Abipusis tgf-beta ir interleukino-2 antagonizmas ląstelių išgyvenamumui ir indukuotų reguliavimo t ląstelių linija | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Abipusis tgf-beta ir interleukino-2 antagonizmas ląstelių išgyvenamumui ir indukuotų reguliavimo t ląstelių linija | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių mirtis
  • Interleukinai
  • Reguliacinės T ląstelės
  • Transformuojantis augimo faktorių beta

Anotacija

Transformuojantis augimo faktoriaus beta (TGF- β ) - ir Interleukino-2 (IL-2) tarpininkavimas signalizacijai suteikia galimybę generuoti ir išplėsti indukuotas reguliuojančias T (iTreg) ląsteles, kurios teikia daug vilčių gydyti lėtines uždegimines ir autoimunines ligas. Tačiau žinių apie veiksnius, stabilizuojančius jų giminės įsipareigojimą ir gyvenimo trukmę, yra nedaug. Čia mes ištyrėme „iTreg“ ląstelių, gautų iš pelių mutantų, kuriems trūko apoptozės, elgesį per aktyvuotą ląstelių autonominę ląstelių mirtį, kurią sukėlė citokinų deprivacija arba aktyvacijos sukeltas ląstelių žūtis (AICD) po T-ląstelių receptoriaus atnaujinimo ir palygino šiuos atsakus su efektorinių T ląstelių reakcijomis. Pastebėjome, kad iTreg ląstelės buvo daug jautresnės IL-2 nepritekliui, bet silpnai jautrios AICD. Tiesą sakant, kai buvo pažeista apoptozė, T-ląstelių receptorių (TCR) ryšys sąlygojo nuo metilinimo nepriklausomą, nuo ERK ir PI3K / mTOR priklausomą Foxp3 ekspresiją, sumažėjo slopinamasis pajėgumas ir efektorinis citokinų gamyba. Nors iTreg ląstelės užkirto kelią kolito indukcijai, jos greitai prarado Foxp3-GFP raišką ir įgijo gebėjimą gaminti efektorinius citokinus, taip sukeldamos Th1 ląstelių likimą efektorinėms ląstelėms. Keista, bet pačią iTreg ląstelių konversiją ribojo nuo TGF β priklausoma Bim / Bcl2L11 priklausoma apoptozė. Taigi tas pats citokinas, kuris skatina „iTreg“ ląstelių generavimą, gali sukelti jų nykimą. Mūsų rezultatai suteikia naujų įžvalgų apie „iTreg“ ląstelių biologiją, padėsiančias optimizuoti „iTreg“ pagrįstą terapiją.

Pagrindinis

Apoptozė limfocitų vystymosi metu ir reguliuojamų T (Treg) ląstelių generavimas yra būtini norint sukurti centrinę ir išlaikyti periferinę toleranciją. 1 Trego ląstelėms būdinga skirtingų ląstelių paviršiaus molekulių, tokių kaip CD4, interleukino (IL) -2R α grandinės (CD25), ekspresija, tačiau transkripcijos faktorius Foxp3 atrodo vienintelis patikimas žymeklis. 2 Trego ląstelės natūraliai atsiranda užkrūčio liaukoje (nTreg) arba gali būti sukeltos (iTreg) periferijoje iš CD4 + Foxp3 nebenaudotų T ląstelių, reaguojant į augimo faktoriaus beta (TGF- β) ir IL-2 3 arba retinoinės rūgšties transformaciją. Atitinkamai pelėms, kurioms nėra citokino, nustatytas autoimunitetas yra priskiriamas jų nesugebėjimui generuoti ar išlaikyti iTreg ląsteles periferijoje. 5, 6 susidūrimas su antigenais ir naivių T limfocitų išsiplėtimas lemia nTreg ląstelių amplifikaciją ir iTGG ląstelių indukciją iš CD4 + Foxp3 - T ląstelių telkinio TGF- β , užkertant kelią imuninio atsako pertekliui. 7

„iTreg“ ląstelės žada daug naudoti gydant lėtines uždegimines ar autoimunines ligas ir nustatant toleranciją transplantacijai. Principų įrodymas buvo pateiktas gyvūnų modeliuose, kai įvaikingai perduodamos iTreg ląstelės, išgelbėjusios skurdus peles, neturinčius funkcinės Foxp3 ekspresijos, kad būtų galima sukurti mirtiną autoimunitetą, 8 arba užkirsti kelią diabeto išsivystymui bendro perdavimo modelyje kartu su diabetogeninėmis ląstelėmis NOD / SCID pelėse., 9, taip pat centrinės nervų sistemos (CNS) anomalijos EAE, kai buvo naudojami į mieliną reaguojantys „iTregs“. 10

Nepaisant daug žadančių rezultatų, entuziazmą dėl terapinio taikymo sumažino stebėjimai, rodantys latentinį iTreg ląstelių atsidavimą Treg linijai, greičiausiai dėl silpnesnės Foxp3 promotoriaus metilinimo 11 ir pranešto nTreg ląstelių polinkio virsti uždegiminio tipo Th17 ląstelėmis praradus Foxp3. ekspresija esant IL-6. 12, 13 Nepaisant to, iTreg ląstelės išlieka patraukliomis terapinėmis priemonėmis. Norint gauti ilgalaikę klinikinę naudą, reikia palaikyti Foxp3 ekspresiją, stabilizuojančią liniją ir pratęsti jos naudojimo laiką. Tačiau dabartinės žinios apie mechanizmus, kontroliuojančius šiuos procesus „iTreg“ ląstelėse, yra ribotos.

Apoptozinė T-ląstelių mirtis sukeliama vadinamuoju „išoriniu keliu“, sujungiant „mirties receptorius“, TNF-R šeimos narius, tokius kaip TNF-R1, TRAIL-R arba CD95 / Apo1 / FAS. Pavyzdžiui, pastarasis receptorius suaktyvėja, kai indukuoja T95 ląstelių receptorius (TCR), perduodant CD95L - procesą, dar žinomą kaip aktyvacijos sukeltas ląstelių žūtis (AICD). Nepakankamas TCR stimuliavimas po antigeno klirenso sumažina citokinų gamybą ir tai sukelia apoptozę „būdingu“ arba „Bcl-2 reguliuojamu“ keliu, kartais vadinamu „aktyvuota ląstelių autonomine mirtimi“ arba ACAD. 14 Suaktyvinant pastarąjį kelią, esminį vaidmenį vaidina tik BH3 turinčių baltymų pogrupio Bim / Bcl2L11 proapoptotinis Bcl-2 šeimos baltymas. 15 Pažymėtina, kad buvo pranešta apie bet kurio apoptozės kelio defektus, palengvinančius autoimunitetą pelėms ir žmonėms. Pavyzdžiui, CD95 / C95L signalizacijos praradimas sukelia priežastį vystytis autoimuniniam limfoproliferaciniam sindromui (ALPS). 16 Taip pat per didelis anti-apoptotinio Bcl-2 ekspresija arba pelių praradimas proapoptoziniu Bim palengvina autoimuniteto atsiradimą ir yra susijęs su žmonių ligomis. 17 Atkreiptinas dėmesys, kad abu ląstelių mirties keliai, bendradarbiaujant, atsižvelgiant į antigeno tipą, gali būti pašalinti pašalinant aktyvintas T ląsteles pasibaigus imuniniam atsakui. 15

