Branduolinės tulžies rūgšties receptoriaus fxr mutacijos sukelia progresuojančią šeiminę intrahepatinę cholestazę | gamtos komunikacijos

Branduolinės tulžies rūgšties receptoriaus fxr mutacijos sukelia progresuojančią šeiminę intrahepatinę cholestazę | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Cholestazė
  • Ligos genetika
  • Genetikos tyrimai
  • Mutacija

Anotacija

Naujagimių cholestazė yra potencialiai pavojinga gyvybei liga, kurią reikia nedelsiant diagnozuoti. Kelių skirtingų genų mutacijos gali sukelti progresuojančią šeiminę intrahepatinę cholestazę, tačiau žinomi genai negali atsižvelgti į visus šeiminius atvejus. Pateikiame keturis asmenis iš dviejų nesusijusių šeimų, turinčių naujagimių cholestazę ir mutacijas NR1H4 , koduojančiame farnesoidinį X receptorių (FXR) - tulžies rūgšties suaktyvintą branduolinio hormono receptorių, kuris reguliuoja tulžies rūgšties metabolizmą. Klinikiniai sunkios, nuolatinės su NR1H4 susijusios cholestazės požymiai yra naujagimio pradžia, greitai progresuojanti iki galutinės stadijos kepenų ligos, nuo vitamino K nepriklausoma koagulopatija, nuo žemo iki normalaus gama-glutamiltransferazės aktyvumo serume, padidėjęs alfa-fetoproteino serumo kiekis ir nenustatoma kepenų tulžies liga. druskos eksporto pompos ( ABCB11 ) išraiška. Mūsų išvados rodo pagrindinę FXR funkciją tulžies rūgšties homeostazėje ir kepenų apsaugoje.

Įvadas

Tulžies rūgštys yra plovikliai, gaminami kepenyse ir išleidžiami į žarnas, siekiant palengvinti ir skatinti lipidų maistinių medžiagų pasisavinimą. Jie yra absorbuojami žarnyne kartu su maistinėmis medžiagomis ir grįžta į kepenis per veninę veną. Per didelis tulžies rūgšties kiekis yra toksiškas, todėl griežtai reguliuojama jų kepenų gamyba ir enterohepatinė cirkuliacija. Tulžies rūgšties lygį nustato branduolinis tulžies rūgšties receptorius, vadinamas farnesoido X receptoriumi (FXR), koduojamas NR1H4 geno. Padidėjęs tulžies rūgšties kiekis suaktyvina FXR, kad sukeltų programą, slopinančią hepatocitų tulžies rūgšties biosintezę ir įsisavinimą, tuo pačiu didinant eksportą 1, 2 .

Dėl tokio tulžies rūgšties susidarymo slopinimo FXR tampa terapiniu taikiniu sergant cholestazine kepenų liga, o klinikiniai FXR agonistų tyrimai pirminės tulžies cirozės atveju žada 3, 4, 5 . FXR aktyvacija slopina autofagiją 6 ir veikia papildomus metabolinius taikinius už tulžies rūgšties homeostazės ribų, o FXR ligadai daro teigiamą poveikį pelių metabolinės ligos modeliams 7, 8 . Atsižvelgiant į tai, FXR buvo nustatytas kaip galimas greitai pelningų bariatrinių operacijų metabolinio poveikio tarpininkas 9 pelėms, o pirminiai klinikiniai rezultatai rodo, kad FXR agonistai gali turėti teigiamą poveikį nealkoholinių riebalinių kepenų ligoms ir metaboliniam sindromui 10., 11 . Taigi, FXR yra pagrindinis daugelio metabolinių ir hepatocitus apsaugančių kelių moduliatorius ir besiformuojantis terapinis taikinys tiek cholestatinėms, tiek metabolinėms ligoms.

Kelių genų, koduojančių tulžies rūgšties homeostazę, mutacijos sukelia naujagimių cholestazę. Progresuojanti 1, 2 ir 3 tipų intrahepatinė cholestazė (PFIC) yra grupė cholestazinių sąlygų, kurias sukelia atitinkamai ATP8B1, ABCB11 ir ABCB4 mutacijos , o TJP2 defektai, koduojantys sandarų jungiamąjį baltymą 2, taip pat gali sukelti sunkią cholestazinę kepenų ligą 12 . Keli heterozigotiniai variantai žinomuose PFIC genuose kai kuriais atvejais gali prisidėti prie ligos 13, tačiau iki trečdalio atvejų jie išlieka idiopatiniai 14 . Pacientams, sergantiems PFIC1 ar PFIC2, ir pacientams, kuriems būdinga TJP2 mutacija, esant mažam ar normaliam gama-glutamiltransferazės (GGT) aktyvumui kraujo serume, 12, 15 . Tiek ABCB11 , kuris koduoja tulžies druskos eksporto pompą (BSEP), tiek turintis PFIC2 trūkumą, tiek ABCB4, kuris koduoja multirezistencinį baltymą 3, MDR3, ir PFIC3, yra tiesioginiai FXR tikslai. NR1H4 variantai, esantys 12q23, 1, buvo susiję su padidėjusia intrahepatinės nėštumo cholestazės rizika 16 . Neseniai atlikta Cholestatic sergančių pacientų funkcinio NR1H4 kitimo paieška. Nerasta nė vieno 17, tačiau vienam pacientui, sergančiam kūdikių cholestaze 18, buvo heterozigotinis NR1H4 variantas. Čia aprašome keturis pacientus iš dviejų šeimų, kuriems homozigotinis NR1H4 funkcijos praradimas ir sunki naujagimių cholestazė.

