Nadfoksidazės nox4 slopina epitelio perėjimą prie ameoidinio perėjimo ir efektyvų naviko pasiskirstymą onkogenas

Nadfoksidazės nox4 slopina epitelio perėjimą prie ameoidinio perėjimo ir efektyvų naviko pasiskirstymą onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių migracija
  • Metastazės

Anotacija

Epitelinis ir mezenchiminis perėjimas yra dažnas naviko platinimo įvykis. Tačiau iki šiol nebuvo būdingas tiesioginis epitelio perėjimas prie ameboidinio. Pateikiame įrodymų, kad kepenų ląstelių karcinomos (HCC), labai metastazavusio vėžio, ląstelės patiria epitelinį ir amioboidinį perėjimą fiziologinėje aplinkoje, pavyzdžiui, organoiduose ar trimatėse kompleksinėse matricose. Be to, NADPH oksidazė NOX4 slopina šį perėjimą ir todėl slopina veiksmingą amoeboidinę pūslinę invaziją. Be to, NOX4 ekspresija yra susijusi su E-kadherino lygiais ir atvirkščiai koreliuojama su invazinėmis savybėmis. NOX4 yra būtinas norint išlaikyti parenchimines struktūras, padidinti adheziją tarp ląstelių ir ląstelių nuo matricos, taip pat pakenkti aktomiozino susitraukiamumui ir amoeboidų invazijai. Svarbu tai, kad HCX sergantiems pacientams dažnai pasireiškia NOX4 geno delecija, koreliuojanti su aukštesniu naviko laipsniu. Priešingai nei pastebėta mezenchiminių ląstelių tipuose, NOX4 slopina Rho ir Cdc42 GTPazių ekspresiją ir paskesnį aktomiozino susitraukimą. HCC sergantiems pacientams NOX4 ekspresija atvirkščiai koreliuoja su RhoC ir Cdc42 lygiais. Be to, žema NOX4 ekspresija kartu su aukšta RhoC arba Cdc42 ekspresija yra susijusi su blogesne prognoze. Taigi, praradus NOX4, padidėja aktomiozino lygis ir sudaromos sąlygos epiteliui pereiti prie ameboidinio perėjimo, taip prisidedant prie naviko agresyvumo.

Įvadas

Metastazavusi plitimas yra pagrindinė mirčių nuo vėžio priežastis. Ląstelių migracija ir invazija yra sudėtingų įvykių, reikalingų metastazei sėkmingai, rinkinys. Vėžio ląstelės gali išplisti iš pirminio naviko kaip atskiros ląstelės, naudodamos amoeboidinį ar mezenchiminį judėjimą, arba kaip ląstelių lakštai, sruogos ir klasteriai, naudodamos bendrą migraciją. 1 Atrodo, kad norint per kraują pernešti metastazių, reikia atskirų ląstelių migracijos. 2 Skirtingi individualių judesių tipai skiriasi pagal jų ląstelių ir matricų adhezijos reikalavimus - procesą, kurį reguliuoja integrinai ir jų įsitraukimas į Rho GTPazės signalizaciją. Rho GTPazės yra pagrindiniai ląstelių migracijos reguliatoriai dėl jų poveikio citoskeletui. Aukštas aktomiozino susitraukiamumo lygis ir žemesnis sukibimo lygis yra būdingi suapvalintai ameoidinei judėjimo formai, kurioje pūslelės naudojamos kaip funkcinės iškyšos. 3, 4 aktomiozino kontraktilumą, vykstant amoeboidų migracijai, galima reguliuoti tiek Rho, tiek pasroviui priklausančiu ROCK aktyvumu, arba Cdc42 per PAK, 5, 6, 7, 8, abiem atvejais sukeliant MLC2 fosforilinimą ir tokiu būdu suaktyvinant mioziną II. 9 Priešingai, pailgintos mezenchiminės migracijos ląstelės naudoja nuo rasės priklausomą aktino polimerizaciją ir aukštesnį nuo integriino priklausomo adhezijos lygį. 10, 11, 12 Intravitalio vaizdavimo tyrimai in vivo parodė, kad amoeboidų migracija yra greičiausias judėjimo būdas, nes tai yra geriausia strategija, naudojama invaziniuose melanomų ir krūties vėžio frontuose. 11, 12, 13, 14 Taip yra dėl mažesnių klijų reikalavimų, leidžiančių tekėti aktino žievės srautams. 15 Be to, fiziologinis uždarumas, kurį sukelia fiziologiškai svarbios sudėtingos matricos, palaiko ameboidinį elgesį. 14, 16, 17 Todėl labai svarbu suprasti, ar ameboidines strategijas gali naudoti kiti vėžio tipai.

Kepenų ląstelių karcinoma (HCC) yra dažniausiai pasitaikantis kepenų navikas, dažnai pasireiškiantis atkryčio ir metastazių atvejais. 18, 19 molekuliniai žymekliai nenaudojami diagnozuojant ar nustatant paciento prognozę bei gydymą; iš tiesų dabar tyrimais siekiama nustatyti molekulinius mechanizmus, kurie leistų sukurti naujus biomarkerius ankstesniuose etapuose ir geriau numatyti jų išgyvenimo laiką bei gydymo tinkamumą. 19 HCC ląstelių migracijos tyrimai daugiausia buvo sutelkti į epitelio – mezenchiminio perėjimo (EMT) vaidmenį ir jo svarbą metastazavusiame procese. 20 EMT metu epitelio ląstelė praranda ląstelių – ląstelių jungtis ir įgyja į mezenchimą panašų fenotipą, kuris padidina jo migracines ir invazines savybes. Šis reiškinys ypač vyksta embriogenezės ir vėžio 21 metu ir yra reguliuojamas daugybe signalizacijos būdų 22, kurie galiausiai suartėja transkripcijos veiksnių, kurie reguliuoja EMT, išraišką. 23 Vėžinės ląstelės, kurioms atliekama EMT, prarado E-kadherino jungtis ir gali judėti kaip atskiros ląstelės. Tačiau trūksta žinių apie judesių rūšis, prisidedančias prie HCC metastazavimo.

