Daugiafunkcinis vieno pluošto akustinis pincetas, skirtas neinvazinėms ląstelių / organizmų manipuliacijoms ir audinių vaizdavimui | mokslinės ataskaitos

Daugiafunkcinis vieno pluošto akustinis pincetas, skirtas neinvazinėms ląstelių / organizmų manipuliacijoms ir audinių vaizdavimui | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Akustika
  • Biomedicininės inžinerijos

Anotacija

Tikslus nekontaktinis manipuliavimas atskiromis mikrodalelėmis, ląstelėmis ir organizmais sukėlė nemažą susidomėjimą biofizika ir biomedicinos inžinerija. Panašiai kaip optiniai pincetai, buvo pasiūlyta ir akustinių pincetų, kurie galėtų manipuliuoti mikrodalelėmis ir netgi ląstelėmis. Nors buvo imtasi bendrų pastangų kurti nekontaktinio manipuliavimo įrankius, alternatyvios kompleksiškos, vientisos būklės žnyplės iki šiol nerastos. Čia pateikiame pranešimą apie paprastą, nebrangų daugiafunkcį akustinį vienos sijos tviterį (SBAT), galintį valdyti atskirą mikrometrų dydžio nesferinę ląstelę Rayleigh režimu ir net vieno milimetro dydžio organizmą Mie režimu, taip pat vaizduojamąjį audinį. . Mes eksperimentiškai parodėme, kad SBAT su ypač mažu f skaičiumi (f # = židinio nuotolis / diafragmos dydis) galėtų atitinkamai manipuliuoti atskirais raudonaisiais kraujo kūneliais ir vienu, 1, 6 mm skersmens, apvaisintu Zebrafish kiaušiniu. Be to, in vitro žiurkių aortos vaizdai buvo sėkmingai surinkti dinaminiuose židiniuose, kuriuose buvo aiškiai matomas aortos liumenas ir išorinis paviršius. Naudodamas ypač mažą f skaičių, SBAT siūlo didelę akustinės spinduliuotės jėgą ir siaurą pluošto plotį, užtikrinančius stiprią spąstus ir didelės skiriamosios gebos vaizdo gavimo galimybes. Šie požymiai suteikia galimybę panaudoti vieną akustinį prietaisą neinvazinėms daugiafunkcėms funkcijoms atlikti vienu metu biomedicinos ir biofizikos srityse.

Įvadas

Su labai sukoncentruotais lazerio pluoštais optiniai pincetai 1, 2 buvo plačiai naudojami ląstelių ir molekulių biofizikinėms savybėms tirti 3, 4, 5 . Nors optiniai pincetai dėl šviesos pobūdžio turi absoliučią pranašumą manipuliuodami mažais, didelės skyros daiktais, jie paprastai apsiriboja optiniu būdu išgrynintais pavyzdžiais. Be to, tikslinius biologinius mėginius lengvai sugadins labai sufokusuota vietinė lazerio spinduliuotė. Be to, optinių žnyplių jėga paprastai yra per maža, kad būtų galima valdyti palyginti dideles daleles ar ląsteles. Palyginti su optiniais pincetais, paprastesnis akustinių prietaisų nustatymas būtų mažesnis. Svarbiausias akustinių prietaisų naudojimo pranašumas yra tas, kad biologiniai mėginiai yra mažiau linkę sugadinti akustinę energiją, apie kurią pranešta ankstesniame tyrime 6, 7, 8 . Taigi, akustinis požiūris laikomas alternatyviu neinvaziniu būdu, kuris suteikia galimybę manipuliuoti biomedicinos ir biofizikos tikslais.

