius 5, 2). Kaip neigiamą kontrolę mes ištyrėme 15 sveikų kontrolinių asmenų kraujo mėginius ir patvirtinome, kad nė viename mėginyje nebuvo teigiama CTC (duomenys nepateikti).

Tarp CTC (+) pacientų, pradiniu metu, 14 (70 proc.) Pacientų ligos progresavo arba mirė, o 5 (25 proc.) Ligos kontrolė (apibrėžta kaip stabili ligos SD ar dalinio atsako PR) antruoju stebėjimo laiku (6 mėn.) pradėjus gydymą). Vienam pacientui (5%) 6 mėnesių stebėjimo nebuvo, nes jis buvo nutrauktas iš tyrimo dėl toksiškumo vaistams.

PD-L1 būklė KTK pradžioje buvo vertinama 20 pacientų, kurių pradiniame KTK buvo aptinkamas, grupėje. Tarp šių 20 pacientų 19 (95%) parodė, kad PD-L1 ekspresuoja KTK. Nustatyta, kad PD-L1 teigiami CTC yra nepriklausomi nuo EGFR mutacijos būklės ir rūkymo istorijos. PD-L1 (+) CTC skaičius svyravo nuo 1 iki 10 (mediana - 3, 6 ląstelių), o PD-L1 (+) CTC dalis svyravo nuo 25 iki 100% viso aptinkamų CTC. PD-L1 dažymo intensyvumas pacientams ir to paties kraujo mėginiui skyrėsi. Didžioji dauguma PD-L1 (+) CTC buvo netaisyklingos formos, dažniausiai pailgos ir turinčios periferinį branduolį, palyginti su dažnesne apvalia forma, stebima PD-L1 (-) CTC (1 pav.). Iš 19 pacientų, sergančių PD-L1 (+) KTK, klinikinė nauda buvo naudinga 5 (26%), o 14 (74%) pacientų progresuojanti liga pasireiškė po 6 mėnesių gydymo. Iš pradžių tik vienas pacientas turėjo CTC, kuris neišreiškė PD-L1, ir po 3 mėnesių gydymo pasitraukė iš tyrimo dėl toksiškumo vaistams.

Image

Pacientas turėjo 7 CTC, iš jų 4 PD-L1 (+). Paveikslėlyje parodyta pailgos formos PD-L1 (+) CTC, palyginti su PD-L1 neigiama.

Visas dydis

KTK išvardijimas ir PD-L1 būklė KTK po 3 gydymo mėnesių

Praėjus 3 mėnesiams nuo gydymo pradžios, iš viso 15 pacientų buvo pakartotinai paimta KTK. Tarp jų 10 (67%) turėjo aptinkamus CTC, iš kurių 7 (70%) patyrė ligos progresavimą ir 3 (30%) turėjo klinikinę naudą (2 SD, 1PR) po 6 mėnesių stebėjimo. Dažnai buvo stebimas CTC lygio pokytis nuo pradinio lygio iki 9–14 savaičių nuo gydymo pradžios. Visų pirma, CTC padidėjo 6 pacientams (1 SD, 5 PD), sumažėjo (arba sumažėjo iki nulio) 7 pacientams (3 PD, 2 RP, 1 SD, 1 iškrito) ir 2 pacientams. buvo rasta nuolat neigiama CTC (abu SD).

PD-L1 būklė KTK atlikus pirmąjį radiologinį atnaujinimą buvo įvertinta 10 pacientų, kuriems buvo nustatomi KTK, grupėje. Tarp CTC teigiamų pacientų visi turėjo PD-L1 ekspresuojančius CTC. PD-L1 (+) CTC skaičius svyravo nuo 1 iki 53 (medianinis skaičius 6, 4 ląstelių), o PD-L1 (+) CTC dalis buvo nuo 25 iki 100% viso aptinkamų CTC. Pirmą kartą įvertinus PD-L1 būklę KTK, 6 pacientams (5 PD, 1SD) padidėjo PD-L1 (+) CTC, palyginti su pradine reikšme, o PD-L1 (+) CTC sumažėjo. buvo stebimas 4 pacientams (1 SD, 2 PR, 1 PD). Tiek PD-L1, išreiškiančių CTC, dalis tarp visos CTC populiacijos, tiek koreliacija tarp PD-L1 statuso CTC pirmojo pakartotinio įvertinimo metu ir radiologinis ligos atnaujinimas praėjus 6 mėnesiams nebuvo skirtingos, palyginti su pradiniais rezultatais. analizė.