Ląstelių migracijos metu Rho GTPazės, reaktyviosios deguonies rūšys (ROS) ir citoskeleto organizacija veikia kaip sudėtingas reguliavimo tinklas; vis dėlto reikia daugiau darbo, kad būtų galima išsamiai išaiškinti šių veiksnių sąveiką ir jų galimą svarbą in vivo . 24 NADPH oksidazės (NOX) šeima pastaraisiais metais tapo svarbiu ROS šaltiniu perduodant signalus. 25, 26 Kepenyse NOX4 vaidina svarbų vaidmenį, tarpininkaujant transformuojančiam augimo faktoriaus beta (TGF-β) veiksmams. Žvaigždžių ląstelėse NOX4 reikalingas TGF-β sukeltai miofibroblastų aktyvacijai, prisidedant prie kepenų fibrozės išsivystymo 26, kuris sudomino NOX inhibitorių, kurie galėtų būti naudojami klinikoje, siekiant palengvinti šią ligą, kūrimu. 27 Tačiau kepenų ir kepenų naviko ląstelėse NOX4 tarpininkauja TGF-β sukeltai mitochondrijų tarpininkaujamai apoptozei, moduliuodamas proapoptotinių genų BIM ​​ir BMF išraišką, 28, kuris prisideda prie gerai žinomo naviko slopinimo poveikio. Todėl slopinant NOX4 kepenų ląstelėse gali atsirasti pro-tumorigeniniai procesai. Palaikydami šią hipotezę, mes neseniai nustatėme, kad NOX4 vaidina vaidmenį reguliuojant kepenų ląstelių proliferaciją fiziologinėmis sąlygomis arba navikogenezės metu. 29 NOX4 nutildymas padidina žmogaus HCC ląstelių tumorigeninį potencialą pelių ksenografuose, todėl anksčiau buvo pradėtas auglys ir padidėjo naviko dydis. Apskritai, rezultatai tvirtai rodo, kad NOX4 vaidina augimą slopinantį vaidmenį. Vis dėlto nežinoma, ar NOX4 taip pat galėtų reguliuoti kitus ląstelių procesus, kurie atsiranda vėliau progresuojant ir kurie palankiai veikia naviko metastazes, pavyzdžiui, migraciją ir invaziją.

Dabartiniame tyrime mes ištyrėme NOX4 vaidmenį reguliuojant HCC migraciją ir invaziją. Mes nustatėme, kad NOX4 palaiko epitelio parenchimines struktūras ir kad NOX4 praradimas, dažnas įvykis HCC, lydimas efektyvaus amoboidų invazinio elgesio.

Rezultatai

NOX4 yra svarbus palaikant epitelio parenchimines struktūras

Anksčiau nustatėme, kad HCC sergantys pacientai išreiškia mažesnį NOX4 baltymų kiekį, palyginti su sveikomis kepenimis. 29 Atitinkamai, NOX4 ekspresijos analizė skirtingose ​​žmogaus HCC ląstelių linijose atskleidė svarbius skirtumus, pradedant nuo ląstelių, kurios ekspresuoja aukštą kiekį, iki ląstelių, kuriose jos nėra (1a ir b pav.) Kadangi EMT yra svarbus įvykis įgyjant migracijos sugebėjimų, mes sutelkėme dėmesį į EMT charakteristikas, kurios galėtų būti siejamos su NOX4 raiška. Mes išanalizavome E-kadherino lygį tiek imunofluorescencijos, tiek Western blot metodu. Rezultatai parodė, kad ląstelės, turinčios aukštą NOX4 ekspresijos lygį, palaiko epitelio požymius, tuo tarpu ląstelės, turinčios žemą NOX4 lygį, turėjo žemesnį E-kadherino lygį (1b ir c pav.). Norėdami išanalizuoti NOX4 slopinimo poveikį tose HCC ląstelėse, kurios ekspresuoja aukštą NOX4 kiekį, atlikome stabilų perpylimą su specifinėmis NOX4 trumpų plaukų smeigtukų RNR (shRNR) PLC / PRF / 5 ir Huh7 ląstelėse (papildomas 1 paveikslas). NOX4 triukšmo slopinimas visais atvejais buvo susijęs su sumažėjusia viduląsteline ROS gamyba (2 paveikslas). PLC / PRF / 5 parodė epitelio fenotipą, formuojantį parenchimines struktūras; tačiau nutildžius NOX4, parenchimo fenotipas buvo prarastas, koreliuojantis su sumažėjusia E-kadherino ekspresija ir mažesnėmis ląstelių kontaktų sritimis (1d – f pav.). Sumažėjęs E-kadherino lygis buvo panašiai stebimas NOX4, kuris numušė Huh7 ląsteles (1f pav.). Kai ląstelės buvo kultivuojamos ant fiziologiškai tinkamos lanksčios matricos, tokios kaip kolagenas I, 13, 30 HCC ląstelės, kurios sudarė grupes, išreiškė aukštesnį NOX4 kiekį (1g ir h pav.). Po NOX4 išeikvojimo buvo pastebėti parenchiminių struktūrų sutrikimai (1i ir j paveikslai), todėl grupėse buvo mažiau ląstelių, palyginti su kontroline (1k pav.). Šie rezultatai rodo, kad NOX4 yra būtinas epitelio fenotipui ir parenchiminei struktūrai palaikyti HCC ląstelėse.

Image

NOX4 reguliuoja ląstelių adheziją HCC ląstelėse. a ) NOX4 ekspresijos lygiai kiekybine PGR. Duomenys rodo vidurkį ± sem ( N = 4). b ) NOX4 ir E-kadherino baltymų kiekis pagal Western blot metodą. β-aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. Parodytas tipinis eksperimentas ( N = 3). Kiekybinis įvertinimas, normalizuotas pakrovimo kontrole, parodomas po kiekvienu blot. c ) E-kadherino (žalia) ir DAPI (mėlyna; mastelio juosta, 50 μm) imunofluorescencija. d ) Reprezentatyvūs ląstelių, išaugintų bazinėmis sąlygomis ant plastiko viršaus, ryškūs lauko vaizdai (kairėje). Ląstelių ir ląstelių kontaktinis vaizdas naudojant E-kadherino (žalia) ir ZO-1 (žalia) imunofluorescenciją; DAPI (mėlyna; N = 3; mastelio juosta, 50 μm; dešinėje). ( e ) CDH1 (E-kadherino) ekspresijos PLC / PRF / 5 ląstelėse analizė kiekybine PGR. Duomenys yra vidurkis ± sem ( N = 4). f ) E-kadherino baltymų kiekis pagal Western blot metodą. β-aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. Parodytas tipinis eksperimentas ( N = 3). g ) reprezentatyvūs žmogaus HCC ląstelių, išaugintų ant galvijų I kolageno I matricos, ryškiojo lauko vaizdai (skalės juosta, 50 μm). h ) Kiekvieno atskirų ląstelių procentinio dydžio nustatymas. i ) Reprezentatyvūs ląstelių, vaizduojančių šviesų lauką, vaizdai ant galvijų kolageno I matricos, kai nutildoma NOX4 ekspresija (skalės juosta, 50 μm). j ) Kiekvieno atskirų ląstelių procentinio dydžio nustatymas. k ) ląstelių skaičius vienoje grupėje. ( H, j ir k ) duomenys yra vidurkis ± sem ( N = 4). Taip pat žiūrėkite papildomus 1 ir 2 paveikslus.