Pastaraisiais metais buvo pranešta apie įvairių tipų akustinius prietaisus, skirtus manipuliuoti. Tačiau dauguma jų, pavyzdžiui, stovinčioji banga 9 ir „Bessel“ pluoštai 10, yra sudėtingos konfigūracijos, kurias galima valdyti tik esant Rayleigh (įstrigusio objekto dydis yra mažesnis už bangos ilgį) arba Mie režimą (įstrigusio objekto dydis yra didesnis) nei bangos ilgio) ar dalelių grupių. Neseniai buvo pranešta, kad akustinės sistemos, pagrįstos 11 paviršiaus akustine banga, gali mikroschemoje manipuliuoti ir ląstelėmis, ir net C. elegans. Iš tų prietaisų, naudojamų skirtingomis metodikomis, įrodyta, kad vieno pluošto akustinis pincetas (SBAT) 12, turintis paprasčiausią konfigūraciją, gali valdyti vieną mikrodalelę tiek teoriniu, tiek eksperimentiniu požiūriais 13, 14, 15 (žr. Darbo mechanizmą Papildomame priede Figūra 1). Panašiai kaip optiniais pincetais, SBAT sukurtas sandariai sufokusuotas ultragarsinis mikrobangus galėjo manipuliuoti objektu Rayleigh 16 ir Mie 13, 17, 18 režimais. Anksčiau pavieniu 5 μm skersmens polistireno mikrosfera buvo manipuliuojama labai jautriais, labai aukšto dažnio (~ 200 MHz) SBAT, šimtų mikrometrų intervale distiliuotame vandenyje 13 . Nors ankstesni tyrimai rodo, kad SBAT gali manipuliuoti dalelėmis ląstelių lygyje ir net sferinėmis ląstelėmis 13, 17, tačiau ji vis dar neparodė manipuliacijos nesferiniais objektais dėl švelnaus intensyvumo gradiento aplink mikrospindulį.

Remiantis iš anksto sufokusuotu vieno elemento ultragarso keitiklio dizainu 19, SBAT praktinį našumą būtų galima pritaikyti keičiant mikrobespindulio intensyvumo gradientą konkrečioms reikmėms. Tiksliau, SBAT dažnis ir f skaičius ( f # = židinio nuotolis / diafragmos dydis) daugiausia lemia spindulio plotį ir akustinės spinduliuotės jėgą. Didėjant spindulio plotui ir mažėjant spindulio intensyvumui fokusuojant, didinant f # (žr. Modeliuotus rezultatus 2 papildomame paveiksle), kad manipuliavimas būtų daug efektyvesnis, prietaiso f # turi būti dar labiau sumažintas, kad būtų galima mikrotraumoje. kad aplink jo fokusą būtų sudarytas staigesnio intensyvumo gradientas. Šiame darbe mes sukūrėme universalų SBAT su ultraflow f #, kuris gali manipuliuoti viena nesferine ląstele ir net mažu organizmu skirtingais režimais. Paprastai aukštą šoninę skiriamąją gebą galima gauti, kai ultragarso pluošto plotis yra siauras 20 . Esant ypač mažam f #, SBAT spinduliuotės plotis būtų gana siauras, o tai leistų didelę vaizdo skiriamąją gebą. Taigi, be išskirtinių manipuliavimo galimybių, SBAT pasižymi ir geriausiomis vaizdo gavimo galimybėmis.

1 paveiksle parodytas akustinis tweezing eksperimentinis nustatymas ir individualių raudonųjų kraujo kūnelių (RBC) manipuliacijos, naudojant 60 MHz SBAT, pavyzdys. SBAT f # yra 0, 6, artėjantis prie į spaudą orientuoto įrenginio fizinės ribos. Tyrimo metu SBAT atsitiktine tvarka taikys ir akustiniu būdu manipuliuos RBC, suspenduotu Alseverio tirpale (žr. 1a pav.). 1b pav. Ryški apskrito forma yra SBAT projekcija. Raudonas apskritimas žymi pavienį įstrigusį RBC (~ 8 μm skersmens), o geltonas taškas yra atskaitos taškas, parodantis ląstelės vietos pokytį. SBAT buvo varomas tokiomis optimaliomis sąlygomis: 60 MHz sužadinimo dažnis, variklio įtampa 20 V pp, darbo ciklas - 0, 2%, impulsų pasikartojimo dažnis - 1 kHz. Parodyta, kad ląstelė juda kartu su SBAT judėjimu. Atskirų ląstelių manipuliavimas yra efektyvus, o tam nepakenktų šalia esančios ląstelės (žr. 1 papildomą vaizdo įrašą). Reikėtų pažymėti, kad tai yra pirmas kartas, kai naudojant akustinį mikrotrauminį prietaisą galima manipuliuoti atskira nesferine ląstele.

