Nanoskopinės skystųjų membranų domenų, esančių plaustais, membranų domenai, atskleisti spartiu vienos dalelės sekimu | mokslinės ataskaitos

Nanoskopinės skystųjų membranų domenų, esančių plaustais, membranų domenai, atskleisti spartiu vienos dalelės sekimu | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Biologinė fizika
  • Interferencinė mikroskopija
  • Membranos sandara ir surinkimas

Anotacija

Lipidiniai plaustai yra membraniniai nanodomainai, palengvinantys svarbias ląstelių funkcijas. Nepaisant pastarojo meto pažangos nustatant plaustų biologinę reikšmę, plaustų pobūdis ir reguliavimo mechanizmas iš esmės nėra žinomi, nes sunku nustatyti gegnių dinaminę molekulinę sąveiką nanoskalėje. Mes tiriame plaustų organizavimą ir vienos molekulės dinamiką stebėdami pavienių molekulių šoninę difuziją plausto turinčiose rekonstruotose membranose, palaikomose ant žėručio substrato. Naudojant didelės spartos interferometrinio išsklaidymo (iSCAT) optinę mikroskopiją ir mažas aukso nanodaleles kaip etiketes, atskirų lipidų judėjimas fiksuojamas atliekant vienaląsčių dalelių sekimą (SPT), naudojant nanometrinį erdvės tikslumą ir mikrosekundės laiko skiriamąją gebą. Atskirų molekulių, padalijamų į skystą mimetinį skystį (L o ) domenai ir iš jų, procesai yra tiesiogiai vizualizuojami nenutrūkstamai ir beprecedenčio aiškumo. Svarbu tai, kad stebime sočiųjų lipidų pasklidimą L o srityje per mikrosekundės laiką, tai rodo nanoskopinį heterogeninį L o domeno išdėstymą. Tolesnė difuzijos trajektorijos analizė rodo, kad L o fazės nano subdomenai yra tokie maži kaip 10 nm, kurie laikinai sugriebia lipidus. Mūsų rezultatai pateikia pirmuosius eksperimentinius įrodymus apie nevienodą L o fazės molekulinę organizaciją, pateikdami naują vaizdą apie tai, kaip plaustai verbuoja ir kaupia molekules ląstelių membranose.

Įvadas

Fazinis perėjimas ir domenų formavimasis biologinėse membranose yra įspūdingi reiškiniai, vaidinantys svarbų vaidmenį atliekant daugelį membranų funkcijų 1, 2, 3, 4 . Tarp įvairių fazių atskyrimo ypatingas dėmesys yra skiriamas su skysčiais suskirstytų (L o ) ir su skysčiais nesutvarkytų (L d ) fazių sambūviui, nes tai remiasi lipidų plausto sąvokomis biologinėse membranose 5, 6 . Lipidų plaustai yra nanoskopiniai membranų domenai, prisodrinti sočiųjų lipidų, turinčių aukštą lydymosi temperatūrą (pvz., Sfingolipidai) ir cholesterolio, kurie aktyviai dalyvauja įvairiuose biologiniuose procesuose, įskaitant signalų perdavimo 5, membranų judėjimą 6 ir viruso patekimą 7 . Ankstesni tyrimai rodo, kad santykinai išdėstyta lipidų plausto molekulinė struktūra gali atrankos būdu įdarbinti ir sulaikyti lipidus ir membraninius baltymus, kurių molekulinės savybės 8, 9 yra panašios, todėl plaustai skelbiami kaip vietiniai baltymų grupavimo ir aktyvacijos reakcijų centrai 5, 6 . Todėl norint suprasti pagrindinį membranos mobilumo reguliavimo mechanizmą ir jo ryšį su membranos funkcijomis, labai svarbu apibūdinti lipidų plausto domenus.

Kadangi ląstelių membranų molekulinė sudėtis yra labai įvairi, būdingos lipidų plaustų savybės buvo išsamiai ištirtos supaprastintame trijų komponentų lipidų kompozicijų membranose, kur L o fazės mimetriniai plaustai egzistuoja kartu su neplanine L d faze 10, 11, 12, 13 . Šioje paprastoje sistemoje nustatyta, kad L o fazę didžiąja dalimi sudaro sočiai lipidai, kurių aukšto lydymosi temperatūra ir cholesterolis, turintys daugybę lipidų plaustų savybių ląstelių membranose 10 . Sąvoka „užsisakyta skysčio“ yra sugalvota apibūdinti ypatingą lipidų fazę su užsakytomis ir prailgintomis acilo grandinėmis, tačiau ji vis dar parodo į skystį panašų šoninį ir sukamąjį judrumą 11 . Cholesterolis vaidina unikalų vaidmenį formuojant L o fazę, nes sutrikdo lipidų kristalinės (gelinės) būklės transliacijos tvarką 14 . Nepaisant daugelio L o fazės savybių, kurių buvo išmokta 15, 16, jų reikšmė plausto ląstelių membranose neaiški. Ankstesni matavimai parodė, kad spėjami plaustai ląstelių plazminėse membranose yra nano dydžio 5, 6 . Todėl idealiu atveju L o fazės apibūdinimas turėtų būti atliekamas naudojant nanometrinę erdvinę skiriamąją gebą, kad būtų pateiktos nanoskopinės detalės, kurios labiau susijusios su gegnėmis ląstelių membranose. Deja, toks nanoskopinis matavimas vandeninėje aplinkoje buvo sudėtingas. Be to, biologinė membrana yra dinamiška skysčių sistema, kurioje dėl šiluminių svyravimų molekulės greitai pasklinda į šonus: pavienės molekulės membranoje pasklinda keliais nanometrais per vieną mikrosekundę. Todėl tikimasi, kad atskirų membranos molekulių sąveika su L o domenais nanoskalėje bus labai trumpalaikė, o jos aptikimui reikalinga didelė mikrosekundžių skiriamoji geba laiko atžvilgiu. Galiausiai, vienas molekulės jautrumas yra dar viena galimybė, norint stebėti trumpalaikę ir retą sąveiką, kurią galima užtemdyti per ansamblio vidurkį. Apibendrinant, norint ištirti plaustų molekulinę dinamiką, reikalinga technika, turinti vienmolekulės jautrumą, nanometrinę erdvinę skiriamąją gebą ir mikrosekundžių laiko skiriamąją gebą, kuri esamiems metodams yra sudėtinga.

