Monomerinė, bet ne trimerinė klarino sunkioji grandinė reguliuoja transkripciją, veikiančią p53 onkogenas

Monomerinė, bet ne trimerinė klarino sunkioji grandinė reguliuoja transkripciją, veikiančią p53 onkogenas

Anonim

Anotacija

Naviko slopinimo p53 baltymas yra transkripcijos faktorius, atsakingas už įvairius genus, įskaitant DNR atstatymą, augimo sustabdymą, apoptozę ir antiangiogenezę. Neseniai mes parodėme, kad klarino sunkioji grandinė (CHC), kuri iš pradžių buvo identifikuota kaip citozolinis baltymas, reguliuojantis endocitozę, yra branduoliuose ir veikia kaip p53 koaktyvatorius. Čia mes nustatėme išsamią CHC p53 rišančią vietą ir CHC delecijos mutantą, kuriame yra ši sritis (CHC833-1406), kuris elgėsi kaip monomeras ląstelėse. Monomerinis CHC833-1406 vis dar turėjo didesnį sugebėjimą aktivuoti p53 nei laukinio tipo CHC, nors šis CHC mutantas nebeatliko endocitinės funkcijos. Be to, panašiai kaip laukinio tipo CHC, monomerinis CHC padidina transkripciją p53 tarpininkaujant įdarbinant histono acetiltransferazę p300. Imunofluorescencinė mikroskopinė analizė parodė, kad CHC833-1406 daugiausia lokalizuotas branduoliuose, ir tai rodo, kad CHC C-terminale gali būti tam tikra reguliavimo sritis branduolio eksportui. Taigi, CHC trimerizacijos domenas nėra būtinas p53 taikinių genų transaktyvacijai, ir šie duomenys pateikia papildomus įrodymus, kad branduolinis CHC vaidina skirtingą vaidmenį nei klatrino tarpininkaujama endocitozė.

Įvadas

P53 genas, kuriame dažniausiai nustatomos žmogaus vėžio mutacijos, koduoja baltymą, kuris vaidina svarbų vaidmenį užkertant kelią augliogenezei (Levine, 1997; Prives ir Hall, 1999; Vogelstein ir kt., 2000; Vousden ir Lu, 2002) ; Bourdon ir kt., 2003; Oren, 2003). Nors buvo pasiūlyta, kad p53 atlieka įvairias funkcijas, tokias kaip transkripcijos aktyvacija ląstelių ciklo sustabdymui ir apoptozei (Bourdon ir kt., 2003; Oren, 2003), centrosomų dubliavimasis (Tarapore ir Fukasawa, 2002), homologinė rekombinacija (Linke et al., 2003), nukleotidų ekscizijos taisymas (Seo ir kt., 2002) ir nuo transkripcijos nepriklausoma mitochondrijų sukelta apoptozė (Mihara ir kt., 2003), manoma, kad transkripcijos reguliavimas p53 yra svarbiausias siekiant užkirsti kelią navikogenezei, nes dauguma p53 naviko ląstelių mutacijos yra centrinėje DNR jungiančioje srityje (Hollstein ir kt., 1991).

P53 baltymo ekspresijos lygį griežtai reguliuoja įvairūs E3 ubikvitino ligatai, įskaitant Mdm2 onkoproteiną (Haupt ir kt., 1997; Honda ir kt., 1997; Kubbutat ir kt., 1997), Pirh2 (Leng ir kt., 2003), COP1 (Dornan ir kt., 2004) ir ARF-BP1 / Mule (Chen ir kt., 2005; Zhong ir kt., 2005), kurie suriša p53, kad jį skaidytų (Brooks ir Gu, 2006). Reaguodamas į įvairius genotoksinius stresus, tokius kaip γ-švitinimas, UV ir priešnavikiniai vaistai, p53 stabilizuojamas ir aktyvuojamas atliekant posttransliacinį modifikavimą, įskaitant fosforilinimą, acetiliavimą ir metilinimą, siekiant skatinti įvairių genų, atsakingų už DNR atkūrimą, transkripciją (p53R2 ir GADD45). augimo sustojimas (p21 waf1 ) ir apoptozė (Bax, Noxa, Puma ir p53AIP1) (Levine, 1997; Prives and Hall, 1999; Vousden ir Lu, 2002; Bourdon ir kt., 2003). P53 tarpininkaujamų transkripcijos mechanizmų analizė yra svarbi norint išsiaiškinti navikogenezę ir sukurti naujus priešnavikinius vaistus. Nors buvo pranešta apie daugelį veiksnių, prisidedančių prie p53 aktyvumo reguliavimo (Prives ir Hall, 1999; Ljungman, 2000; Samuels-Lev ir kt., 2001), išsamūs mechanizmai dar turi būti išsiaiškinti. Neseniai pranešėme, kad p53 pakeitimas serinu ir fenilalaninu prie 46 kodono (p53S46F) smarkiai padidino p53 funkciją, todėl stabilizavosi sąveika su klarino sunkia grandine (CHC), kad pagerėtų p53 tarpininkaujama transkripcija (Enari et. al., 2006). Be to, neseniai buvo pranešta, kad p53S46F perduodamas adenovirusogenas genų efektyviau slopina vėžinių ląstelių auglį nei laukinio tipo p53 auglys in vivo (Nakamura ir kt., 2006).

Klatrino tarpininkaujant endocitiniam keliui, klatrinas yra sudarytas iš CHC trimerio ir yra susietas su kiekviena lengva grandine, vadinama triskelionu, ir jie toliau surenkami, kad sudarytų daugiakatedrę narvelio struktūrą (Kirchhausen, 2000). Poliaridinis clathrinas yra įdarbinamas į plazmos membraną ir skatina tam tikrų receptorių įsiskverbimą į organizmą pasiimti maistinių medžiagų arba perduoti teisingą tarpląstelinį signalą iš receptorių (McPherson et al., 2001). Be to, visai neseniai buvo pranešta, kad CHC vaidina svarbų vaidmenį mitozėje (Royle ir kt., 2005). CHC susideda iš N-galinio β-sraigto domeno, reikalingo prisijungti prie adapterio baltymų, kad būtų galima internalizuoti įvairias molekules, o po jo eina septynios α-spiralės pasikartojančios struktūros, vadinamos „klatrino pakartojimais“ (Kirchhausen, 2000). C-gale CHC turi trimerizacijos domeną, būtiną stabiliam poliaridinio klatrino struktūros formavimui (Wakeham ir kt., 2003). Neseniai parodėme, kad branduoliuose yra CHC, o branduolinis CHC, reaguodamas į DNR pažeidimą, sudarė kompleksą ir su p53, ir su histono acetiltransferaze p300. Taigi, mes parodėme, kad CHC, be endocitozės ir mitozės funkcijų, turi ir naują funkciją, kaip reguliuojančią p53 tarpininkaujamą transkripciją (Enari et al., 2006). Vis dėlto dar neaišku, ar p53 transaktyvacijai reikalingas trimerizuotas CHC susidarymas, kurio reikia grotelėms formuoti, siekiant skatinti nuo klatrino priklausomą endocitozę.

Šiame tyrime mes nustatėme išsamų pC3 jungiantį CHC domeną, naudodamiesi įvairiais CHC delecijos mutantais ir atskleidėme, kad CHC turinčios liekanos nuo 833 iki 1406 (CHC833-1406) neturi trimerizacijos ir klarino lengvosios grandinės (CLC) surišimo domenų sąveikos su p53. . Nors CHC833-1406 ne Oligomerizuojasi, jis vis tiek turi galimybę aktyvuoti p53, tai rodo, kad CHC oligomerizacija, kuri yra kritiška endocitozės ir mitozės metu, nėra būtina transkripcijai p53. Be mūsų ankstesnio stebėjimo (Enari ir kt., 2006), šie rezultatai dar patvirtina, kad CHC turi alternatyvią funkciją kaip koaktyvatorių p53 ir skiriasi nuo endocitozės bei mitozės reguliavimo.