Image

a ) Eksperimento su akytine virpėjimu schema, skirta manipuliuoti RBC. b ) SBAT judėjimo metu buvo manipuliuojama vienu RBC (raudonu apskritimu). Ryški apskrito forma yra SBAT projekcija. Geltonas taškas yra atskaitos taškas, parodantis langelio vietos pasikeitimą, o mėlyna rodyklė rodo SBAT judėjimo kryptį.

Visas dydis

Nors optiniai pincetai pasižymi absoliučiu pranašumu manipuliuojant mažomis dalelėmis, turinčiomis didelę skiriamąją gebą, jėga yra per maža, kad būtų galima valdyti didelius objektus. SBAT atveju mažesnio f # dizainas suteikia staigesnį mikrospindulio intensyvumo gradientą, todėl padidėja akustinės spinduliuotės jėga. Naudojant identišką (60 MHz f # 0, 6) SBAT, akustiniu būdu būtų galima manipuliuoti net vienu žuvies kiaušiniu. 2a paveiksle parodyta, kad apvaisinti „Zebrafish“ kiaušiniai yra skaidrūs, o negyvi kiaušiniai yra pieniškos spalvos. Palyginti su ląstele, Zebrafish kiaušinis, kurio skersmuo 1, 6 mm, yra daug didesnis. Kai geltonas taškas yra vietos atskaitos taškas, kaip parodyta 2b pav., Akivaizdu, kad apvaisintą kiaušinį galima akustiniu būdu manipuliuoti naudojant SBAT, kurio centrinis dažnis yra 32 V pp įtampa, darbo ciklas - 0, 2%, ir impulsų pasikartojimo dažnį 1 kHz. Iš 2 papildomo vaizdo įrašo matyti, kad apvaisintas kiaušinis su gyvu embrionu iš pradžių nejuda, kai SBAT yra išjungtas. Įjungus SBAT, kiaušinis tinkamai juda pagal SBAT judėjimą. Tai yra didžiausia gyvo organizmo manipuliacija, atlikta su SBAT.

Image

a ) Apvaisinti Zebrafish kiaušiniai su gyvu embrionu yra skaidrios išvaizdos, o negyvas kiaušinis (viršuje) yra pieniškos spalvos. Vidutinis Zebrafish kiaušinių skersmuo yra 1, 6 mm. b ) SBAT judėjimo metu buvo akustiškai valdomas vienas apvaisintas „Zebrafish“ kiaušinis. Ryški apskrito forma yra SBAT projekcija. Geltonas taškas yra atskaitos taškas, kuris parodo žuvies kiaušinio vietos pasikeitimą, o mėlyna rodyklė nurodo SBAT judėjimo kryptį.

Visas dydis

Norėdami parodyti, kad SBAT nėra invazinis, mes atlikome RBC gyvybingumo testą, veikdami SBAT tokiomis pačiomis važiavimo sąlygomis, kai atliekami akustiniai manipuliavimai. 3a paveiksle parodytas normalizuotas vidutinis RBC gyvybingumas prieš ir po SBAT ekspozicijos tam tikrais laiko tarpais. Nustatyta, kad RBC fluorescencija reikšmingai nepakito per 30 minučių po SBAT ekspozicijos ( p reikšmė = 0, 485, > 0, 01). 3b paveikslas iliustruoja, kad RBC vis dar skleidžia stiprią žalią fluorescenciją po 30 min., Parodydamas gerą gyvybingumą eksperimentinėmis sąlygomis, naudojant manipuliaciją akustine įranga. Rezultatai rodo, kad SBAT yra neinvazinis ir biologiškai nesuderinamas.

