Miozino lengvosios grandinės kinazė yra atsakinga už didelį proliferacinį krūties vėžio ląstelių gebėjimą per anti-apoptozę, apimančią p38 kelią | acta pharmaologica sinica

Miozino lengvosios grandinės kinazė yra atsakinga už didelį proliferacinį krūties vėžio ląstelių gebėjimą per anti-apoptozę, apimančią p38 kelią | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti, ar miozino lengvosios grandinės kinazė (MLCK) prisidėjo prie didelio krūties vėžio ląstelių proliferacijos.

Metodai:

Buvo nustatytas minkštų agarų kolonijų susidarymas MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių linijose. MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių ciklai buvo aptikti naudojant srauto citometrijos analizę. Atlikta Western blot analizė, norint aptikti p-ERK1 / 2, viso-ERK1 / 2, p-p38, bendro p38, p-JNK, bendro-JNK, survivino, Bcl-2, p-MLC, kaspazės-ekspresijos lygius. 9, suskaidyta kaspazė-9 ir MLCK. Po gydymo adriamicinu (ADR), ML-7 ir SB203580, apoptozė buvo ištirta naudojant srauto citometrijos analizę ir aneksino V-FITC fluorescencinę mikroskopiją.

Rezultatai:

Krūties vėžio LM-MCF-7 ląstelių linija, pasižyminti dideliu metastazių potencialu (metastazinis MCF-7 subklonas), palyginti su MCF-7 ląstelėmis, turėjo didesnį anti-apoptozės gebėjimą reaguoti į gydymą adriamicinu (apoptozės dažnis: 6, 76%, palyginti su 28, 58 %, P <0, 05). Be to, buvo padidintas MLCK ekspresijos lygis ir sumažintas fosforilinto p38 (p-p38) lygis LM-MCF-7 ląstelėse. Srauto citometrijos analizė parodė, kad ML-7, selektyvus MLCK inhibitorius, gali sukelti LM-MCF-7 ląstelių apoptozę, kurioje p-p38 lygis padidėjo. Tuo tarpu Bcl-2 ir išgyvenivino ekspresijos lygis buvo sumažintas, o kaspazė-9 buvo sureguliuotas, o tai rodo, kad ląstelėms buvo atlikta apoptozė. Srauto citometrijos analizė parodė, kad SB203580, p38 inhibitorius, panaikino ML-7 sukeltą apoptozę, dėl kurios padidėjo Bcl-2 ir survivino kiekis, o kaspazė-9 buvo sureguliuota žemyn, o tai rodo, kad Bcl-2, survivinas ir kaspazė-9. yra paskesniuose p38 efektoriuose.

Išvada:

MLCK yra atsakingas už didelį proliferacinį krūties vėžio ląstelių sugebėjimą per antiapoptozę, kurioje dalyvavo p38 kelias.

Įvadas

Citoskeleto baltymai yra pagrindiniai ląstelių progresavimo iki apoptozės dalyviai, o citoskeleto gebėjimas deformuotis ir reformuotis yra labai svarbus daugelio ląstelių atsakų aspektas 1 . Ankstesnėse ataskaitose buvo teigiama, kad TNF-α sukelia MLC (miozino lengvosios grandinės) fosforilinimo priklausomą endotelio aktino citoskeleto pertvarkymą su tarpląsteliniais tarpais ir streso pluošto susidarymu, kai molekulinis variklis, lemiantis aktino citoskeleto pokyčius, yra miozinas 2, 3 . Miozinas II yra pagrindinė miozino klasė be raumenų, susidedanti iš dviejų miozino sunkiųjų grandinių rinkinių (200 kDa) ir dviejų MLC rinkinių (16–20 kDa) ir kurią reguliuoja MLC fosforilinimas, katalizuojamas miozino lengvųjų grandinių kinazės (MLCK). Kai kuriose ataskaitose buvo ištirtas MLC fosforilinimo dalyvavimas apoptozinės membranos blauzdose - procesas skiriasi nuo 4, 5 apoptozės vykdymo fazės. Be to, MLCK vaidina vaidmenį reguliuojant epitelio ląstelių išgyvenimą 1 . Farmakologinis slopinimas parodė, kad daugiafunkcio MLCK aktyvinimas TNF-α yra kritinis norint užprogramuoti ląstelių mirtį 6 . Citoskeleto struktūrą ir standumą didžiąja dalimi lemia jėgos, kurias sukuria aktinas ir miozinas II (MLC 20 ), kurį katalizuoja MLCK, stimuliuoja miozino II aktyvuojamas nuo aktino suaktyvintas, nuo Mg 2+ priklausomas ATPazės aktyvumas 7 . ML-7 [1- (5-jodonaftalen-1-sulfonil) -1H-heksahidro-1, 4-diazapino hidrochloridas] yra ląstelėms pralaidus, stiprus ir selektyvus MLCK inhibitorius ( K i = 0, 3 μmol / L), kuris slopina. baltymų kinazė A ( K i = 21 μmol / L) ir baltymų kinazė C ( K i = 42 μmol / L) esant didesnei koncentracijai 8 . Ankstesni tyrimai parodė, kad ML-7 pats sukelia apoptozę ir stimuliuoja etopozido gebėjimą sukelti apoptozę pieno ir prostatos vėžio ląstelėse. ML-7 taip pat stimuliuoja etopozido gebėjimą užkirsti kelią pelių ir prostatos navikų augimui pelėms ir žiurkėms, atitinkamai 6 . Tačiau mechanizmas, kuriuo ML-7 reguliuoja apoptozę, buvo retai ištirtas.