Taigi tiek Trego ląstelės, tiek aktyvuotų T ląstelių apoptozė yra labai svarbios užtikrinant imuninę homeostazę, o gilesnės žinios apie tai, kaip reguliuojamas Trego skaičius, padės lengviau jas gydyti. Čia mes palyginome TGF- β sukeltų CD4 + Foxp3 + iTreg ląstelių jautrumą su aktyvuotomis įprastomis CD4 + Foxp3 - T ląstelėmis (Tcon) apoptozės sukelta citokinų deprivacija ar TCR resimuliacija. Ląstelių mirties reakcijos buvo tiriamos, esant vidinio ir išorinio apoptozės signalizacijos kelio pagrindiniams komponentams, atsižvelgiant į TCR, IL-2 ir TGF- β suaktyvintus citokinų signalus, taip pat atsižvelgiant į Foxp3 tarpininkavimą. Be to, mes palyginome terapinį iTreg ir nTreg ląstelių įsitraukimo į gydymą potencialą ir stabilumą in vivo , pernešdami įpopuliaciją pelių T ląstelių sukeliamame uždegiminės žarnos ligos modelyje.

Rezultatai

„iTreg“ ląstelės yra silpnai jautrios CD95 naikinimui

Mes išanalizavome CD95 ir CD95L raišką, taip pat CD4 + Foxp3-GFP + nTreg ir naivių CD4 + Foxp3-GFP - T ląstelių, išskirtų iš blužnies iš Foxp3 gfp reporterio pelių 18, jautrumą CD95 sukeltai apoptozei. Ląstelės iš CD95 trūkumų turinčių Foxp3 gfp lpr pelių buvo naudojamos kaip kontrolė. „nTreg“ ląstelės žymiai sumažino ląstelių išgyvenamumą po CD95-ligacijos, palyginti su ką tik išskirtomis naiviomis T ląstelėmis, tuo tarpu lpr pelių ląstelės priešinosi CD95 žudymui (1a pav.). Pažymėtina, kad wT pelių nTreg ląstelėse padidėjo CD95 ekspresija jų ląstelių paviršiuje (1b pav.). CD95L mRNR lygis vis dėlto buvo žemesnis nTreg ląstelėse, palyginti su anksčiau negydytomis T ląstelėmis (1c paveikslas).

Image

„iTreg“ ir „Tcon“ ląstelės reaguoja skirtingai į AICD ir ACAD. a ) nTreg ir naivios T ląstelės buvo išskirtos iš wt ar CD95 trūkumų turinčių lpr pelių blužnies ir palygintos su iTreg ir Tcon ląstelėmis, sukurtomis ex vivo ląstelių išgyvenimui po CD95 / CD95L ligavimo. Gyvybingumas buvo analizuotas naudojant „AnnexinV / 7AAD“ dažymą ir srauto citometriją po 18 valandų kultūroje. Vertės buvo normalizuotos iki spontaniškos ląstelių mirties, pastebėtos kultūroje. Stulpeliai žymi n = 4 (masės) arba 3 ( lpr ) eksperimentų vidurkį. SEM ( b ) CD95 paviršiaus ekspresija nTreg, palyginti su naiviomis CD4 + Foxp3-GFP - T ląstelėmis, šviežiai izoliuotomis nuo blužnies, ir in vitro sukurtomis iTreg prieš Tcon ląsteles. Parodyti tipiniai trijų nepriklausomų eksperimentų pavyzdžiai. ( c ) qRT-PGR analizė santykiniais CD95L mRNR lygiais nTreg, palyginti su naiviomis CD4 + Foxp3-GFP - T ląstelėmis ir in vitro indukuotomis iTreg palyginti su Tcon efektorinėmis ląstelėmis. Stulpeliai žymi n = 3 nepriklausomų eksperimentų, atliktų su trimis skirtingais mRNR mėginiais, vidurkį ± SEM. ( d ) Išgrynintos iTreg ir Tcon ląstelės buvo kultivuojamos 48 valandas, nesant arba neturint skersinio ryšio anti-CD3, papildytų IL-2, TGF- β arba jų deriniu. Ląstelių išgyvenimas buvo analizuojamas naudojant „AnnexinV / 7AAD“ dažymą ir srauto citometriją. Stulpeliai rodo n = 3 nepriklausomų eksperimentų vidurkius ± SEM * P ≤0, 05

Visas dydis

Toliau mes palyginome „iTreg“ ir aktyvuotų T ląstelių elgesį su CD95 tarpininkaujama apoptozė. Ląstelės buvo generuojamos iš anksčiau nenaudotų T ląstelių, išgrynintų iš foxp3 gfp arba foxp3 gfp lpr pelių, ir kultivuojamos, jei nebuvo CD95L, arba 18 valandų. Įdomu tai, kad iTreg ląstelės buvo labai atsparios CD95L sukeltai ląstelių mirčiai, palyginti su nTreg ar Tcon ląstelėmis, kurios kultūroje mirė greičiau (1a pav.).

Norėdami įvertinti, kodėl iTreg ląstelės buvo atsparesnės CD95 tarpininkaujamai apoptozei, palyginti su Tcon ląstelėmis, mes taip pat kiekybiškai įvertinome CD95 ir CD95L raišką abiejuose T ląstelių tipuose iškart po jų indukcijos in vitro . CD95 baltymo ir CD95L mRNR ekspresija buvo žymiai sumažinta iTreg ląstelėse, palyginti su Tcon ląstelėmis, pateikiant pirmąjį paaiškinimą apie jų santykinį atsparumą CD95 ligavimui (1b ir c pav.), Tuo tarpu cFLIP , ląstelėje esančio kaspazės inhibitoriaus, mRNR lygis. 8, reikalingi CD95 žudymui, buvo palyginami (vidutinė mRNR išraiška iTreg versijoje Tcon 1: 1, 25 ± 0, 08; n = 3).