Image

a ) normalizuotas ląstelių gyvybingumas tam tikrais laiko intervalais (0 (kontrolė), 10, 20 ir 30 minučių). b ) atitinkami fluorescenciniai vaizdai. (Žalia fluorescencija reiškia gyvybingą ląstelę).

Visas dydis

Be manipuliavimo tyrimų, buvo įvertintas identiško SBAT biomedicininis vaizdinis vaizdas. 4 paveiksle pavaizduoti in vitro žiurkių aortos audinių vaizdai, surinkti dinaminiuose židiniuose, kur SBAT pamažu buvo perkeliamas arčiau mėginio. Kaip parodyta 4a pav., Aortos spindis ir išorinis paviršius galėtų būti aiškiai matomi šalia SBAT židinio. Kai SBAT buvo perkeltas arčiau pavyzdžio, viršutinė vaizdo dalis buvo neryški ir iškraipyta, o tai daugiausia priskiriama susilpnintam signalui, atsirandančiam dėl stipraus fokusavimo įtaiso akustinių spindulių stiprių skirtumų. Sujungiant dinaminių židinių dalinius vaizdus, ​​galima atkurti aukštos kokybės B režimo / gylio nuskaitymo (B / D nuskaitymo) 21 vaizdą. Naudojant tinkamas lango nustatymo / svėrimo funkcijas, galima fokusuoti beveik fokusavimo segmentus iš skirtingų vaizdų, gautų skirtingu atstumu nuo įrenginio iki pavyzdžio, kad būtų gautas vaizdas, kurio vaizdas yra didelis. 4b paveiksle parodytas sudėtingas žiurkės aortos vaizdas. Palyginti su 4a pav. Pavaizduotais vaizdais, sudėtingas vaizdas yra tolygus gylio krypčiai su padidintu kontrastu ir mažesniais arti lauko artefaktų. Galima aiškiai atskirti visą aortos formą ir kraštą. Specifinis raištelių raštas priskiriamas aukšto dažnio tiksliai įfiksuotiems vaizdams 22 ir tardymo struktūrai 23 . Dinaminis B / D nuskaitymo atvaizdo diapazonas yra 50 dB, o tai atitinka dinaminių B atvaizdų, naudojamų sudėtiniams komponentams, diapazoną. Šis metodas sėkmingai išplėtė vaizdavimo gylį, išlaikant B-nuskaitytų vaizdų skiriamąją gebą ir dinaminį diapazoną. Atsižvelgiant į mažą raižinį ir didelį vaizdo kontrastą, audinių vaizdų gavimo rezultatai ne tik parodo SBAT vaizdo gavimo galimybes, bet ir parodo siūlomo metodo galimybes tiriant audinių struktūras mikroskopiniu lygiu.

Image

a ) Žiurkės aortos pavieniai vaizdai, surinkti (5 μm šoninis žingsnis) skirtingais atstumais nuo prietaiso iki mėginio. Fokusavimo vieta pažymėta purpurine juosta. ( b ) Gautas aortos vaizdas, sujungtas su 3a paveiksle pavaizduotais papildomais vaizdais (B / D-scan), pasižymi padidintu kontrastu ir dideliu vaizdo gyliu.