Visas dydis

NOX4 yra svarbus adhezijai tarp ląstelių ir matricų

Toliau mes ištyrėme, ar NOX4 taip pat dalyvauja adhezijoje tarp ląstelių ir matricų. Vinkulino (2a paveikslas) arba fosforilintos židinio adhezijos kinazės (pFAK) (papildomas 3A paveikslas) analizė imunofluorescencijos būdu parodė mažesnius ekspresijos lygius ir skirtingą pasiskirstymą NOX4 prislopintose ląstelėse, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis. NOX4 nutildytose ląstelėse žymiai sumažėjo tiek židinio adhezijos užimamas plotas, tiek židinio adhezijos skaičius vienoje ląstelėje (2b ir c paveikslai; papildomi 3B ir C paveikslai). Naudodami α / β-integrino-tarpininkaujamą ląstelių adhezijos matricą, mes patvirtinome, kad ląstelių paviršiuje sumažėja skirtingų integrino baltymų kiekis. Kai NOX4 ekspresija buvo slopinama, buvo stebimas reikšmingas žemesnis α2-, α5- ir αV-integrinų, taip pat komplekso α5β1-integrino lygis (2d paveikslas; papildomas 4 paveikslas). Šie židinio adhezijos ir integrino lygio pokyčiai buvo paversti adhezijos sumažėjimu tarp ląstelių ir matricų, kai buvo prarasta NOX4 ekspresija, kuri realiuoju laiku buvo stebima naudojant xCELLigence sistemą (Acea Biosciences, San Diegas, CA, JAV) ląstelių kultūroje. plokštės (2e pav.). Šie rezultatai rodo, kad NOX4 taip pat svarbus ląstelių adhezijai HCC ląstelėse.

Image

Praradęs NOX4, sutrikdo ląstelių ir matricų adheziją HCC ląstelėse. a ) Vinkulino (žalios) ir DAPI (mėlyna; N = 3, 5 paveikslai / eksperimentas; mastelio juosta, 20 μm) imunofluorescencija. b ir c ) Vinkulino vaizdo apdorojimas naudojant „ImageJ“ programinę įrangą: židinio adhezijos užimamos srities analizė vienoje ląstelėje ( b ) ir židinio adhezijų skaičiaus vienoje ląstelėje skaičiavimas ( c ). ( d ) Ląstelės paviršiaus integrinų analizė naudojant α / β-Integrino tarpininkaujamą ląstelių adhezijos matricą (Millipore). Tų integrinų, kurie reikšmingai pakito PLC / PRF / 5 shNOX4 (# 1) ląstelėse, pasirinkimas ( N = 3). Žiūrėkite visą integruotų elementų grupę, išanalizuotą papildomame 4 paveiksle. F ) Realaus laiko adhezijos tyrimas („xCELLigence“ sistema). Duomenys išreiškiami procentais, palyginti su kontrolinėmis (nepatikrintomis shRNR perkeltomis) ląstelėmis ( N = 3). ( B - e ) duomenys yra vidurkiai ± sem. Taip pat žr. 3 papildomą paveikslą.

Visas dydis

NOX4 slopina migracijos / invazinį potencialą

Toliau mes analizavome žmogaus HCC ląstelių migracijos gebėjimus, naudodamiesi žaizdų gijimo ir chemotaksio tyrimais. Aukštas NOX4 lygis buvo susijęs su mažesniu migracijos potencialu (papildomi 5A ir B paveikslai). Be to, nutildžius NOX4, padidėjo ląstelių migracija, naudojant ir žaizdų gijimo testą, ir realiu laiku stebint ląstelių migraciją, naudojant xCELLigence sistemą (papildomi 5C ir D paveikslai) arba atliekant trijų minučių trimatės vaizdo mikroskopijos analizę (3D). ) lanksti matrica (3a – d paveikslai; papildomi vaizdo įrašai 1–3). Norėdami įvertinti ląstelių invazinį pajėgumą, mes panaudojome testą, kuris išmatuoja individualią ląstelių invaziją trimis matmenimis. 12, 13 Mes panaudojome dvi skirtingas matricas, kolageno I ir kolageno I / matrigelo mišinį, kad pakartotinai pateiktume matricos heterogeniškumą, esantį HCC pažeidimuose. Ląstelės, išreiškiančios žemą NOX4 (HLF ir SNU449) kiekį, buvo invaziškiausios (3e pav.). NOX4 nuostoliai padidino Huh7 ir PLC / PRF / 5 ląstelių invazijos potencialą (3f pav.). Toliau įvertinome NOX4 reikšmę HCC ląstelių migracijoje ir invazijoje, tirdami HCC ląstelių, auginamų kaip kolageno I įterptų sferoidų, elgesį. Šis tyrimas matuoja proliferaciją ir invaziją laikui bėgant (invazinį augimą). 31 Per 4 dienas ląstelės, turinčios aukštą NOX4 kiekį, parodė mažesnį invazinį augimo pajėgumą (3g paveikslas). Svarbu tai, kad NOX4 nutildymas Huh7 ir PLC / PRF / 5 ląstelėse padidino jų invazinį augimo pajėgumą (3h pav.). Be to, mes nustatėme, kad 23% HCC sergančių pacientų pasireiškė NOX4 delecija, kai NOX4 DNR kopijų skaičiaus pokyčiai buvo analizuojami naudojant „Cancer Genome Atlas“ duomenų bazę (//cancergenome.nih.gov/) ( n = 249 pacientai). Įdomu tai, kad NOX4 delecijos buvo dažniau randamos vėlyvosiose kepenų navikogenezės stadijose (32% pacientų 3/4 laipsnyje, palyginti su 17% pacientų 1/2 laipsnio pacientuose; 3i paveikslas).