Apoptozė, labiausiai paplitusi užprogramuotų ląstelių mirties forma stuburiniams gyvūnams, apibūdina reguliuojamų ląstelių mirties tipą, susijusį su įvairiais morfologiniais požymiais, tarp kurių yra ląstelių susitraukimas, branduolinis / citoplazminis suskaidymas ir tankių kūnų formavimasis. Daugybė tyrimų parodė, kad svarbūs apoptoziniai moduliatoriai yra panaikinti metastazavusių vėžio ląstelių reguliavimo principai ir patvirtina hipotezę, kad apoptozės slopinimas turi lemiamą vaidmenį metastazavusio proceso metu 9, 10 . Apoptozė gali būti sužadinta dviem skirtingais tarpląsteliniais signalizacijos keliais: mirties receptoriaus ir mitochondrijų aktyvacijos tarpininkavimu. Ankstesnį kelią lemia mirties receptorių, tokių kaip Fas ir TNFR1, sujungimas. Priešingai nei mirties receptorių kelias, mitochondrijų kelias reaguoja į priešvėžinius vaistus ir įvairias aplinkos streso klases 11 . Išsiskyręs citochromas c dalyvauja procese, kuris lemia kaspazės-9 aktyvaciją, o po to - kaspazės-3 aktyvaciją.

Ląstelėms visada reikia integruoti išorinius streso signalus ir taip nuspręsti ląstelių likimus mirti ar išgyventi nuolat. Šiuos likimo sprendimus priima įvairūs signalizacijos keliai, kuriuos kontroliuoja kinazės. Mitogeno suaktyvintos baltymų kinazės (MAPK) yra kinazių, kurios perduoda signalus iš ląstelės membranos į branduolį, reaguodamos į įvairius stimulus, įskaitant stresą 12, 13, 14, šeima. MAPK yra serino / treonino kinazės, kurios stimuliuodamos fosforilina jų specifinius substratus serino ir (arba) treonino liekanose. Įprastinius MAPK sudaro trys šeimos nariai: tarpląsteliniu signalu reguliuojama kinazė (ERK1 / 2); c-Jun NH2-termino kinazė (JNK / SAPK1); ir p38 MAPK / SAPK2. ERK kelią aktyvuoja mitogeniniai dirgikliai, tokie kaip augimo faktoriai ir citokinai. Priešingai nei ERK, JNK ir p38 MAPK silpnai suaktyvina augimo faktoriai, tačiau stipriai reaguoja į įvairius streso signalus, įskaitant naviko nekrozės faktorių, interleukiną-1, jonizuojančią ir UV spinduliuotę bei chemoterapinius vaistus 15 . Tyrimai, naudojant JNK ir p38-MAPK inhibitorius, leido manyti, kad JNK ir (arba) p38 MAPK aktyvinimas yra būtinas UV, citokinų, keramidų ir chemoterapinių vaistų sukeltai apoptozei sukelti 16, 17 . „P38-MAPK“ signalizacijos keliai dalyvauja įvairiose ląstelinėse reakcijose, o ląstelių atsako rezultatai yra įvairūs ir sudėtingi. P38 MAPK fosforilinamas ir aktyvuojamas dvigubomis kinazėmis MKK3 ir MKK6 treonino ir tirozino srityse. P38-MAPK kontroliuoja transkripcijos veiksnių, kinazių ar fosfatazių, tokių kaip ATF-2, MEF2, MAPKAPK, CDC25 arba MSK1 / 2, 15 funkciją.

Tačiau MLCK vaidmuo, susijęs su dideliu metastazavusiu krūties vėžio ląstelių gebėjimu, išlieka neaiškus. Šiame tyrime daugiausia dėmesio skirta MLCK vaidmens antiapoptozėje tyrimui, naudojant modelius kaip dvi lygiagrečias krūties vėžio ląstelių linijas, MCF-7 ir LM-MCF-7. Mūsų radiniai rodo, kad MLCK yra atsakingas už didelį proliferacinį krūties vėžio ląstelių sugebėjimą per anti-apoptozę, apimančią p38 kelią. Potencialiai MLCK gali tarnauti kaip terapinis krūties vėžio taikinys.

medžiagos ir metodai

Ląstelių linijos ir ląstelių kultūra

Krūties vėžio ląstelių linijos, tokios kaip MCF-7 ir LM-MCF-7 18 (metastazavęs MCF-7 subklonas), buvo palaikomos RPMI-1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo ir 100 U / ml penicilino, 100 V / ml streptomicino, sudrėkintame 5% CO 2, esant 37 ° C.