CTC išvardijimas ir PD-L1 statusas CTC po 6 gydymo mėnesių

Iš viso 10 pacientų buvo imamas trečias kraujo kiekis praėjus 6 mėnesiams nuo gydymo pradžios. Visi turėjo aptinkamus CTC. Iš jų 5 turėjo PD. 4 turėjo SD ir 1 - PR. Palyginti su 3 mėnesių kraujo tyrimais, CTC padidėjo 6 pacientams (3 PD, 2 SD ir 1 PR), sumažėjo (arba sumažėjo iki nulio) 3 pacientams (2 PD, 1SD) ir 1 pacientui. buvo rastas nuolat teigiamas CTC buvimas (SD). Tarp pacientų, kuriems atlikus antrąjį radiologinį pakartotinį vertinimą buvo aptinkama KTK, 5/10 (50%) buvo nustatyta PD-L1 (+) KTK. Visi šie pacientai patyrė ligos progresavimą. Įdomu tai, kad po 6 gydymo mėnesių 50% pacientų stebėjome PD-L1 (-) CTC populiaciją, kurie visi pasiekė klinikinę naudą (4 SD ir 1 PR) (2 pav.). PD-L1 (+) CTC padidėjimas, palyginti su 3 mėnesių kraujo tyrimu, nustatytas 3 pacientams (visiems PD), sumažėjimas arba sumažėjimas iki 0 iš 3 pacientų (2 SD, 1 PR). Dviems pacientams buvo nustatyta, kad PD-L1 (+) CTC (visi PD) yra nuolat teigiami, o likusiems 2 - neigiami PD-L1 (+) CTC (abu SD).

Image

Didelė KT dalis išreiškė PD-L1 pradiniame ir per pirmąjį pakartotinį vertinimą, o PD-L1 (+) KT procentas reikšmingai sumažėjo per antrąjį pakartotinį vertinimą ( A ). Koreliacija tarp PD-L1 statuso CTC ir pacientų baigčių 3 ir 6 gydymo mėnesius. Po 3 mėnesių visi nustatyti CTC buvo rasti PD-L1 (+). Po 6 mėnesių pacientai gali būti suskirstyti į dvi grupes, atsižvelgiant į tai, ar CTC išreiškė PD-L1, ar ne. Įdomu tai, kad visi pacientai, sergantys PD-L1 (-) CTC, įgijo klinikinę naudą, tuo tarpu visi pacientai, sergantys PD-L1 (+) CTC, patyrė ligos ( B ) progresavimą. CB: klinikinė nauda, ​​PD: ligos progresavimas.