Visas dydis

Mūsų sukurtas „ultralow f # SBAT“ yra paprastas, nebrangus ir universalus, pasižymintis išskirtinėmis akustinėmis manipuliavimo galimybėmis ir puikiu vaizdo gavimo našumu. Kai f # yra 0, 6, labai didelis akustinio mikrobaimio intensyvumo gradientas suteikia didelę gaudymo spąstais galimybę, kad SBAT yra pajėgus manipuliuoti atitinkamai atskiru nesferiniu RBC ir atskiru apvaisintu Zebrafish kiaušiniu. Kalbant apie įstrigusių objektų dydį, SBAT galėtų būti vykdomas Rayleigh (RBC dydis 8 μm <bangos ilgis 25 μm 60 MHz) ir Mie (Zebrafish kiaušinių dydis 1600 μ m ≫ bangos ilgis 25 μ m @ 60 MHz). ) režimai. Be akustinių manipuliacijų, tas pats SBAT taip pat gali vaizduoti audinius. Taikant siūlomą metodą, būtų galima gauti in vitro žiurkės aortos audinio vaizdą su dideliu regėjimo gyliu. Tikimės, kad šis atradimas atskleis galimybes, kad daugiafunkcinis akustinis prietaisas gali atlikti įvairias funkcijas, skirtas biomedicinos reikmėms, pavyzdžiui, manipuliuoti vaizduojant vaistus ar stimuliuoti vaizduojant, kad apibūdintų ląsteles.

Metodai

BAT plėtra

SBAT buvo suprojektuoti pagal Krimholtz, Leedom ir Matthaei (KLM) modelius. Optimalus ličio niobato (LiNbO 3 ) kristalų storis buvo ~ 45 μm , o angos dydis 1, 6 mm, esant 60 MHz centriniam dažniui. Pirmasis akustinis derinimo sluoksnis buvo λ / 4 storio sidabro epoksidinė medžiaga, pagaminta iš sidabro dalelių (Adrich Chem. Co., Milwaukee, WI) ir „Insulcast 501“ epoksidų („American Safety Technologies“, Roseland, NJ) mišinio, kuris buvo išlietas ant neigiama chromo / aukso apibarstyto vaflinio pusė. Laidus sidabro epoksidinė medžiaga (E-Solder 3022, Von Roll Isola Inc., Naujasis Havenas, CT) tarnavo kaip atraminis sluoksnis, kuris buvo išlietas į teigiamą vaflinės pusę. Akustinė rietuvė su atitinkamais ir atraminiais sluoksniais buvo sufokusuota 1, 0 mm židinio nuotoliu, kad būtų gautas f # ~ 0, 6. ~ 10 μm storio parileno sluoksnis buvo nusodintas ant SBAT priekinio paviršiaus, kad jis tarnautų ir kaip antrasis derinimo sluoksnis, ir kaip apsauginis sluoksnis. Tolesniems eksperimentams SBAT buvo surinktas į SMA jungtį.

Akustiniai virpėjimo eksperimentai

Tiriamojoje kameroje su SBAT buvo sukurta akustinė tvinkčiojimo eksperimentinė sąranka (žr. 1a pav.). Tirpalas buvo Alseverio tirpalas (A3551, Sigma-Aldrich, MO) raudonųjų kraujo kūnelių tyrimui, o tirpalas buvo vanduo, kurį tiekė Zebrafish kiaušinių tiekėjas (Caroline Biological Supply Company) Zebrafish kiaušinių tyrimui. Raudonųjų kraujo kūnelių eksperimentui iš sveiko donoro buvo paimta ~ 4 μl kraujo ir tris kartus plaunama 1 ml fosfatu buferiuotu tirpalu (PBS). Išplautos ląstelės buvo praskiestos iki 10 5 ląstelių / μl Alseverio tirpale.

