Mtbdrplus greitam akių tuberkuliozės diagnozavimui ir atsparumo vaistams patikrinimui | akis

Mtbdrplus greitam akių tuberkuliozės diagnozavimui ir atsparumo vaistams patikrinimui | akis

Anonim

Dalykai

  • Diagnozė
  • Medicininiai tyrimai
  • Tuberkuliozė

Anotacija

Tikslas

Laiku diagnozuota intraokulinė tuberkuliozė (IOTB) ir aptiktas atsparumas vaistams gali išgelbėti daugelį akių nuo regėjimo sutrikimų. Daugėjant IOTB ir didėjant atsparumui vaistams, skubiai reikalinga patikima diagnostikos platforma, leidžianti tuo pat metu nustatyti sukėlėją ir mutavusį geną. MTBDRplus tyrimas buvo tiesiogiai įvertintas stiklakūnio skysčio mėginiuose.

Pacientai ir metodai

Perspektyviame tyrime MTBDRplus tyrimas buvo atliktas su 127 stiklakūnio skysčio mėginiais (77 „tyrimo grupė“, apimanti įtariamos akių tuberkuliozės atvejus, ir 50 „kontrolinės grupės“ ligos kontrolės atvejų ( n = 25) ir neuveitinės kontrolės ( n = 25)). Visi mėginiai, teigiami MTBDRplus tyrimu, buvo tiriami genų seka, siekiant patvirtinti rifampicino ir izoniazido atsparumo mutacijas.

Rezultatai

MTBDRplus tyrimas nustatė IOTB aptikimui atitinkamai 36, 36%, 100%, 100% ir 50, 50% jautrumą, specifiškumą, teigiamą prognozuojamąją vertę (PPV) ir neigiamą prognozuojamąją vertę (NPV). Iš 28 tyrimų grupės atvejų, kurių MTBDRplus tyrimas buvo teigiamas, šeši buvo pranešti apie atsparumą rifampicinui, o dviem - atsparumą izoniazidui. Sekavus rpoB ir katG geną, buvo nustatytas vienas atvejis, kai MTBDRplus sukėlė melagingą rifampicinui atsparų atvejį. Kiti atsparūs izoliatai parodė atitinkamas mutacijas tarp MTBDRplus tyrimo ir sekos nustatymo.

Išvada

MTBDRplus tyrimas yra veiksminga priemonė greitai diagnozuoti IOTB ir nustatyti atsparumą vaistams, taip pagerinant IOTB rezultatą.

Įvadas

Intraokulinė tuberkuliozė (IOTB) yra vienas iš daugybės Mycobacterium tuberculosis - bacilos, žinomos dėl ne pulmonalinio plitimo, pristatymų. Dvigubas ligos požymis yra akys tiesiogiai per hematogeninį plitimą arba netiesiogiai dėl padidėjusio jautrumo reakcijos dėl infekcijos kitoje vietoje 1, todėl IOTB nėra tokia reta ligos rūšis, ypač endeminėse šalyse. IOTB dažnis skirtinguose tyrimuose skiriasi. Jis ne tik siaučia didelio endemijos vietose, sudarančiose 10, 5% visų uveito atvejų 2, bet ir mažai endeminėse vietose, kur jos paplitimas yra nuo 1 iki 7%, 3, 4 ir didėja. 5 Nesant vienodos IOTB atvejo apibrėžties 6, šie skaičiai taip pat gali būti labai nuvertinti. Kadangi IOTB 7 proc. Užkrėstų akių per 6 mėnesius pasireiškia vidutinio sunkumo ar sunkiais regos sutrikimais, 7 būtina greitai ir teisingai diagnozuoti. Didėjantis atsparumas daugeliui vaistų nuo tuberkuliozės procentas pabrėžia atsparumo genų tyrimų svarbą ir IOTB pacientų populiacijoje. 8