Rezultatai

CHC trimerizacijos domenas nėra būtinas sąveikai su p53, o CHC rišantis domenas slopina sąveiką su p53

CHC apima N-galinį rutulinį domeną, reikalingą prisijungti prie įvairių endocitinių adapterių baltymų, kad būtų galima sureguliuoti endocitinius veiksmus, septynias kartotines struktūras, paskirtas kaip klatrino pakartojimus vidurinėje ir C-galo dalyse, po kurių seka CLC surišimo ir trimerizacijos domenai. C-galas. Anksčiau nustatėme CHC ir p53 sąveikos sritį ir parodėme, kad p53 jungiasi su CHC per CHC C galą (Enari et al., 2006); tačiau, nors CHC C-galas yra pagrindinė jungimosi prie p53 vieta, kitas CHC regionas taip pat reikalingas visiškam jungimosi prie p53 aktyvumui (duomenys nepateikti). Norint nustatyti išsamų regioną, kuris jungiasi su p53, PGR buvo naudojamas sukonstruoti įvairius CHC C-galo delecijos mutantus, ir jie buvo ekspresuoti kaip 35 S pažymėti baltymai in vitro transkripcijos / transliacijos sistemoje, naudojant triušio retikulocitų lizatus (1a pav. ). Atliekant autoradiografiją, kaip tikėtinos juostos buvo aptikti 35 S pažymėti CHC baltymai (1b paveikslas) ir, kaip aprašyta anksčiau (Enari et al.), Tiriama, ar jie prisijungia prie laukinio tipo p53, sulieto su glutationo- S -transferaze (GST-p53wt). ., 2006). Likučių nuo 1675 iki 1615 (CHC1-1634 ir CHC1-1615) trynimas neturi įtakos CHC prisijungimui prie p53 (1b paveikslas). Priešingai, ištrynimas 1522 liekanais (CHC1-1522) sumažino sąveiką su p53 (1b pav.), O tolesnis CHC ištrynimas į liekanas 1406 (CHC1-1406) atgavo p53 sąveiką, o tai rodo, kad C-galo sritis, kurioje yra trimerizacijos domenas, yra CHC nėra būtinas jungiantis prie p53 ir, greičiausiai, konkuruoja dėl prisijungimo prie CLC (1b pav.).

Image

Klarcino sunkiosios grandinės (CHC) p53 rišančios srities nustatymas. a ) Pilno ilgio CHC (CHC1-1675) ir jo C-galo delecijos mutantų schema. Mėlyna ir raudona dėžutės nurodo atitinkamai β-sraigto kamuolinį domeną ir klatrino kartotines struktūras. Trimerizacijos domeną vaizduoja juoda juosta. ( b ) p53 rišančios srities žemėlapis naudojant CHC mutantus su C-galo sutrumpinimu. 35S pažymėtas CHC1-1675 ir delecijos mutantai buvo susintetinti in vitro transkripcijos būdu sujungto vertimo sistema, naudojant triušio retikulocitų lizatus. Lizatai, kurių kiekviename yra 35S pažymėtas CHC baltymas, buvo sumaišyti su Sepharose granulėmis, imobilizuotomis glutation- S- transferazėje (GST) arba GST, sulietose su laukinio tipo p53 (GST-p53), kad būtų galima atlikti jungimosi testus. c ) CLC rišančios srities žemėlapis, naudojant N-galinius CHC mutantus. Retikulocitų lizatai, kurių kiekviename yra 35S pažymėtas CHC baltymas, buvo sumaišyti su Sepharose granulėmis, imobilizuotomis GST arba GST, sulietomis su laukinio tipo CLCa (GST-CLCa), kad būtų galima atlikti jungimosi testus. ( d ) CHC1-1675 ir jo N-galo delecijos mutantų scheminis vaizdas. ( e ) p53 rišančios srities žemėlapis, naudojant N-galinius CHC mutantus. Susintetinti 35S pažymėti CHC1-1675 ir delecijos mutantai su N-galo sutrumpinimu ir naudojami in vitro surišimo tyrimams, kaip aprašyta b punkte. Žvaigždutės nurodo įvairius CHC baltymus, ekspresuojamus retikulocitų lizatuose. f ) CHC1-1675 ir CHC833-1406, schematiškai parodytas, kuris atitinka 3 klatrino pakartojimą, kad pakartotų 6. g ) Reikalaujama, kad CHC būtų reikalingas regionas tarp 833 ir 1406 liekanų, kad būtų galima sąveikauti su p53. Susintetinti 35S pažymėti CHC1-1675 ir CHC833-1406 ir naudojami in vitro surišimo tyrimams. ( h ) H1299 ląstelės buvo transfekuotos kiekvienu HA-CHC konstruktu, neturint ar neturint FLAG pažymėto p53 konstrukto. FLAG pažymėtas p53 ląstelių lizatuose buvo imuniniu būdu nusodintas anti-FLAG antikūnu, o eluatai buvo užpilti ant 5–20% gradiento SDS – poliakrilamido gelio, po to imamasi imunoblotų su anti-HA antikūnais. CHC1-494 buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė imunoprecipitacijos tyrimui.

Visas dydis

Norint įvertinti, ar padidėja CHC, turinčio trimerizacijos domeną, gebėjimas prisijungti prie CLC, buvo paruoštos dvi CLC baltymų izoformos kaip GST sulietos baltymai. CHC delecijos mutantų, neturinčių trimerizacijos domeno, jungimosi afinitetas abiems GST-CLC baltymų izoformoms yra nuo trijų iki keturių kartų didesnis nei laukinio tipo CHC (1c pav.), Suderinamas su tuo, kad CHC, neturintis trimerizacijos domeno, turi stipresnį surišimo aktyvumą. ištirtas naudojant mielių dviejų hibridų sistemą (Chen et al., 2002). Taigi šie rezultatai leidžia manyti, kad padidėjęs CHC jungimosi prie CLC afinitetas lemia p53 pašalinimą iš CHC komplekso. Mutantai, papildomai išbraukiantys iš 1313, 1213 arba 1073 liekanų, turėjo mažai galimybių jungtis su p53, tai rodo, kad pagrindinė p53 rišanti CHC vieta yra tarp 1313 ir 1406 liekanų, nors visiškas surišimo afinitetas taip pat reikalingas CHC N-galinėje dalyje. iki p53 (žr. žemiau).

Toliau mes ištyrėme CHC N-galo trynimo įtaką prisijungimui prie p53, naudojant GST ištraukiamuosius testus. Kadangi CHC viduryje ir C gale yra septynios pasikartojančios struktūros (vadinamos klatrino pakartojimais) ir buvo pranešta apie numatomą šių regionų tretinę struktūrą (Ybe et al., 1999), mes sukūrėme įvairius CHC mutantus, turinčius N-galinę deleciją. pakartoti 1 (aa 686–1675), pakartoti 2 (aa 833–1675) ir pakartoti 3 (aa 979–1675), kad būtų galima įvertinti, kokių pakartotinių struktūrų reikia prisijungimui prie p53 (1d pav.). GST ištraukiamųjų testų analizė atskleidė, kad CHC833-1675 turėjo panašų p53 surišimo afinitetą su laukinio tipo CHC ir kad tolesnis trynimas pakartojant 3 žymiai sumažino sąveiką su p53 (1e pav.). Be to, mes sukūrėme CHC N- ir C-galines delecijas, turinčias regioną nuo 833-1406 liekanų (CHC833-1406), ir atlikome šio delecijos mutanto GST ištraukimo testą (1f pav.). Kaip ir tikėtasi, CHC833-1406 turėjo visišką surišimo afinitetą su p53, palyginti su laukinio tipo CHC (1g paveikslas). Be to, panaudodami anti-FLAG antikūną, mes ištyrėme FLAG pažymėto p53 ir hemagliutinino (HA) pažymėto CHC833-1406 sąveiką ląstelėse. Imunobloto analizė parodė, kad HA žymėtame CHC833-1406, taip pat HA pažymėtame pilnametražyje CHC buvo imunoprecipituotose medžiagose, turinčiose FLAG pažymėtą p53 iš H1299 ląstelių ekstraktų (1h pav.), Ir tai rodo, kad regionas nuo liekanų nuo 833 iki 1406 CHC, kuris atitinka 3–6 pakartojimus, yra minimali p53 jungimosi vieta, kad būtų galima visiškai surišti afinitetą.