Kadangi, kaip pranešama, T ląstelių jautrumas CD95 žudymui priklauso nuo aktyvacijos sukeltos ląstelių ciklo progresavimo ir susijusios CD95L indukcijos, 19 taip pat įvertinome santykinį proliferacijos greitį, kiekybiškai įvertindami mitozinių fosfo-histono H3 (pH3) teigiamas ląsteles išsiplėtimo metu (papildomas paveikslas S1A ). Pažymėtina, kad mitozinis aktyvumas pasirodė dar didesnis iTreg ląstelėse, atmetus sumažintą ląstelių ciklo greitį iTreg ląstelėse kaip galimą paaiškinimą pastebėtiems CD95L raiškos skirtumams ir jautrumui CD95 žudymui. PKH-26 etiketės išlaikymas patvirtino šiuos rezultatus (papildomas paveikslas S1B).

TGF- β gali daryti priešingą poveikį iTreg išlikimui, palyginti su Tcon ląstelėmis

Mes įvertinome, ar TGF- β, esantis „iTreg“ kultūrose, yra atsakingas už šių ląstelių atsparumą CD95 / CD95L tarpininkaujantiems žudymams po TCR religacijos. iTreg ir aktyvuotos Tcon ląstelės buvo auginamos arba vien tik terpėje, arba pakartotinai stimuliuotos kryžminiu anti-CD3 mAb. Ląstelės toliau nebuvo gydomos arba joms buvo gautas šviežias IL-2, TGF- β arba abiejų citokinų derinys. iTreg ląstelės greitai mirė, po aktyvuotos ląstelių autonominės ląstelių mirties (ACAD), kurią sukėlė citokinų pasitraukimas, auginant vien terpėje, tuo tarpu Tcon ląstelėse pastebėta palyginti mažai apoptozės (1d pav. ir papildoma S1C nuotrauka). Papildymas IL-2 išgelbėjo iTreg ląsteles nuo apoptozės, tuo tarpu Tcon ląstelės turėjo palyginti mažai naudos, o TGF- β pridėjimas neturėjo jokio poveikio. Atkreiptinas dėmesys, kad pridėjus IL-2, abiejų tipų ląstelėse dar labiau padidėjo CD25 raiška (papildomas S1D ​​paveikslas), palyginti su ląstelėmis, tiriamomis iškart po pradinio išsiplėtimo (MFI CD25 3 dieną: iTreg 63 ± 15; Tcon 24 ± 5). .

Stebina, kad nors Tcon ląstelės greitai mirė AICD, iTreg ląstelės reagavo silpnai, nepaisant IL-2 trūkumo (1d pav.), Sutampančios su CD25 palaikymu ir padidėjusia CD95 ekspresija iTreg ląstelėse, nepastebėtos Tcon ląstelėse (papildomi S1D ir E). Pažymėtina, kad tuo metu iTreg ląstelių žūtis iš tikrųjų buvo padauginta iš kultūrų, papildytų IL-2, ir to nepastebėta Tcon ląstelėse (1d pav.). Galiausiai, nors TGF- β neturėjo įtakos CD95 paviršiaus lygiui Tcon ląstelėse (papildomas paveikslas S1E), jie buvo išgelbėti nuo AICD. TGF- β , priešingai, palyginti su sumažėjusiu jautrumu AICD, galutinai užmušė iTreg ląsteles po to, kai buvo pakartotinai stimuliuotos, naudojant jų TCR (1d pav., Papildoma S1C pav.). Pažymėtina, kad TGF- β apdorotose „TCR“ pakartotinai stimuliuotose „iTreg“ ląstelėse CD25 lygis buvo mažesnis - šį efektą įveikė pridedant IL-2 (papildomas paveikslas S1D). Atitinkamai, IL-2 taip pat atidėjo TGF- β -tarpininkaujant TCR resimuzuotų iTreg ląstelių apoptozę, tačiau neturėjo jokio poveikio resimimuliuojamoms Tcon ląstelėms. Šiose ląstelėse vien tik TGF- β padidino ląstelių išgyvenamumą (1d pav.).

Atnaujintų iTreg ląstelių gydymas TGF- β indukuoja tik BH3 turinčius baltymus

Siekiant geriau suprasti šių stebėjimų molekulinius pagrindus, buvo išanalizuoti skirtingų Bcl-2 šeimos narių mRNR lygiai ir CD95 signalizuojančių komponentų duomenys. TGF- β pridėjimas prie TCR pakartotinai stimuliuotų iTreg ląstelių lėmė lengvą anti-apoptozės Bcl-xL slopinimą, tačiau stipriai sukėlė proapoptotinius Bim ir Bmf , tuo tarpu Bid ir anti-apoptotinių Bcl-2 raiška nepakito (pav. 2a – e). Remiantis mūsų apoptozės rezultatais, buvimas IL-2 panaikino TGF- β sukeliamą Bim ar Bmf reguliavimą ir taip pat stabilizavo Bcl-xL , sudarydamas mechanizmą, kaip IL-2 išsaugo iTreg ląstelių išgyvenimą. Pranešama, kad TGF- β taip pat tarpininkauja ląstelių ciklo sustabdymui, sukeldamas p2120, ir gali sumažinti IL-2R β grandinės, CD122, lygius. 6 Tačiau mRNR lygis, koduojantis IL-2Rβ, šiek tiek padidėjo, tuo tarpu p21 mRNR lygis iš tikrųjų buvo sumažėjęs (2f ir g paveikslai). Pažymėtina, kad TCR restimuliacija taip pat sukėlė stiprų CD95L mRNR reguliavimą iTreg ląstelėse, kurios buvo panaikintos pridedant TGF- β , bet ne IL-2 (2h pav.). Taigi, atlikus TCR pakartotinį „iTreg“ ląstelių stimuliavimą, jų išgyvenimą gali užtikrinti tik kombinuoti signalai, kuriuos sukelia IL-2 ir TGF- β .