IOTB diagnozė yra didelis iššūkis. Klinikinis kitų etiologijų, tiek infekcinių, tiek neinfekcinių, modeliavimas ir imuninis atsakas į tuberkuliozės antigenus tolimose vietose prisideda prie diagnostinės painiavos. Dėl akių angiografijos ir ultragarso klinikinių apraiškų ir ribotos pagalbos 6 oftalmologui suteikiama saugoma „tariamos akių tuberkuliozės“ apibrėžtis. 9 Šis apibrėžimas grindžiamas patvirtinančiais netiesioginiais įrodymais, tokiais kaip imuninis atsakas į tuberkuliozės antigeną (odos tuberkulino testas, γ-interferono tyrimai), krūtinės ląstos rentgenografija ir atsakas į antivėžinį gydymą, išskyrus kitas uveito priežastis. 1 Ši diagnozės schema taip pat patiria keletą spragų. 9 Nors tuberkuliozės bacilų demonstravimas yra auksinis diagnozės standartas, retai kada įmanoma jas išskirti pasėliais arba mikroskopu. Nepavykus surinkti pakankamai mėginio (skysčio ar biopsijos) iš sudėtingų akių struktūrų ir paucibacilinis ligos pobūdis užkerta kelią organizmo izoliacijai. Nors polimerazės grandininė reakcija, nukreipimas į dažniausiai naudojamus genus, turi daugybę apribojimų diagnozuojant paucibacilinę tuberkuliozę, įskaitant mažą jautrumą, 10, 11 multiplekso PGR 12 ir LAMP tyrimas 13 dar nebuvo plačiai prieinamas komerciškai. MTBDRplus linijos zondo tyrimas yra komerciškai prieinamas diagnostikos metodas, šiuo metu rekomenduojamas tepinėlio teigiamame plaučių mėginyje ir iš kultūros. 14 Kiek mums yra žinoma, yra tik du tyrimai 15, 16, kuriuose nagrinėjamas MTBDRplus tyrimo vaidmuo, atitinkamai 11 ir 5 atvejais, siekiant diagnozuoti IOTB ir nustatyti atsparumą tuo pačiu metu. Todėl įvertinome daugelio stiklakūnio skysčio mėginių MTBDRplus tyrimo diagnostinį potencialą, kad galėtume įtraukti į esamą šios srities literatūrą.

medžiagos ir metodai

Studiju dizainas

Tyrimą patvirtino instituto etikos komitetas. Perspektyviniame tyrime buvo įtraukti 127 stiklakūnio skysčio (VF) mėginiai, paimti iš akių, kuriems atlikta pars plana vitrektomija (PPV) nuo 2012 m. Sausio mėn. Iki 2015 m. Birželio mėn., Ir perdirbti mūsų instituto mikobakteriologijos laboratorijoje. Jie buvo suskirstyti į šias grupes: IOTB grupė ( n = 77) - tariamos akių tuberkuliozės pacientai, diagnozuoti remiantis anksčiau aprašytais kriterijais, 17 I kontrolinės grupės ( n = 25) - pacientai, sergantys ne tuberkuliniu akies uždegimu, ir II kontrolinė grupė ( n = 25) - pacientai, turintys neuždegiminį vitreoretininį sutrikimą, kaip aprašyta ankstesniame tyrime. 12 Visiems mėginiams buvo atliktas MTBDRplus tyrimas, siekiant nustatyti M. tuberculosis ir nustatyti atsparumą rifampicinui ir izoniazidui. Visi mėginiai, kurių MTBDRplus tyrimo rezultatas buvo teigiamas, buvo tiriami genų seka, siekiant patvirtinti mutacijas.

Mėginių rinkimas

Neskiestas stiklakūnio skystis buvo surinktas iš pažeistos akies standartiniu 23 matuoklių PPV. Tokiu būdu kiekvienai akiai buvo surinkta ~ 2 ml VF.