Image

NOX4 slopina migracinį / invazinį HCC ląstelių potencialą. a ) Rankiniu būdu stebimos NOX4 nutildytos ląstelės, judančios ant storo kolageno I / matrigelo sluoksnio. Kiekybiškai įvertinamas atskirų migruojančių ląstelių greitis ( b ), atstumas ( c ) ir kryptingumas ( d ). Duomenys išreiškiami kaip vidurkis ± sem (20–30 ląstelių kiekvienai sąlygai). Taip pat žiūrėkite papildomus vaizdo įrašus 1-3. Įvairių žmogaus HCC ląstelių linijų ( e ) ir NOX4, sunaikintų Huh7 ir PLC / PRF / 5 ląstelių, 3D invazijos į galvijų kolageno I (kairėje) ir kolageno I / matrigelo mišinio (1: 1; dešinėje) matavimas f ). Duomenys išreiškiami padidėjimu kartų, palyginti su „Huh7“ ląstelėmis arba „shControl“, ir yra vidurkis ± sem ( N = 3–5). g ) Invazinis augimas išanalizavo ląstelių įterpimą į sferoidus galvijų kolageno I matricoje. Reprezentatyvūs vaizdai 0 ir 4 dienomis (mastelio juosta, 100 μm). h ) Reprezentatyvūs sferoidų ploto padidėjimo iš kontrolinių (shControl) ir nutildytų NOX4 (shNOX4) ląstelių dydžiai nuo 0 iki 4 dienos po jų įdėjimo į kolageną (skalės juosta, 100 μm) nuo 0 iki 4 dienos. i ) HCC sergančių pacientų, kuriems buvo išbraukta NOX4, dalis (23%) iš vėžio genomo atlaso duomenų bazės ( N = 249). HCC pacientų dalis, kai navikas yra 1/2 laipsnio (17%; kairėje) ir 3/4 laipsnio navikas (32%; dešinėje), rodantis NOX4 deleciją.

Visas dydis

Anksčiau buvome pranešę apie naviką slopinantį NOX4 vaidmenį per neigiamą proliferacijos reguliavimą. 29 Turėdami visus šiuos naujus duomenis mes įrodėme, kad NOX4 ne tik slopina naviko augimą, bet ir naviko invaziją HCC. Todėl NOX4 gali veikti kaip naviko slopintuvas skirtingais lygmenimis.

NOX4 slopina aktomiozino kontraktilumą ir amoeboidines savybes

Aktomiozino susitraukiamumas yra pagrindinis invazijos į sudėtingą 3D aplinką veiksnys 32, o aukštesnis aktomiozino susitraukiamumo laipsnis buvo susijęs su mažesniu sukibimo lygiu. 16, 17 Kadangi pastaruoju metu įrodyta, kad migliacija, pagrįsta aktomiozinų sukelta migracija, teikia pranašumą daugelyje svarbių fiziologinių scenarijų, 1, 14, 16, 17, 33, 34, pirmiausia ištyrėme, ar HCC ląstelių linijos gali rodyti amoeboidų pūtimą, nes iki šiol tai nebuvo aprašyta. Galėjome pastebėti į pūslelinę panašias struktūras kai kuriose ląstelių linijose mūsų skydelyje ir tai buvo susiję su padidėjusiu miozino lengvosios grandinės 2 (MLC2) fosforilinimo lygiu. Atkreipkite dėmesį, kad negalėjome stebėti plikimo, kai ląstelės buvo parenchiminių struktūrų dalis. Dar svarbiau, kad tulžies susidarymas ir MLC2 fosforilinimo lygis buvo atvirkščiai susijęs su NOX4 ekspresija (4a – c pav.). Be to, NOX4 nuostoliai padidino ląstelių, kuriose yra kraujavimas, procentą ir MLC2 fosforilinimo lygius (4d – g paveikslai). Įdomu tai, kad atlikę 3D vaizdus iš NOX4 nutildytų įsibrovusių ląstelių, galėjome pastebėti, kad jos buvo suapvalintos (4h paveikslas). Panašiai, amoeboidinis invazinis elgesys buvo stebimas vaizduojant labiausiai invazinę ląstelių liniją mūsų skydelyje, SNU449 (4h pav.). Todėl šie duomenys rodo, kad NOX4, būdamas neigiamas aktomiozino kontraktilumo reguliatorius, galėtų sureguliuoti kontraktilinio ameoido fenotipą ir invazinį HCC ląstelių pajėgumą.

Image

NOX4 slopina aktomiozino susitraukimą HCC ląstelėse. Visuose eksperimentuose ląstelės buvo kultivuojamos ant galvijų kolageno I matricos. ( a ir d ) Ląstelių, kuriose yra pūslelės, procentas. ( b ir e ) fosforilinto MLC2 (pMLC2) imuninio dažymo intensyvumo nustatymas ląstelės paviršiuje. c ir f ) Reprezentatyvūs konfokaliniai pMLC2 (žalios), F-aktino (raudonos) ir DAPI (mėlynos) dažymo vaizdai ( N = 4; mastelio juosta, 20 μm, kvadratas su didesniu padidinimu parodytas geresniam vaizdavimui). Baltos rodyklės rodo plikas. Duomenys ( a, b, d ir e ) yra vidurkiai ± sem ( N = 4, mažiausiai penki paveikslai per eksperimentą). g ) fosforilintų ir bendrųjų MLC2 baltymų kiekis. GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Parodytas tipinis eksperimentas ( N = 3). h ) 3D vaizdas PLC / PRF / 5 (shControl ir shNOX4) ir SNU449 ląstelėse, įsiveržiančiose kolageno I / matrigelo mišinio (1: 1) matricą. Didesnis padidinimas parodytas norint geriau vizualizuoti. Juodoji rodyklė nurodo invazijos kryptį.