CHC prisijungimas prie p53 koreliuoja su p53 transaktyvacija

Kai laukinio tipo CHC konstruktas buvo kotransfekuotas p53 ekspresijos vektoriu p53-null H1299 ląstelėse, įvairių p53 reaguojančių promotorių, įskaitant p21 waf1, Noxa, p53R2 ir p53AIP1 promotorius, transaktyvacija buvo žymiai pagerėjusi, palyginti su tais, kurie buvo transfekuoti tik p53 ( Enari ir kt., 2006). Šiomis sąlygomis mes ištyrėme CHC833-1406 poveikį įvairių p53 taikinių promotorių (p53AIP1, Noxa ir p21 waf1 promotorių) p53 transaktyvacijai . Žurnalistų tyrimai, naudojant įvairius p53 taikinių promotorius, parodė, kad nuo visų naudojamų promotorių nuo p53 priklausomos transaktivizacijos buvo pagerinta CHC833-1406 išraiška tiek p53-null H1299, tiek Saos-2 ląstelėse (2a ir b pav.), Parodant, kad CHC833- 1406, neturintis C-galo srities, turinčios trimerizacijos domeną, turi panašų ar gana didesnį aktyvumą p53 aktyvinti, palyginti su laukinio tipo CHC. Norėdami patvirtinti CHC833-1406 poveikį jo transkripciniam aktyvumui, endogeninių p53 taikinių genų indukcija buvo stebima naudojant atvirkštinės transkriptazės sujungtą pusiau kiekybinę PGR (RT – PGR). RT – PGR eksperimentai, parodantys, kad į p53 reaguojančių genų indukcija buvo padidinta kartu ekspresuojant CHC833–1406 su p53, iki panašių ar šiek tiek aukštesnių verčių, palyginti su viso ilgio CHC (2c pav.), Nors p53 baltymų lygis buvo beveik tas pats, kaip nustatyta atliekant imunoblotus (2d pav.).

Image

Nuo p53 priklausomos transkripcijos pagerinimas CHC833-1406. ( a, b ) Padidėjusi p53 transaktyvacija CHC833-1406 būdu, naudojant luciferazės pagrįstą reporterio testą. H1299 ląstelės ( a ) ir „Saos-2“ ląstelės ( b ) buvo transfekuotos 5 ng p53 konstrukto, 200 ng kiekvieno CHC konstrukto ir reporterio plazmidžių, kaip nurodyta, ir luciferazės aktyvumas buvo išmatuotas praėjus 24 val. Po transfekcijos. ( c ) Į endogeninius p53 reaguojančių genų ekspresijos padidėjimas CHC833-1406. H1299 ląstelės buvo transfekuotos p53 konstrukto ir CHC ekspresijos vektoriais ir praėjus 17 val. Po transfekcijos, p53-taikinių genų ekspresijos lygiai buvo analizuojami pusiau kokybine RT – PGR. PGR produktų intensyvumas buvo kiekybiškai įvertintas naudojant NIH Image programinę įrangą. d ) p53 ekspresijos lygis H1299 ląstelėse, naudojamose RT – PGR eksperimentams. CHC1-494 buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė RT – PGR eksperimentams.

Visas dydis

CHC sritis nuo 833 iki 1406 liekanų veikia kaip monomeras

CHC formuoja homo-trimerį per trimerizacijos domeną, esantį CHC C gale, ir homo-trimerį, toliau surinktą, kad sudarytų į narvą panašią struktūrą, atsakingą už endocitinę funkciją; todėl įvertinome, ar CHC833-1406, neturintis trimerizacijos domeno, mūsų sąlygomis iš tikrųjų buvo monomeras. Norėdami tai išsiaiškinti, pirmiausia atlikome imunoprecipitacijos testą su įvairiomis FLAG ir HA pažymėtomis CHC konstrukcijomis. ŽVALGĖLĖS arba HA pažymėtos laukinio tipo CHC arba abi konstrukcijos buvo transfekuotos į ląsteles, o ląstelių lizatai buvo nepašalinti anti-HA antikūnais. Imuninis kompleksas buvo išplautas ir eluatuose aptiktas FLAG pažymėtas CHC buvo aptiktas imunoblotu naudojant anti-FLAG antikūnus. Kaip parodyta 3a paveiksle, su VVG pažymėtu laukinio tipo CHC buvo galima susieti su HA pažymėtu laukinio tipo CHC. Kita vertus, CHC833-1406, neturintis trimerizacijos domeno, neturėjo arba labai mažai sugebėjo susieti su bet kokiais CHC baltymais ir nesudarė homo-oligomero (3a ir b pav.). Norėdami dar labiau apibūdinti CHC833-1406 polimerinę būklę, atlikome cheminio kryžminio sujungimo eksperimentus, naudodami bis [sulfosukcinimidil] suberatą (BS 3 ), biofunkcinį cheminį kryžminįjį ryšį, kurio ilgis 11, 4 Å, kuris buvo pasirinktas dėl kryžminio. - Anksčiau buvo naudojamas CHC susiejimas su dimetil-suberimidatu (DMS), kurio rankos ilgis yra panašus (11, 0 Å) (Kirchhausen ir Harrison, 1981). Kai rekombinantinis CHC1073-1675 baltymas, išgrynintas iš Escherichia coli, buvo sureaguotas su BS3, kurio koncentracija buvo 2 mM, jis buvo kryžminamas ir aptiktas trimerizuotas CHC1073-1675 formavimasis (3c paveikslas). Priešingai, CHC833-1406, neturintis trimerizacijos domeno, nebuvo oligomerizuotas net tada, kai buvo apdorotas BS3, ir buvo aptiktas kaip monomeras, kaip nustatyta dažant sidabru (3c paveikslas). Šie duomenys rodo, kad CHC833-1406, turintis galimybę aktyvinti p53, yra monomeras.

Image

CHC833-1406 yra monomeras. ( a ) CHC833-1406, neturintis C-galo trimerizacijos domeno, nesąveikauja su viso ilgio CHC1-1675. H1299 ląstelės buvo transfekuotos naudojant FLAG pažymėtą viso ilgio CHC1-1675 ir HA pažymėtą viso ilgio CHC1-1675 arba CHC833-1406. HA pažymėti CHC baltymai ląstelių lizatuose buvo imuniniu būdu nusodinti anti-HA antikūnais ir imunoblotuojami nurodytais antikūnais. ( b ) CHC833-1406 nesudaro homo-oligomero. ŽYMĖJIMAIS pažymėtas CHC (CHC833-1675 arba CHC833-1406) ir HA pažymėtas CHC (CHC833-1675 arba CHC833-1406) buvo ektopiškai ekspresuojami H1299 ląstelėse, o kiekvienas HA pažymėtas CHC baltymas ląstelių lizatuose buvo imuniniu būdu nusodintas anti-HA. antikūnas, po to atliekamas imunoblotas su nurodytais antikūnais. ( c ) CHC833-1406 yra monomeras. Scheminis rekombinantinio CHC baltymo, naudojamo kryžminio jungimo eksperimentuose, vaizdas (viršutinė plokštė). Apdorotų CHC baltymų (CHC1073-1675, CHC1073-1406 ir CHC833-1406) susietų rūšių sidabro dažymo schema parodyta apatinėse plokštėse. Šiame tyrime naudojami rekombinantiniai CHC baltymai buvo ekspresuojami E. coli ir išgryninami, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai. Išgryninti CHC baltymai buvo kryžminami su BS3, esant galutinei 2 mM koncentracijai 10 min., Esant 30 ° C, ir reakcija sustabdyta pridedant 1/5 tūrio 1 M Tris – HCl (pH 6, 8). Tinklinės rūšys buvo pašalintos naudojant 10% SDS – poliakrilamido gelio elektroforezę ir vizualizuotos dažant sidabru. Žvaigždutė nurodo nespecifinę juostą.