Minkštojo agaro kolonijų susidarymo tyrimas

Nepriklausomas nuo kolonijų susidarymas šiose ląstelių linijose buvo nustatytas, kaip aprašyta anksčiau 16, su kai kuriomis modifikacijomis. Trumpai tariant, ląstelės buvo surinktos ir išplautos, o iš viso 3 x 103 ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos DMEM, turinčioje 0, 3% agarozės. Suspensijos buvo kultivuojamos 6 šulinėlių plokštelėse virš sukietintos 0, 5% agarozės, esančios DMEM su 10% FCS, sluoksnio. Minkštojo agaro kolonijų susidarymo tyrimas buvo patikrintas trimis egzemplioriais kiekvienai ląstelių linijai. Po 3 savaičių auginimo buvo nufotografuoti reprezentatyvūs kiekvienos ląstelės linijos laukai. Plokštelės buvo nudažytos 0, 5 ml 0, 005% krištolo violetinės spalvos 1 valandą. Kolonijos buvo suskaičiuotos dalelių mikroskopu.

Srauto citometrijos analizė

Norėdami nustatyti MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių ciklus, ląstelės buvo imamos tripsinizacijos būdu ir du kartus plaunamos PBS. Išplautos ląstelės buvo pakartotinai suspenduotos 0, 6 ml PBS (pH 7, 4) ir fiksuotos pridedant 1, 4 ml 100% etanolio 4 ° C temperatūroje per naktį. Fiksuotos ląstelės buvo du kartus praplaunamos PBS ir pakartotinai suspenduotos propidium jodo (PI) tirpale, kuriame yra 50 μg / ml propidium jodido ir 50 μg / ml RNaseA (Sigma, MO, JAV) PBS be kalcio ir magnio, tada inkubuojamos. 30 minučių 37 ° C temperatūroje tamsoje. Nudažytos ląstelės buvo praleidžiamos per nailono tinklo sietą, kad būtų pašalinti ląstelių gumulėliai, ir išanalizuoti naudojant FACScan srauto citometrą ir „Cell Quest“ analizės programinę įrangą (Becton Dickinson, San Chosė, CA, JAV). Ląstelių proliferacinis indeksas (PI) buvo apskaičiuotas kaip S ir G 2 / M fazės ląstelių suma, išreikšta visos ląstelių populiacijos dalimi (PI = [(S + G 2 / M) / (G 0 / G 1 + S + G 2 / M)] × 100%) 19 . Apibrėžus LM-MCF-7 apoptozę po apdorojimo 10 μmol / L adriamicino (ADR) arba 20 μmol / L ML-7, dvi LM-MCF-7 ląstelių grupės (1 × 10 6 ) buvo surinktos tripsinizacijos būdu ir du kartus plaunama PBS. Kontrolinė grupė nebuvo gydoma. Tada atlikdami eksperimentą atlikote aukščiau minėtą operaciją. Srauto citometrijos analizė buvo pakartota tris kartus nepriklausomai.