Rezultatai

Dviejų nesusijusių probandų, turinčių sunkią cholestazę, viso egzomo sekos ir vieno nukleotido polimorfizmo (SNP) matricos atskleidė homozigotinį funkcijos mutacijų praradimą NR1H4 , esančiame 12q23.1. Tolesnė analizė patvirtino tą patį NR1H4 genotipą papildomam paveiktam asmeniui kiekvienoje šeimoje (1 lentelė). Visiems pacientams ankstyvame amžiuje buvo sutrikusi kepenų veikla (1 lentelė). Trims buvo pristatyta naujagimių cholestazė; 4 pacientui gimus buvo ascitas, pleuros ertmė ir kraujavimas į veną. Pradinio įvertinimo metu visiems pacientams buvo konjuguota hiperbilirubinemija, padidėjęs aminotransferazių kiekis, sumažėjęs normalus GGT ir padidėjęs protrombino laikas bei tarptautinis normalizuotas santykis (1 lentelė ir 1 papildoma lentelė). 1 ir 3 pacientų V ir VII faktorių lygis buvo ženkliai sumažėjęs. Alfa-fetoproteino, išmatuoto trims pacientams, ligos pradžioje stebėtinai padidėjo ir laikui bėgant sumažėjo. 1 paciento organizme padidėjo tulžies rūgščių serume. Pirmaisiais 2–3 metų pacientais kepenų nepakankamumas pasireiškė pablogėjusia koagulopatija, hipoglikemija ir hiperammonemija. Abiem 1 šeimos pacientams buvo mirusios donoro kepenų transplantacijos, o 3 pacientas mirė laukdamas transplantacijos. 4 pacientas mirė 5 savaites nuo aortos trombo komplikacijų.

Pilno dydžio lentelė

Histologiškai ištyrus visų keturių pacientų kepenis, nustatyta dukulinė reakcija, difuzinė milžiniškų ląstelių transformacija, hepatocitų balionų susidarymas ir intralobulinė cholestazė (1 pav.). Uždegiminių ląstelių infiltracijos ir fibrozės laipsnis kinta priklausomai nuo ligos progresavimo, tačiau 1 paciento išaiškintos kepenys parodė mikronodulinę cirozę, o fibrozė vėlesniuose etapuose buvo akivaizdi visiems pacientams. 3 paciento autopsija parodė kepenų, kasos, širdies ir skydliaukės siderozę (papildomas 1 pav.), Rodančią gestacinę aloimuninę kepenų ligą, tačiau imunohistocheminiai tyrimai nepatvirtino šios diagnozės 19 . Kepenų imunohistochemija neleido aptikti BSEP ekspresijos tulžies kanaluose visiems pacientams, tačiau fosfolipidų pernešėjo MDR3 raiška išliko (1 pav.). Papildomi 1 paciento imunohistocheminiai tyrimai parodė normalią alanilo aminopeptidazės, GGT ir MRP2 ekspresiją, taip pat padidėjusį perinizoidinį ir perihepatocitinį retikuliną (papildomas 2 pav.). Nors šie rezultatai rodo ABCB11 trūkumą, 1 paciento ABCB11 sekos ir delecijos-dubliavimo analizė buvo neigiama.

Image

BSEP, MDR3 ir FXR ekspresija kepenyse (diaminobenzidino chromogeno ir hematoksilino kontrastainis ) pacientams, sergantiems su NR1H4 susijusia cholestaze; normalus įdėklų valdymas. Hematoksilino / eozino vaizdas orientacijai. Originalus padidinimas, visi vaizdai, × 200. BSEP ir FXR nėra visiems keturiems pacientams, palyginti su teigiama kontrole (įdėta). MDR3 yra visiems keturiems pacientams, nors sumažėjęs 2 ir 4 pacientams. H&E, hematoksilinas ir eozinas.