Image

TGF- β indukuoja tik BH3 turinčių baltymų genų Bim ir Bmf transkripciją restimuliuojamose iTreg ląstelėse. iTreg ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos kryžminiu anti-CD3 ir kultivuojamos 18 val. arba be papildomo apdorojimo, esant IL-2, TGF- β , ar IL-2 ir TGF- β deriniui. Santykinė mRNR raiška buvo analizuojama kiekybine RT-PGR ir normalizuota į namų tvarkymo geną β- aktiną. Rezultatai pavaizduoti kaip indukcija raukšlėmis arba sumažėjimais, palyginti su pakartotinai stimuliuotais anti-CD3 iTregs, kultivuojamais be citokinų ( a – g ) ar šviežių iTreg ląstelių, prieš anti-CD3 restimuliaciją ( h ). Juostos rodo n = 3 nepriklausomų eksperimentų, atliktų su skirtingais mRNR / cDNR mėginiais, vidurkį ± SEM * P ≤0, 05

Visas dydis

TCR replikacija skatina iTreg ląsteles nuo CD95 priklausomos apoptozės

Norint ištirti aukščiau paminėtų genų ekspresijos pokyčių svarbą, iTreg ir Tcon ląstelės buvo indukuotos iš foxp3 gfp , foxp3 gfp Bim - / - , foxp3 gfp vav -Bcl-2 transgeninių pelių ir kultivuojamos nesant citokinų arba buvo pakartotinai stimuliuojamos. jų TCR. Spontaninė apoptozė, atsirandanti dėl citokinų trūkumo, buvo žymiai mažesnė ląstelėse, kuriose trūksta Bim ar Bcl-2 (3a ir b pav.). Remiantis šiais rezultatais, IL-2 nepriteklius stipriai sukėlė Bim mRNR lygį iTreg ląstelėse, tuo tarpu CD95L ar TGF-β sumažėjo, galbūt dėl ​​trūkstamų TCR signalų (papildoma S2A-C pav.). Kaip ir tikėtasi, pridedant anti-CD95L mAb prie visų tirtų genotipų pagerėjo TCR atnaujintų Tcon ląstelių išgyvenimai (3a ir b paveikslai). Be to, Tcon ląstelės, gautos iš foxp3 gfp lpr pelių, buvo atsparios ląstelių žūčiai, kurią sukėlė TCR religacija, tuo tarpu citokinų pasitraukimas sukėlė mirtį panašia kinetika kaip ir Wcon Tcon ir iTreg ląstelėse (papildomi S2D ir E paveikslai). Taigi, TCR religacija sukelia nuo CD95 priklausomą apoptozę Tcon ir iTreg ląstelėse, tačiau pastarosiose tai vyksta su labai atidėta kinetika. Pažymėtina, kad iTreg ląstelių apoptozė po CD3 pakartotinio stimuliavimo buvo sustiprinta esant IL-2 ( P ≤0, 05), bet užkirstas kelią anti-CD95L antikūnais (palyginti 3b ir c paveikslėlius kairėje), laikantis stebėjimų, kad IL-2 gali pagerinti AICD padidinant CD95L išraišką. 20

Image

TGF- β skirtingai moduliuoja AICD „iTreg“, palyginti su „ Tcon“ ląstelėmis. „iTreg“ ir „Tcon“ ląstelės buvo indukuotos iš „ foxp3 gfp“ , „ foxp3 gfp Bim - /“ ir „ foxp3 gfp vav -Bcl-2“ pelių ir iki 48 val. kultivuojamos, jei nebuvo arba nebuvo neutralizuojančio anti-CD95L. Ląstelės buvo auginamos atskirai ( a ) arba pakartotinai stimuliuotos kryžmiškai sujungtu anti-CD3 be ( b ) arba esant IL-2 ( c ), TGF- β ( d ) arba IL-2 ir TGF- β deriniui ( e ). Ląstelių išgyvenimas buvo įvertintas naudojant „AnnexinV / 7AAD“ dažymą ir srauto citometriją. Stulpeliai rodo n = 3 nepriklausomų eksperimentų vidurkius ± SEM * P ≤0, 05

Visas dydis

Norėdami išsiaiškinti, kaip TGF- β užmuša iTreg ląsteles, wt, Bim - / - ir vav-Bcl-2 tg iTreg ląstelės buvo stimuliuotos anti-CD3 mAb ir TGF- β . Dalinis Bim praradimas ir per didelis Bcl-2 ekspresija visiškai išgelbėjo iTreg ląsteles nuo TGF- β mediacijos apoptozės, tuo tarpu neutralizuojančio anti-CD95L buvimas dar nepagerino jų išgyvenimo (3d pav.). Nuosekliai TCR atnaujintos lpr iTreg ląstelės buvo tokios pat jautrios TGF- β sukeltoms ląstelėms, kaip ir wt ląstelės (papildomas S2E paveikslas). Taigi TGF- β sukelia pakartotinai stimuliuotų iTreg ląstelių apoptozę, suaktyvindamas Bcl-2 reguliuojamą vidinės ląstelės mirties kelią. Pažymėtina, kad pridėjus IL-2 tokiomis sąlygomis buvo išvengta TGF- β tarpininkaujamos apoptozės, greičiausiai neutralizuojant Bim ir Bmf indukciją (2c, d ir 3e paveikslai). Kaip pažymėta anksčiau, TGF- β išgelbėjo Tcon ląsteles nuo AICD. 21

TCR restimuliacija gali sukelti iTreg ląstelių virsmą, kai sutrinka apoptozė

Pasidomėjome, kaip iTreg ląstelės išgyveno po TCR pakartotinės stimuliacijos, nesant IL-2. Todėl 3 dieną palyginome „Foxp3-GFP“ raišką šviežiai sukeltose „iTreg“ ląstelėse su jų, gautų iš TCR pakartotinai stimuliuotų ląstelių, auginamų, jei nėra arba nėra IL-2 ir (arba) TGF- β, ląstelėse. Siekiant išvengti laipsniško AICD indukcijos, stebimos vėlesniais laiko momentais po TCR restimuliacijos, ląstelės buvo inkubuojamos kartu su neutralizuojančiu anti-CD95L mAb. „Foxp3-GFP“ ekspresija laikui bėgant išliko stabili „iTreg“ ląstelėse, auginamose su IL-2 arba IL-2 ir TGF- β deriniu. Atvirkščiai, atlikus CD3 restimuliaciją, iTreg ląstelės greitai prarado GFP ir viduląstelinę Foxp3 raišką. To nebeleido užkirsti pridedant IL-2, bet reikėjo abiejų citokinų (4a paveikslas, papildomas S3 paveikslas). Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant CD95 trūkumus turinčias lpr iTreg ląsteles, neįskaitant neutralizuojančio anti-CD95L mAb įtakos Foxp3-GFP ekspresijai (papildomas S3A paveikslas). Pažymėtina, kad Bcl-2 per daug ekspresuojančios „iTreg“ ląsteles, kurios tokiomis sąlygomis mirė daug lėčiau dėl sutrikusio spontaninio mirties kultūroje, taip pat parodė didelį GFP nuostolį (papildomas paveikslas S3A). Tai rodo, kad Foxp3 ekspresijos išjungimas priklauso nuo TCR religacijos ir gali būti atjungtas nuo apoptozės. Kaip ir mūsų in vitro kultūrose, iTreg ląstelės pradėjo prarasti Foxp3 ekspresiją po įvaikinimo perkėlimo ir TCR religacijos in vivo (4b paveikslas).