Western blot analizė

Western blot analizės procedūra buvo atlikta pagal ataskaitas 20, 21 . Du kartus plaunant šaltu PBS, ląstelės lizuojamos ledo šalto lizės buferiu (150 mmol / L NaCl, 20 mmol / L Tris-HCl, pH 7, 4, 0, 1% SDS, 1, 0% NP-40, 0, 5% Na-DOC), 0, 2 mmol / L PMSF ir proteazės inhibitorių kokteiliai). Lizatai buvo centrifuguoti 12 000 x g greičiu 20 min., O supernatantai buvo naudojami kaip visi ląstelių lizatai. Baltymų koncentracija buvo nustatyta Bradfordo baltymų tyrimu (Bio-Rad, JAV). Natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės būdu (SDS-PAGE) buvo atskirtas 30 μg bendro baltymo kiekis per juostą ir perkeltas į polivinilideno fluoro (PVDF) membranas (Millipore). Membranos buvo užblokuotos 5, 0% pieno milteliais 0, 05% Tween-PBS, inkubuotos atitinkamai su antikūnais, tokiais kaip pelės anti-p-ERK1 / 2 (skiedimas santykiu 1: 1000, Santa Krusas, JAV), triušis prieš bendrą ERK1 / 2 (skiedimas santykiu 1: 1000, ląstelių signalizavimas, JAV), triušis su anti-p-JNK (skiedimas santykiu 1: 500, Santa Krusas), triušis prieš bendrą JNK (skiedimas santykiu 1: 600, Santa Krusas), pelės anti-MLCK ( Skiedimas santykiu 1: 500, Santa Kruzas), triušio anti-p-MLC (1: 500 skiedimas, Santa Krusas), pelės anti-p-p38 Thr180 / Tyr182 (skiedimas santykiu 1: 500, „NeoMarkers“, JAV), triušio anti-bendras p38 (1: 400 skiedimas, NeoMarkers, JAV), pelės anti-survivinas (1: 1000 skiedimas, Chemicon, JAV), pelės anti-Bcl-2 (skiedimas santykiu 1: 500, NeoMarkers), triušis su anti- skaldyta kaspaze -9 Asp330 ( 1: 1000 skiedimas, ląstelių signalizavimas), pelės anti-kaspazė-9 (1: 500 skiedimas, „Lab Vision“, JAV), pelės anti-β-aktinas (1:20 000 skiedimas, Sigma, MO, JAV) kambario temperatūroje 2 valandas, po to sekė peroksidaze konjuguotas antrinis antikūnas, praskiestas 0, 3% BSA / Tween-PBS kambario temperatūroje 1 valandą. Juostos buvo vizualizuotos naudojant ECL reagentą (Amersham biosciences, JAV). Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus. Β-aktino kontrastinės pilkos spalvos parodymui buvo naudojama „Glyco Band-Scan“ programinė įranga.

Gydymas ADR, ML-7 ir SB203580

LM-MCF-7 ląstelės buvo kultivuojamos 6 šulinėlių plokštelėse 24 valandas, po to prieš apdorojimą ląstelės buvo pakartotinai kultivuojamos terpėje, kurioje nėra serumo. Srauto citometrijos analizei atlikti apoptozės tyrimas buvo atliekamas LM-MCF-7 ląstelių apdorojimu 10 μmol / L adriamicinu (ADR, Sigma). Be to, 60 ir 120 min. Buvo pridėta 20 μmol / L ML-7, kad būtų galima atlikti aneksino V-FITC fluorescencinę mikroskopiją. Tada 30, 60 ir 120 minučių srauto citometrijos analizei apoptozės tyrimui buvo pridėta 20 μmol / L ML-7, o Western blot - 15 μmol / L ML-7 15, 30, 60 ir 120 min. analizė p-MLC aptikti. Į LM-MCF-7 ląsteles buvo įpilta dvidešimt μmol / L SB203580 (Sigma) atitinkamai 5, 20 ir 40 min., Po to atlikta „Western blot“ analizė, siekiant nustatyti p-p38 ir išgyvenamino, Bcl, ekspresijos lygius. -2 ir kaspazė-9.

Anneksino V-FITC fluorescencinė mikroskopija

LM-MCF-7 ląstelės buvo suskirstytos į dvi grupes, kurios atskirai buvo apdorotos 20 μmol / L ML-7 60 ir 120 min. LM-MCF-7 ląstelės, negaunančios gydymo ML-7, buvo apibrėžtos kaip kontrolinė grupė. Ląstelės plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS) ir pakartotinai suspenduojamos lizės buferyje (10 mmol / L HEPES, pH 7, 4, 140 mmol / L NaCl ir 2, 5 mmol / L CaCl2). Įpilta dešimt μL FITC-aneksino V ir 5 μL propidium jodido (PI) iki galutinės 50 μg / ml koncentracijos. Mišinys inkubuotas 15 min., Po to analizuojamas fluorescencine mikroskopija.

Statistinė analizė

Statistinė analizė atlikta naudojant „Sigma Plot 10.0“. Reikšmės buvo išreikštos kaip vidurkis ± SD. Skirtumai tarp grupių buvo apskaičiuoti naudojant Studento t testą. P <0, 05 buvo apibrėžtas kaip statistiškai reikšmingas.

Rezultatai

MLCK ekspresijos lygiai buvo atvirkščiai koreliuojami su p-p38 lygiais LM-MCF-7 ląstelėse, turinčiose didelį proliferacijos sugebėjimą

Anksčiau mūsų laboratorijoje buvo nustatytas metastazavęs krūties vėžio ląstelių MCF-7 ląstelių subklonas, vadinamas LM-MCF-7 18 . Čia mes ištyrėme MCF-7 ir LM-MCF-7 krūties vėžio ląstelių augimo galimybes. Minkšto agaro klono formavimo tyrimas parodė, kad LM-MCF-7 turi stipresnį klono formavimo sugebėjimą nei MCF-7 ląstelės (1A pav., P <0, 05). Srauto citometrijos analizė papildomai parodė, kad LM-MCF-7 proliferacijos indeksas (PI) (PI: 36, 21%) yra didesnis nei MCF-7 ląstelių (PI: 24, 97%) (1B paveikslas, P <0, 05 vs MCF- 7 langeliai). Anksčiau pranešėme, kad MLCK sugebėjo padidinti krūties vėžio ląstelių augimą ir migraciją, įtraukdamas kryžminį pokalbį su ERK1 / 2-MAPK LM-MCF-7 ląstelėse 19 . Be to, mes nustatėme, kad p-p38-MAPK lygis ląstelėse buvo sumažėjęs. Šiame tyrime Western blot analizė papildomai patvirtino duomenis (1C pav.), Leidžiančius manyti, kad MLCK ekspresijos lygiai yra atvirkščiai koreliuojami su p-p38-MAPK lygiais. Taigi, manome, kad p-p38 gali būti susijęs su MLCK funkcija.