Visas dydis

Viso egzomo seka 2 pacientui (1 šeima) nustatė, matyt, homozigotinę c.526C> T (p.R176 *) mutaciją NR1H4, kuri per anksti nutraukia baltymą 176 aminorūgšties (nukleotidas: NM_005123 ir baltymas: NP_005114) DNR. įrišimo sritis (DBD). Tokia pati homozigotinė mutacija nustatyta ir 1 paciente; abu besimptomiai tėvai yra nešiotojai (2a pav. ir 2 lentelė). Derėjimas šioje šeimoje buvo patvirtintas atliekant cSNP matricos aptikimą ∼ 89 Mb bendrų homozigotinių sričių, didesnių nei 5 MB kiekvienam pacientui. Prognozuojamame baltymų liekanų fragmente trūksta ir DNR surišimo, ir hormonų receptorių domenų, o imunohistochemija FXR ekspresijos neturėjo (1 pav. 1). Apie šį variantą anksčiau buvo pranešta vienam pacientui, sergančiam kūdikių cholestaze, kaip heterozigotiniam pokyčiui 18, tačiau heterozigotiniams 1 šeimos tėvams kepenų biochemija buvo normali. Nė viena iš trijų nėštumų motina neturėjo cholestazės simptomų.

Image

a ) Sangerio atliktas homozigotinio varianto c.526C> T (p.R176 *) sekos nustatymas 1 šeimos 1 ir 2 pacientams. Abu tėvai yra heterozigotiniai nešiotojai. ( b ) homozigotinio varianto c.419_420insAAA (p.Tyr139_Asn140insLys) seka 2 ir 3 šeimos pacientams. Motina patiria heterozigotinį pokytį. c ) 2- osios šeimos lūžio taško sankryžų žemėlapių sudarymas. PGR ir Sangerio sekos patvirtino 31, 7 kb deleciją, apimančią pirmuosius du koduojančius visų NR1H4 izoformų egzonus . Ištrynimo sritis pažymėta užpildytu langeliu. d ) Visi 2 šeimos nariai, išskyrus motiną, yra išbraukti. PGR buvo atliekama naudojant pirmyn ir atgalinius pradmenis, pažymėtus rodyklių galvutėmis, d . F1 / R1b pradmenų pora nesugeba amplifikuoti laukinio tipo lokuse, nes atstumas tarp jų viršija PGR reakcijos ribą. Grunto pora F1 / R1 naudojama kaip kontrolė. NTC, nėra šablono valdymo.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Viso egzomo seka 4 pacientui (2 šeima) nustatė akivaizdžiai homozigotinį vidiniame kadre įterpimo variantą c.419_420insAAA (p.Tyr139_Asn140insLys) NR1H4 , kuris taip pat buvo parodytas 3 pacientui (2b pav.). Nepaisant tikėtino rėmo įterpimo mutanto produkto ekspresijos, FXR baltymas nebuvo aptinkamas abiem pacientams (1 pav.). Motina atliko rėmo intarpą NR1H4, o tėvas buvo neigiamas. SNP masyvas pasiūlė kopijų skaičiaus praradimą (papildomas 3 pav.) Ir lūžio taško jungties PGR parodė, kad abu pacientai NR1H4 gene pernešė paterniškai paveldėtą 31, 7 kb deleciją (2c, d pav.). Šis trynimas apima pirmuosius du NR1H4 nuorašų koduojančius egzonus ir, kaip manoma , sukels visišką FXR ekspresijos praradimą. 4 pacientas taip pat buvo heterozigotinis dėl C.197G> A (p.Trp66 *) numatomo patogeniško varianto SLC10A2 , koduojančio pienligės apikinį nuo natrio priklausomą tulžies rūgšties pernešėją (ASBT). 3 variante šio varianto nebuvo (2 lentelė). Taip pat nustatyta, kad 4 pacientas yra homozigotinis bendro AB1411 c.1331T> C (p.V444A) varianto atžvilgiu . 3 pacientui buvo heterozigotinis šitas alelis, kurio nebuvo 1 šeimoje (2 lentelė).