Image

iTreg ląstelės slopina Foxp3 raišką ir inicijuoja IL-2 gamybą po anti-CD3 stimuliavimo. ( a ) Išgrynintos iTreg ląstelės buvo kultivuojamos esant arba neturint kryžminto anti-CD3 mAb, be citokinų, su IL-2 arba IL-2 ir TGF- β . Norėdami užblokuoti AICD, į kultūras buvo įpilama 10 μg / ml neutralizuojančio anti-CD95L. Foxp3-GFP MFI buvo analizuojami srauto citometrija. Pavaizduoti Foxp3-GFP išraiškos histogramų tipiniai užrašai ( n = 3). ( b ) 5 × 10 5 Ly 5.2 iTreg ląstelės buvo perneštos iv į Ly 5.1 izogeninius imunodetalius gavėjus, po to sušvirkšta 20 μg anti-CD3 mAb arba fiziologinio tirpalo. Po 3 dienų gyvūnai buvo nužudyti, o Ly 5.2 + iTreg ląstelės atsektos blužnyje. Parodytas tipiškas Ly5.2 + CD4 + TCR β + iTreg ląstelių taškinis diagrama ir histogramos perdengimas fiziologiniame tirpale arba anti-CD3 sušvirkštytose pelėse ( n = 2). ( c ) iTreg ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos kryžmiškai sujungtu anti-CD3, jei nebuvo arba nebuvo TGF- β 18 valandų. Santykinė IL-2 mRNR raiška buvo stebima qPCR ir normalizuota iki β- aktino. Rezultatai pavaizduoti kaip raukšlės indukcija prieš neapdorotas šviežiai išvalytas iTreg ląsteles prieš anti-CD3 restimuliaciją. ( d ) „iTreg“ ląstelės buvo kultivuojamos 48 valandas, neturint arba neturint kryžminto anti-CD3 su neutralizuojančiu anti-IL-2 mAb arba be jo. Ląstelių gyvybingumas buvo įvertintas naudojant „AnnexinV / 7AAD“ dažymą ir srauto citometriją. Stulpeliai rodo n = 3 nepriklausomų eksperimentų vidurkius ± SEM * P ≤0, 05

Visas dydis

Mes iškėlėme hipotezę, kad iTreg ląstelės gali perprogramuoti į IL-2 gaminančias efektorines ląsteles, kurios paaiškintų jų sugebėjimą išgyventi be egzogeninio IL-2. Iš tiesų, qRT-PGR atskleidė, kad iTreg ląstelės pradėjo gaminti IL-2 mRNR po TCR pakartotinio stimuliavimo. Tai sumažino TGF- β ir antikūnų sukelta IL-2 neutralizacija žymiai sumažino jų išgyvenamumą (4c ir d paveikslai). Taigi, mes pasidomėjome, ar šios ląstelės vis dar sugeba slopinti ir (arba) gali išreikšti uždegiminius citokinus. Todėl mes įvertinome šviežiai sukeltų „iTreg“ ląstelių slopinamąjį poveikį, palyginti su „iTreg“ ląstelių, auginamų papildomas 4 dienas po CD3, stimuliacijos. Kadangi „Foxp3“ reguliavimas palaipsniui vyko CD3 atnaujintose „iTreg“ ląstelėse, nedidelė šių ląstelių dalis (∼ 5%) 4 dieną vis dar buvo aukšto lygio „ Foxp3-GFP“ (papildomas paveikslas S3B). Norėdami atmesti galimybę, kad šios „Foxp3-GFP“ aukšto lygio „ iTreg“ ląstelės klastoja mūsų rezultatus, išanalizavome šias grupes: šviežias „iTreg“ ląsteles be pakartotinių stimuliacijų, „TCR“ atnaujintomis „Foxp3-GFP“ didelėmis ir „Foxp3-GFP“ žemomis ląstelėmis, taip pat bendras „Foxp3-GFP“ visas „ iTreg“ ląsteles. Šviežios „iTreg“ ląstelės stipriai slopino reaktoriaus T ląstelių proliferaciją, net esant koeficientui 16: 1 (5a pav.). Tačiau atlikus CD3 restimuliaciją, slopinamasis poveikis sumažėjo kartu su GFP ekspresija. Pažymėtina, kad per CD3 resimuliuotos „Foxp3-GFP“ žemos „ iTreg“ ląstelės sureguliavo CD25, nurodydamos jų sumažėjusią citokinų priklausomybę, tačiau išlaikė aukštą CTLA-4 lygį, kritinį slopinimą (5b paveikslas). Kai TCR restimuliacija buvo atlikta Th1 ar Th2 pasvirusiomis sąlygomis, „iTreg“ ląstelės, praradusios GFP raišką, taip pat pradėjo gaminti IFN γ arba IL-4 (5c pav.), Išreikšta mRNR, koduojančia T-helperio linijos įsipareigojimo genus T-bet arba Atitinkamai GATA-3, tuo tarpu ROR γ t indukcijos nepastebėta (papildomi S4A – C paveikslai).

Image

TCR religacija sukelia „iTreg“ ląstelių konvertavimą. a ) T-ląstelių slopinimo tyrimas naudojant iTreg ląsteles iškart po in vitro išplėtimo arba po pakartotinio stimuliavimo anti-CD3 dar 4 dienas, esant neutralizuojančiam anti-CD95L. Atnaujintos „iTreg“ ląstelės su anti-CD3 buvo naudojamos arba masiškai („iTreg GFP-all“), arba padalijamos į „iTreg GFP-high“ ir „iTreg GFP-low“ langelius. Naivios CD4 + atsakiklio T ląstelės buvo kultivuojamos atskirai arba su skirtingais iTreg ląstelių santykiais, švitintais APC ir tirpiu anti-CD3 72 valandas. Proliferacija buvo įvertinta įtraukiant 3H-timidiną ir normalizuota kaip atsakiklio T ląstelių, išaugintų be iTreg ląstelių, proliferacija. Simboliai žymi n = 4 (atskirtas „iTreg“) n = 8 (bendras „iTreg“) nepriklausomus eksperimentus, atliktus trimis egzemplioriais ± SEM ( b ) CD25 ir CTLA-4 išraiška iTreg ląstelėse iškart po indukcijos (-anti-CD3) arba po papildomų 4 dienos anti-CD3 pakartotinės stimuliacijos, esant neutralizuojančiam anti-95L (+ anti-CD3). Parodytas vienas reprezentatyvus histogramos grafikas iš trijų nepriklausomų eksperimentų, duodančių panašius rezultatus. ( c ) Išrūšiuotos iTreg ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos kryžminiu anti-CD3 ir neutralizuojančiu anti-CD95L, atskirai (kairėje), esant IL-4 (Th2 sąlygos, centras) arba IL-12 (Th1 sąlygos, dešinėje) 4 dienas. dienų. IL-4 ir IFN- γ ekspresija buvo įvertinta srauto citometrine analize. Duomenys atspindi tris nepriklausomus eksperimentus, kurių rezultatai panašūs. * P ≤0, 05; ** P ≤0, 01