Image

MLCK ekspresijos lygis buvo atvirkščiai koreliuojamas su p-p38 lygiais LM-MCF-7 ląstelėse, turinčiose didelį proliferacijos sugebėjimą. (A) Histograma parodė MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių kolonijų skaičių viename šulinyje minkštame agare, kad atspindėtų augimo galimybes tarp MCF-7 ir LM-MCF-7 ( b P <0, 05). Juostos rodo standartinius nuokrypius. (B) Tarp MCF-7 ir LM-MCF-7 išplitimo galimybės buvo patikrintos srauto citometrijos analize. Platinimo indeksas (PI) buvo apskaičiuotas pagal formulę Medžiagos ir metodas ( b P <0, 05, palyginti su MCF-7 ląstelėmis). (C) p-ERK1 / 2, bendro-ERK1 / 2, p-p38, bendro p38, p-JNK, bendro-JNK ir MLCK raiškos lygiai tarp MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių buvo tiriami Western blot analizė. Histograma parodo β-aktino pilkos spalvos kontrastinę vertę, naudojant „Glyco Band-Scan“ programinę įrangą.

Visas dydis

LM-MCF-7 ląstelės turėjo didesnį anti-apoptozinį pajėgumą nei MCF-7 ląstelių linija

Kadangi ADR turėjo reikšmingą poveikį sužadinant krūties vėžio ląstelių apoptozę, mes panaudojome 20 μmol / L ADR kaip apoptozės induktorių, kad gydytų ląsteles 3 valandas, kad įvertintų antiapoptozinį MCF-7 ląstelių ir LM-MCF-7 sugebėjimą. ląstelės. Srauto citometrijos analizė parodė, kad LM-MCF-7 apoptozės dažnis buvo mažesnis (6, 76%) nei MCF-7 (28, 58%) (2A paveikslas, P <0, 05, LM-MCF-7 ląstelės, apdorotos 10 μmol / L ADR, palyginti su MCF- 7 ląstelės, apdorotos 10 μmol / L ADR). Toliau mes ištyrėme kelių baltymų, susijusių su ląstelių apoptoze, pavyzdžiui, survivino, Bcl-2 ir kaspazės-9, ekspresijos lygius tarp MCF-7 ląstelių ir LM-MCF-7 ląstelių, atlikdami Western blot analizę. Rezultatai parodė, kad išgyvenamino ir Bcl-2 ekspresijos lygis ląstelėse buvo padidintas, o kaspazės-9 ekspresijos lygis ląstelėse buvo sumažintas (2B paveikslas), kas rodo, kad LM-MCF-7 krūties vėžio ląstelės turi didesnę anti-apoptozės galimybės nei MCF-7 krūties vėžio ląstelės.

Image

LM-MCF-7 ląstelės turėjo didesnį anti-apoptozinį pajėgumą nei MCF-7 ląstelių linija. (A) Poveikis ADR sukeltai apoptozei tarp MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių buvo ištirtas srauto citometrijos analize ( b P <0, 05, LM-MCF-7 ląstelės apdorotos 10 μmol / L ADR prieš MCF-7). ląstelės, apdorotos 10 μmol / L ADR, Studento testas), kuriose buvo naudojamas PI dažymas ir sub-G 1 santykio analizė. (B) Su antiapoptozė susijusių baltymų, išgyvenamųjų Bcl-2 ir apoptozės, susijusių su kaspazės-9 baltymų ekspresijos lygiai MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelėse buvo tiriami atliekant Western blot analizę. Histograma parodo β-aktino pilkos spalvos kontrastinę vertę, naudojant „Glyco Band-Scan“ programinę įrangą.