C.419_420insAAA (p.Tyr139_Asn140insLys) intarpas yra pirmajame FXR DBD cinko rišimo modulyje, esančiame netoli DNR atpažinimo spiralės (3a, b pav.). Šis DBD regionas yra labai konservuotas stuburinių branduolių receptoriuose (papildomas 4 pav.), Kas rodo, kad šis intarpas sutrikdo DNR jungimąsi. Nors mutanto baltymo ekspresija nebuvo nustatyta imunohistochemiškai, jis gali būti ekspresuojamas mažai. Taigi, tiek laukinio tipo, tiek intarpinis mutantas FXR buvo gaminamas atliekant in vitro vertimą kartu su retinoido X receptoriaus (RXRα) heterodimerio partneriu, o FXR / RXR DNR prisijungimas buvo įvertintas naudojant elektroforetinį mobilumo-poslinkio testą. FXR mutantas nepastebimai prisijungė prie bendros FXR / RXR jungties vietos, kurioje yra apjungtas receptorių surišančio heksamero pakartojimas, atskirtas viena bazine pora (IR-1), arba IR-1 elementas nuo SHP promotoriaus (3c pav. ). Įterpimas taip pat panaikino transkripcijos aktyvumą reaguojant į sintetinį agonistą GW4064 ant sintetinio promotoriaus, turinčio tris sutarimo IR-1 kopijas (3d pav.). Be šios IR-1 transakcijos, neseniai pranešėme, kad FXR transkripciniu būdu gali atremti autofaginių genų ekspresiją per aiškų DR-1 tiesioginį pakartojimo elementą 6 . Mutato baltymas taip pat neturėjo šios funkcijos (papildomas 5 pav.).

Image

a ) Labai konservuotas žmogaus FXR baltymo cinko piršto domenas. 1 šeimoje aptiktas nesąmonių mutacijos likutis pažymėtas žalia rodykle. „Lys 140“ įterpimo, esančio 2-oje šeimoje, vieta pažymėta raudona rodykle. „Zn“ reiškia cinko jonus. Cisteino liekanos, tiesiogiai sąveikaujančios su cinko jonais, yra raudonos spalvos. b ) Numatomų DBD struktūrų palyginimas. Numatomos laukinio tipo FXR ir FXR mutantų struktūros su vidiniu rėmo intarpu, pagrįstu EcR / RXR DBD struktūra komplekse su IR-1 (PBD 1R0N). RXR yra pilka, EcR - oranžinė, laukinio tipo hFXR - žalsvai mėlyna, hFXR mutantas violetinė, o cinko jonai - žali. Įdėtas lizino likučiai yra raudonos spalvos, parodyta šoninė grandinė. c ) elektroforetinio judėjimo poslinkio tyrimas, atliktas su FXRE arba FXR rišančia sritimi pelių SHP promotoriuje ir laukinio tipo arba Lys intarpų mutantų FXR ir RXR konsensuso srityje, kaip nurodyta. d ) Žurnalisto nurodyta santykinė luciferazės išraiška, kurioje yra trys sutarimo kopijos, reaguojant į laukinio tipo ir mutantinius FXR baltymus, esant arba neturint sintetinio FXR agonisto GW4064. Kartojama tris kartus (* P , 0, 01 pagal t- testą, klaidų juostos sd). FXRE, FXR surišantis elementas.

Visas dydis

Be kepenų, FXR yra labai ekspresuojamas plonojoje žarnoje, kur jis reguliuoja FGF19 - hormoninį augimo faktorių, kuris kepenyse sumažina tulžies rūgšties sintezę, slopindamas biosintetinio fermento CYP7A1 ekspresiją (nuoroda 20). Atlikus žarnyno FXR nebuvimą, išgyvenusių 1 šeimos pacientų FGF19 kiekis serume yra žemas (31, 6 ± 6 pg ml −1 ; vaikų normalus 220 ± 35 (ref. 21)), lydimas aukšto CYP7A1 aktyvumo, kurį rodo aukštas tulžies kiekis serume. rūgšties pirmtakas C4 (211, 8 ± 124; vaikų normalus 22, 8 ± 15, 8 ng ml −1 (nuoroda 22)) ir mažas cholesterolio kiekis (63 ± 8 mg dl −1 ) (papildomas 6d – f pav.). Šie pacientai taip pat turi nuolatinių bilirubino ir kepenų fermentų anomalijų (papildomas 6a – c pav.) Ir progresuojančios steatozės histologinių įrodymų. Gali būti, kad jų lengva hepatopatija po transplantacijos yra normalios enterohepatinės tulžies rūgšties homeostazės sutrikimo pasekmė. Po transplantacijos progresuojanti kepenų steatozė taip pat buvo pranešta apie PFIC1 (nuorodos 23, 24), galbūt dėl ​​pakitusio FXR signalo 25 .

Visiems pacientams ankstyvos ligos metu pasireiškė sunki nuo vitamino K nepriklausoma koagulopatija. Tai atitinka neseniai atliktą viso genomo „ChIP-Seq“ DNR surišimo tyrimą, kuris nustatė, kad komplementas ir krešėjimo kaskados yra tiesioginiai FXR reguliavimo tikslai žmogaus pirminiuose hepatocituose 26, taip pat su ankstesnėmis ataskaitomis, kad žmogaus FXR skatina 27 fibringeno ir kininogeno 28 ekspresiją . . Mes patvirtinome, kad FXR agonistai indukuoja visų trijų fibrinogeno genų FGA , FGB ir FGG mRNR raišką, taip pat padidina genų, koduojančių audinių faktorių / faktorių III / tromboplastiną ( F3 ), XII faktoriaus / Hagemano faktorių ( F12 ) ir XIII faktorių, ekspresiją. B ( F13B ) žmogaus kepenų ląstelių linijoje Huh7 (papildomas 7a pav.). Šie atsakai buvo sumažinti dėl FXR numušimo (papildomas 7b pav.).