Vienos dalelės sekimas (SPT) yra perspektyvi technika, leidžianti greitai nustatyti lokaliąsias membranos molekules. Naudojant 40 nm aukso nanodaleles (GNP) kaip ryškių laukų aptikimo etiketes, pavieniai lipidai ir membranos baltymai buvo sekami plazmos membranoje 17 nm erdviniu tikslumu 40 kHz dažnyje, iš kurios buvo aptiktas šimtų nanometrų skyrimas membranoje 17 . Neseniai buvo pristatyta nauja išsklaidymo signalo interferometrinio aptikimo (iSCAT) koncepcija, rodanti pažadą dar labiau pagerinti sklaida paremto SPT jautrumą ir erdvėlaikį skiriamąjį gebą 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 . Interferometrinis aptikimas leidžia apeiti signalo ir triukšmo santykio (SNR) apribojimą, kurį nustato greitaeigių detektorių elektroninis triukšmas, pasiekdamas optimalų jautrumą, reikalingą labai mažų dalelių lokalizavimui per vidinį išsisklaidymą 24 . Atliekant iSCAT mikroskopiją, buvo aptiktos ir lokalizuotos atskiros nanodalelės, pradedant metalinėmis dalelėmis ir baigiant viruso dalelėmis. 20, 21, 22, 23, 24, 25 . Stabilus ir nesočiųjų sklidimo signalas leidžia ilgalaikį aptikimą su neribotu stebėjimo laiku. Šiame darbe mes naudojame itin greitus „iSCAT SPT“ 50 kHz dažniu, kad ištirtume vienos molekulės difuziją plausto turinčiose rekonstruotose dvisluoksnėse membranose. Atidžiai išnagrinėta galimybė atsekti atskiras lipidų molekules nanoskalėje per 20 nm GNP žymes, neįdedant ženklinimo artefaktų. „ISCAT“ mikroskopija leidžia nuolat stebėti pavienių lipidų molekules, atsiskyriančias į plausto mimezinius L o domenus, iš nanometrų erdvinio tikslumo ir mikrosekundžių laiko skiriamąją gebą. Iš išsamių pavienių lipidų, tyrinėjančių plausto turinčias membranas, trajektorijų, stebime lipidų molekulių nukrypimus nuo Browno judėjimo L o srityje per mikrosekundės laiką, parodydami pirmuosius eksperimentinius įrodymus apie L o fazės nanoskopinį nevienalytį molekulinį išdėstymą. Mūsų atradimas taip pat atskleidžia nanodalelių domenų buvimą L o fazėje, kurie stipriai veikia molekulių judėjimą. Tikimasi, kad šie nano-subdomenai bus svarbūs rekularizuotų molekulių įdarbinimui ir ribojimui ląstelių membranų lipidų platybėse.

Rezultatai

Greitas nanoskopinis atskirų lipidų molekulių sekimas iSCAT mikroskopu

Mažas 20 nm skersmens GNP naudojamas lipidų molekulėms membranoje žymėti per streptavidiną ir biotiną optiniam vaizdavimui ir stebėjimui (1a pav.). „ISCAT“ mikroskopu (žr. Metodus ir S1 pav.) Fiksuojamas vieno GNP išsklaidytas vaizdas per interferometriją 50 kHz dažniu. Lyginamieji matavimai buvo atlikti stebint vieno zondo lipidą (biotino-dangtelio-DPPE), difuziškai šoniniu būdu, homogeninėje Ld fazės DiPhyPC membranoje, paruoštoje ant atomiškai plokščio žėručio substrato (žr. Metodai). Vietoj kitų dažniausiai naudojamų nesočiųjų fosfolipidų pasirinkome DiPhyPC, kad išvengtume lipidų molekulių fotooksidacijos, galinčios pakeisti lipidų mobilumą 26 . Membranoje vienu metu gali būti matomos kelios dalelės (žr. „Movie S1“), o jų difuzijos trajektorijos buvo gautos naudojant SPT (žr. Metodai). 1b paveiksle parodyta tipinė difuzijos trajektorija, susidedanti iš daugiau nei 155 000 žingsnių. „ISCAT“ 20 nm GNP vaizdas turi SNR ~ 20 (1c pav.), Suteikiantį erdvinės vietos nustatymo tikslumą 3 nm (S2 pav.). Ilga ir tiksli trajektorija kartu su 20 μs skiriamąja geba laiko atžvilgiu leidžia tiksliai išanalizuoti jo difuzijos charakteristikas. Mes stebime puikų Gauso žingsnio dydžio pasiskirstymą dviem šoninėmis kryptimis, tai reiškia, kad matavimas suteikia pakankamai duomenų statistinei analizei (1d pav.). Norėdami įsitikinti, kad ženklinimo schema ir matavimai yra patikimi, mes surinkome daug difuzijos duomenų iš 62 trajektorijų (kurių kiekviena yra ilgesnė nei 6000 žingsnių) ir kaip laiko funkciją apskaičiavome jų vidutinį vidutinį poslinkį kvadratu (MSD). intervalas Δt ir jų difuzijos greičiai