Visas dydis

„iTreg“ ląstelės apsaugo nuo kolito sukėlimo, tačiau yra linkusios perprogramuoti

Toliau įvertinome, ar iTreg ląstelės turi panašų fenotipą uždegiminėmis sąlygomis in vivo. Todėl kolitas buvo sukeliamas RAG1 - / - pelėms, perduodant vien Ly5.1 + CD45RB CD4 + CD25 - Tcon ląsteles (kontrolinė grupė) arba kartu su Ly5.2 + CD4 + CD45RB maža Foxp3-GFP + blužnies gauta Ly5.2 + CD4 + CD45RB ląstelėmis. nTreg arba 1 × 10 5 Ly5.2 + CD4 + Foxp3-GFP + in vitro sukurtos iTreg ląstelės. Pažymėtina, kad tiek nTreg, tiek iTreg ląstelės veiksmingai užkirto kelią kolito indukcijai (6a ir b pav.).

Image

„iTregs“ apsaugo nuo kolito sukėlimo, tačiau perprogramuojamos in vivo . 3 × 10 5 Ly5.1 + CD45RB didelės CD4 + CD25 - Tcon ląstelės buvo švirkščiamos ip į Ly5.2 RAG1 - / - peles, atskirai (kontrolinė grupė), arba kartu su 1 × 10 5 Ly5.2 + CD45RB maža CD4 + „ Foxp3-GFP“ + „ nTreg“ arba 1 × 105 „Ly5.2“ + CD4 + „ Foxp3-GFP“ + „ iTreg“ ląstelės ( n = 3–4 pelės kiekvienoje grupėje). Gyvūnai buvo nužudyti, kai svorio netekimas siekė> 20% (kontrolinis) arba praėjus 7 savaitėms po įvaikinimo (pelėms, gaunančioms arba nTreg, arba iTreg ląsteles). a ) Santykinis kūno svorio pokytis normalizuotas iki pradinio svorio prieš perkėlimą. b ) Reprezentatyviais H&E dažytais vidurinės žarnos skyriais iš neapdorotų (tik Tcon), iTreg ar nTreg gydytų gyvūnų (100 ×). c ) Foxp3-GFP išraiška Ly5.2 + CD4 + nTreg arba iTreg ląstelėse praėjus 7 savaitėms po įvaikinimo. Pavaizduotas reprezentatyvus taškinis paveikslėlis (kairysis stulpelis) iš gyvūnų, gavusių Tcon ląsteles kartu su nTreg arba iTreg ląstelėmis, blužniuose. Dešiniajame skydelyje rodomos Ly5.2 + CD4 + Foxp3-GFP + nTregs ir iTreg ląstelių procentinės dalys tarp visų Ly5.2 + CD4 + T ląstelių blužnyje ir mLN ( n ≥3 kiekvienoje grupėje). d ) IFN- γ (viršutinė linija) arba IL-17A (apatinė linija) ekspresijos reprezentatyvūs taškiniai brėžiniai Ly5.1 + CD4 + Tcon ląstelėse, išskirtose iš blužnies (kairėje skiltyje), ir šių ląstelių kiekybinis įvertinimas blužnyje ir mLN ( n ≥3 vienai grupei). ( e ) Ly5.1 - CD4 + Treg ląstelės analizuojamos kaip nurodyta d punkte ( n ≥3 kiekvienoje grupėje). Juostos reiškia vidurkį ± SEM * P ≤0, 05

Visas dydis

Toliau mes analizavome linijinės struktūros stabilumą praėjus 7 savaitėms po ląstelių perdavimo in vivo. Dėl Ly5.2 žymens, ekspresuoto išskirtinai ant perkeltų nTreg ir iTreg ląstelių, ekspresijos, Foxp3-GFP praradimas buvo selektyviai stebimas šiose populiacijose. Kaip pastebėta in vitro, dauguma iTreg ląstelių blužnyje ir mezenteriniuose limfmazgiuose prarado Foxp3-GFP raišką perėmus ląstelę, tuo tarpu dauguma nTreg ląstelių vis dar ekspresuoja Foxp3-GFP (6c paveikslas). Tačiau pelėse, apdorotose iTreg ląstelėmis, mes taip pat nustatėme padidėjusį bendrą GFP - Ly5.2 + CD4 + T ląstelių skaičių, palyginti su nTreg ląstelėmis gydytais gyvūnais (papildomas paveikslas S5A). Todėl bendras reguliuojamų Ly5.2 + CD4 + Foxp3-GFP + T ląstelių skaičius pelėse, gavusiose iTreg ar nTreg ląsteles, analizės metu vis dar buvo palyginamas, atspindėdamas ir palyginamą gydymo sėkmę (papildomas S5B paveikslas).

Keista, tačiau, nors svoris ir histologinis balas buvo vienodi abiejose grupėse, gydomose skirtingo tipo Treg ląstelėmis, citokinų ekspresijos profilis Ly5.1 + CD4 + Tcon ląstelėse reikšmingai skyrėsi tarp grupių. Pelėms, apdorotoms iTreg ląstelėmis, buvo nustatyta daugiau IFN- γ + Tcon ląstelių, palyginti su gyvūnais, kuriems buvo gautos nTreg ląstelės. Priešingai, pastarojoje grupėje IL-17A + Tcon ląstelių buvo gausu (6d pav.). Remiantis mūsų in vitro analize (5 paveikslas), iTreg ląstelės taip pat pradėjo įgyti gebėjimą gaminti IFN- γ arba IL-17 po įvaikinimo. Šis gebėjimas buvo žymiai silpnesnis nTreg ląstelėse (6e pav.), Patvirtindamas jų tvirtesnį įsitraukimą į liniją.