Eksperimentų metu objektai buvo pakabinti tirpale. Atskiras objektas buvo nukreiptas per mikroskopo matymo lauką. SBAT buvo sumontuotas ant trijų ašių motorizuotos scenos (LMG26 T50 MM; OptoSigma, Santa Ana, CA), valdomos pritaikytos LabVIEW programos tokiu būdu, kad SBAT buvo manipuliuojama statmenai pluošto ašiai židinio nuotolyje virš akustiškai skaidrios mylar plėvelės. . SBAT buvo varomas sinusoidinio sprogimo režimu optimaliomis važiavimo sąlygomis, derinant dažnį, įtampą, darbo koeficientą ir impulsų pasikartojimo dažnį. Įstrigę objekto judesiai buvo užfiksuoti fiksuojant 10 kadrų per sekundę kadrą, naudojant CMOS kamerą (ORCA-Flash2.8, Hamamatsu, Japonija) kartu su mikroskopu (IX-71, Olympus, Japonija). Norėdami parodyti akustinio manipuliavimo galimybes, SBAT su įstrigusiu objektu motorizuotomis pakopomis buvo perkeltas atsitiktiniu keliu.

Ląstelių gyvybingumo testas

Iš sveiko donoro buvo paimtas šviežias kraujas ir tris kartus išplautas fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS). Kiekviename ląstelių gyvybingumo bandyme buvo paruoštas membraną pralaidus gyvų ląstelių ženklinimo dažiklis Calcein AM („In vitrogen Corp.“, Grand Island, NY, JAV) kaip pradinis 1 mM tirpalas dimetilsulfokside, laikomas kambario temperatūroje. Į ląsteles buvo įpilta 10 μM kalceino-AM darbinio tirpalo (galutinė koncentracija). Ląstelių fluorescencinis vaizdavimas buvo atliktas prieš ir po SBAT ekspozicijos su didžiausia akustinių manipuliacijų varomąja galia (įtampa = 32 V pp, darbo ciklas = 0, 2%, impulsų pasikartojimo dažnis = 1 kHz, ekspozicijos laikas = 30 s). Ląstelių gyvybingumo pokytis buvo lyginamas tam tikrais laiko intervalais (0, 10, 20 ir 30 min.). Statistinei analizei gautas vidutinis ir standartinis fluorescencijos lygio nuokrypis kiekvienu laiko intervalu, kai mėginio dydis n = 10.

Vaizduojamasis eksperimentas

Pietinės Kalifornijos universiteto medicinos mokyklos chirurgas surinko maždaug 0, 9 cm skersmens žiurkės aortą, kuri prieš eksperimentą buvo laikoma Eurocollins tirpale 4 ° C temperatūroje. Vaizdai buvo gauti naudojant ultragarsinę biomikroskopijos (UBM) sąranką. SBAT nuskaitymui buvo pritvirtintas su 3D motorizuota linijine pakopa (Newport Corporation, CA). Audinių mėginiai buvo sujungti naudojant vandenį. Sužadinimo impulsą ir aido signalą sukūrė ir priėmė komercinis impulsų imtuvas (JSR Ultrasonics, NY). Signalas buvo suskaitmenintas naudojant 2 GHz spartos duomenų kaupimo kortelę (Gage, IL). Buvo sukurta „Matlab“ (Mathwork, MA) pagrįsta valdymo ir vaizdų apdorojimo programinė įranga, kurioje aido signalas buvo filtruojamas 4 -ojo laipsnio Butterworth juostos pralaidumo filtru ir apgaubta informacija buvo aptikta naudojant Hilberto transformaciją. Derinant papildinius vaizdus, ​​buvo naudojama trikampio svorio funkcija, kurioje svorio koeficientas buvo 1 židinyje ir tiesiškai sumažėjo iki 0 100 μm atstumu nuo fokusavimo. Vaizdams su artimiausiu / tolimiausiu fokusavimu buvo naudojama trapecijos svorio funkcija. Tada buvo apskaičiuotas sudėtingas vaizdas, pritaikant atitinkamas svorio funkcijas atvaizdams filtruoti.

Studijų patvirtinimas / Informuotas sutikimas / Atitikimas

Visi eksperimentai su gyvais stuburiniais gyvūnais buvo atlikti pagal protokolus, patvirtintus Pietų Kalifornijos universiteto Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas vaizdo įrašas

  2. 2.

    2 papildomas vaizdo įrašas

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.