Mėginių apdorojimas ir DNR ekstrahavimas

Mėginiai buvo perdirbti II lygio biosaugos kabinetuose laikantis standartinių bakteriologinių procedūrų, kurių reikia laikytis norint nustatyti M. tuberculosis . Visi 127 mėginiai buvo užkoduoti, tinkamai paženklinti ir atsitiktinai paskirstyti prieš atliekant bet kokį bandymą, kad tyrėjas būtų aklas apie jų pradinį grupavimą. Kiekvienu atveju DNR ekstrakcijai MTBDRplus tyrimui buvo padalijama 500 μl – 1 ml VF. Likęs bandinys buvo laikomas –20 ° C temperatūroje, kad būtų galima naudoti ateityje. DNR buvo ekstrahuota naudojant „Qiagen Mini“ DNR ekstrahavimo rinkinį pagal gamintojo instrukcijas.

MTBDRplus tyrimas

Visi užkoduoti mėginiai buvo ištirti naudojant MTBDRplus V 2.0 genotipą („Hain Lifescience“, GmbH, Nehren, Vokietija). Trys svarbiausi priešanalitiniai pagrindinio mišinio paruošimo, DNR šablono pridėjimo ir amplifikacijos PGR atlikimo etapai buvo atlikti tiksliai apibrėžtose patalpose, skirtose kiekvienai iš šių stadijų. Viename mėginyje buvo užfiksuota 45 μl pagrindinio mišinio, kuriame neužteršta terpė, o į atskirą vietą įpilama 5 μl DNR šablono. Amplifikacija susideda iš dviejų pakopų multipleksinio PGR, naudojant biotinilintus pradmenis, kurie buvo atvirkštinės hibridizacijos su savo specifiniais zondais metu. Reagentai, kuriuos gamintojas pateikė kaip A ir B amplifikacijos mišinius, buvo optimizuoti ir iš anksto įdiegtas hibridizacijos protokolas buvo naudojamas naudojant „Twin Cubator“ (Hain Life Sciences, GmbH, Nehren, Vokietija). Teigiamas juostinio modelio palyginimas su laukinio tipo zondais rodo mutacijos nebuvimą, o juostos modelio prieš laukinio tipo zondus nebuvimas ir (arba) bet kurios mutacijos juostos buvimas rodo atsparumą atitinkamam vaistui.

Sekavimas

Visi MTBDRplus teigiami VF mėginiai buvo tirti rpo B ir ka tG seka, naudojant „Big-Dye 3.1 Terminator“ („Applied Biosystems“, „Foster City“, Kalifornija, JAV) ir „ABI 3130“ („Applied Biosystems“). Kaip pamatinė seka buvo naudojama H37Rv.

MTBDRplus tyrimo, skirto nustatyti atsparumą vaistams, rezultatai buvo įvertinti naudojant genų seką kaip aukso standartą.

Statistinė analizė

Jautrumas, specifiškumas, teigiamos numatomosios vertės ir neigiamos prognozuojamos vertės buvo apskaičiuoti naudojant standartines formules.

Rezultatai

MTBDRplus tyrimas nustatant M. tuberculosis

Tarp IOTB grupės MTBDRplus tyrimas nustatė M. tuberculosis aptikimą 28/77 (36, 36%) atvejais. Visi mėginiai iš dviejų kontrolinių grupių buvo neigiami dėl M. tuberculosis . Testo juostelės davė teisingus visų mėginių rezultatus, nes visos šešios kontrolinės juostos visais atvejais buvo optimalios. MTBDRplus bendras jautrumas, specifiškumas, teigiama prognozinė vertė ir neigiama prognozinė vertė nustatant IOTB M. tuberculosis formos pacientus buvo atitinkamai 36, 36%, 100%, 100% ir 50, 50% (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

MTBDRplus tyrimas atsparumui vaistams nustatyti

Iš 28 atvejų, kai MTBDRplus tyrimu buvo nustatyta M. tuberculosis , šešiais atvejais buvo nustatytas atsparumas rifampicinui, dviem - atsparumas izoniazidui (2 lentelė). Buvo du atvejai, kai buvo ir rifampicino, ir izoniazido mutacijos; jie buvo paženklinti kaip daugialypė vaistams atspari tuberkuliozė (MDR-TB). Iš likusių mėginių 22/28 mėginiai buvo jautrūs rifampicinui, o 26/28 mėginiai buvo jautrūs izoniazidui. Visas laikas, kurio prireikė MTBDRplus tyrimui, nuo mėginio paruošimo iki rezultatų nuskaitymo, buvo ~ 24 valandos.