„Foxp3“ ekspresijos nutildymas naudojant TCR signalus

Norėdami gauti daugiau žinių apie perprogramavimo procesą, įvertinome kritinių regionų metilinimo būklę Foxp3 geno lokuse. 11 Mūsų analizė parodė, kad TCR pakartotinis ryšys su anti-CD3 sukeltu tirpalu reikšmingai nepadidino metilinimo laipsnio, ir tai rodo, kad tokiomis sąlygomis Foxp3 išjungimui naudojami papildomi mechanizmai (papildomi S6A ir B paveikslai).

Ankstesnėse ataskaitose nurodoma, kad PI3K / mTOR signalo slopinimas leidžia TGF- β- nepriklausomą Foxp3 ekspresiją Tcon ląstelėse, 22 o AKT arba ERK aktyvacija riboja Trego įsipareigojimą. 23, 24 Taigi, mes pasidomėjome, ar blokuojant šiuos signalizacijos tinklus gali būti išvengta „Foxp3“ reguliavimo sumažinimo iTreg ląstelėse po TCR restimuliacijos. Taigi, iTreg ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos anti-CD3mAb, esant IL-2 ir anti-CD95L mAb, kad būtų išsaugotas jų išgyvenimas. Laikui bėgant buvo stebima „Foxp3“ raiška, kai nebuvo arba nebuvo PI3K inhibitoriaus LY294002, mTOR inhibitoriaus Rapamicino ar MEK1 / 2 inhibitoriaus U0126. Iš tikrųjų, dėl TCR išsiskyrimo suaktyvinto AKT / PI3K / mTOR signalinio kelio aktyvacijos slopinimas sumažino Foxp3 ekspresijos reguliavimą, tačiau slopinimas arba ERK signalizavimas pasirodė efektyvesni. Kalcineurino / NFAT signalo slopinimas ciklosporinu A, priešingai, tokio poveikio neturėjo (7a pav.).

Image

MEK, PI3K ir mTOR signalizacijos slopinimas apsaugo nuo Foxp3 praradimo, tačiau sukelia T-ląstelių apoptozę. ( a ) Išrūšiuotos iTreg ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos kryžminiu anti-CD3 mAb, IL-2 ir neutralizuojančiu anti-CD95L, esant arba neradus nurodytų inhibitorių. Foxp3-GFP ekspresija buvo stebima nurodytais laiko momentais atliekant srauto citometrinę analizę. Parodyta reprezentatyvių trijų nepriklausomų eksperimentų pavyzdžių histograma. ( b ) Išrūšiuotos iTreg ląstelės buvo pakartotinai stimuliuotos kryžmiškai sujungtu anti-CD3, esant neutralizuojančiam anti-CD95L mAb ir nurodytiems inhibitoriams, jei nėra (kairiajame stulpelyje) arba nėra (dešinėje skiltyje) IL-2. Ląstelių išgyvenimas nurodytais laiko momentais buvo analizuojamas dažant „AnnexinV / 7AAD“. Tik „AnnexinV - 7AAD“ ląstelės buvo laikomos gyvomis. Vaizduojami vidurkiai ± SEM ( n ≥ 3 vienai grupei)

Visas dydis

Nors AKT / PI3K / mTOR arba ERK signalizacijos slopinimas sutrikdė Foxp3 žemyn reguliuojamą iTreg ląstelėse po anti-CD3 restimuliacijos, šis reiškinys buvo gerai pastebėtas tik esant neutralizuojantiems anti-CD95L mAb ir IL-2, nes visi šie inhibitoriai greitai sukeltą apoptozę (7b pav.), užkertant kelią galimam šių atradimų patvirtinimui priimančiojo perkėlimo nustatymuose.

Diskusija

Kadangi „iTreg“ ląstelės turi daugybę įvairių ląstelių terapinių vaistų kaip ląstelinis terapijos potencialas, tikslios žinios apie veiksnius, apibrėžiančius giminystės ryšį ir gyvenimo trukmę, yra labai svarbios, norint palengvinti klinikinį taikymą. Mūsų tyrimas atskleidė, kad pelių iTreg ląstelės yra labai jautrios ACAD, bet silpnai jautrios AICD, palyginti su Tcon ląstelėmis (1 ir 2 pav.). Nors ankstesnis stebėjimas atitinka atradimus nTreg ląstelėse, kurios taip pat rodo stiprią IL-2 priklausomybę išgyvenimui, 25 pastebėtas iTreg ląstelių atsparumas CD95 žudymui prieštarauja stebėjimams, padarytiems žmogaus ir pelių nTreg ląstelėse, kurios yra labai jautrios šio tipo ląstelėms. ląstelių mirtis. Šis skirtumas buvo susijęs su sumažėjusiais CD95 ir CD95L ekspresijos lygiais ankstesniame (1 pav.), Bet ne su cFLIP (duomenys nepateikti), kaspazės-8 inhibitoriumi.

Dėl sumažėjusio jautrumo CD95 ligavimui, mes ištyrėme AICD, kai TCR religacija skatina autokrininę CD95L gamybą, sukeldama auto- ir parakrino T-ląstelių mirtį. 27 Keista, tačiau dėl TCR pakartotinio stimuliavimo iTreg ląstelės jautė tik laipsnišką CD95 žudymą, tuo pačiu metu išgyvendamos jas mažiau priklausė nuo IL-2 (1 paveikslas). Imuninio atsako žemoje fazėje toks mechanizmas atrodo naudingas, nes jis gali užtikrinti uždelstą iTreg ląstelių žūtį, kai antigenas bus pašalintas ir IL-2 taps ribotas. Kaip ir Tcon ląstelėse, apoptozė po citokinų trūkumo priklausė nuo Bim 28 ir galbūt kitų tik BH3 turinčių baltymų, tokių kaip PUMA, 29, kaip Bcl-2 padidinta ekspresija, kaip ir Bim praradimas (3 paveikslas). Nuosekliai Bim praradimas iš dalies išgelbėjo Treg ląstelių praradimą pelėms, kurioms trūko IL-2. 30