Visas dydis

Diskusija

Iki šiol ginčijami PD-L1 raiškos NSCLC numatomos vertės ir atsako į PD-1 / PD-L1 inhibitorius rezultatai neleidžia įtikinamai apsvarstyti statinio PD-L1 kaip biomarkerio įvertinimo 8 . PD-L1 įvertinimo atlikimas atliekant CTC anksčiau buvo aprašytas krūties vėžiu 9 . Pirmą kartą stebėjome PD-L1, išreiškiantį CTC, pacientams, sergantiems IV stadijos NSŠK, progresuojančiais po ankstesnio sisteminio gydymo, per pirmuosius 6 gydymo Nivolumab mėnesius. Prieš pradedant gydymą ir po 3 gydymo mėnesių du stebėjimai buvo ypač intriguojantys. Pirmasis buvo tas, kad didžioji dauguma pacientų turėjo kraujo aptikimo CTC nustatant pradinį kraujo mėginį, priešingai nei anksčiau buvo pranešta apie mažą CTC aptikimo dažnį NSCLC pacientams atliekant „CellSearch“ analizę, kuris neviršija 40% tarptautinėje literatūroje 10 . Didelį CTC aptikimą greičiausiai lemia tai, kad visi ištirti pacientai buvo įtraukti į išplėstinės prieigos programą, todėl juos paveikė stipriai iš anksto apdorotas (antros eilės ir už jos ribų) metastazavęs NSCLC. Antras pastebėjimas buvo tas, kad tiek pradiniame, tiek praėjus 3 mėnesiams nuo gydymo pradžios, visi CTC išreiškė PD-L1, neatsižvelgiant į EGFR mutacijos būklę, naviko histologiją ir rūkymo istoriją. Taigi, nors buvo nustatyta, kad tiek CTC buvimas, tiek PD-L1 ekspresija buvo nuosekliai susiję su blogais pacientų rezultatais, ypač didelis PD-L1 ekspresuojančių CTC dažnis pradiniame ir pirmame pakartotiniame vertinime kliudė veiksmingai atskirti pačių CTC vaidmenį, palyginti apibrėžti prognozę, palyginti su PD-L1. Kitaip tariant, nei pradiniame, nei praėjus 3 mėnesiams po gydymo pradžios CTC populiacijos, neigiamos PD-L1 ekspresijai, nebuvimas neleido atsižvelgti į tikrąją prognostinę ir prognozuojamą PD-L1 reikšmę CTC. Ir atvirkščiai, nors CTC vis dar buvo nustatyta visiems pacientams praėjus 6 mėnesiams po gydymo, šiuo metu pacientai galėjo būti suskirstyti į dvi grupes atsižvelgiant į tai, ar CTC išreiškė PD-L1, ar ne. Įdomu tai, kad 6 gydymo mėnesius pacientai, kuriems buvo neigiami PD-L1 KT, gavo klinikinę naudą, tuo tarpu visi pacientai, sergantys PD-L1 (+) KT, patyrė ligos progresavimą. Šis pastebėjimas rodo, kad PD-L1 ekspresija CTC pradeda įgyti aiškesnę prognozuojamą reikšmę vėlai gydant. Tai atitinka duomenis, gautus atliekant „Checkmate 017“ tyrimą, lyginant Nivolumabą ir docetakselį iš anksto gydytų pažengusių NSCLC pacientų, kai dvi bendros išgyvenamumo kreivės rodo atidėtą atskyrimą, kuris prasideda maždaug po 6 mėnesių 3 . Šis lėtas atsakas į kontrolinio taško inhibitorius paaiškinamas tuo, kiek reikia laiko imuninei sistemai suaktyvinti 11 . Taigi įsivaizduojama, kad 3 mėnesių gydymo nepakanka, kad imuninė sistema pašalintų PD-L1 (+) CTC, taigi skysta biopsija šiuo metu gali būti nenaudinga diskriminuojančius pacientus, kurie gali reaguoti. Priešingai, PD-L1 (+) CTC išlikimas 6 mėnesius gali atspindėti gydymo pabėgimo mechanizmą. Mes taip pat pastebėjome, kad patvariausi PD-L1 teigiami CTC turėjo neįprastą pailgos verpstės pavidalo morfologiją su išsiplėtusia uodega, sudaryta iš branduolio, palyginti su PD-L1 neigiamais CTC, kurie dažniausiai buvo maži ir suapvalinti. Įdomu tai, kad šie morfologiniai CTC anomalijos buvo susieti su bloga įvairių navikų rūšių prognozėmis 12 . Buvo pasiūlyta, kad šie pailginti CTC gali sudaryti nedidelę dalį EMT transformuotų vėžinių ląstelių 13, kurias vis dar gali užfiksuoti „CellSearch“, nes jos gali išlaikyti tam tikrus epitelio požymius (citokeratinus, EpCAM). dalinio