Pilno dydžio lentelė

Genų mutacijų molekulinis modelis MTBDRplus tyrime

Tarp šešių rifampicinui atsparių atvejų mutacijos juostos keturiais atvejais atitiko 531 kodoną (rpoB MUT3), kiekvienu atveju - 526 kodoną (rpoB MUT2A) ir 516 kodoną (rpoB MUT1). Dviejuose izoniazidams atspariuose atvejais buvo mutacija 315 kodone (katG MUT1).

MTBDRplus tyrimo metu nustatyto atsparumo vaistams palyginimas su genų seka

Atlikus 28 mėginių rpoB geno seką, buvo tik penki atvejai, kai buvo nustatyta rifampicino mutacija, skirtingai nuo šešių atvejų MTBDRplus tyrime. Taigi MTBDRplus tyrime buvo pranešta apie vieną klaidingo atsparumo rifampicinui atvejį , nes izoliato rpoB geno sekos nustatymas nenustatė jokios mutacijos rpoB gene. Išskyrus šį izoliatą, kiti penki mėginiai turėjo atitinkamus rezultatus tarp MTBDRplus tyrimo ir tikslios mutacijos sekos sekos. Rezistencija izoniazidui buvo suderinta su genų seka, nes abiem atvejais, gavus katB (aukšto lygio) mutaciją MTBDRplus tyrimu, taip pat buvo mutavęs kodonas 315 katG geno padėtyje sekvenavimo metu (3 lentelė). Taikant genų seką kaip aukso standartą, MTBDRplus tyrimo jautrumas, specifiškumas, PPV ir NPV buvo atitinkamai 95, 65, 100, 100 ir 83, 33%, siekiant nustatyti atsparumą rifampicinui. Rezultatai buvo nustatyti 100% atsparumui izoniazidui.

Pilno dydžio lentelė

Diskusija

Šiame tyrime M. tuberculosis buvo nustatytas 28 iš 77 (36, 36%) IOTB pacientų. Tai atitinka ankstesnius tyrimus, kuriuose MTBDRplus tyrimu buvo nustatytas 33% jautrumas nustatant M. tuberculosis iš cerebrospinalinio skysčio (CSF) mėginių. 18 Kadangi sterilūs kūno skysčiai yra paucibacilinio pobūdžio, sumažėjęs aptikimo jautrumas, atliekant tyrimą tiesiogiai iš mėginio, nestebina. Kitas tyrimas pranešė, kad M. tuberculosis aptiktas 55%, kai CSF mėginys buvo analizuotas iš 31 patvirtinto tuberkulinio meningito atvejo. 19 Kita galima sąlyginai nedidelio tyrimo jautrumo priežastis galėtų būti kriterijai, naudojami įtariamos IOTB diagnozei nustatyti. Kadangi teigiamas atsakas į prieštuberkulinį gydymą yra apibrėžimo kriterijų dalis17, tikėtina, kad tyrimas negalėjo aptikti M. tuberculosis pacientams, kuriems taikoma terapija.

Siekiant nustatyti atsparumą vaistams, šiame tyrime MTBDRplus tyrimo jautrumas buvo 95, 65% rifampicino ir 100% izoniazido. Maurya ir kt. , 20, vertindami MTBDRplus testą tiek su PTB ( n = 423), tiek su EPTB ( n = 127) izoliatais, pranešė, kad jautrumas rifampicinui ir izoniazidui aptikti yra atitinkamai 98 ir 98, 4%. Šis jautrumo skirtumas gali būti siejamas su šiais dviem prieštaringais veiksniais tarp dviejų tyrimų. Nors šis tyrimas skirtas tik LF mėginiams, Maurya ir kt . Galėjo įtraukti įvairius EPTB mėginius, įskaitant pūlių ir audinių mėginius, kuriuose mikobakterijų apkrova yra santykinai didesnė. Antra, nors mes pasirinkome genų seką kaip palyginimo standartą, Maurya ir kt. Naudojo fenotipinį jautrumo vaistams testą (DST) 1% proporcijos metodu. Trečia, atsižvelgiant į IOTB paucibacilinį pobūdį, šiame tyrime VF mėginiai buvo tiesiogiai tiriami MTBDRplus tyrimu, prieš tai jų nekultūrinant. Tai priešingai nei Maurya ir kt. , Kuriems MTBDRplus tyrimas buvo atliktas tik pagal kultūrą teigiamus izoliatus (tiek PTB, tiek EPTB).