Image

(žr. 1ef pav. ir metodus). Išmatuojome panašius atskirų dalelių difuzijos greičius (1, 48 ± 0, 39 μm 2 s – 1 ), kas rodo aukštą membranos ir dalelių vienodumą. Difuzijos charakteristikoms analizuoti MSD buvo pritaikytas anomalios difuzijos modeliu 27 :

Image

a ) 20 nm GNP, pritvirtinančio prie vienos lipidų molekulės, galvos membranoje, schema, skirta greitam iSCAT sekimui. Dalelė ir dvisluoksnė membrana nubraižytos ta pačia skalė. b ) Vienos lipidų molekulės difuzijos trajektorija vienalytėje membranoje, užfiksuota 50 kHz dažniu 3, 1 s (taip pat žiūrėkite filmą S1). c ) iSCAT momentinis vaizdas, kuriame 20 nm GNP išsisklaido ant membranos, užfiksuotos 50 kHz dažniu. Dėmės dydis yra ~ 300 nm (visas plotis ties puse maksimalios), o SNR yra 20. Dėmės centras nustatomas SPT, o centro padėties nustatymo tikslumas yra 3 nm. ( d ) Abiejų žingsnių dydžio pasiskirstymas dviem šoninėmis kryptimis 20 μs laiko intervale rodo abu tikslus Gauso pasiskirstymas. e ) vidutinis 62 difuzijos trajektorijų (pilkos spalvos linijos) ir jų ansamblio vidurkis (stora juoda linija), parodantis tolygią Brownian difuziją. Raudona linija rodo tiesinę MSD priklausomybę nuo laiko intervalo Δt, kaip tobulai Brownian difuzijai. f ) Išmatuoto difuzijos greičio histograma (

Image
= 1, 48 ± 0, 39 μm 2 s – 1 ). g ) Išmatuoto anomalinio eksponento α histograma. Siaura smailė ties α = 1 rodo, kad difuzija vienalytėje membranoje yra beveik ruda.

Visas dydis

Image

kur

Image
yra anomalus transportavimo koeficientas,
Image
yra nenormalus eksponentas, ir
Image
yra poslinkis dėl dinaminės lokalizacijos klaidos 28 . Tinkamų verčių histograma
Image
rodo siaurą smailę ties 0, 99 (1g pav.), tai reiškia, kad difuzija buvo beveik ruda (
Image
= 1, kai difuzija yra tobulai ruda). Stebima Brauno difuzija rodo, kad membrana yra homogeninė ilgio skalėse nuo nanometrų iki mikrometrų, o atraminis substratas membranai nesukelia erdviškai nevienalyčio efekto. Taip pat pastebėta, kad nesočiųjų fosfolipidų DOPC homogeninėse membranose, naudojant GNP etiketę ir iSCAT SPT, buvo tirpinama biotino-dangtelio-DPPE difuzija Brownijoje (duomenys nepateikti). Mes taip pat įsitikinome, kad masės pakrovimas 20 nm GNP buvo nereikšmingas, nes BNP parodė tą pačią difuzijos greitį kaip ir vienas dažais pažymėtas streptavidinas, kai buvo paženklintas biotino dangteliu-fosfolipidu (S3 pav.). Daugiau apie atskirų lipidų molekulių sekimo pagrįstumą nustatant GNP etiketes yra aptariama papildomoje informacijoje.