Visas dydis

Per didelis NOX4 ekspresija slopina aktomiozino susitraukimą ir invaziją

Iki šiol mūsų duomenys rodo, kad NOX4 vaidina svarbų vaidmenį palaikant epitelinius ir neinvazinius bruožus HCC ląstelėse. Taigi, mes pasidomėjome, ar pakartotinė NOX4 ekspresija gali paveikti migracines ir invazines savybes. NOX4 per didelis ekspresyvumas labai invazinėse SNU449 ląstelėse (pasiekęs panašų lygį, koks yra Huh7; 5a pav.) Paskatino parenchiminių struktūrų atsiradimą, ląstelių ir ląstelių sąveikai svarbių baltymų, tokių kaip ZO-1, pakartotinę ekspresiją ir padidėjo židinio adhezijos kompleksų skaičius (5b paveikslas). Be to, dėl per didelės NOX4 ekspresijos sumažėjo aktomiozino susitraukiamumas (5c – e pav.), Sumažėjo atskirų ląstelių procentas (5f paveikslas) ir sumažėjo migracija (5g – i paveikslai; papildomi vaizdo įrašai 4 ir 5) ir invazinis potencialas (5c – e pav.) 5j paveikslas). Be to, ląstelės, išaugintos kaip sferoidai į I kolageną, patyrė ryškų invazinio augimo sutrikimą, kai NOX4 buvo ekspresuojamas per daug (5k ir l paveikslai). Visi šie duomenys rodo, kad vien tik NOX4 ekspresijos pakanka parenchiminių struktūrų palaikymui, ląstelių ir substrato adhezijos padidėjimui, aktomiozino kontraktilumo ir invazinio elgesio slopinimui HCC ląstelėse.

Image

Per didelis NOX4 ekspresija SNU449 ląstelėse pereina į parenchiminį fenotipą ir slopina aktomiozino kontraktilumą ir invazinį elgesį. a ) NOX4 mRNR (aukštyn) ir baltymų (žemyn) lygis SNU449 ląstelėse, per daug ekspresuojančiose NOX4 (+ NOX4) ir Huh7 ląstelėse. Betaktinas naudojamas kaip krovimo kontrolė. ( b ) ZO-1 (žalia) ir vinkulino (žalia) imunofluorescencija. DAPI (mėlyna) branduoliams aptikti ( N = 3; mastelio juosta, 50 μm). c ) Reprezentatyvūs HCM ląstelių, gautų ant galvijų kolageno I matricos viršaus, imuninės spalvos pMLC2 ir F-aktino vaizdai ( N = 3; mastelio juosta, 50 μm). d ) fosforilintų ir bendrųjų MLC2 baltymų kiekis. GAPDH buvo naudojamas kaip pakrovimo kontrolė. Parodytas tipinis eksperimentas ( N = 3). e ) pMLC2 imuninio dažymo intensyvumo nustatymas ląstelės paviršiuje. f ) Kiekybinis atskirų ląstelių, išaugintų ant I kolageno matricos, procentas. g ) Rankiniu būdu sekti SNU449 ląsteles, judančias storu kolageno I / matrigelo sluoksniu. Kiekybiškai įvertinamas atskirų migruojančių ląstelių greitis ( h ) ir atstumas ( i ). Duomenys yra vidurkis ± sem (20–30 ląstelių kiekvienoje sąlygoje). j ) 3D invazijos į galvijų kolageno I matricą kiekybinis įvertinimas. k ) Reprezentatyvūs kontrolinių ir NOX4 ląstelių per daug ekspresuojančių sferoidų vaizdai 0 ir 2 dieną įdėjus juos į I kolageną (mastelio juosta, 100 μm). l ) Kiekybiškai įvertinkite sferidų ploto padidėjimą nuo 0 iki 2 dienos. Duomenys ( a, c, f, j ir l) yra ± ± sem ( N = 3).

Visas dydis

NOX4 reguliuoja Rho GTPazės ekspresiją

Rho GTPazės yra svarbiausi citoskeleto reguliatoriai ląstelių migracijos ir invazijos metu. 32 Kad suprastume, kaip NOX4 slopina kontraktiškumą ir invazinį HCC ląstelių pajėgumą, išanalizavome skirtingų Rho GTPazių, kurios, kaip pranešama, esmines palaikant pūslelinę migraciją ir aktomiozino susitraukiamumą, ekspresijos lygius. 6, 7, 11 ląstelėse, kuriose mažai NOX4 ekspresijos , mes nustatėme aukštesnį RhoA, RhoC ir Cdc42 RNS (mRNR; 6a pav.) Ir baltymų (6b paveikslas) lygį (6b paveikslas). Atsižvelgiant į tai, NOX4 nuostoliai Huh7 ir PLC / PRF / 5 ląstelėse padidino RhoA, RhoC ir Cdc42 lygį (6c ir d paveikslai), ir atvirkščiai, per didelis NOX4 ekspresija SNU449 padidino jų lygį (6d pav.). Be to, naudodamiesi viešai prieinamais genų ekspresijos analizės duomenimis (Gene Expression Omnibus, GEO), mes pastebėjome reikšmingą atvirkštinę koreliaciją tarp NOX4 ir Rho GTPazių ekspresijos ( RhoC , Cdc42) , taip pat MLC2 ( MYL9 ) ekspresijos (6e pav.). Iš tiesų pastebimas RhoC , Cdc42 ir MYL9 ekspresijos lygio padidėjimas metastazėse, palyginti su pirminiais navikais (6f pav.), Rodantis, kad aktomiozino kontraktilumo faktoriai parenkami metastazavus HCC. Be to, pacientams, kurių NOX4 ekspresija buvo žema, o RhoC ar Cdc42 buvo labai ekspresyvūs, prognozė buvo žymiai blogesnė, palyginti su pacientais, kurių NOX4 ekspresija buvo aukšta ir RhoC ar Cdc42 buvo maža ( n = 249 pacientai; 6g pav.). Šie rezultatai rodo, kad invazinis ir metastazinis elgesys HCC iš dalies gali būti susijęs su Rho GTPazės ir MLC2 ekspresijos reguliavimu. Tai visi įvykiai, kuriuos slopina NOX4; todėl tai yra mechanizmas, kuriuo NOX4 praradimas galėtų prisidėti prie invazinių HCC progreso.