Visas dydis

CHC833-1406 poveikis klatrino sukeltai endocitozei

Atsižvelgiant į tai, kad CHC833-1406 nesudarė oligomero, mes paklausėme, ar šis CHC mutantas gali paveikti klatrino sukeltą endocitozę, kad būtų atmesta galimybė, kad p53 transkripcija CHC yra dėl nuo klatrino priklausomos endocitozės disfunkcijos. Ligando sukeltas transferino receptorių internalizavimas vyksta per klatrino sukeltą endocitozę, o transktrolino surišto transferino receptoriaus internalizacijos sistema buvo naudojama klatrino sukelto endocitozės analizei. Naudodamiesi šia sistema, mes ištyrėme monomerinio CHC mutanto poveikį klatrino sukeltai endocitozei. Atliekant šią eksperimentinę procedūrą, kiekvienas konstruktas, laukinio tipo CHC arba CHC833-1406, buvo perkeltas į ląsteles, neturint trumpų plaukų smeigtukų RNR (shRNR) ekspresijos vektoriaus, palyginti su 3′-ne-transliuojamu CHC mRNR (shRNR) regionu. -CHCunt), norėdamas sumažinti endogeninės CHC ekspresiją ir pamatyti ektopiškai išreikšto CHC poveikį endocitozei. Kai ląstelės buvo transfekuotos laukinio tipo CHC konstruktu be shRNR-CHCunt, fluorescenciniu žymėto transferino įsisavinimas šiek tiek padidėjo, palyginti su kontroliniu (4a paveikslas, 1 stulpelis, palyginti su 2), nors ląstelių paviršiaus surišto transferino kiekis buvo beveik tas pats kaip kontrolinis (4b paveikslas, 1 skiltis prieš 2). Ląstelėse, transfekuotose kontroliniu vektoriu ir shRNR-CHCunt, transferino endocitozė buvo stipriai sutrikusi ir sumažėjo iki 50% (4a paveikslas, 4 stulpelis), tuo tarpu kai ląstelės buvo transfekuojamos laukinio tipo CHC konstruktu ir shRNA-CHCunt, sunkus endocitozės defektas, padarytas shRNR-CHCunt, buvo atkurtas iki 90% (4a pav., 5 skiltis). Endocitinis aktyvumas transferino įsisavinimui gerai koreliuoja su CHC ekspresijos lygiu (4c paveikslas). Šiomis sąlygomis CHC833-1406 poveikis transferino endocitozei buvo panašus į tuščiojo vektoriaus (4a ir b pav.), Nors CHC833-1406 ir transferino receptorių išraiška yra panaši į viso ilgio CHC (4c paveikslas)., nurodantį, kad CHC833-1406 neturi arba turi mažai galimybių paveikti endocitinį poveikį.

Image

CHC833-1406 ekspresijos poveikis klatrino sukeltai endocitozei arba jo nedaug. a ) CHC833-1406 ekspresija neturi įtakos transferino receptorių sąlygotai endocitozei. HeLa ląstelės buvo transfekuotos nurodytomis plazmidėmis ir žaliosios fluorescencinės baltymo (GFP) ekspresijos plazmidėmis. Praėjus trims dienoms po transfekcijos, ląstelės 8 minutes buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje DMEM, turinčioje 20 μg ml −1 AlexaFluor-594 konjuguoto transferino (AF594-transferino) ir 0, 1% BSA. Pašalinus iš ląstelių paviršiaus surinktą AF594-transferriną, šios ląstelės buvo tripsinuotos ir pritvirtintos 4% paraformaldehidu. Norint išmatuoti AF594-transferino įsisavinimą, GFP teigiamos ląstelės buvo kiekybiškai įvertintos srauto citometrine analize, kaip aprašyta Medžiagos ir metodai. ( b ) Transferino receptorių ekspresijos ląstelės paviršiuje analizė. HeLa ląstelės buvo transfekuotos, kaip aprašyta a punkte, padalintos su 1 mM EDTA / PBS ir 20 minučių inkubuojamos ant ledo DMEM, turinčiame 20 μg ml −1 AF594-transferino ir 0, 1% BSA. Po plovimo su šaltu PBS, šios ląstelės buvo fiksuotos, o AF594-transferino kiekis, surištas ant ląstelės paviršiaus, buvo išmatuotas srauto citometrine analize. c ) CHC ir transferino receptorių ekspresijos lygiai HeLa ląstelėse, transfekuotose pSUPER-CHC ir CHC ekspresijos vektoriais. CHC ir transferino receptorių ekspresijos lygiai ląstelių lizatuose iš ląstelių, transfekuotų, kaip aprašyta a punkte, buvo analizuojami imunobotologiškai naudojant anti-CHC (X.22) arba antitransferrino receptorių antikūnus, kad būtų patvirtinta. Β-tubulino kiekis nurodomas kaip įkrovos kontrolė.

Visas dydis

Monomerinis CHC sustiprina apoptozę, veikiančią p53

Laukinio tipo CHC sustiprina p53 tarpininkaujamą apoptozę, kai ląstelės yra kotransfekuojamos CHC ir p53 ekspresijos vektoriais arba kai CHC konstruktas yra transfekuojamas į p53 teigiamas ląsteles (Enari et al., 2006); todėl toliau nagrinėjome, ar monomerinė CHC forma turi galimybę sustiprinti p53 tarpininkaujamą apoptozę. Kadangi kaspazės aktyvacija yra gerai apibūdinamas apoptozės žymeklis, kaspazės-3/7 aktyvacija buvo matuojama naudojant fluorogeninį substratą. Kai monomerinis CHC833-1406 konstruktas buvo kotransfekuotas p53 ekspresijos vektoriu, padidėjęs kaspazės-3/7 aktyvumas buvo aptiktas aukštesniame lygyje nei tų, kurie buvo kotransfekuoti laukinio tipo CHC ir p53 konstruktais (5a paveikslas), nors p53 ekspresijos lygis tarp šių mėginiai buvo panašūs (5b paveikslas). Be to, šį rezultatą taip pat patvirtinome stebėdami poli-ADP ribozės polimerazės-1 (PARP-1), žinomo kaip mirties substratas, skaidymą (5c paveikslas), rodantį, kad monomerinis CHC vis dar turi galimybę skatinti p53 tarpininkavimą. apoptozė.

Image

Nuo p53 priklausomos apoptozės sustiprinimas CHC nepriklausomai nuo oligomerizacijos. ( a ) sustiprintas kaspazės-3/7 aktyvacija apoptozės metu, kurią sukelia monomerinis CHC, esant p53. H1299 ląstelės buvo transfekuotos p53 ir CHC ekspresijos vektoriais. Praėjus 17 val. Po transfekcijos, ląstelės lizuojamos ir kaspazės-3/7 aktyvumas lizatuose buvo nustatytas fluorometriniu tyrimu. CHC1-494 buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė apoptozės tyrimui. b ) p53 ir CHC ekspresijos lygiai, naudojami ( a ) punkte. ( c ) sustiprėjęs PARP-1 skilimas, kurį sukelia p53 tarpininkaujama apoptozė, reaguodama į monomerinę CHC išraišką. Pirmiau paimti mėginiai buvo imituojami antibakteriniu PARP-1 antikūnu ir imunokompleksas buvo aptiktas sustiprinta chemiliuminescencija.