Pavienių lipidų molekulių difuzija plausto turinčiose membranose

Naudodamiesi greitaeigiu iSCAT SPT, mes ištyrėme pavienių lipidų molekulių difuziją plausto turinčiose membranose, esant dideliam spatiotemporaliniam skyriui. Plausto turinčios dvisluoksnės membranos buvo paruoštos iš DiPhyPC / DPPC / cholesterolio (40:40:20 mol%) lipidų mišinio ir iš nedidelio kiekio lipofilinių dažų DiI-C18 (žr. Metodus). Mikro dydžio L domenai buvo stebimi per fluorescenciją (2a pav.), Iš kurio buvo nustatytos domeno ribos (2b pav.). Pastebėjome, kad L o domenai laikui bėgant gali lėtai dreifuoti, pertvarkyti ir susilieti, kaip buvo pranešta anksčiau 29 . Per trumpą vienos minutės stebėjimo laiką L o domenų formos ir vietos pokyčių fluorescenciniame vaizde nepastebėta. Įdomu tai, kad L o domenai taip pat atsiranda „iSCAT“ vaizde su mažu kontrastu (~ 1%) dėl nedidelio Ld ir L o fazių lūžio rodiklio neatitikimo, kaip neseniai pranešta 30 . Tada mes pridėjome GNP, kad pažymėtume zondo lipidą (biotino dangtelis-DPPE), ir stebėjome jų judesius per iSCAT SPT 50 kHz dažniu. Kiekvienas greitas „iSCAT“ įrašas užtruko kelias sekundes ir per vieną minutę sugebėjome įrašyti daug vaizdo įrašų, kol L o domeno forma pastebimai pasikeitė. Atkreipkite dėmesį, kad tikslus GNP lokalizavimas buvo atliktas naudojant iSCAT vaizdus, ​​kuriuose nėra fono, kur buvo pašalintas netolygus nejudantis fonas dėl apšvietimo, membranos domenų ir nevienalyčių pikselių atsakų (metodai). Užfiksuotos vieno zondo lipidų difuzijos trajektorijos buvo uždėtos ant to paties mėginio srities fluorescencinio vaizdo, nurodant plausto mimezinių L o sričių vietą (2c pav.). Stabilus sklaidos signalas iš GNP suteikia galimybę užfiksuoti tikslias ir nuolatines vieno zondo lipidų difuzijos trajektorijas, tiriant Ld ir L o sritis, todėl leidžia ištirti, kaip L o sritis įtakoja lipidų molekulių difuziją. Mūsų įrašytais duomenimis, daugiau nei 90% trajektorijų tiria Ld ir L o sritis. Pabrėžiame, kad galimybė stebėti atskiras daleles tiriant abi sritis yra vertinga, nes tai leidžia tiesiogiai palyginti tos pačios dalelės difuzijos charakteristikas abiejose srityse, todėl galimi sistemingi artefaktai, kuriuos sukelia neišvengiami atskirų zondo nanodalelių skirtumai (pvz., Dydis, formos, kryžminio jungiklio molekulės orientacijos ir kt.) galima išvengti. 2d paveiksle pavaizduotas lipidų molekulės difuzijos trajektorijos segmentas, pakartotinai išeinantis iš L o domeno ir į jį įeinantis (taip pat žiūrėkite filmą S2). Iš arti pavaizduoti 2e, f pav. Trajektorijos vaizduoja skirtingą difuzinę elgseną L o ir L d srityse. Akivaizdu, kad zondo lipido pereinamosios difuzijos greitis staiga pasikeičia, kai jis kerta domeno ribą (2g pav., Žr. Pereinamosios difuzijos greičio apskaičiavimo metodai). Remdamiesi šia trajektorija, stebime greitą 1, 19 μm 2 s – 1 difuziją L d srityje ir lėtą 0, 13 μm 2 s – 1 difuziją L o srityje. Mūsų eksperimentas taip pat aiškiai iliustruoja faktą, kad nors L o domeno morfologija per stebėjimo laiką nesikeičia, atskiros molekulės membranoje greitai keičiasi difuziškai ir net nuolat kerta domeno ribą.

Image

a ) mikrono dydžio plausto mimezinių L o domenų (rodomų kaip tamsios sritys) fluorescencinis vaizdas membranoje. ( b ) L o ir L d sričių sritys, apibrėžtos pagal fluorescencinį vaizdą. c ) Dešimt reprezentatyvių atskirų lipidų molekulių difuzijos trajektorijų plausto turinčioje membranoje, užfiksuotos 50 kHz dažniu, kai kiekviena iš jų tiria Ld ir L o domenus. L d ir L o domenų trajektorijų dalys yra atitinkamai raudonos ir mėlynos spalvos, o domenų ribos pažymėtos brūkšniais. ( d ) Lipidų molekulės difuzijos trajektorijos segmentas, pakartotinai išeinantis iš plausto srities ir į jį patenkantis (žr. S2 filmą). Domeno riba nubrėžta kaip juoda linija. Iš pradžių lipidas buvo L o srityje (pažymėtas kaip I); jis paliko L o domeną ir netrukus vėl įvedė L o domeną (pažymėtą kaip II), o pabaigoje vėl paliko L o domeną. ( e, f ) Iš dalies d punkte parodytos trajektorijos vaizdas atitinkamai L o srityje ( e ) ir L d srityje ( f ), parodantis skirtingą difuzijos elgesį. g ) laikinas lipido difuzijos greitis, apskaičiuotas pagal d punkte nurodytą trajektoriją. L o ir L d sričių difuzijos greitis yra labai skirtingas: atitinkamai L o ir L d srityse buvo matuojama lėta 0, 13 μm 2 s − 1 difuzija ir greita 1, 19 μm 2 s − 1 difuzija.

Visas dydis

Anomalinė molekulinė difuzija L o fazėje

Mes užfiksavome atitinkamai 166 ir 88 difuzijos trajektorijas Ld ir L o srityse ir apskaičiavome jų individualų laiko vidurkį MSD (3 pav.). Kiekviena trajektorija yra ilgesnė nei 1000 laiptelių. Iš viso Ld ir L o srityse buvo išmatuota daugiau kaip 2, 3 × 10 6 ir 1, 7 × 10 6 pakopų, pateikiant daug statistinių duomenų tiksliam difuzijos apibūdinimui. LD srityje išmatuotas MSD skalėje yra linijinis su laiko intervalu Δt, nurodant, kad difuzija yra Brauno. Kita vertus, LD srityje išmatuotas MSD parodo subdiffuziją mikrosekundės laikotarpiu. Pasikeitimas nuo subdiffuzijos iki akivaizdaus Browno judesio L o srityje buvo pastebėtas ~ 1 ms, kai MSD reikšmė ~