Diskusija

Darome išvadą, kad homozigotinis FXR funkcijos praradimas dėl NR1H4 mutacijų sukelia mažą GGT sunkiojo PFIC formą. Klinikinės su NR1H4 susijusios cholestazės ypatybės yra naujagimių ligos pradžia, greitai progresuojančios iki galutinės stadijos kepenų ligos, nuo ankstyvosios vitamino K nepriklausančios koagulopatijos, nuo žemo iki normalaus GGT serume, padidėjusio alfa-fetoproteino serume ir nenustatomos kepenų BSEP ekspresijos. GGT pakilimo stoka atitinka BSEP išraiškos praradimą. BSEP, užkoduotas ABCB11 , buvo pirmasis identifikuotas FXR taikinys. BSEP promotorius ypač reaguoja į FXR aktyvaciją 29, tai rodo, kad BSEP ekspresijos nebuvimas yra tiesioginė FXR funkcijos praradimo pasekmė. Buvo išlaikyta MDR3, kuri mažiau reaguoja į FXR 30, raiška.

Neaišku, kokie yra sunkesnių abiejų 2 šeimos pacientų simptomų ir 4 paciento hidrikos simptomai. Homozigotinis ASBT / SLC10A2 funkcijos praradimas sukelia tulžies rūgšties malabsorbciją jau antrą gyvenimo dieną 31, o ASBT haploinfektyvumas gali dar labiau sutrikdyti tulžies rūgšties homeostazę padidėjus prenataliniam tulžies rūgščių kiekiui. Taigi patogeniško SLC10A2 geno varianto heterozigotumas gali prisidėti prie sunkios 4 paciento patologijos. Šis pacientas taip pat buvo homozigotinis dėl bendro ABCB11 c.1331T> C (p.V444A) varianto, kuris buvo susijęs su padidėjusia rizika kelios intrahepatinės cholestazės formos 32 . Tačiau trūksta aptinkamo BSEP baltymo ekspresijos visiems keturiems pacientams, dėl 3 ar 4 pacientų funkcinio šio polimorfizmo poveikio. Dėl aptinkamos FXR ekspresijos nebuvimo taip pat galima spręsti apie galimą dominuojantį neigiamą p.Tyr139_Asn140insLys įterpimo mutanto baltymo poveikį.

Kadangi abu 1 šeimos tėvai yra heterozigotiniai dėl p.R176 * apipjaustymo, tačiau neparodo kepenų funkcijos sutrikimo, mūsų rezultatai neatitinka ankstesnio pranešimo apie sunkią kūdikio cholestazę atskirame heterozigotiniame tos pačios mutacijos heterozigotoje 18 . Net jei trumpas mutantinis peptidas būtų išreikštas, jam trūksta nei DBD, nei ligandą surišančio domeno, ir nėra jokio akivaizdaus mechanizmo, kuris leistų daryti dominuojantį neigiamą poveikį. Todėl tikimasi, kad šis paprastas funkcijos praradimas bus laukinio tipo alelio recesija, kaip pastebėta abiem 1 šeimos tėvams, abiem heterozigotiniams 2 šeimos tėvams, taip pat pelėms, neturinčioms vieno NR1H4 alelio. Viena iš galimybių yra tai, kad ankstesniame pranešime nurodytas probandas turėjo papildomą, nenustatytą mutaciją, paveikiančią kitą NR1H4 alelį. Tačiau šiam pacientui buvo padidėjęs GGT lygis serume 18, o tai neatitinka keturių čia pateiktų asmenų su patvirtintu NR1H4 bialleliniu praradimu. Taigi, ankstesnis pacientas galėjo turėti žalingą kito geno, susijusio su cholestaze, mutaciją, kaip pastebėta 4 pacientui, arba apskritai kokią nors kitą problemą, kuri pakenkė kepenų funkcijai. Apskritai akivaizdu, kad heterozigotinis FXR funkcijos praradimas nėra pakankamas kūdikio cholestazei sukelti.