Image

NOX4 slopina aktomiozino reguliatorius RhoA / C ir Cdc42. ( a ir c ) RhoA , RhoC ir Cdc42 GTPazių mRNR ekspresijos lygiai analizuojami kiekybine PGR. Duomenys rodo vidurkį ± sem ( N = 4). ( b ir d ) RhoA, RhoC ir Cdc42 GTPazių reprezentacinis Vakarų blotas. Kraunant kontrolę buvo naudojamas GAPDH ( N = 3–5). Kiekybinis įvertinimas, normalizuotas pakrovimo kontrole, parodomas po kiekvienu blot. e ) NOX4 , RhoC , Cdc42 ir MYL9 (MLC2) ekspresijos koreliacijos analizės išsklaidyti brėžiniai, naudojant normalizuotus mRNR ekspresijos duomenis iš GEO duomenų rinkinių (registracijos numeris GSE40367). ( f ) NOX4, RhoC , Cdc42 ir MYL9 (MLC2) ekspresijos lygiai, lyginant pirminį naviką ir metastazę, naudojant tuos pačius duomenų rinkinius kaip ir e . g ) Kaplano-Meierio 5 metų išgyvenamumas vėžio genomo atlaso HCC sergantiems pacientams pagal NOX4 raišką kartu su RhoC ir Cdc42 raiška.

Visas dydis

Diskusija

Metastazė yra sudėtinga įvykių kaskada, įskaitant nenormalią migraciją ir vėžio ląstelių invaziją. EMT buvo apibūdinta kaip dažnas epitelio vėžio metastazavimo paplitimo žingsnis. 21, 35 Mažiau žinoma apie epitelio vėžį, pereinantį prie ameoidinio elgesio. Pateikiame įrodymų, kad amoeboidų invazija iš tiesų yra efektyvi strategija, kurią HCC ląstelės naudoja fiziologiškai svarbioje 3D aplinkoje. HCC yra blogos prognozės navikas, pasižymintis dideliu atkryčio ir metastazių dažniu. Nepaisant naujausių farmakologinių gydymo laimėjimų, HCC turinčių pacientų išgyvenamumas išlieka mažas. 36 Vienas iš pagrindinių agresyvaus vienišo HCC požymių yra jo gebėjimas migruoti ir įsibrauti, dėl kurio padidėja intrahepatinių mazgelių skaičius (sumažėja transplantacijos galimybės), taip pat jo gebėjimas metastazuoti kitus organus. Taigi geresnės žinios apie šiuos procesus reguliuojančius mechanizmus gali paskatinti veiksmingų metodų, skirtų sumažinti HCC mirtingumą, kūrimą. Mūsų darbe pirmą kartą aprašoma, kaip NOX4 slopina epitelio ir amjeboidinį perėjimą HCC ląstelėse, palaiko parenchimines struktūras, padidina adheziją tarp ląstelių ir matricų bei slopina aktomiozino kontraktilumą slopindamas RhoC ir Cdc42 GTPazės ekspresiją (7a pav.). Iš tikrųjų NOX4 praradimas gali prisidėti prie agresyvaus HCC elgesio (7b paveikslas).

Image

NOX4 slopina amoeboid invaziją HCC. ( a ) NOX4 palaiko epitelio parenchimines struktūras neinvaziniame HCC. NOX4 praradimas skatina ląstelių ir ląstelių bei ląstelių substrato adhezijos sutrikimą ir padidintą RhoC ir Cdc42 GTPazių ekspresiją, teikiant pirmenybę amoeboidų invazijai. ( b ) HCC agresyvumas yra skatinamas per epitelio ir amėjaus perėjimą, prarandant NOX4.

Visas dydis

Pirmasis aprašytas NOX buvo kvėpavimo takų sprogojojo NADPH oksidazės kompleksas, kurio katalizinis subvienetas dabar žinomas kaip NOX2. Kiti šeimos nariai buvo klonuoti ir tiriami per pastaruosius 15 metų. 37 Funkcinė izofermento NOX4 analizė atskleidė unikalias savybes, palyginti su kitomis NADPH oksidazėmis. 38 NOX4 asocijuojasi su jų reguliatoriais (p22phox arba Poldip2) tarpląstelinėse membranose, kur superoksido anijonas greitai virsta H2O2. Nei vienam iš žinomų citozolinės oksidazės baltymų, nei GTPazės Rac nereikia jo aktyvumui, kuris, regis, daugiausia reguliuojamas transkripcijos lygiu. 38, 39, 40 NOX4 vaidmuo naviko progresavime yra prieštaringas ir naujausi tyrimai rodo NOX4 vaidmenį palaikant naviko migraciją. 41, 42 Vis dėlto, nors dauguma šių tyrimų buvo atlikti dviejų dimensijų migracijos sistemose, mes išanalizavome NOX4 vaidmenį 3D sistemose, rekapituojančiose intersticinį audinį supančius navikus, kur anksčiau mes nustatėme, kad amoeboidų migracija yra ypač efektyvi. Be to, verta pažymėti, kad NOX4 stipriai tarpina apoptozę ir senėjimą HCC ląstelėse 43, 44, taip pat reguliuoja homocisteino metabolizmą, o tai daro įtaką kepenų glutationo lygiui. Iš viso galima manyti, kad NOX4 gali atlikti specifines kepenų funkcijas, o jo vaidmuo gali skirtis nuo kitų navikų, kai jis skatina migraciją ir ląstelių išgyvenimą. 41, 42, 46, 47

Skirtingi literatūros duomenys rodo, kad NOX generuojamos ROS, ypač gaunamos iš NOX1, NOX2 ir NOX4, yra svarbūs aktino citoskeleto ir citoskeleto palaikomų ląstelių funkcijų reguliatoriai. 48 Molekuliniai mechanizmai nėra visiškai suprantami, nors NOX4 gali reguliuoti integrinų funkciją priklausomai nuo redokso. 49 Kraujo lygiųjų raumenų ląstelėse NOX4 reikalingas židinio adhezijos formavimui ir adhezijos stiprumui 50 bei citoskeleto reguliatorių aktyvinimui. 51 Tačiau vienas iš svarbiausių mūsų darbo radinių yra NOX4 vaidmuo reguliuojant aktomiozino kontraktilumą ir Rho GTPazių genų ekspresiją. NOX4 ekspresija skirtingose ​​žmogaus HCC ląstelių linijose ir HCC sergantiems pacientams atvirkščiai koreliuoja su jų RhoA, RhoC ir Cdc42 lygiais tiek mRNR, tiek baltymų lygiu. Be to, NOX4 numušimas padidino RhoC ir Cdc42 transkripto ir RhoA, RhoC ir Cdc42 baltymų lygius. Atrodo, kad daugelį Rho GTPazių reguliuoja jų išraiška, o ne vien tik jų aktyvacijos būsena. Iš tikrųjų RhoA transkripciją sukuria Myc / Skp2 / Miz1 / p300 transkripcijos kompleksas. 52 Įdomu tai, kad buvo aprašyta, kad NOX4 padidėjimas HCC ląstelėse sutampa su c-Myc žemu reguliavimu, 43, kurie pateisintų jo gebėjimą slopinti Rho GTPazių raišką. NOX4 vaidmuo slopinant Rho GTPazės ekspresiją ir aktomiozino kontraktilumą dar labiau sustiprina jo, kaip slopinančio kepenų naviko metastazes, potencialą, nes čia parodyta, kad reikšmingas RhoC, Cdc42 ir MLC2 ekspresijos lygio padidėjimas yra nustatytas metastazėse, palyginti su pirminėmis kepenimis. navikai. Be to, naudodamiesi viešai prieinamais duomenimis (vėžio genomo atlasu) mes parodome, kad žema NOX4 ekspresija kartu su aukšta RhoC arba Cdc42 ekspresija yra susijusi su blogesne HCC prognoze. Įdomu tai, kad neseniai buvo pranešta, kad žema NOX4 ekspresija yra nepriklausomas prognozuojantis tiek trumpesnį išgyvenamumą be atkryčio, tiek trumpesnį bendrą išgyvenamumą, naudojant imunohistochemiją naviko audinyje iš 227 HCC sergančių pacientų. 53