Image

μm 2, ty 20 × 20 nm 2 . Tai rodo, kad molekulinė difuzija L o domene patiria heterogeniškumą ilgio skalėje <20 nm per mikrosekundės trukmę. Ilgesnį milisekundžių periodą heterogeniškumo poveikis išmatuojamas ir tokiu būdu pastebimas akivaizdus Browno judesys. Pabrėžkime, kad eksperimentas be pakankamo laiko skiriamojo laipsnio negalėtų aptikti subdifuzijos L o srityje, tačiau matuojama akivaizdesnė lėtesnės difuzijos greičio Browno difuzija. Mes atlikome tą patį „iSCAT SPT“ matavimą mažesniu 1 kHz greičiu, esant tokioms pačioms sąlygoms, o Ld ir L o sričių sklaida iš tikrųjų buvo gan Brownian (S4 pav., Ir Movie S3). Stebima anomalinė subdiffusion per mikrosekundės trukmę, kai ilgio skalė <20 nm, iš tikrųjų yra dėl nanoskopinių L o srities substruktūrų; tai nėra sistemingas artefaktas (dėl BNP ženklinimo ar trumpalaikės sąveikos su atraminiu substratu), nes remiantis MSD duomenimis (1e pav.), Brownian difuzija matuojama atliekant etaloninį homogeninių membranų eksperimentą, kurio ilgio skalė yra ne mažesnė kaip 10 × 10 nm 2, kur neuždengta. Anomalinio eksponento histogramos

Image
ir difuzijos greitis
Image
atskirų trajektorijų, išmatuotų Ld ir L o srityse, yra pavaizduotos S5 pav., kur L o srities difuzija yra lėta (
Image
= 0, 24 ± 0, 12 μm 2 s – 1 ) ir subdiffuzinis (
Image
= 0, 75 ± 0, 16), o difuzija Ld domenuose yra greita (
Image
= 1, 43 ± 0, 50 μm 2 s −1 ) ir dar daugiau Brownian (
Image
= 0, 92 ± 0, 08). Išmatuotos difuzijos spartos dviejose fazėse yra panašios į tas, kurios anksčiau buvo matuojamos dažų molekulėmis DiD, naudojant fluorescencinės koreliacijos spektroskopiją (FCS) 29 . Nepaisant to, mes pažymime, kad difuzijos greitis skirtinguose zondo molekulių tipuose skiriasi, galbūt dėl ​​skirtingų jų krūvių, dėl kurių skiriasi elektrostatinės sąveikos su substratu 29 stiprumas. Taip pat buvo pastebėtas anomalinis subdiffuzija DOPC / smegenų sfingomielino / cholesterolio (40:40:20 mol%) (40:40:20 mol%) lipidų mišinio membranose (S6 pav.). Tai rodo, kad heterogeninė molekulinė organizacija L o fazėje yra bendro pobūdžio, o ne lipidų konkretus.

Image

Iš Ld ir L o domenų buvo išmatuotos 166 ir 88 trajektorijos, atskirai apskaičiuoti ir nubraižyti jų MSD. Raudonos ir mėlynos storos linijos yra jų ansamblio vidurkiai. Šiame dvigubame logaritminiame MSD grafike nuolydis parodo anomalinio eksponento vertę

Image
. Dvi juodos tvirtos linijos rodo 0, 75 ir vienos nuolydį. Pavienės lipidų molekulės laisvai difunduoja Ld srityje, nes nuolydis yra beveik vienas. Kita vertus, lipidų molekulėse L o domenuose mikrosekundžių intervale pasitaiko anomali subdiffuzija, tai rodo, kad molekulinė difuzija L o domene patiria nanoskopinį nevienalytiškumą per mikrosekundės. Heterogeniškumo poveikis išmatuojamas per ilgesnį laiką ir tokiu būdu akivaizdus Browno judesys stebimas ilgesniu laiko intervalu (> 1 ms).

Visas dydis

Laikinas sočiųjų lipidų uždengimas L o fazės nano subdomenuose

Norėdami gauti daugiau įžvalgos apie stebimą subdiffuziją, atidžiai panagrinėjome L o domenų difuzijos trajektorijas. Kaip parodyta 2e pav., Trajektorijose yra daugybė lokalizacijos grupių, išmatuotų L o srityje. Tolesnė analizė rodo, kad daugelis šių grupių yra laikinas lipidų uždarymas nanodalelių zonose (žr. Metodus) 31 . Iš visų trajektorijų, išmatuotų L o domenuose, mes išanalizavome gimdyvių dydį ir buvimo laiką kiekvienoje gimdykloje (žr. Metodus, 4ab pav.). Mes nustatėme gana aukštus kriterijus (99% pasikliovimo laipsnis) aptikti trumpalaikį gimdymą, kad būtų išvengta melagingo aptikimo į stochastinį panašų Browno judesį (4ab pav.). Mūsų analizė rodo, kad L o fazėje yra nemažai nano uždarymų. Vidutinis apsistojimo laikas yra 0, 62 ms, o vidutinis gimdyvės skersmuo yra 32 nm. Pastebime, kad gali būti daug daugiau labai trumpalaikių ir labai mažų uždarumų, o norint patikimai juos aptikti, reikia išmatuoti dar didesnę erdvėlaikio skiriamąją gebą. Tiesą sakant, mūsų LD sričių MSD duomenys (3 pav.) Rodo anomalią difuziją, apimančią ilgio skalę nuo (6 nm) 2 iki (20 nm) 2, tai reiškia, kad L o domeno membranos struktūra yra nevienalytė nanoskalėje. . Kadangi zondo lipidas, stebimas mūsų eksperimente, yra sočiųjų lipidų biotino-dangtelio-DPPE, šie nano-subdomenai, kurie laikinai fiksuoja zondo lipidą, greičiausiai yra glaudžiai supakuotų sočiųjų lipidų DPPC, turinčių panašias molekulines struktūras ir savybes, grupės. Remdamiesi savo eksperimentiniu stebėjimu, mes siūlome galimą nanoskopinio molekulinio išdėstymo L o srityje modelį (4c pav.): L o domeno viduje yra daugybė padomenių, mažesnių nei dešimtys nanometrų, kurie daro didelę įtaką molekulinei difuzijai. Šis modelis buvo pasiūlytas atliekant branduolinio magnetinio rezonanso (BMR) spektroskopijos tyrimus, rodančius, kad L o fazės formavimąsi daugiausia reguliuoja aukšto lydymosi temperatūros sočiųjų lipidų (pvz., Sfingolipidų) sąveika, todėl gali egzistuoti nano dydžio klasteriai. L o srityje 32 . Molekulinis dinaminis modeliavimas taip pat numatė anomalią sočiųjų lipidų difuziją ir substruktūras L o fazėje nanosekundžių laikotarpiu 33, 34 .