Visas dydis

p53 transaktyvacija monomeriniu CHC tarpininkauja p300

Anksčiau mes parodėme, kad CHC aktyvina p53, pasitelkdamas histono acetiltransferazę p300 (Enari et al., 2006). Norint ištirti, ar monomerinis CHC833-1406 sąveikauja su p300, buvo atliktas imunoprecipitacijos tyrimas. HA-pažymėtu CHC833-1406 buvo imuniteto nuosėdose, įskaitant FLAG pažymėtą p300, taip pat HA pažymėtą viso ilgio CHC (6a pav.). Norėdami ištirti, ar CHC833-1406, taip pat laukinio tipo CHC, bendradarbiauja su p300, kad stimuliuotų p53 tarpininkaujamą transkripcijos aktyvumą, buvo naudojamas reporterio tyrimas, naudojant p53AIP1 promotorių, kaip aprašyta aukščiau. Laukinio tipo p300 ir p53 negimdinė ekspresija su laukinio tipo CHC p53-null ląstelėse žymiai padidino p53 transaktyvaciją, palyginti su vien p53 (6b pav.). Panašiai kaip laukinio tipo CHC, CHC833-1406 sustiprino p300 tarpininkaujamą p53 transaktivizaciją (6b paveikslas). Be to, p300DN (liekanos nuo 1514 iki 1922), kuris veikia kaip dominuojantis neigiamas p300 transkripcijai, veikiančiai p53, slopino CHC833-1406 tarpininkaujamą p53 transaktivizaciją (6c paveikslas), parodydamas, kad monomerų sustiprinta p300 tarpininkaujama p53 transakcija. CHC forma yra beveik lygiavertė laukinio tipo CHC.

Image

Bendras CHC ir histono acetiltransferazės p300 poveikis nuo p53 priklausomai transkripcijai. ( a ) p300 ląstelėse sąveikauja su CHC833-1406, taip pat su viso ilgio CHC1-1675. H1299 ląstelės buvo transfekuotos FLAG pažymėtu p300 ir HA pažymėtu CHC konstruktais. Lizatai buvo paruošti praėjus 48 valandoms po transfekcijos, imunoprecipifikuoti anti-FLAG antikūnais, o eluatai imunoblotuojami nurodytais antikūnais. ( b ) CHC833-1406, bendradarbiaudamas su p300, aktyvuoja p53. H1299 ląstelės buvo transfekuotos 1 ng p53 konstrukto, 200 ng HA pažymėto p300 konstrukto, 200 ng CHC konstrukto ir 150 ng reporterio plazmidės, turinčios p53AIP1 promotorių, ir luciferazės aktyvumas ląstelių lizatuose buvo išmatuotas 24 valandas po transfekcijos. ( c ) Dominuojantis neigiamas p300 fragmentas (p300DN) slopina CHC833-1406 tarpininkaujamą p53 transakciją. H1299 ląstelės buvo transfekuotos 1 ng p53 konstrukto, 200 ng su FLAG pažymėto p300DN konstrukto, 200 ng CHC konstrukto ir 150 ng reporterio plazmidės, turinčios p53AIP1 promotorių, ir luciferazės aktyvumas ląstelių lizatuose buvo išmatuotas, kaip aprašyta b punkte.

Visas dydis

Padidėjęs monomerinio CHC branduolio lokalizacija

Anksčiau mes parodėme, kad branduoliuose yra maždaug 5% endogeninio CHC ir tai yra svarbu sukeliant p53 taikinius genus. Norėdami ištirti CHC baltymo trimerizacijos srities pašalinimo įtaką ląstelių lokalizacijai, atlikome konfokalinę imunofluorescencinę mikroskopinę analizę. HA pažymėti laukinio tipo CHC ir CHC833-1675, turintys trimerizacijos domeną, daugiausia buvo lokalizuoti citoplazmoje ir turėjo panašų lokalizacijos modelį kaip endogeninis CHC (7a ir b pav., O duomenys nepateikti). Tačiau HA pažymėtas CHC833-1406, neturintis trimerizacijos domeno, daugiausia susikaupusio branduoliuose ir pasižymintis padidėjusia branduolio lokalizacija (7a ir b pav.), Rodo, kad C-galo sritis, kurioje yra CHC trimerizacijos domenas, yra nepaprastai svarbi palaikant CHC citoplazmoje. CHC833-1406 gali sukelti p53 tarpininkaujamą apoptozę efektyviau nei viso ilgio CHC (5 pav.) Dėl padidėjusio branduolio kaupimosi, kurį sukelia CHC C-galo ištrynimas.

Image

Patobulinta CHC branduolinė lokalizacija, neturinti C-galo srities, turinčios trimerizacijos domeną. ( a ) dalis CHC833-1406 yra lokalizuota branduoliuose. HA pažymėtas viso ilgio CHC arba CHC833-1406 buvo ekspresuojamas H1299 ląstelėse, fiksuotose 4% paraformaldehido. Fiksuotos ląstelės buvo nuosekliai inkubuojamos su anti-HA antikūnais ir su AlexaFluor-594 konjuguotu antriniu antikūnu, ir jiems buvo atlikta imunofluorescencinė mikroskopinė analizė. Branduoliai buvo priešpriešinami propidium jodidu (PI). ( b ) CHC lokalinė ląstelių ląstelių ląstelė buvo kiekybiškai įvertinta darant fluorescencinius signalus iš konfokalinės imunofluorescencinės mikroskopinės analizės. Ląstelių lokalizacijos procentas ląstelių populiacijoje buvo apskaičiuotas naudojant daugiau nei 100 ląstelių per tris nepriklausomus eksperimentus. Parodytas ląstelių procentas, daugiausia lokalizuotas citoplazmoje (atviros juostos), vienodai lokalizuotos citoplazmoje ir branduolyje (išsiskleidusios juostos) ir daugiausia lokalizuotas branduolyje (juodos juostos). c ) Gydymas leptomicinu B (LMB) neturi įtakos CHC lokalizacijai. H1299 ląstelės buvo transfekuotos 400 ng HA pažymėtu CHC arba 400 ng GFP pažymėtu p53, sujungtu su branduolio eksporto signalo (NES) konstruktu. Kitą dieną ląstelės buvo apdorotos 10 nM LMB 24 valandas ir analizuojamos konfokalinės imunofluorescencinės mikroskopijos būdu. Branduoliai buvo priešpriešinami PI. ( d ) CHC ląstelių, ląstelių, apdorotų LMB, ląstelių ląstelių ląstelėse skaičius buvo nustatytas, įvertinant fluorescencinius signalus iš imunofluorescencinės mikroskopinės analizės, kaip aprašyta b punkte.

Visas dydis

Leptomicinas B yra branduolio eksporto inhibitorius, tarpininkaujamas CRM1, kuris yra branduolio eksporto faktorius. Jis blokuoja įvairių nukleocitoplazminių šaudyklinių baltymų, turinčių leucino turtingo branduolio eksporto signalo (NES) sekas, branduolinį eksportą (Kumar ir kt., 2006). Norėdami išsiaiškinti, ar CHC kaupimasis branduolyje priklauso nuo klasikinės branduolio eksporto sistemos, mes išbandėme leptomicino B poveikį branduoliniam CHC eksportui. Ląstelių gydymas leptomicinu B paskatino p53, susiliejusio su NES sekomis, gautomis iš cAMP priklausomos baltymo kinazės (PKI) inhibitoriaus, kuris, kaip žinoma, priklauso nuo CRM1, branduolį kaupimąsi (7c pav.). Atvirkščiai, leptomicinas B neturėjo arba nedaug veikė CHC kaupimąsi branduolyje (7c ir d paveikslai), rodantis, kad CHC branduolio lokalizaciją kontroliuoja nenustatyta branduolio eksporto sistema ir tikėtina, kad ji panaudos skirtingą branduolinio eksporto sistemą nei įprastas metodas.

Diskusija

Nors iš pradžių buvo nustatyta, kad CHC yra klarino tarpininkaujamos endocitozės, pūslelių transportavimo ir baltymų rūšiavimo reguliatorius, neseniai įrodėme, kad branduoliuose yra nedidelis kiekis CHC ir reikalingas p53 tarpininkaujant transkripcijai (Enari et al., 2006). . Yra žinoma, kad citozolinis CHC yra svarbus trimituojant ir formuojant į narvą panašią struktūrą atliekant endocitinį poveikį. Be to, neseniai pranešta, kad sergant mitozė reikalinga CHC diferenciacija (Royle ir Lagnado, 2006); tačiau vis dar neaišku, ar reikalinga branduolinio CHC trimerizacija transkripcijai p53 tarpininkauti.