Kiti ankstesni tyrimai, išanalizavę MTBDRplus tyrimą rifampicinui ir izoniazidui nustatyti, parodė, kad 51 neoekuliarinio EPTB mėginio jautrumas yra atitinkamai nuo 92, 8 iki 93, 3%; 60 kaulų ir sąnarių tuberkuliozės (BJTB) mėginių - atitinkamai 83, 3 ir 85, 7%; 89 cerebrospinalinio skysčio (CSF) mėginiuose atitinkamai 22–80 ir 93%. Šie skirtumai galėjo atsirasti dėl pasirinkto etaloninio standarto ir naudojamos mašinos versijos 23 . Be to, skirtingai nei mūsų tyrimas, nė vienas iš šių tyrimų nepatvirtino savo rezultatų atlikdamas nusikaltimą sukeliančio narkotiko genų seką. Kiti du tyrimai, 15, 24, kuriuose buvo lyginami MTBDRplus bandymo versijos 2.0 rezultatai su sekos nustatymu, pranešė atitinkamai 96, 7 ir 100% jautrumą nustatant atsparumą rifampicinui ir 100% - nustatant atsparumą izoniazidui. Šis tyrimas skiriasi nuo šių dviejų tuo, kad pirmasis buvo atliktas su 115 kultūroje teigiamų neapibrėžtų (PTB ar EPTB) mėginių, o antrasis buvo atliktas tik su vienuolika VF mėginių iš IOTB atvejų.

MTBDRplus tyrimas parodė atsparumą rifampicinui 6/28 (21, 42%) atvejų, o izoniazido atsparumą - 2/28 (7, 14%) atvejais. Mutacijos buvo aptiktos 531 kodone ( n = 4), 526 ( n = 1) ir 516 ( n = 1) rpoB gene; ir katG geno 315 kodoną ( n = 2). Išvados yra panašios į rezultatus, gautus ankstesniuose tyrimuose 16, 20, 21, 25, nes tai yra dažniausiai pasitaikančios mutacijos, prisidedančios prie atitinkamai rifampicino ir izoniazido atsparumo vaistams.

Šiame tyrime pastebėtas vienas „melagingo“ atsparumo rifampicinui atvejis, ty atsparus MTBDRplus tyrimui ir nežinomų mutacijų nustatant rpoB genų seką. Po pusantrų metų stebėjimo šis pacientas kliniškai pagerėjo ir nebuvo gydomas MDR. Panašus pastebėjimas buvo padarytas ankstesnių tyrinėtojų, kurie MTBDRplus tyrimais užfiksavo bent vieną klaidingo atsparumo rifampicinui atvejį, palyginti su rpoB sekos nustatymu, 24 DST, 20, 21 ar CRS. 18 Tokie klaidingo atsparumo rifampicinui atvejai galėjo atsirasti dėl kryžminio užteršimo bet kuriame tyrimo etape, taip pabrėžiant atskirų darbo sričių svarbą kiekvienam etapui. Įdomu tai, kad žinoma ir kita komerciškai prieinama molekulinė platforma - „GeneXpert MTB / RIF“ tyrimas - apie „melagingą“ rifampicino atsparumą 26, 27, nepaisant pusiau automatinės uždaros sistemos, turinčios minimalią kryžminio užkrėtimo tikimybę. Ankstesniuose tyrimuose taip pat buvo užfiksuoti klaidingo jautrumo rifampicinui MTBDRplus tyrimais atvejai, ty šie atvejai buvo neteisingai paženklinti rifampicinu, jautriu MTBDRplus tyrimu, tuo tarpu jie buvo atsparūs sekos nustatymu ( n = 2) 24 arba DST (kiekviename n = 1). 20, 22. Neatitikti izoniazidų rezultatai, kaip pranešta anksčiau, 20, 21, 22 gali atsirasti dėl DNR praradimo atliekant rankinį apdorojimą (skirtingai nei „GeneXpert“), esant inhibitoriams ar dėl „heterorezistencijos“ reiškinio. MTBDRplus tyrimo atlikimo palyginimas su genų sekų nustatymu yra protingesnis nei su DST ar CRS, nes tai ne tik nusako tikslią atitinkamo geno mutacijos lokusą, bet ir patvirtina abejotinus atvejus, apie kuriuos pranešama kaip apie „tarpinius“ (nėra laukinių tipas ir atitinkama mutacijos juosta) MTBDRplus tyrimu. Nors dabartiniame tyrime tokių „tarpinių“ rezultatų negauta, ankstesni tyrimai rekomendavo būti atsargiems aiškinant MTBDRplus tyrimo rezultatus, patvirtinant seką. 28