Image

a ) Nano izoliacijos (skersmens), aptiktos pagal trajektorijas, išmatuotos L o srityse (mėlyna spalva) ir iš modeliuotų Brownian difuzijos trajektorijų (pilkos spalvos), pasiskirstymas pagal dydį. Žr. „Metodai“, jei norite sužinoti daugiau apie nano uždarymą. L o domenuose aptinkamas nemažas kiekis 32 ± 10 nm nano uždarymų. b ) Gyvenimo laiko pasiskirstymas kiekvienoje izoliatoriuje. Mėlyna histograma rodo eksperimentinius rezultatus, išmatuotus iš L o domenų, o pilkoji histograma rodo imituotos Brauno difuzijos valdymą. Pavienės lipidų molekulės yra trumpalaikės, mažesnės kaip 1 ms, nano dydžio zonose, esančiose plausto L o srityje. c ) Siūlomos nanoskopinės molekulinės dinamikos ir organizavimo L o srityje schema. Molekulinis išdėstymas L o srityje nėra vienalytis nanoskalėje. Yra daugybė dešimčių nanometrų subdomenų, kurie gali būti glaudžiai supakuotų sočiųjų lipidų, turinčių aukštą lydymosi temperatūrą, grupių sankaupos. Šie padomeniai daro didelę įtaką molekulių difuzijai. Iliustracijos tikslais nubrėžta dirbtinė difuzijos trajektorija, rodanti greitą ir laisvą difuziją Ld fazėje (raudona) ir trumpalaikius spąstus L o fazės nano subdomenuose (mėlyna).

Visas dydis

Diskusija

Įspūdinga tai, kad molekulinė organizacija L o fazėje yra nevienalytė nanoskalėje. Buvo žinoma, kad L o fazės cholesterolis sutrikdo lipidų, kurie kitaip yra 14 gelio fazėje, pakavimą. Lipidų mišinio fazinė schema keičiama pridėjus cholesterolio, parodyta BMR spektroskopijos ir diferencinio skenavimo kalorimetrijos (DSC) matavimais 35, 36 . Spėjama, kad tarpinė fazė, kurią sukelia cholesterolis, pvz., L o fazė, vaidina svarbų vaidmenį biologinėse membranose, nes sumažina lipidų polinkį formuoti atskiras Ld ir gelio fazes 37 ir tuo pačiu stabilizuoja tariamus funkcinius nanodomainus. ląstelių membranose (gegnėse) 38 . Tačiau nebuvo eksperimentinių duomenų, rodančių, kaip cholesterolis sutrikdo lipidų pakavimą nanoskalėje ir tuo pačiu palaiko L o srities vientisumą. Šiame darbe mes aiškiai parodome, kad L o fazėje yra daugybė nano-subdomenų. Nors mes neturime papildomų įrodymų, kurie tiksliai patvirtintų, kas iš šių nano subdomenų susideda iš dabartinio etapo, remiantis mūsų stebėjimais apie nano uždarymą trajektorijose, jie greičiausiai yra tankiai supakuoti sočiųjų lipidų DPPC (lipidas, kuris turi aukštesnė lydymosi temperatūra trišaliame mišinyje), kurių molekulinės struktūros yra panašios kaip mūsų zondo lipidų DPPE. Cholesterolis ir mažas DiPhyPC tankis (žemesnės lydymosi temperatūros lipidas) užpildo spragas tarp nano-subdomenų. Molekulinis dinaminis modeliavimas taip pat parodė sočiųjų lipidų nanoklasterių egzistavimą L o srityse 34 .

Pastebėjome, kad buvo atlikti keli Ld ir L palaikomų dvisluoksnių membranų topografijos matavimai, naudojant atominės jėgos mikroskopiją (AFM) 29, 39, 40 . Tačiau tuose AFM tyrimuose L o fazėje nenustatyta jokių nanosubstraktų. Manome, kad taip gali būti dėl šių priežasčių. Pirmiausia, norint aptikti L o fazės nanostruktūras, reikia išmatuoti didelės skiriamosios gebos AFM. Įvertinome, kad aukščio skirtumas tarp nanostruktūrų ir aplinkinės teritorijos yra <0, 8 nm, atsižvelgiant į Ld ir L o fazių aukščio skirtumą ~ 0, 8 nm 29, 39, 40 . Kalbant apie šoninį dydį, remiantis mūsų MSD duomenimis ir trumpalaikio uždarumo analize, pamatinių konstrukcijų dydis yra mažesnis nei dešimtys nanometrų. Kaip minėta tekste, mes manome, kad yra mažesnių padomenių, kurių nenustato šiame darbe pateikta technika. Norint aiškiai parodyti tankią ir smulkią L o fazės struktūrą, gali prireikti subnanometro skyros. Antra, nanosistemos gali būti dinamiškos, todėl joms išspręsti reikalingas greitasis AFM. Trečia, nanostruktūros gali būti trapios, todėl matuojant AFM galiuką reikėtų kuo labiau trikdyti. Kadangi pastaraisiais metais greitai pagerėjo AFM metodo jautrumas ir erdvėmitralinė skiriamoji geba, didelės skiriamosios gebos ir greitaeigis AFM su subnanometro skiriamąja geba 41 ir kitomis artimojo lauko technologijomis rodo, kad žadama pateikti papildomus L o fazės molekulinės struktūros įrodymus.