Taigi uždelstas „iTreg“ ląstelių valymas po TCR pakartotinio sujungimo gali užkirsti kelią nepageidaujamam likusiam efektorinių T ląstelių susitraukimo aktyvumui ir gali padėti formuoti atmintį. However, upon TCR religation, experienced during chronic infection or repeated encounter of auto-antigens, this reduced sensitivity to CD95 killing harbours the potential problem that, depending on the cytokine milieu present, iTregs can be converted into effector T cells (Figure 5). iTreg cells appear particularly vulnerable to conversion as their lineage commitment does not appear to be as definite as that of nTreg cells (Floess et al. 11 and Supplementary Figure S6). This feature of iTreg cell biology appears particularly problematic when considering adoptive transfer of auto-antigen-specific cells into patients. Scrutinizing this hypothesis, we assessed iTreg function and stability in a T cell driven model of colitis. 31 Although both nTreg and iTregs efficiently prevented colitis, most iTreg cells lost Foxp3-GFP expression after adoptive transfer and gained the capacity to produce inflammatory cytokines (Figure 6), similar to what we observed after anti-CD3 restimulation of iTreg cells in vitro (Figure 5). This raises the question why mice treated with iTreg cells did not develop severe signs of colitis. First the total amount of Ly5.2 + CD4 + iTreg cells detected after 7 weeks in the animals (Supplementary Figure S5A) was significantly higher than that of Ly5.2 + CD4 + nTreg cells. This phenomenon may result from continued expansion of iTreg cells after transfer in vivo or their increased survival. The latter seems rather unlikely, given their high susceptibility to spontaneous death in vitro (Figure 3a). Regardless, due to this effect, the absolute numbers of functional iTreg and nTreg cells in vivo was comparable and may have compensated for the loss of iTreg cells lost due to reprogramming (Supplementary Figure S5B).

Interestingly, the cytokine production potential by Tcon cells derived from nTreg or iTreg-treated animals showed marked differences. In mice that received nTreg cells more IL-17A + Tcon cells were found, whereas in mice that were treated with iTreg cells Tcon cells produced preferentially IFN- γ (Figure 6d). Differences in iTreg survival and stability of lineage commitment in vivo may explain why in some disease models iTregs are curative but fail in others. 32 Downregulation or loss of Foxp3 often correlates with reduced suppressive capacity that was also noted in our experiments (Figure 5a). Reprogramming of these cells to cytokine-producing effector T cells might contribute to augmented inflammation or the development of autoimmunity, limiting their therapeutic potential. Interestingly, a recent report demonstrates that myelin-reactive iTreg cells can be converted into Th1-like effectors, but fortunately elicited only mild CNS-pathology upon adoptive transfer. 33 Nonetheless, general validity of such benign behavior of converted iTreg cells remains to be established and these observations, together with our own findings and previously published results on nTreg conversion, 12, 13 clearly constitute a caveat for the therapeutic use of autoantigen-specific iTreg cells, if recapitulated in the human setting.

Of note, loss of Foxp3 expression was accompanied by a gradual decline in suppressive capacity but TCR-religation-mediated reprogramming did not associate with increased methylation of the Foxp3 promoter (Supplementary Figure S5B), suggesting that alternative mechanisms can account for loss of Foxp3 expression. Regardless, these events are related to TCR religation-dependent activation of the ERK-signaling cascade and, to a lesser extent, the PI3K/mTOR-network, as inhibition of either pathway delayed conversion (Figure 5). This finding may actually also explain in part the immunosuppressive properties of Rapamycin, originally thought to primarily act negatively on effector T-cell proliferation. 34 In line, constitutive activation of AKT reportedly prevents commitment to the Treg cell lineage, 23 and loss of MEKK2/3 signaling causes an accumulation of Treg cells in the periphery. 24 These genetic studies clearly support our in vitro observations using pharmacological inhibitors of these pathways (Figure 7) and suggest that targeting these kinases may be exploited therapeutically.

To our surprise, we observed that TGF- β prevents conversion by triggering apoptosis in TCR-restimulated iTreg cells by counteracting IL-2 synthesis and promoting induction of mRNA encoding BH3-only proteins Bim and Bmf (Figure 2). The latter feature was previously noted only in primary gastric or malignant mammary epithelial cells. 35 Hence, iTreg-dependent cellular therapy may benefit from co-administration of TGF- β to limit conversion. However, as TGF- β also spares Tcon cells from CD95-mediated cell death (Figure 1), an overall beneficial effect of such a strategy remains questionable. Of note, our observations may provide a possible explanation how TGF- β can act also in an immune-promoting manner 36 by rescuing Tcon cells from AICD and/or triggering of Bim-dependent iTreg cell death when IL-2 levels are suboptimal. In line, prosurvival effects of TGF- β on T lymphocytes have been described to depend in part on induction of Bcl-xL after co-stimulation 37 or inhibition of CD95L-induction during the down-phase of an immune response. 21 We also noted that TGF- β inhibited CD95L induction in restimulated iTreg cells, as shown before in Tcon cells, 21 but in the former this coincided with the induction of Bim and Bmf mRNA, indicative for a rewiring of the apoptotic machinery in iTreg cells after TCR-restimulation. Consistently, Bim-deficient or Bcl-2-overexpressing iTreg cells were refractory to TGF- β -mediated death after TCR religation (Figure 3).

In summary, our findings demonstrate that TGF- β can exert opposing roles during iTreg generation versus maintenance, depending on the levels of IL-2 present and TCR activity. We propose that TGF- β -mediated apoptosis of iTreg cells limits their conversion into effector T cells after TCR religation that mainly depends on ERK and, to a lesser extent, PI3K/mTOR-signaling. Tcon cells can be rescued under such conditions from AICD and this phenomenon, together with iTreg depletion, may help to preserve immune function. However, when apoptosis is impaired, this also bears the risk of ongoing inflammation contributing to the development of immune-pathology.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi 1-6 paveikslai

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos figūros legendos

  2. 2.

    Papildoma informacija

  3. 3.

    Point-to-Point Reply

Žodynas

AICD

suaktyvinimo sukelta ląstelių mirtis

ACAD

activated cell autonomous cell death

TGF- β

transformuojantis augimo faktorius beta

TCR

T-ląstelių receptoriai

Bcl-2

B cell lymphoma 2

Bim/Bcl2L11

Bcl-2 sąveikaujantis ląstelių mirties tarpininkas

PFI

vidutinis fluorescencijos intensyvumas

Tcon

conventional effector T cells

iTreg

induced regulatory T cells

nTreg

natural regulatory T cells

mTOR

mammalian target of Rapamycin

PI3K

phosphoinositide-3 kinase

„FoxP3“

Forkhead box P3

GFP

žali fluorescenciniai baltymai

EAE

experimental autoimmune encephalomyelitis

IL

interleukin

IFN γ

interferon gamma

T-bet

T-BOX expressed in T cells

GATA-3

GATA-binding protein 3

ROR γ t

RAR-related orphan receptor gamma

PMR

percentage of methylated reference

CNS

Centrinė nervų sistema

Papildoma informacija pridedama prie dokumento apie ląstelių mirtį ir diferenciaciją svetainėje (//www.nature.com/cdd)