Visas dydis

ML-7 tarpininkaujant MLCK negaliai atsirado apoptozė, apimanti p38 aktyvaciją

Ankstesnis tyrimas parodė, kad ML-7 sukelia apoptozę prostatos vėžio 6 ląstelėje. Taigi šiame tyrime kaip modelį mes panaudojome LM-MCF-7 ląsteles, tirdami ML-7 poveikį apoptozei. Aneksino V-FITC fluorescencinė mikroskopija buvo taikoma norint nustatyti apoptozės, sukeltos 20 μmol / L ML-7, dažnį LM-MCF-7 ląstelėse laikui bėgant (3A pav.). Be to, srauto citometrijos analizė parodė, kad gydymas 20 μmol / L ML-7 laikui bėgant galėjo sukelti apoptozę LM-MCF-7 ląstelėse (3B paveikslas, P <0, 05, palyginti su Mock). „Western blot“ tyrimas parodė, kad fosforilinto MLC (p-MLC) lygis sumažėjo apdorojant 20 μmol / L ML-7 laikui bėgant (3C pav.), O tai rodo, kad gydymas lėmė MLCK funkcijos sutrikimą. Tuo tarpu p-p38 lygis padidėjo tuo atveju, kuris patvirtino, kad p-p38 dalyvavo sukeliant ML-7 sukeltą apoptozę. Mes pastebėjome, kad išgyvenamino, Bcl-2 ir viso ilgio kaspazės-9 ekspresijos lygis buvo sumažintas, o suskaidytos kaspazės-9 ekspresijos lygis buvo padidintas, o tai dar labiau patvirtino, kad ląstelėms buvo atlikta apoptozė. Taigi, mūsų išvada rodo, kad MLK-7 tarpininkaujama MLCK negalia lemia LM-MCF-7 ląstelių apoptozę, apimančią p38-MAPK aktyvaciją.

Image

ML-7 tarpininkaujant MLCK negaliai atsirado apoptozė, apimanti p38 aktyvaciją. (A) ML-7 sukelta LM-MCF-7 ląstelių apoptozė buvo išmatuota aneksino V-FITC analize, naudojant fluorescencinę mikroskopiją. LM-MCF-7 ląstelės, neapdorotos ML-7, buvo naudojamos kaip kontrolė. (B) ML-7 sukelta krūties vėžio LM-MCF-7 ląstelių apoptozė buvo ištirta srauto citometrijos analize. LM-MCF-7 ląstelės buvo apdorotos 20 μmol / L ML-7 atitinkamai 30, 60 ir 120 minučių. Mock, LM-MCF-7 ląstelės nebuvo apdorotos 20 μmol / L ML-7, naudotos kaip kontrolė ( b P <0, 05, palyginti su mock). Buvo naudojamas PI dažymas ir sub-G 1 proporcijų analizė. (C) p-p38 MAPK ir ekspresivino, Bcl-2, suskaidytos kaspazės-9 ir kaspazės-9 ekspresijos lygiai buvo ištirti atliekant Western blot analizę LM-MCF-7 ląstelėse po apdorojimo 20 μmol / L ML -7 atitinkamai 15, 30, 60 ir 120 min. Histograma parodo β-aktino pilkos spalvos kontrastinę vertę, naudojant „Glyco Band-Scan“ programinę įrangą.

Visas dydis

P38-MAPK aktyvinimas buvo atsakingas už apoptozę, kurią sąlygojo ML-7

Norėdami dar labiau patvirtinti p-p38 vaidmenį apoptozėje, kurią sukelia ML-7, mes panaudojome p38 inhibitorių (20 μmol / L SB203580), kad blokuotume ML-7 tarpininkaujamos apoptozės indukciją LM-MCF-7 ląstelėse. Srauto citometrijos analizė parodė, kad gydymas 20 μmol / L SB203580 gali panaikinti 20 μmol / L ML-7 sukeltą apoptozę (4A pav., P <0, 05, palyginti su tik 20 μmol / L ML-7). Gydymas 20 μmol / l ML-7 galėjo sumažinti p-MLC lygį ir ekspresyvųjį išgyvenamino bei Bcl-2 lygį laikui bėgant (5 min., 20 min. Ir 40 min.). Priešingai, gydymas gali padidinti p-p38 lygį ir ekspresinį suskaidytos kaspazės-9 lygį (4B paveikslas). Be to, „Western blot“ analizė pateikė įrodymų, kad gydymas su 20 μmol / L ML-7 sumažėjusiais išgyvenamino ir Bcl-2 baltymais bei padidintu p-p38 ir suskaidytu kaspazės-9 baltymu gali būti išgelbėtas. 20 μmol / L SB203580 laikui bėgant (4B pav.), Leidžia daryti prielaidą, kad survivinas, Bcl-2 ir kaspazė-9 yra pasroviui p38 priklausantys efektai. Taigi darome išvadą, kad p38-MAPK aktyvacija yra atsakinga už apoptozę, kurią sukelia ML-7.