ROS tarpininkaujama signalizacija neseniai atsirado kaip tinkama slopinimo priemonė, prieštaraujanti ankstesnėms idėjoms, teigiančioms, kad ROS yra naviko progresavimo tarpininkai ir antioksidantai kaip priešnavikiniai agentai. Iš tiesų buvo aprašyta, kad antioksidantai, tokie kaip N -acetil-cisteinas arba Trolox, padidino RhoA aktyvaciją, o RhoA signalizacijos blokavimo pakako antioksidantų sukeltos ląstelių migracijos ir in vivo metastazių susidarymo panaikinimui. 54, 55 Be to, mes neseniai aprašėme, kaip melanomos metu RhoA aktyvacija ir aktomiozino lygis slopinamas ARHGAP5 - Rho GTPazę aktyvinančiu baltymu, kontroliuojamu ROS. 13 Kita vertus, „Nrf2“, pagrindinio genų, koduojančių fermentus, saugančius nuo oksidacinio streso, transkripcijos aktyvatoriaus nutildymas slopina HCC ląstelių galimybę augti minkštame agare ir sudaryti navikus. Suaktyvinančios Nrf2 mutacijos vyksta labai ankstyvose kancerogeninio proceso stadijose, o tai rodo, kad Nrf2 kelio aktyvinimas yra būtinas HCC progresavimui. 56

Mūsų modelis atitinka šiuos paskutinius rezultatus, teigdamas, kad geno, dalyvaujančio ROS tarpininkaujant signalizavimui, ekspresija būtų slopinantis HCC faktorius. Vis dėlto reikia papildomų analizių, kad būtų įrodyta, jog pastebėti manipuliuojant NOX4 ekspresija atsiranda dėl pokyčių, kuriuos sukelia ROS lygis. Nepaisant to, mes parodome, kad reikšmingas procentas HCC sergančių pacientų NOX4 geną išbraukia ir (arba) išraišką sumažina. Mūsų duomenys tvirtai patvirtina, kad NOX4 slopina kepenų navikų migraciją ir invaziją, į kuriuos reikės atsižvelgti, vartojant specialius vaistus, slopinančius NOX4 kepenų ligoms gydyti. Galiausiai, mūsų darbas taip pat įtraukia HCC į agresyvių vėžio rūšių, galinčių įsitraukti į ameoidų platinimo strategijas, sąrašą. Reikia išsiaiškinti, kiek epitelio vėžio formų gali tiesiogiai pereiti į epitelio ir amjeboidinius pokyčius. Svarbu tai, kad NOX4 gali slopinti šiuos procesus kituose epitelio navikuose ir veikti kaip bendras metastazių slopintuvas.

medžiagos ir metodai

Ląstelių modeliai

Hep3B ir PLC / PRF / 5 ląstelių linijos buvo iš Europos ląstelių kultūrų kolekcijos (ECACC, Porton Down, Salisbury, Wiltshire, JK). „Huh7“ ir „HLF“ ląstelės (maloniai parūpintos dr. Perales iš Barselonos universiteto, Ispanija ir Dr. Giannelli, Bario universitetas, Italija) buvo iš Japonijos mokslinių tyrimų bioresursų kolekcijos (JCRB ląstelių bankas, Ibaraki City, Osaka, Japonija). SNU449 buvo iš Amerikos audinių kultūros kolekcijos (ATCC, Manassas, VA, JAV). Hep3B cells were grown in MEM medium supplemented with non-essential amino acids, SNU449 and HLF in RPMI medium, and Huh7, PLC/PRF/5 in DMEM medium, supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), in a humidified atmosphere at 37 °C, 5% CO 2 . Cell lines were never used in the laboratory for longer than 3 months after receipt or resuscitation.

Cell culture on thick layers of collagen I

Fibrillar bovine collagen I (5005; PureCol, Advanced BioMatrix, San Diego, CA, USA) was prepared at 1.7 mg/ml in DMEM according to the manufacturer's protocol. After polymerisation (4 h–37 °C, 10%CO 2 ) cells were seeded on top in medium containing 10% FBS and imaged after 24 h in culture.

Knockdown assays

Huh7 and PLC/PRF/5 cell lines were stable silenced for NOX4 using four different shRNA plasmids (either alone or in combination) as described (see Supplementary Table I for shRNA sequences). 29 Best-silenced clones were chosen and at least two different shRNA or combinations were used in each cell line.

Overexpression assays

Lentiviral vector containing the human NOX4 sequence (NM_016931) was obtained from GE Healthcare (Little Chalfont, UK; OHS5898–219582330). Lentiviral supernatants were produced as previously described 57 and used to infect SNU449 cells, which were then selected with 10 μg/ml blasticidin (from InvivoGen, Toulouse, France). The empty LentiORF-RFP-positive control (OHS5898) was used as a control.

Genų ekspresijos analizė

RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) was used for total RNA. Reverse transcription was carried out with random primers using High Capacity RNA to cDNA Master Mix Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) following manufacturer's instructions. Expression levels were determined in a LightCycler 480 Real Time PCR System, using the LightCycler 480 SYBR Green I Master Mix (Roche Applied Science, Basel, Switzerland). See Supplementary Table II for primers sequences.