Šiame tyrime mes sukūrėme įvairius CHC delecijos mutantus ir nustatėme išsamų regioną, atsakingą už sąveiką su p53. In vitro surišimo analizė, naudojant įvairius CHC mutantus, neturinčius N- ir / ir C-galinių sričių, parodė, kad sąveikauti su p53 reikia tarp 833 ir 1406 liekanų ir kad CH5 trimerizacijos domenas nėra būtinas jungiantis p53 (1 paveikslas). . Šis regionas atitinka klatrino pakartojimą 3–6, apie kuriuos nebuvo pranešta apie jungiamąjį baltymą, nors dalis šio regiono sutapo su CLC jungimu (Enari et al., 2006). Šie duomenys atitinka mūsų ankstesnį pastebėjimą (Enari et al., 2006), kad tiek CLC, tiek p53 abipusiai jungiasi tik su klatrino pakartojimu 6 šiame regione. Be to, analizuojant p53 transaktivizaciją, naudojant reporterio testą, reikia, kad CHC sąveika su p53 būtų reikalinga ir koreliuotųsi su sustiprinta p53 transaktyvacija (2 paveikslas).

Neseniai pastebėjome didelį p53 N-galinio transaktyvacijos domeno aplink Ser46 panašumą su CLC jungiančiu CHC regionu ir kritišką Trp108 liekaną (galvijų CLCa) CHC surišimui, išsaugotą p53 (Chen et al., 2002; Enari). et al., 2006). Manoma, kad CLC konkuruoja su p53 per šį homologinį regioną, ypač per klatrino 6 pakartojimą. Trečioji p53-CHC komplekso struktūra dar turi būti nustatyta ir tai padės išsiaiškinti mechanizmus, kuriais CHC aktyvuoja p53.

Yra žinoma, kad CHC trimerizacijos sritis yra reikalinga endocitinei funkcijai, o endocitozės disreguliacija gali sukelti įvairius globalius pakitimus, įskaitant ląstelių išgyvenimą, ląstelių augimą ir ląstelių mirties signalus. Norėdami atmesti galimybę, kad pC53 transkripciją CHC833-1406 sukelia klatrino sukelta endocitozė, pirmiausia atlikome koimuninio nusodinimo tyrimą. Kaip ir tikėtasi, šis tyrimas rodo, kad nei endogeninis CHC, nei CHC, turintis C-galo trimerizacijos domeną, nebuvo kartu nusodinti su FLAG pažymėtu CHC833-1406 (3 paveikslas). Be to, transferino įsisavinimo ląstelėse tyrimas patvirtina, kad CHC833-1406 iš tikrųjų nedaro įtakos klatrino sukeltai endocitozei (4 paveikslas). Rezultatai rodo, kad CHC833-1406 yra ląstelėse monomerinės formos pavidalu ir turi savybę transactivuoti p53, jei nepaveikiama klatrino sukelta endocitozė (4 paveikslas). Taigi, šie radiniai pateikia papildomų įrodymų, kad CHC vaidina skirtingą vaidmenį nuo žinomų CHC funkcijų, tokių kaip endocitozė ir mitozė; vis dėlto ar ląstelėse yra monomerinio CHC? Gelio filtravimo ir glicerolio gradiento eksperimentai iš įvairių ataskaitų rodo, kad kai kurios endogeninės ir ektopetiškai išreikštos CHC populiacijos ląstelėse egzistuoja kaip monomeras, nors autoriai neminėjo CHC polimerinės būklės (Kim ir Kim, 2000; Barth ir Holstein)., 2004; Royle ir Lagnado, 2006). Endogeninio monomerinio CHC, parodyto hidrodinaminiais metodais, svarba išlieka neaiški ir reikės atlikti papildomus tyrimus, norint įsitikinti, kad monomerinis CHC ląstelėse vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant p53 tarpininkaujamą transkripciją.

Nors iki šiol buvo pranešta, kad daugybė baltymų jungiasi prie CHC N-galinio domeno (Kirchhausen, 2000; Dell'Angelica, 2001; Lafer, 2002), pranešimo apie ryšį su regionu, kuris čia nurodytas kaip p53, nėra. -įrišimo sritis, atitinkanti 3–6 pakartojimą. Kai kurie endocitiniai baltymai, įskaitant β-areztinus, epsin1 ir eps15, persikelia iš citoplazmų į branduolius, reaguodami į leptomicino B arba fiziologinius giminingus G baltymų sujungtų receptorių ligandus, ir buvo priversti veikti kaip transkripcijos moduliatoriai tam tikriems taikiniams genams (Vecchi et al., 2001; Kang ir kt., 2005). Kadangi dauguma endocitinių reguliatorių jungiasi prie CHC N-galiniame domene, kuris nėra būtinas p53 transaktyvacijai, jie gali nereguliuoti p53 tarpininkaujamos transkripcijos jungdamiesi CHC; tačiau mes negalime atmesti galimybės, kad kai kurie endocitinius reguliatoriai gali modifikuoti kitus transkripcijos veiksnius bendradarbiaudami su branduoline CHC.

CHC yra labai gausus baltymų kiekis ląstelėse, o daugiausia CHC yra citoplazmoje. Tačiau, kaip mes anksčiau pranešėme naujausiame dokumente (Enari et al., 2006), branduoliuose yra maždaug 5% CHC ir jo reikia transkripcijai p53 tarpininkauti. Be to, imunoelektrine mikroskopine analize nustatyta, kad CHC iš tikrųjų yra nepažeistose ląstelėse, kaip aprašyta anksčiau (Enari et al., 2006). Norėdami toliau parodyti šį fiziologinį tinkamumą, mes kiekybiškai įvertinome, kiek CHC ir p53 molekulių yra branduoliuose. Mes išgryninome rekombinantinį CHC ir p53 iš ląstelių, kurios buvo ektopiškai užkrėstos FLAG pažymėtu CHC arba p53, ir išgrynintų baltymų koncentracijos buvo nustatytos CBB dažymu, palyginus su žinoma galvijų serumo albumino (BSA) koncentracija. CHC ir p53 kiekiai citozolinėje ir branduolinėje frakcijose buvo apskaičiuoti naudojant išgrynintą CHC ir p53. Šie eksperimentai parodė, kad DNR pažeistose ląstelėse yra apytiksliai 4, 74x105 CHC molekulių branduolyje, kita vertus, DNR pažeistose ląstelėse yra 0, 34 × 105 p53 molekulių, esančių branduolyje, kaip nustatyta NIH vaizdinio 1.6.1 versijos densitometrijoje ( neskelbtini duomenys). Taigi, branduolinis CHC yra gausiau už DNR sugadintą sukauptą branduolinį p53, nors branduoliuose esantis CHC kiekis sudaro tik 5% viso CHC baltymo, patvirtindamas, kad CHC veikia kaip p53 koaktyvatorius.

Ankstesnis mūsų pastebėjimas, kad branduoliuose yra nedidelė CHC dalis, rodo, kad tam tikra CHC dalis reikalinga norint išlaikyti citoplazmą ar užkirsti kelią branduolio importui. Norėdami ištirti CHC branduolinio pernešimo reguliavimo mechanizmą, šiame tyrime buvo naudojamas leptomicinas B, specifinis nuo CRM1 / Exportin1 priklausomo branduolinio eksporto inhibitorius. Deja, leptomicinas B nepadarė jokio poveikio CHC lokalizacijai, o tai rodo, kad CHC branduolinis pernešimas vykdomas nepriklausomai nuo CRM1 / Exportin1 (7 pav.). Keista, tačiau C-galo srities (1523–1675 liekanų) ištrynimas iš CHC lemia padidėjusį branduolio kaupimąsi, kas rodo, kad CHC turi potencialą patekti į branduolį ir kad galimas stiprus branduolio eksportas ar citoplazmos susilaikymo sekos. C-galo sritis, kurioje yra CHC trimerizacijos domenas. Iki šiol buvo nustatyti septyni branduolinio ginklo eksporto veiksniai, įskaitant CRM1, CAS, Exp-t, Exp-4, -5, -6 ir -7 (Kutay ir Guttinger, 2005). Be to, kai kuriuos transkripcijos veiksnius citoplazmoje sulaiko tam tikri baltymai, susiję su aktino ir mikrotubulų citoskeletais (Ziegler ir Ghosh, 2005). Ateityje reikės išaiškinti CHC branduolinio pernešimo mechanizmą, kad būtų galima nustatyti, kuris veiksnys yra atsakingas už CHC citoplazminį susilaikymą.