Verta paminėti, kad buvo atliktas labai panašus tyrimas, kurio tikslas buvo išsiaiškinti nanoskopinę L o fazės molekulinę organizaciją, naudojant superresoliucinį optinį stimuliuotos emisijos išeikvojimo - fluorescencinės koreliacijos spektroskopijos (STED-FCS) 42 metodą. Atliekant šį matavimą nenustatyta anomalios difuzijos L o fazėje ir padaryta išvada, kad lėtą L o fazės difuziją daugiausia lemia tankus molekulinis pakavimas, o ne sukeliantis anomalią subdiffuziją ilgio skalėje> 40 nm. Šiame darbe pateikti greitaeigiai iSCAT SPT duomenys dar labiau padidina aptikimo skiriamąją gebą iki kelių nanometrų ir parodo, kad mažesnėje ilgio skalėje (<30 nm) yra L o fazės nanostruktūros, kurios stipriai veikia lipidų difuziją, sukeliantis subdiffuziją per trumpalaikius uždarumus. Norint išsiaiškinti nanoskopines struktūras dinaminėse membranų sistemose, būtina aukšta erdvėmitemo skiriamoji geba.

Nors mūsų matavimai buvo atlikti modelinių membranų L o srityse, tikimasi, kad išmatuota įgimta molekulinė sąveika ir susidariusi molekulinė organizacija nanoskalėje bus glaudžiai susijusi su lipidų plaustais ląstelių membranose. Įrodyta, kad biologinės membranos yra nevienalytės nanoskalėje 43, 44, o lipidų plaustai gali būti mažesni nei dešimtys nanometrų 5, 6 . Atsižvelgiant į mūsų eksperimentuose pastebėtus nanodalelių L o fazės subdomenus, molekulių plaustų organizavimas ląstelių membranose gali būti labai nevienalytis. Taip pat mes atskleidžiame, kad molekulinei dinamikai L o fazėje didelę įtaką daro nanopagrindiniai plotai, todėl šios nano-substruktūros gali būti lengvai atsakingos už molekulių pasiskirstymo nustatymą lipidų plaustus. Su plaustais susiję baltymai galėtų būti įstrigę tarp tankiai prisotintų sočiųjų lipidų subdomenų ir apsupti didelio cholesterolio tankio. Taigi nanoskopinė membranos aplinka, kurią sukuria plaustų nano-subdomenas, yra unikali, tai parodo L o fazės lipidų plaustų esminius dalykus, kurių vaidmens negali įvykdyti vien gelinės fazės arba Ld-fazės domenai.

Apibendrinant galima pasakyti, kad ultragarsiniu iSCAT optiniu metodu kartu su mažomis nanodalelėmis kaip etiketes mes ištyrėme vienos molekulės difuziją dvisluoksnių modelių membranose nanometrų erdviniu tikslumu ir mikrosekundžių laiko skiriamąja geba. Pavienių nanodalelių difuzija ant palaikomų dvisluoksnių membranų buvo tiriama greitaeigiu iSCAT mikroskopu prieš 22, 23. Ankstesniame darbe dėl daugybinių lipidų surišimo vietų ant dalelės, lipidų susikaupimo ir substrato poveikio buvo pastebėta anomalinė dalelių difuzija, multimobilumas ir taip pat nanovaržymas, kurie apsunkina vienmolekulės dinamikos tyrimą. membrana. Spręsdami šias problemas, šiame darbe mes skatiname monovalentiško surišimo tikimybę, prisotindami kelias dalelės surišimo vietas. Be to, mes paruošėme dvisluoksnes membranas ant atomiškai plokščio žėručio pagrindo, kuris žymiai sumažina nevienalyčio substrato poveikį. Mes taip pat panaudojome gerai veikiantį zondo lipidą, biotino-dangtelį-DPPE, kuris nesudaro klasterių ir laisvai difunduoja vienalytėje membranoje be trumpalaikio uždarumo. Atskirų dalelių judėjimas tiksliai atspindi pavienių molekulių pasklidimą nanometrų tikslumu, pagrįstą Browno difuzijos duomenimis, stebimais vienalytėje membranoje iki mikrosekundės laiko. Toliau mes panaudojome „iSCAT SPT“, norėdami ištirti plausto mimezinių L domenų molekulinę dinamiką ir nanoskopinę organizaciją. Mes radome laikinus lipidų molekulių apribojimus dėl būdingų L o domenų nanosubstraktų, kurie anksčiau nebuvo išspręsti, pateikdami naują molekulinės struktūros vaizdą L o fazėje nanoskalėje. Šie nano subdomenai L o fazėje greičiausiai yra atsakingi už reidu susijusių molekulių atrankos, padalijimo ir uždarymo valdymą ląstelių membranų plausto domenuose.