Koagulopatija, pastebėta visiems keturiems pacientams, gali būti suprantama kaip paprasta jų kepenų ligos pasekmė arba gali būti antrinė problema, susijusi su lipiduose tirpių maistinių medžiagų, ypač vitamino K, absorbcija, kuri yra būtina krešėjimui. Tačiau keturios skirtingos, bet viena kitą papildančios įrodymų linijos tvirtina, kad tai yra tiesioginė FXR funkcijos praradimo pasekmė. Pirma, koagulopatija buvo pastebėta labai anksti jų ligos eigoje, gerokai prieš galutinės stadijos kepenų nepakankamumą. Ši ankstyva koagulopatija neatsakė į gydymą vitaminu K. Antra, keli ankstesni tyrimai pasiūlė tokią FXR funkciją. Pradines ataskaitas, rodančias, kad žmogaus FXR sukelia 27- ojo fibrinogeno ir 28- ojo kininogeno ekspresiją, stipriai patvirtino naujausia FXR cistromos žmogaus pirminiuose hepatocituose ChIP-Seq analizė, kurioje nustatyti keli komplemento ir krešėjimo kaskadų komponentai kaip specialiai praturtinti FXR tikslai 26 . Mes patvirtinome visų trijų fibrinogeno genų ir mažiausiai trijų papildomų krešėjimo faktorių indukciją nuo FXR žmogaus kepenų ląstelių linijoje (papildomas 7 pav.). Trečiasis - padidėjęs krešėjimo greitis pacientams, gydytiems FXR agonistu obeticholio rūgštimi, kaip rodo nedidelis, bet reikšmingas tarptautinio normalizuoto santykio sumažėjimas 11 . Atsižvelgiant į tai, ketvirta yra naujausia ataskaita apie padidėjusį krešėjimą pacientams, sergantiems įvairiais cholestatiniais sutrikimais 33 . Kepenų nepakankamumo požiūriu tai buvo laikoma paradoksalu, tačiau dabartinėje situacijoje yra tiesiogiai numatoma FXR aktyvacijos padidėjusia tulžies rūgštimi pasekmė. Atsižvelgiant į šį platesnio pacientų rato apibūdinimą, nuo vitamino K nepriklausoma koagulopatija nėra dažnas ankstyvas PFIC sutrikimų grupės tyrimas 34 . Taigi, mūsų pacientų duomenys, tiesioginis FXR vaidmuo reguliuojant krešėjimą ir klinikiniai tyrimai su obeticholio rūgštimi gydytais pacientais ir kitomis cholestazės formomis rodo, kad ankstyva pradžia nuo vitamino K nepriklausanti koagulopatija yra skiriamasis NR1H4 gydomos cholestazės diagnostinis bruožas.

Išgyvenę 1 šeimos pacientai yra genetiškai mozaikiniai, laukinio tipo FXR išreiškiama tik kepenyse. Kadangi jie nerodo akivaizdžių patologijų kituose organuose, žinomuose kaip FXR, įskaitant žarnyną ir inkstus, tokia ekstrahepatinė FXR funkcija nėra būtina. Tačiau tikėtina, kad FXR nebuvimas žarnyne lemia jų labai mažą cirkuliuojančio FGF19 kiekį. Savo ruožtu šio neigiamo grįžtamojo ryšio reguliatoriaus praradimas greičiausiai lemia padidėjusią tulžies rūgšties sintezę, vidutiniškai padidėjusį kepenų fermentų kiekį ir kepenų steatozę.

Priešingai nei sunki žmonių liga, FXR funkcijos praradimas pelėms sukelia tik nedidelį tulžies rūgšties lygio padidėjimą, nesukeliantį kepenų nepakankamumo 35, 36 . Vienas iš galimų to paaiškinimų yra tas, kad pelės turi papildomą FXR izoformą FXRβ, užkoduotą NrIh5 (nuoroda 37). NR1H5 yra pseudogenas žmonėms, turintis kelis kodonuose esančius kodonus, taip pat numatyto nuorašo kadro poslinkius. Nors apie FXRβ funkciją žinoma labai mažai, tikėtina, kad ji sutampa su FXRα / NrIh4 funkcija . Taigi yra įmanoma, kad FXRβ ekspresija iš dalies kompensuoja FXRα / NrIh4 praradimą pelėms.

Apskritai, ankstyvosios cholestazės vystymasis ir greitai progresuojantis kepenų funkcijos sutrikimas, turintiems NR1H4 geno mutacijų, sustiprina FXR kaip pagrindinio tulžies rūgšties homeostazės reguliatoriaus vaidmenį ir patvirtina pagrindinį vaidmenį atliekant kepenų apsaugą, užkertant kelią tulžies rūgšties sukeltam kepenų toksiškumui. Prognozuojame, kad kai kurie pacientai, kuriems PFIC charakteristikos būdingi esant normaliam GGT ir nenustačius mutacijų žinomuose PFIC genuose 12, 34, turės NR1H4 funkcijų praradimo variantus ir kad šie pacientai gali būti kliniškai išskirti dėl ankstyvo jų vartojimo vitamino. K nepriklausoma koagulopatija ir greita progresija.