virsmo proceso. Buvo pranešta apie ryškią PD-L1 ekspresijos ir epitelio-mezenchiminio perėjimo (EMT) indukciją skirtinguose vėžio tipuose, palaikančią galimą su EMT susijusios imunosupresijos mechanizmą 14 . Sunkiai ieškodami biomarkerio, visi tyrimai sutelkė dėmesį į PD-L1 raišką pirminiuose navikuose kaip kandidato atsakymo biomarkerį 15 . Iš literatūros duomenų matyti, kad nors bendras NSSLC sukelto atsako į Nivolumabą dažnis (ORR) yra didesnis pacientams, sergantiems PD-L1 teigiamais navikais, palyginti su neigiamais PD-L1, vis dėlto dauguma PD-L1 teigiamų navikų nereaguoja į anti-PD- 1 nukreipta imunoterapija, taip pat PD-L1 ekspresijos nebuvimas neatmeta 16, 17 atsako galimybės. Remiantis naujausia analize 18, Nivolumabo ORR 511 pacientų, sergančių PD-L1 teigiamais navikais, grupėje svyruoja nuo 16% iki 50%, o tai patvirtina, kad PD-L1 naviko audiniuose yra labai netobulas biomarkeris. Šis netobulumas gali atspindėti turimų tyrimų standartizacijos trūkumą, painiavą dėl ribinių verčių, kintančią PD-L1 išraišką atsižvelgiant į biopsijos laiką ir vietą bei plačią PD-L1 raišką, stebėtą vėžio ląstelėse ir kitų tipų ląstelėse, sudarančiose vėžio mikroaplinką. Kai kuriuos iš šių klausimų gali išspręsti skysčio biopsija, leidžianti atskleisti atsparumo mechanizmų dinamiškumą solidiniuose navikuose. Pasidomėjome, kodėl šiame pacientų pogrupyje PD-L1 teigiami CTC atrodo kaip atsparumo imunoterapijai žymeklis. Pateikta įrodymų, kad sergant plaučių vėžiu, PD-L1 raiška yra susijusi su blogu pacientų išgyvenimu 19 . Intratumorinis CD8 + T ląstelių išsekimas, kuris didžiąja dalimi prisideda prie to, kad imuninė sistema nepašalina vėžio, daugiausia buvo susijęs su naviko ląstelių PD-L1 raiška 20 . Kadangi PD-L1 teigiamos vėžinės ląstelės dažnai aptinkamos naviko invazijos priekyje 21, hipotezė, kad ląstelės, pasižyminčios agresyvesniais bruožais ir pasirengusios migruoti į kraują, gali išlaikyti PD-L1 kaip skydą, kad išvengtų imuninio atsako svetimoje mikroaplinkoje, skamba patraukliai. Tai yra pirmasis tyrimas, kurio metu buvo siekiama ištirti PD-L1 (+) CTC ryšį su atsaku į anti-PD-1 kontrolinio taško imunoterapiją. Mes spėjame, kad PD-L1, ekspresuojančių KTK į kraują, išlikimas gydymo metu gali atspindėti imunoterapijos pabėgimo mechanizmą, kurį pasirenka vėžinės ląstelės. Ar PD-L1 pasilieka iš pirminio naviko ar įgytas po atjungimo dėl selektyvaus slėgio, turi būti išsamiau paaiškinta atliekant pirminių navikų ir skystų biopsijų lyginamąją analizę. Pagrindiniai šio stebėjimo tyrimo trūkumai yra nedidelis populiacijos dydis, dėl kurio neįmanoma atlikti statistinės analizės, ir informacijos apie PD-L1 būklę pirminiuose navikuose trūkumas. Šis paskutinis punktas susijęs su išplėstine prieigos programa, kurioje Nivolumabas buvo patvirtintas nepriklausomai nuo PD-L1 statuso pirminiame navike. Tiksliai įvertinti PD-L1 ir TILs būklę naviko biopsijose būtų buvę naudinga siekiant išsiaiškinti, ar pacientams, kurie nereagavo į Nivolumabą, buvo būdinga teigiama PD-L1 išraiška ir TIL trūkumas, kurie būtų suponavę konstituciškai dominuojančią išraišką. PD-L1 ir vidinio imuninio atsparumo 22 . Šiuo metu tiriamas pacientų, kandidatuojančių į pirmąjį gydymą Nivolumabu, PD-L1 būklės skirtingose ​​mikroaplinkose, ypač pirminiame naviklyje ir kraujyje, palyginimas, kuris yra privalomas siekiant šio tikslo. Galiausiai šiame tyrime aprašytoje pacientų grupėje ilgesnis stebėjimo laikas gali padėti išsiaiškinti PD-L1 tendencijos reikšmę CTC pacientams, kurių atsakas yra ilgalaikis.