MTBDRplus tyrimas turi keletą pranašumų, palyginti su kitais DST metodais. Tai palyginti paprastesni, greitesni ir ekonomiškesni nei įprasti DST metodai. Nors fenotipinis DST yra ne tik sudėtingas, jam reikia mažiausiai 4–6 savaičių inkubacijos, o rezultatai ne visada gali būti patikimi. Automatinės skystųjų kultūrų sistemos, tokios kaip MGIT, neabejotinai sutrumpino reikalingą inkubacijos laiką, tačiau jas riboja didelės išlaidos ribotų išteklių ištekliais šalyse, kuriose yra didelis TB endemiškumas. 29 Tarp komercinių platformų, „GeneXpert“ turi pranašumą prieš MTBDRplus testą, atsižvelgiant į jo automatizavimą, kuris sumažina rankinio klaidų ir užteršimo tikimybę, tačiau jį riboja tai, kad „GeneXpert“ gali nustatyti tik atsparumą rifampicinui, skirtingai nei rifampicinui, tiek izoniazido atsparumas, nustatytas MTBDRplus tyrimu. Šis MTBDRplus pranašumas, palyginti su „GeneXpert“, padeda teisingai nustatyti atsparumą vaistams, taip užkertant kelią MDR-TB pervertinimui tose vietose, kur mono-rifampicino atsparumas yra endemiškas. Viena vertus, „GeneXpert“ yra spartesnis (TAT 3 val.), Palyginti su MTBDRplus tyrimu (TAT 24 val.), Kita vertus, naudojant „GeneXpert“, daugiau nei MTBDRplus tyrime, nurodomi neatitikimo rifampicinui rezultatai. 30 „GeneXpert“ ir „MTBDRplus“ tyrimo kaina už izoliatą yra atitinkamai 10 USD ir 22 USD.

Infekcinis uveitas, ypač IOTB, yra žinomas dėl savo nespecifinio klinikinio pobūdžio ir rimtų pasekmių. Padėtį dar labiau apsunkina vėluojanti diagnozė ir blogas atsakas tokiose vietose, kur įprastas atsparumas vaistams. Neseniai atliktame tyrime pasisakoma už tai, kad, kai įmanoma, kultūros ir (arba) molekuliniai tyrimai būtų atlikti su akių skysčiais, kad būtų galima vienu metu nustatyti sukėlėją arba jo DNR ir atskirti mutanto geną sekos nustatymo būdu. 8

Išvada

Nors jo tuberkuliozės nustatymo iš IOTB mėginių greitis yra palyginti mažesnis nei kitų molekulinių tyrimų, jos didžiausias potencialas yra žymiai sutrumpėjęs apsisukimo laikas, palyginti su įprastais DST metodais, ir patikimas atvejo žymėjimas MDR-TB. išanalizavus tiek rifampicino, tiek izoniazido genų mutacijas. Taigi MTBDRplus tyrimas yra svarbus diagnostinis būdas laiku nustatyti ir gydyti IOTB atvejus.

Image