Metodai

Klinikinis viso egzomo sekos nustatymas

Tiriamieji buvo įtraukti į tyrimus, kuriuos patvirtino Baylor medicinos koledžo arba Stanfordo universiteto medicinos mokyklos institucinės peržiūros tarybos, ir buvo gautas informuotas sutikimas. Klinikinis viso egzomo sekos nustatymas buvo atliktas, kaip aprašyta anksčiau 38 . Trumpai tariant, genominės DNR mėginiai buvo suskaidyti ultragarsu, sujungti į multipleksavimo suporuotų galų adapterius, sustiprinti PGR ir hibridizuoti į tirpalu pagrįstą egzomo surinkimo biblioteką, kuri buvo suprojektuota įmonėje. Praturtinti DNR produktai buvo sekuoti poromis (100 bp) „Illumina HiSeq 2000“ platformoje, o vidutinis aprėptis buvo> × 130 ir bent × 20 aprėptis> 95% tikslinių regionų. Duomenys buvo išanalizuoti ir komentuoti naudojant įmonėje sukurtą dujotiekį. Visiems mėginiams buvo atlikta cSNP matricos analizė, atlikta naudojant žmogaus egzomo „BeadChip“ (Illumina, San Diegas, CA) pagal gamintojo instrukcijas.

Laužimo taško sankryža PGR

Norėdami ištrinti trynimo sandūrą, buvo suprojektuotos nuoseklios pradmenų poros su maždaug 15 kb intervalais, apimančios apskaičiuotą minimalų ištrynimo regioną, kaip apibrėžta cSNP matricos rezultatu. PGR buvo atlikta naudojant „Qiagen LongRange“ PGR rinkinį (Qiagen, Valensija, CA). Ši strategija davė ne daugiau kaip 20 kb ilgio amplikonus, užtikrinančius PGR amplifikacijos gedimą be porų trynimo. Sėkmingai amplifikavus, toje vietoje buvo suprojektuoti papildomi pradmenų rinkiniai, skirti generuoti mažesnio nei 1000 bp ilgio PGR produktus, kad būtų galima patvirtinti Sangerio seką.

Baltymų sekos suderinimas ir struktūros numatymas

Baltymų sekos buvo gautos iš „UniProt“ (www.uniprot.org). Eilių derinimas buvo atliekamas su „Clustal X“ (nuoroda 39). Numatomos laukinio tipo FXR ir FXR mutantų struktūros su vidiniame rėmelyje įterpimu buvo sukurtos naudojant RaptorX (nuoroda 40) ir palygintos su EcR / RXR DBD struktūra komplekse su IR-1 (PBD 1R0N) (nuoroda 41).

Elektroforetinio judesio-poslinkio tyrimas

Elektroforetinis mobilumo-poslinkio tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta 5, su modifikacijomis, kaip aprašyta žemiau. Dvisluoksniai oligonukleotidai (konsensusas FXRE / IR1 ir SHP / IR1, 5′-GATGGCCAAGGTCAATGACCTCGGGG-3 ′ ir 5′-CCCTGGTACAGCCTGGGTTAATGACCCTGTTTATGCACTTG-3 ′, atitinkamai were led mmol); T4 polinukleotidų kinazė zondui žymėti. Žmogaus FXR ir RXRα baltymai (2c pav.) Buvo paruošti naudojant TNT T7 greitai sujungtą sistemą (Promega, Madison, WI). In vitro ištirti baltymai buvo inkubuojami su 0, 05 ng zondo rišančios reakcijos buferyje, kuriame yra 10 mM Tris (pH 8, 0), 60 mM KCl, 0, 1% NP-40, 6% glicerolio, 1 mM ditiotreitolio ir 1 μg poli (dI-dC). ) ant ledo 20 min. DNR-baltymų kompleksai buvo išskaidyti standartiniais nedenaturuojančiais 4% poliakrilamido geliais. Geliai buvo džiovinami ir veikiami rentgeno plėvele –80 ° C temperatūroje 5–24 valandas.