Apibendrinant, mes apibrėžėme minimalų p53 rišančią CHC sritį ir įrodėme, kad monomerinis CHC vis dar turi galimybę aktyvuoti p53. Kadangi monomerinis CHC nedaro įtakos klatrino tarpininkaujamai endocitozei ir daugiausia kaupiasi branduolyje, kad padidintų p53 tarpininkaujamą transkripciją, jis gali būti panaudotas kaip priešnavikinis vaistas be jokio šalutinio poveikio.

medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūra ir transfekcija

Žmogaus plaučių karcinomos H1299 ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% galvijo vaisiaus serumo ir penicilino / streptomicino. Žmogaus gimdos kaklelio karcinomos HeLa ląstelės ir žmogaus osteosarkomos Saos-2 ląstelės buvo auginamos Dulbecco modifikuotoje Eagle terpėje (DMEM), papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo ir penicilino / streptomicino, esant 37 ° C, 5% CO 2 atmosferoje.

Transfekcijai ląstelės dieną prieš transfekciją buvo apdengtos 80–90% konfluencija ir pagal gamintojo protokolą buvo perpiltos lipofectAmine 2000 reagentu (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV).

Plazmidės ir antikūnai

PAVIRŠIAI pažymėtos p53, HA pažymėtos ir nepažymėtos viso ilgio CHC ekspresijos plazmidės buvo aprašytos anksčiau (Enari et al., 2006). cDNR, koduojantys kiekvieną CHC fragmentą, buvo amplifikuoti PGR ir klonuoti į pcDNA3.1 (Invitrogen) arba pCAGGS (Niwa et al., 1991) su HA epitopu ir be jo ir patvirtinti DNR seka. Už shRNR išraiškos prieš 3'-netransliuotos regione CHC mRNR, sintetinių oligoDNAs, 5'-GATCCCCAGAGCACCATGATTCCAATTTCAAGAGATTGGAATCATGGTGCTCTTTTTTGGAAA-3 'ir 5'-AGCTTTTCCAAAAAGAGCACCATGATTCCAATTCTCTTGAAATTGGAATCATGGTGCTCTGGG-3', buvo atkaitinto ir klonuotas į pSUPER vektoriaus (Brummelkamp ir kt., 2002) . Anti-Mdm2 antikūnas (Ab1) buvo įsigytas iš Calbiochem. Anti-p21 antikūnas (SX.118) buvo įsigytas iš „BD Pharmingen“ (Tokijas, Japonija). Krienų peroksidaze konjuguotas anti-p53 antikūnas (DO-1) buvo įsigytas iš „Santa Cruz Biotechnology Inc.“ (Santa Krusas, Kalifornija, JAV). Anti-PARP ir anti-HA (6E2) antikūnai buvo įsigyti iš Cell Signaling Technology (Beverly, MA, JAV). Anti-FLAG antikūnas (M2) buvo įsigytas iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO, JAV). Antitransferrino receptoriaus antikūnas buvo įsigytas iš Zymed (San Franciskas, Kalifornija, JAV).

Imuninis nusodinimas ir imunoblotų nustatymas

H1299 ląstelės (1, 8x106) buvo transfekuotos FLAG pažymėtomis ir (arba) HA pažymėtomis CHC plazmidėmis ir surinktos praėjus 21 val. Po transfekcijos. Ląstelės lizuojamos lizės buferiu (50 mM Tris – HCl, kurio pH 7, 2, 250 mM NaCl, 0, 1 mM EDTA, 0, 1 mM EGTA, 2 m M MgCl2, 0, 1% nonidet P-40, 0, 1 mM DTT, 10 μg ml −1 antipain, 10 μg ml −1 pepstatino, 10 μg ml −1 chmostatinas, 10 μg ml −1 leupeptino, 10 μg ml −1 E-64, 10 μg ml −1 aPMSF, 1 mM Na 3 VO. 4 ir 10 mM NaF) 20 min ant ledo, o lizatas nuskaidrinamas centrifuguojant 20 000 g 20 min. Kad būtų galima nusipirkti baltymą, pažymėtą vėliava, lizato imuninis nusodinimas atliekamas 10 μl M2-agarozės granulių (Sigma) 2 valandas ir tris kartus plaunamas lizės buferiu. Imuniniai nusėdimai buvo išplaunami naudojant 3 × Flag peptidą (Sigma) 4 ° C temperatūroje 30 min., Atskiriant natrio dodecilsulfato ir poliakrilamido gelio elektroforeze (SDS – PAGE) ir imituojant juos nurodytais antikūnais. Imunoprecipitacijai su HA pažymėtais baltymais buvo naudojami anti-HA antikūnai (12CA5) ir baltymo G sefarozė („GE Healthcare“, Tokijas, Japonija). Susieti baltymai buvo išplaunami verdant 100 ° C temperatūroje 5 minutes ir buvo tiriami SDS – PAGE, po to atliktas imunoblotas. Norint atlikti imunoblotus, baltymai SDS poliakrilamido geliuose buvo perkelti į polivinilideno fluoro (PDVF) membraną (Millipore, Bedfordas, MA, JAV), membranos buvo užblokuotos 5% neriebiu pienu tris kartus buferiniame druskos tirpale su Tween (TBS-T) buferiu. (20 mM Tris – HCl, esant 7, 6 pH ir 137 mM NaCl ir 0, 1% Tween 20) 1 val., Iš eilės tiriant pirminiais antikūnais per naktį 4 ° C temperatūroje ir antriniu antikūnu, konjuguotu su krienų peroksidaze 1 valandą kambario temperatūroje. . Antigenai buvo vizualizuoti ECL chemiliuminescencija (GE Healthcare).

Rekombinantiniai baltymai ir cheminis kryžminimas

Įvairių rekombinantinių CHC baltymų ekspresijai išreikšti cDNR, koduojantys CHC fragmentus 1073–1675, 1073–1406 ir 833–1406, buvo klonuoti į pGEX-6P vektorių ir transformuoti į E. coli DH10B ląsteles. Šios bakterijos, turinčios kiekvieną pGEX-CHC plazmidę, buvo auginamos Luria sultinio terpėje, kol OD 600 pasiekė 0, 6–0, 8. GST-CHC ekspresija buvo sukelta pridedant izopropil-D-tiogalaktopiranozido (IPTG), kai galutinė koncentracija buvo 0, 1 mM, ir nepertraukiamą auginimą 30 ° C temperatūroje 3 valandas. Ląstelės buvo susuktos ir suardytos ultragarsu 4 ° C temperatūroje, o lizatai buvo centrifuguojami 20 000 g 4 ° C temperatūroje 10 min. Gauti supernatantai buvo maišomi su glutationo-Sepharose 4B (GE Healthcare) 1 valandą 4 ° C temperatūroje. Karoliukai keturis kartus buvo plaunami 25 mM „Hepes-NaOH“, esant pH 7, 5, 150 mM NaCl, 0, 1 mM DTT ir rekombinantiniams CHC baltymams, 4 ° C temperatūroje per naktį išplaunami aštuoniais vienetais „PreScission“ proteazės („GE Healthcare“).