Image

P38-MAPK aktyvinimas buvo atsakingas už apoptozę, kurią sąlygojo ML-7. (A) Srauto citometrijos analizė parodė SB203580 poveikį ML-7 sukeltai apoptozei LM-MCF-7 ląstelėse. Gydymas 20 μmol / L SB203580 sugebėjo panaikinti 20 μmol / L ML-7 sukeltą apoptozę LM-MCF-7 ląstelėse ( b P <0, 05, palyginti su tik 20 μmol / L ML-7). Buvo naudojamas PI dažymas ir sub-G 1 proporcijų analizė. (B) p-MLC, p-p38, survivino, Bcl-2, suskaidytos kaspazės-9 ir kaspazės-9 ekspresijos lygiai buvo tiriami atliekant Western blot analizę LM-MCF-7 ląstelėse po apdorojimo 20 μmol / L. ML-7 atskirai arba kartu su 20 μmol / L ML-7 ir 20 μmol / L SB203580 atitinkamai 5, 20 ir 40 min.

Visas dydis

Diskusija

Krūties vėžys yra labiausiai paplitęs vėžys pasaulyje ir išlieka antra pagrindine moterų, susijusių su vėžiu, mirties priežastimi. Krūties vėžio vystymasis ir nuolatinis augimas susijęs su pakitusiomis ląstelių proliferacijos normomis. Sergant ankstyvu krūties vėžiu, kaip prognostinis rodiklis, proliferacija gali būti nustatoma kartu su naviko dydžiu, laipsniu, mazgo statusu ir steroidų receptorių būkle 23 . Apoptozės disreguliacija dažniausiai būna įvairių žmogaus piktybinių navikų. Vėžio ląstelių nesugebėjimas atlikti apoptozę, kurią sukėlė priešnavikiniai vaistai, yra pagrindinė vėžio terapijos problema. Navikų agresyvumas iš dalies yra susijęs su jų įgytu atsparumu apoptozei 24, 25, 26 . Anksčiau sukūrėme krūties vėžio ląstelių liniją LM-MCF-7, kuri buvo gauta iš sunkaus kombinuoto imunodeficito (SCID) pelės, persodintos MCF-7 ląstelėmis, metastazių plaučiuose. LM-MCF-7 ląstelės buvo švirkščiamos po oda į SCID peles, plačiai metastazuojamos į plaučius, inkstus, blužnį, kaulų čiulpus, limfmazgį ir širdį27. LM-MCF-7 krūties vėžio ląstelių linija turi didesnį proliferaciją ir metastazavimo galimybes nei jos lygiagrečios ląstelės MCF-7. Anksčiau pranešėme, kad kryžminis ERK1 / 2-MAPK ir MLCK pokalbiai prisidėjo prie LM-MCF-7 krūties vėžio ląstelių dauginimosi ir migracijos. Dramatiškai, palyginti su MCF-7 ląstelėmis, fosforilintas p38-MAPK LM-MCF-7 sumažėjo. Taigi, mes manėme, kad p-p38 gali dalyvauti MLCK veikloje esant piktybiniam fenotipo krūties vėžio ląstelių linijai LM-MCF-7. Šiame tyrime mes atkreipėme dėmesį į problemą.

Pirmiausia palyginome augimą ir proliferaciją tarp MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių, kad būtų patvirtintas didelis piktybinis LM-MCF-7 fenotipas minkštojo agaro kolonijų formavimosi tyrimu ir srauto citometrijos analize. Rezultatai rodo, kad LM-MCF-7 ląstelių augimo ir dauginimosi galimybės yra stipresnės nei MCF-7 ląstelių (1A – 1B paveikslas). Pagal mūsų ankstesnį tyrimą apie MAPK ekspresiją LM-MCF-7 22, palyginome MAPK ir MLCK raišką tarp MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių. Mes nustatėme, kad p-p38 lygis sumažėjo LM-MCF-7 ląstelėse, kurios buvo atvirkščiai koreliuojamos su MLCK ekspresijos lygiais. Ankstesnis tyrimas parodė, kad MLCK slopinimas specifiniu inhibitoriumi ML-7 galėjo sukelti vėžinių ląstelių apoptozę 7 . Taigi manėme, kad per didelis MLCK ekspresija gali būti susijęs su p-p38 lygiais anti-apoptozėje LM-MCF-7 krūties vėžio ląstelėse.