FXR transaktyvacijos tyrimas

Hela ląstelės ir AML12 ląstelės buvo palaikomos DMEM su 10% vaisiaus galvijų serumu (FBS) 37 ° C, 5% CO2. Hela ląstelių transfekcijai ląstelės buvo pasėtos į 12 šulinėlių plokšteles ir perpiltos 1 μg reporterio vektoriu (pGL3-FXREx3) ir 50 ng / 100 ng pCMX-hFXR, pCMX-hFXR mutanto, pCMX-hRXRα, atitinkamai, naudojant iM Fectin. („GenDEPOT“, „Barker“, TX) pagal gamintojo instrukcijas. Vidinei kontrolei buvo kotransfekuota 10 ng beta-galaktozidazės plazmidės. Praėjus trims valandoms po transfekcijos, ląstelės buvo apdorotos nešikliu (dimetilsulfoksidu) arba 1 μM sintetiniu FXR agonistu GW4064 (Sigma-Aldrich, Sent Luisas, MO) ir inkubuojamos dar 24 valandas. Galiausiai ląstelių lizatai buvo surinkti ir luciferazės aktyvumas išmatuotas, kaip aprašyta anksčiau 42 . AML12 transfekcijai ląstelės buvo pasėtos į 24 šulinėlių plokšteles ir perpiltos 200 ng reporterio vektoriaus (pGL3-DR1x3 ir pGL3-LC3ax3), 100 ng p (CMX) -mPPARα arba pCMX-hFXR ir 50 ng CMX. -β-galaktozidazė. Po 4 h transfekcijos ląstelės buvo apdorotos arba nešikliu (0, 1% DMSO), naudojant Lipofectamine 2000 (Invitrogen), 10 μM Wy-14, 643 arba 1 μM GW4064 terpėse, kuriose buvo 20 val. Nuo anglies atskirto serumo, prieš atliekant luciferazės ir β-galaktozidazės testą. .

siRNR transfekcija

Huh7 ląstelės buvo palaikomos DMEM, papildyta 10% FBS (Life technologies). Ligandų gydymui terpė buvo pakeista fenolio neturinčiu DMEM, papildytu 5% medžio anglies atskirtu FBS (Life technologies), tada FXR ligadai (CDCA, Sigma, C-9377; GW4064, Tocris bioscience, # 2473) buvo gydomi 24 valandas. Pagal gamintojo protokolą siRNR, nukreipti į žmogaus FXR (Dharmacon, L-003414-00-0005), buvo transfekuoti Lipofectamine 2000 (Life technologies). Po 24 val. Terpė buvo pakeista fenolio neturinčiu DMEM, turinčiu 5% medžio anglies atskirtos FBS, tada FXR ligadai buvo apdorojami dar 48 valandas.

RNR išskyrimas ir realaus laiko PGR analizė

Visa RNR buvo išskirta naudojant „Quick-RNA MiniPrep Kit“ („Zymo Research“, # 11-328), o cDNR buvo paruošta naudojant amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Master Mix (GenDEPOT, # 5600). Genų ekspresijos lygis buvo nustatytas realaus laiko PGR naudojant „LightCycler 480 Real-Time PCR System“ (Roche) su „PerfeCTa SYBR Green FastMix“ („Quanta Biosciences“). Išraiškos vertės buvo normalizuotos iki GAPDH mRNR. Gruntų komplektai išvardyti 3 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

FGF19 matavimai

FGF19 serumas buvo matuojamas šaldytais nevalgiusiais serumo mėginiais, gautais iš 1 ir 2 pacientų ir sveikų jaunų suaugusiųjų, naudojant kiekybinį sumuštinių fermentų susietą imunosorbentų tyrimą, naudojant parduodamą rinkinį (FGF19 Quantikine ELISA rinkinys, katės Nr. DF1900; R&D Systems, Minneapolis, MN). ir laikydamiesi gamintojo nurodymų. Mes atlikome du nepriklausomus matavimus, kuriuose buvo panaudota 100 μl serumo ir visi mėginiai buvo tirti trimis egzemplioriais.

7-alfa-hidroksi-4-cholesten-3-ono (C4) serumo matavimas

C4 buvo matuojamas šaldytuose nevalgius serumo mėginiuose iš 1 ir 2 pacientų ir sveikų jaunų suaugusiųjų. Matavimai buvo nustatyti naudojant aukšto efektyvumo skysčių chromatografijos ir tandemos masių spektrometriją, kaip prieš tai buvo tinkamai aprašyta 43 .

Autoriaus tęsiniai

Tyrimą sukūrė, suprojektavo ir jam vadovavo NG-O., CJP, RXFX, BLS, GME ir DDM. NG-O., CJP, BLS, KM, JLP, TAJ, GCW, MP, WEB, RJS ir NK matė pacientus arba rinko ar analizavo paciento mėginius. RX ir FX sukūrė, atliko ir interpretavo genetinę analizę, daug prisidėję JZ, WH, PL, DMM, EB, JRL, SEP, RAG, CME ir YYASK bei MJF, atlikdami histologinę analizę. NG-O., RX ir DDM parašė rankraštį, daug prisidėdami CJP, BLS, ASK ir MJF. Visi autoriai patvirtino galutinį rankraštį ir prisidėjo prie jo intelektinio turinio.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    1-7 paveikslai ir 1-2 lentelės

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.