Imunoblotai

Cells were lysed in RIPA lysis buffer 1 h at 4 °C. Western blotting was carried out as described previously. 29 For Rho GTPases expression, cells were lysed in Laemmli sample buffer and sonicated 15 s before centrifugation. 13 Antibodies used are summarized in Supplementary Table III.

Immunofluorescence, confocal microscopy and image quantification

Epifluorescence microscopy studies were performed as described previously. 29 ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA) was used to analyse the number, area and distribution of focal adhesions per cell from pFAK immunostaining TIFF images. DAPI staining was used to elucidate the number of cells.

For the immunostaining of cells seeded on top of a thick collagen I matrix, cells were fixed with paraformaldehyde and immunostained for rabbit anti-phospho-MLC2 (Ser19, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) and Alexa Fluor 546-phalloidin (Life Technologies Ltd, Paisley, UK) for F-actin detection as described. 13 For imaging, collagen gels were transferred to glass-bottomed dishes and visualized on a Zeiss LSM 510 Meta confocal microscope (Carl Zeiss, Cambridge, UK) with C-Apochromat × 40/1.2 numerical aperture (water) and Zen software (Carl Zeiss). Confocal Z-slice images were analysed using ImageJ software. Phospho-MLC2 fluorescence signal was quantified calculating the pixel intensity in single cells relative to the cell area, determined using F-actin staining, using Fiji open source software (National Institutes of Health).

Migracijos ir invazijos testai

Cell motility was examined by different methods: (i) transwell migration assay, 4 (ii) wound-healing assay 58 and (iii) real-time migration assay through the xCELLigence System (Acea Biosciences), 58 and time-lapse microscopy and cell tracking of cells seeded on top of a thick layer of collagen I/matrigel. 13 Spheroid cell culture was performed using the hanging drop method, as described previously by Del Duca et al. 59 Once formed, spheroids were collected and resuspended in a collagen I solution (1.7 mg/ml in DMEM). 10% FBS-containing media was added on top (day 0) and phase contrast pictures were taken. For invasive growth quantification, increase on the area occupied by the spheroids between day 0 and 4 was calculated using ImageJ software. For 3D invasion assays, 13 cells were resuspended in serum-free bovine collagen I solution at 2.3 mg/ml or in a solution of serum-free bovine collagen I/matrigel (Corning, New York, NY, USA) in a 1:1 proportion, to a final concentration of 14 000 cells per 100 μl of matrix and spun down, in a 96-well plate. After the matrix was polymerized, 10% FBS-containing media was added on top of the gel. The 3D invasion index was calculated as number of invading cells at 50 μm divided by the number of cells at the bottom. For 3D imaging of invading cells, cells were stained with Alexa Fluor 546-phalloidin (Life Technologies Ltd) and sequential Z sections were obtained using a Zeiss 710 confocal microscope. 3D reconstructions of invaded cells were made using Zen software.

Sukibimo tyrimas

Real-time cell adhesion was examined using the xCELLigence System (Acea Biosciences). Overall 1.25 × 10 4 cells per well were seeded onto an E-plate-VIEW 16 (Acea Biosciences), which features microelectronic sensors integrated on the bottom of the plate. Continuous values were represented as cell index, a dimensionless parameter reflecting a relative change in measured electrical impedance, and quantified as a slope (per hour) of the first 3 h.

Integrin array

The α/β-Integrin-Mediated Cell Adhesion Array Combo Kit (ECM532, Merck Millipore, Billerica, MA, USA) was used according to the manufacturer's instructions. Each well containing mouse anti-alpha or anti-beta integrin received 100 μl containing 1.5 × 10 5 cells, as did the bovine serum albumin-coated negative control wells. The plate was incubated for 2 h at 37 °C in 5% CO 2 and washed with assay buffer. Cells were then stained with a Cell Stain Solution (provided in kit), incubated for 5 min and washed with dH 2 O. Extraction buffer (100 μl) was added to each well and left to shake for 5–10 min. Fluorescence was measured in Microplate Fluorescence Reader Fluostar optima (BMG Labtech GmbH, Ortenberg, Germany).

Analysis of gene expression from human databases

From public database GEO (Gene Expression Omnibus, accession number GSE40367) we analysed expression of NOX4 , RhoC , Cdc42 and MYL9 (MLC2) comparing HCC primary tumours and metastasis. Data were normalized using Gene Pattern (//www.broadinstitute.org/cancer/software/genepattern/).

From The Cancer Genome Atlas database (//cancergenome.nih.gov/), we extracted gene expression data of 249 HCC patients to analyse NOX4 , RhoC and Cdc42 expression in HCC outcome. Only patients whose tumour sample contained <15% of stroma were selected to avoid interference, as NOX4 is highly expressed in surrounding non tumoral tissue. We also extracted data concerning NOX4 DNA copy number alterations from the same patients. Normalized mRNA expression data and z -scores for mRNA expression data and copy number alterations from GISTIC were downloaded from cBioportal 60, 61 and analysed as described below.

Statistinė analizė

Two-sided Student's t -test versus control (unspecific shRNA-transfected) cells was used to generate P -values when only two groups were compared. Two-sided one-way analysis of variance with Dunnett's post hoc test versus Huh7 cells (when cell lines were compared) or versus shControl (when silencing shRNA were compared) was used to generate P -values (* P <0.05, ** P <0.01 and *** P <0.001). Statistical analyses were performed using GraphPad Prism software (GraphPad, San Diego, California, USA). Data were represented as mean±sem In general, experiments were carried out at least three independent times with two to three technical replicates.

Pearson χ 2 was used to determine P -values when comparing NOX4 DNA copy number events and tumour grade.

For survival analysis, The Cancer Genome Atlas expression data were categorized using a z -score cutoff of 0. Kaplan–Meier method using the log-rank test was used to estimate survival curves. Pearson χ 2 and survival analysis were performed using SPSS (IBM, North Harbour, Portsmouth, UK).

Prisijungimai

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE40367

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

  2. 2.

    Papildomos lentelės

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    1 papildomas vaizdo įrašas

  2. 2.

    2 papildomas vaizdo įrašas

  3. 3.

    3 papildomas vaizdo įrašas

  4. 4.

    4 papildomas vaizdo įrašas

  5. 5.

    5 papildomas vaizdo įrašas

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Prie šio dokumento pridedama papildoma informacija „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)