Medžiagos ir metodai

Pacientų

Buvo įtraukti 24 (24) pacientai, sergantys IV stadijos NSŠKL, kuriems buvo taikomas ankstesnis sisteminis gydymas ir kurie buvo įtraukti į išplėstinės prieigos prie Nivolumab programą. Reikalavimus atitinkantys pacientai buvo 18 metų ar vyresni, o Rytų kooperatinės onkologijos grupės (ECOG) efektyvumo rodiklis buvo 0 arba 1. Pacientų demografinės ir pradinės charakteristikos pateiktos 1 lentelėje.

Kraujo mėginių rinkimas

Iš anksto gavus išankstinį informuotą sutikimą, 7, 5 ml viso kraujo buvo surinkta į „CellSave Preserrative“ mėgintuvėlius (Janssen), kuriuose yra EDTA ir ląstelių fiksatorių iš pacientų ir sveikų normalių donorų savanorių. Mėginiai buvo palaikomi kambario temperatūroje ir apdoroti per 96 valandas. Metodai buvo atlikti laikantis atitinkamų gairių. Tyrimo protokolą patvirtino Romos Sapienza universiteto (Italija) Policlinico Umberto I etikos komitetas, protokolas Nr. 668/09. Iš visų pacientų buvo gautas informuotas sutikimas.

CTC nustatymas

Kiekvienas kraujo mėginys buvo apdorotas ir išanalizuotas „CellSearch System“ (Janssen). Visiems eksperimentams mes naudojome „CellSearch CXC“ rinkinį, kuriame yra ferofluidų pagrindu pagaminamas reagentas ir imunofluorescenciniai dažymo reagentai. Ferrofluidinį reagentą sudaro nanodalelės, turinčios magnetinę šerdį, apgaubtą polimeriniu sluoksniu, padengtu anti-epitelio ląstelių adhezijos molekulės (EpCAM) antikūnu CTC gaudyti. Po imunomagnetinio fiksavimo ir praturtinimo, identifikavimui ir skaičiavimui pridedami šie fluorescencinių dažymo reagentai: anti-CK-fluoresceino izotiocianatas (FITC), 4′-6-diamidino-2-fenilindolas (DAPI) ir anti-CD45-alifoficianinas (APC). . „CellSearch CXC Kit“ palieka kanalą, skirtą įvertinti papildomą žymeklį ant CTC. Į vartotojo apibrėžtą žymeklio kanalą pridėjome anti-žmogaus B7-H1 / PD-L1 fikoeritrinu (PE) konjuguotą antikūną (R&D sistema). Įvykis buvo klasifikuojamas kaip CTC, kai jo fenotipas yra EpCAM +, CK +, DAPI +, CD45- ir teigiamas arba neigiamas PD-L1.

Ląstelių linija ir auginimo sąlygos

H441 (ATCC) žmogaus plaučių vėžio ląstelių linija buvo parinkta remiantis anksčiau aprašyta PD-L1 raiška 8 . Ląstelių linija buvo auginama RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS) ir 1% penicilino-streptomicino (EuroClone SPA), esant 37 ° C, 5% CO 2 ir 95% oro.