Cheminiam kryžminimui kiekvienas išgrynintas CHC fragmentas buvo praskiestas 25 mM Hepes-NaOH (pH 7, 5) 150 mM NaCl koncentracija 20 μg ml −1 . Norint užtikrinti pakankamą buferinį tūrį, buvo pridėta 1/5 tūrio 1 M trietanolamino, kurio pH 8, 5. Cheminis kryžminis jungiklis BS 3 (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, JAV) buvo ištirpintas 5 mM natrio citrate (pH 5, 0) ir panaudotas šiam tyrimui per 2 minutes. Vienas tūris 10 mM BS3 buvo sumaišytas su keturiais tūriais baltymų mėginių ir inkubuotas 30 ° C temperatūroje 10 min. Kryžminio susiejimo reakcija (10 μl) buvo nutraukta pridedant 1/5 tūrio (2 μl) 1 M Tris – HCl, esant 6, 8 pH. Mėginiai virinami 2 minutes, atskirti SDS-PAGE ir vizualizuoti sidabriniu dažymu.

Endocitozės tyrimas

Norint išanalizuoti CHC fragmentų poveikį endocitiniam aktyvumui, HeLa ląstelės (3x105) buvo transfekuotos 1 μg pSUPER-CHC ir 2 μg pCAGGS-CHC vektoriais kartu su 50 ng pmaxGFP vektoriaus (Amaxa), kuris buvo transfekcija. žymeklis. Praėjus trims dienoms po transfekcijos, ląstelės 3 valandas buvo inkubuotos DMEM, turinčiame 0, 1% BSA, po to 8 min 37 ° C temperatūroje apdorojant 20 μg ml −1 Alexafluor-594 konjuguoto transferino (AF594-transferinas, molekuliniai zondai). Ląstelės buvo greitai atšaldytos plačiai plaunant ledu šaltu fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS), o po to ląstelės paviršiuje esantis AF594-transferinas buvo pašalintas plaunant ledo šaltos rūgšties plovimo buferiu, kuriame yra 0, 2 M acto rūgšties (pH 4, 5) ir 0, 5 M NaCl. Šios ląstelės buvo tripsinizuotos, fiksuotos 4% paraformaldehidu PBS 20 minučių kambario temperatūroje ir pakartotinai suspenduotos 0, 1% BSA PBS. Santykinė fluorescencija buvo kiekybiškai įvertinta atlikus citometrinę analizę (Beckton Dickinson, Franklin, NJ, JAV), kai buvo naudojamas internalizuotas AF594-transferinas.

Norėdami išmatuoti ląstelės paviršiuje esančius transferino receptorius, ląstelės pirmiausia buvo atskirtos naudojant PBS, turinčio 1 mM EDTA, ir inkubuojamos ant ledo su 20 μg ml −1 AF594-transferino 20 min. Tada ląstelės vieną kartą plaunamos ledo šaltu PBS, 20 minučių kambario temperatūroje fiksuojamos 4% paraformaldehidu PBS ir po to pakartotinai suspenduojamos 0, 1% BSA PBS. Santykinė fluorescencija buvo kiekybiškai įvertinta atlikus citometrinę AF594-transferino srauto citometrinę analizę.

RT – PGR

RT – PGR tyrimas buvo atliktas iš esmės taip, kaip aprašyta Enari et al. (2006). Trumpai tariant, visa RNR buvo išskirta naudojant „RNeasy“ mini rinkinį (QIAGEN, Valensija, Kalifornija, JAV), o penki mikrogramai visos RNR buvo atvirkščiai perrašyti naudojant „Superscript II“ pirmosios krypties sintezės rinkinį (Invitrogen), naudojant oligo-dT pradmenis. Pusiau kiekybinei PGR buvo naudojami atvirkščiai perrašyti produktai. Pradmenų sekos ir PGR programos buvo aprašytos Enari et al. (2006). PGR produktai buvo išskaidyti naudojant 2% agarozės gelio elektroforezę ir vizualizuoti etidžio bromidu.

Žurnalisto tyrimas

Žurnalistų tyrimas buvo atliktas iš esmės, kaip aprašyta anksčiau (Enari et al., 2006). Trumpai tariant, H1299 ląstelės (4 × 10 4 ) arba „Saos-2“ ląstelės (3 × 10 4 ), išklotos 24 šulinėlių plokštelėse, buvo perpiltos 1–5 ng pC53-SN3, 200 ng pcDNA3.1-CHC, 200 ng pCMVβ-p300 ir 150 ng nurodytų reporterių vektorių kartu su 10 ng phRG-TK, koduojančiu Renilla luciferazę kaip vidinę kontrolę. Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo surinktos ir luciferazės aktyvumas kiekybiškai įvertintas dviguba luciferazės tyrimo sistema (Promega, Madison, WI, JAV) pagal gamintojo instrukcijas.

Apoptozės tyrimas

Kaspazės-3/7 tyrimui H1299 ląstelės (2x105) buvo transfekuotos 50 ng pC53-SN3 su 2 μg pcDNA3.1-CHC arba be jo. Po 17 valandų inkubacijos ląstelės buvo surinktos ir kaspazės-3/7 aktyvumas ląstelių lizatuose išmatuotas CaspACE tyrimo rinkiniu, naudojant fluorogeninius substratus (Promega) pagal gamintojo instrukcijas.

In vitro surišimo tyrimas

Norint išanalizuoti CHC ir p53 sąveiką, buvo atliktas GST-pull-down testas, kaip aprašyta anksčiau (Enari et al., 2006). Trumpai tariant, bakteriniai lizatai, kurių sudėtyje yra p53, sulieti su GST (GST-p53), buvo inkubuojami su glutationo-sefarozės granulėmis („GE Healthcare“) ir plačiai plaunami rišamuoju buferiu (50 mM Tris – HCl, esant pH 7, 2, 250 m M NaCl, 0, 1). m M EDTA, 0, 1 m M EGTA, 2 m M MgCl 2, 0, 1% Tween 20, 0, 1 m M DTT, 10 μg ml −1 antipain, 10 μg ml −1 pepstatinas, 10 μg ml −1 chmostatinas, 10 μg ml - 1 leupeptinas, 10 μg ml −1 E-64, 10 μg ml −1 aPMSF, 1 m M Na 3 VO 4, 10 m M NaF). 35 S žymėtas pilno ilgio CHC ir jo delecijos dariniai buvo susintetinti naudojant in vitro transkripcijos / transliacijos būdu sujungtą retikulocitų lizato sistemą (Promega). Lizatai, turintys 35S pažymėtus CHC baltymus, buvo praskiedžiami 12 tūrių rišančio buferio ir inkubuojami su aukščiau išvardintomis granulėmis, imobilizuotomis GST-p53, 4 ° C temperatūroje 2 valandas. Po plovimo 1 ml rišamojo buferio, surišti baltymai išplaunami verdant SDS mėginių užpildymo buferyje 5 minutes, veikiant 10% SDS – PAGE ir analizuojami autoradiografijos būdu.

Imunofluorescencija

H1299 ląstelės (2x104) buvo pasodintos į 8 šulinėlių „Labtek II“ kamerą (NalgeNunc, Tokijas, Japonija). Kitą dieną ląstelės buvo transfekuotos 400 ng pcDNA3.1-HA-CHC ir inkubuojamos 24 valandas. Ląstelės buvo fiksuotos 4% paraformaldehidu PBS, permeabiliuotos 0, 1% Triton X-100 ir užblokuotos 3% BSA PBS. Kamera nuosekliai inkubuojama su anti-HA antikūnais 1 valandą kambario temperatūroje ir su „AlexaFluor488“ arba „AlexaFluor594“ pažymėtu antriniu antikūnu (Molecular Probes, Eugene, OR, JAV) ir sumontuojama kartu su „Vectashield“ („Vector Laboratories“, Burlingame, CA, JAV). . Konfokinė imunofluorescencija buvo atlikta naudojant ECLIPSE E600 fluorescencinį mikroskopą (Nikonas, Tokijas, Japonija), aprūpintą Radiance 2000 vaizdo gavimo sistema (Bio-Rad, Hercules, CA, JAV). Norint įvertinti CHC subkauląstelinę lokalizaciją, buvo suskaičiuota daugiau kaip 100 ląstelių viename mėginyje.