Buvo žinoma, kad ADR turėjo reikšmingą poveikį sužadinant krūties vėžio ląstelių apoptozę 28 . Todėl, norėdami patvirtinti aukščiau pateiktą hipotezę, įvertinome antiapoptozinį sugebėjimą, naudodamiesi ADR tarp MCF-7 ir LM-MCF-7 ląstelių. Mes nustatėme, kad LM-MCF-7 ląstelės po ADR indukcijos parodė žymiai daugiau anti-apoptozinių gebėjimų nei MCF-7 ląstelės. Toliau mes paaiškinome, kad su antiapoptozė susijusio baltymo survivino Bcl-2 ekspresijos lygis buvo didesnis nei MCF-7 ląstelėse, o apoptozės sukelto baltymo kaspazės-9 ekspresijos lygis buvo žemesnis LM-MCF-7 ląstelėse ( 2A – 2B pav. Taigi, visi įrodymai parodė faktą, kad LM-MCF-7 ląstelių antiapoptozinis gebėjimas buvo didesnis nei MCF-7 ląstelių. Buvo pranešta, kad MLCK slopinimas sukėlė vėžio ląstelių apoptozę 7 . Šiame tyrime mes parodėme, kad ML-7 sukelto MLCK slopinimas sukėlė LM-MCF-7 ląstelių apoptozę (3A – 3B pav.), Kuri atitiko ankstesnį tyrimą su prostatos ląstelėmis 6 . Norėdami aptikti ML-7 sukeltą apoptozės mechanizmą, aptikome p-p38, survivino, Bcl-2 ir kaspazės-9 ekspresijos lygius, kai LM-MCF-7 ląstelės buvo gydomos ML-7. Western blot analizė parodė, kad 20 μmol / L ML-7 stimuliavo p38-MAPK aktyvaciją ir padidino suskaidytos kaspazės-9 ekspresiją, tačiau tai sumažino išgyvenivino, pilno ilgio kaspazės-9 ir Bcl-2 ekspresiją (3C pav. ). Šie radiniai leidžia manyti, kad MLK-7 slopindamas MLCK, gali sukelti apoptozę per p38-MAPK LM-MCF-7 krūties vėžio ląstelėse.

Manoma, kad streso suaktyvintos baltymų kinazės p38-MAPK vaidina svarbų vaidmenį apoptozėje 29 . Tyrimai, naudojant p38-MAPK inhibitorių, parodė, kad p38-MAPK aktyvacija yra būtina UV, citokinų, keramido ir chemoterapinių vaistų sukeltai apoptozei 30 . Todėl p38 neseniai atkreipė dėmesį į naviko slopintuvą. Palyginus 20 žmogaus kepenų ląstelių karcinomų su gretimais neneoplastiniais audiniais, paaiškėjo, kad p38 augliai buvo žymiai mažiau aktyvūs. Be to, kuo didesnis navikas, tuo mažiau buvo aptiktas p38 aktyvumas 31 . Šie tyrimai rodo, kad ilgalaikis p38 aktyvumas atitinka ramybės būseną ir nesuderinamas su pirminių navikų dauginimu ir augimu in vivo . Savo tyrime parodėme, kad ML-7 sukeltą apoptozę gali išgelbėti 20 μmol / L SB203580 (p38-MAPK inhibitorius). Kaip kontrolė, gydymas vien 20 μmol / L ML-7 taip pat galėjo slopinti survivino Bcl-2 ekspresiją ir suaktyvinti p38 ir kaspazę-9. Tuo tarpu 20 μmol / L ML-7 tarpininkaujant p-p38 ir padidėjusio suskaidytos kaspazės-9 stimuliacijai, tai gali būti veiksmingai slopinama 20 μmol / L SB203580, tuo tarpu ML-7 tarpininkaujant gali būti slopinamas išgyvenimas ir Bcl-2. išgelbėtas 20 μmol / L SB203580 (4A – 4B pav.), leidžia daryti prielaidą, kad survivinas, Bcl-2 ir kaspazė-9 yra pasroviui einantys p38-MAPK. Šie rezultatai rodo, kad ML-7 sukelta apoptozė dalyvauja p38-MAPK signalo keliuose krūties vėžio ląstelėse.

Bendrai paėmus, mes parodome, kad didelės piktybinės krūties vėžio LM-MCF-7 ląstelės pasižymi galingu anti-apoptoziniu gebėjimu nei krūties vėžio MCF-7 ląstelės, nes yra didesnis MLCK ekspresijos lygis. ML-7 tarpininkaujamas MLCK slopinimas gali sukelti apoptozę LM-MCF-7 ląstelėse ir keičia p38-MAPK lygį. Taigi, mes darome išvadą, kad MLCK yra atsakingas už didelį proliferacinį krūties vėžio ląstelių sugebėjimą per anti-apoptozę, apimančią p38 kelią. Potencialiai MLCK gali tarnauti kaip terapinis krūties vėžio taikinys.

Autoriaus indėlis

Prof Li-hong YE ir prof Xiao-dong ZHANG suprojektavo tyrimą, išanalizavo duomenis, parašė rankraštį ir pataisė darbą; Wen-jing CUI ir Yi LIU atliko tyrimą; „Xiao-lei ZHOU“ ir „Feng-ze WANG“ padeda atlikti dalį tyrimų.

Žodynas

MLCK

miozino lengvosios grandinės kinazė

p-MLC

fosforilinto miozino lengvoji grandinė

ŽEMĖLAPIS

mitogeno suaktyvinta baltymų kinazė

ERK

tarpląsteliniu signalu reguliuojama kinazė

p-p38

fosforilintas p38

ADR

adriamicinas

SCID

sunkus kombinuotas imunodeficitas