Vakarų dėmė

Norint apibūdinti H441 ląstelių liniją kaip tinkamą teigiamą kontrolę, buvo atlikta Western blot analizė. Ląstelės du kartus plaunamos šaltu PBS, surenkamos ir po centrifugavimo ištirpinamos 10 mMTris-HCl, 160 mMNaCl, 1 mM EGTA, 1% deoksicholio rūgšties, 1% Tritono, 0, 1% SDS ir pilnoje mini proteazės inhibitoriaus kokteilio tabletėje ( Chemijos įmonė SIGMA). Ląstelėms buvo leista 30 minučių lizuoti vieną ledą ir po 30 minučių centrifugavimo esant 12000 g, tada supernatantas buvo surinktas. Baltymų koncentracija buvo nustatyta bicinchinino rūgšties (BCA) tyrimu. Baltymų ekstraktas (30 μg) buvo inkubuotas 100 ° C temperatūroje 10 minučių, atskirtas 4–12% SDS-PAGE geliu, nufiltruojamas ant PVDF membranos („GE Healthcare“) ir tiriamas per naktį 4 ° C temperatūroje naudojant šiuos pirminius antikūnus: pelių monokloninį antigeną. -pan-citokeratinai (2A4), pelių monokloninis anti-PD-L1 (1B12), pelių monokloninis anti-IgG1 (izotipo valdymas) (NCG01) (Abcam) ir pelių monokloninis anti-EpCAM (C-10) („Santa Cruz“ biotechnologija) . Membranos tris kartus 10 minučių plaunamos TBS ir 0, 1% Tween-20 ir paliekamos inkubuoti su atitinkamais antriniais antikūnais 1 valandą kambario temperatūroje. Po trijų plovimų imunoreaktyviosios juostos buvo vizualizuotos sustiprinta chemoliuminescencija (PerkinElmer). Pelės anti-aktinas („Santa Cruz Biotechnology“) tarnavo kaip baltymų įkrovos kontrolė.

Parametrų optimizavimas

Siekiant optimizuoti vartotojo apibrėžto žymeklio parametrus, buvo atlikta daugybė eksperimentų. Tam tikslui apibrėžti skaičiai (700) H441 ląstelių buvo padalinti į 7, 5 ml sveikų savanorių kraujo mėginius trimis egzemplioriais, kad būtų galima atlikti „CellSearch“ analizę. Buvo nustatyta, kad galutinė antikūnų koncentracija (0, 06 μg / ml) sukuria optimalų dažymą. Trumpai tariant, vienam mėginiui 1 μL pradinio antikūnų tirpalo (25 μg / ml) buvo praskiestas PBS ir CXC skiedimo buferiu, kad galutinis tūris būtų 450 μL. Tada praskiestas antikūnas buvo įpiltas į „CellSearch“ reagento taurę ir padėtas į „CellTracks Autoprep“ sistemos vieną iš nešiklio reagentų dėklo. „MagNest“ kasetės buvo nuskaitytos naudojant „CellSearch Analyzer II“ optimaliu ekspozicijos laiku (2.5), kad PD-L1 būtų vizualizuojamas vartotojo apibrėžtame žymeklio kanale per 24 valandas. Mes apdorojome H441 ląstelių liniją be žymeklio (neigiamos kontrolės) tais pačiais analizės parametrais, kad būtų atsižvelgta į foninį signalą, kuris gali būti susijęs su ekspozicijos laiku, naudojamu mėginių analizei. Toje pačioje koncentracijoje buvo naudojamas izotipo kontrolinis anti-pelės IgG1 PE-konjuguotas antikūnas (R&D sistema), kad būtų patvirtintas jungimosi tarp pirminio antikūno ir jo taikinio specifiškumas (3 pav.).

Image

A skydelis: EpCam, B-citokeratinų, PD-L1 ir izotipo kontrolė, atlikta H441 ląstelių linijoje, naudojamoje eksperimentams atlikti. B skiltis: Parametrų optimizavimas PD-L1 teigiamų CTC įvertinimui naudojant „CellSearch“ kontrolinių ląstelių linijoje, įpiltoje į sveiko donoro kraują. PD-L1 buvo aptiktas tik 4 -ajame kanale kontroliuojamoje ląstelių linijoje ir jo nebuvo izotipo kontrolėje, siekiant patvirtinti jungties tarp pirminio antikūno ir jo tikslo specifiškumą. Neigiamoje kontrolėje rastas silpnas foninis signalas.

Visas dydis

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Nicolazzo, C. et al . PD-L1 teigiamų cirkuliuojančių naviko ląstelių stebėjimas nesmulkialąsteliniu plaučių vėžiu sergantiems pacientams, gydytiems PD-1 inhibitoriumi Nivolumabu. Mokslas. Rep. 6, 31726; „doi“: 10.1038 / srep31726 (2016).

Pokyčių istorija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.