Metodai

iSCAT mikroskopas

„ISCAT“ mikroskopu apšvietimas plačiame lauke buvo padarytas sufokusuojant 532 nm lazerio spindulį („Finesse Pure“, „Laser Quantum“) aukšto NA mikroskopo objektyvo (UPLSAPO 100X, NA 1.4 „Olympus“) užpakalinėje židinio plokštumoje. Dalis sužadinimo (~ 0, 6%) atsispindėjo žėručio ir vandens sąsajoje dėl lūžio rodiklio neatitikimo, kuris buvo naudojamas kaip nuoseklus atskaitos spindulys iSCAT vaizdavimui. Praleidžiama šviesa apšvietė BNP. Iš bendrojo vidaus produkto grįžtamasis signalas kartu su atspindinčia atskaitos šviesa buvo surinktas tuo pačiu objektyvu ir nufotografuotas ant greitaeigės CMOS kameros („Phantom v711“, „Vision Research“). Bendras iSCAT vaizdavimo optinis padidinimas buvo 416, 7, o tai atitinka 48 × 48 nm 2 taškų skiriamąją gebą viename taške. Naikinantys trukdžiai tarp BNP sklaidos signalo ir atskaitos pluošto lemia tamsią vietą iSCAT vaizde. Kelias sekundes įrašėme „iSCAT“ vaizdo įrašus 50 kHz dažniu, per kuriuos GNP išsisklaidė ant membranos. Žadinimo intensyvumas buvo ~ 10 kW cm −2, o tai sąlygojo nedidelį temperatūros padidėjimą GNP paviršiuje ~ 0, 3 K. ISCAT mikroskopas buvo aprūpintas epi-fluorescenciniu vaizdavimu lygiagrečiai. Fluorescenciniai vaizdai buvo imami jautria kamera (EMCCD; „iXon Ultra 897“, „Andor“) 1 Hz dažniu kartu su iSCAT vaizdavimu. Bendras fluorescencinio vaizdo optinis padidinimas buvo 166, 7, o tai atitinka 96 × 96 nm 2 taškų skiriamąją gebą per pikselį. ISCAT ir fluorescenciniai vaizdai buvo suderinti lokalizuojant nejudrias 100 nm fluorescencines daleles ant dengiamojo stiklo vienu metu abiejuose kanaluose prieš atliekant membranos eksperimentus. Santykinis „pikselių“ poslinkis tarp „iSCAT“ ir fluorescencinių vaizdų yra pataisytas galutiniame membranos domenų fluorescencinio vaizdo ir „iSCAT“ trajektorijų fluorescencinio vaizdo persidengime. Perdangos tikslumas yra ~ 4 nm, ją riboja fluorescencinių dalelių lokalizacijos tikslumas.

Atstatytų palaikomų dvisluoksnių membranų paruošimas žėručio ir GNP etiketėse

Šiame darbe mes panaudojome daugiausia dviejų tipų lipidinius dvisluoksnius membranus. Plausto turinti membrana susideda iš 40:40:20 molio% 1, 2-difitanoil-sn-glicerolio-3-fosfocholino (DiPhyPC), 1, 2-dipalmitoil-sn-glicer-3-fosfocholino (DPPC) ir cholesterolio (Chol). Homogeninę membraną pagamino DiPhyPC. Abiejų tipų membranos, sudarytos iš 1 mol% biotiniluotų zondo lipidų analogų (1, 2-dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamin-N- (dangtelio biotinilo); biotino dangtelis-DPPE) ir 0, 1 mol% fluorescencinių karbocianino dažų. Kadangi abu fosfolipidai (DiPhyPC ir DPPC) yra prisotinti, matuojant membranos turi mažesnę tikimybę būti fotooksiduotos. Šios lipidų molekulės ir cholesterolis buvo nupirkti iš bendrovės Avanti (Avanti Polar Lipids Inc., Alabaster, Alabamos valstija, JAV). Oranžinės-raudonos spalvos fluorescenciniai dažai, 1, 1′-dioktadecil-3, 3, 3 ′, 3′-tetrametilindokarbocianino perchloratas ( DiI-C18), buvo įsigytas iš „Life Science“. Atkreipkite dėmesį, kad DiI-C18 yra lipofilinė membranos dėmė, kuri geriau dalijasi membranų Ld fazėje. Todėl tamsieji fluorescencinių vaizdų regionai vaizdavo L o domenus.

Palaikomi lipidų sluoksniai (SLB) buvo suformuoti naudojant pūslelių suliejimo metodą 45 . Visi lipidai buvo ištirpinti chloroforme ir išdžiovinti iki plėvelės azotu ir prieš vartojimą bent 1 valandą laikyti vakuume. Išdžiovinta lipidinė plėvelė buvo hidratuojama iki 1 mg ml – 1 lipidų koncentracijos dvisluoksniame buferiniame tirpale (10 mM HEPES, 200 mM NaCl2 ir 2 mM CaCl2, PH 7, 0) 1 valandą 60 ° C temperatūroje. Tada buvo suformuotos daugiasluoksnės pūslelės (MLV), maišant lipidų tirpalą. Šis drumstas tirpalas buvo praskiestas buferiniu tirpalu iki 0, 25 mg mL −1 ir dar 10 minučių ultragarsu apdorotas 30% galia ultragarsiniame ultragarsu 60 ° C temperatūroje (Q700, Qsonica LLC., JAV). Šio proceso metu MLV buvo suskaidytos į mažas vienaląstes pūsleles (SUV). Tada lipidų tirpalas 20 minučių buvo centrifuguojamas esant 16 000 g, o supernatantyje esantys visureigiai buvo atsargiai ištraukiami be šiukšlių ir likusių MLV apačioje. Skaidrus visureigių tirpalas buvo laikomas 4 ° C temperatūroje ir sunaudotas per 48 valandas.

Norėdami suformuoti SLB, žėručio diskas („Ted Pella Inc“, JAV) pirmiausia buvo klijuojamas ant išvalyto dangtelio su optiniais klijais („Norland Products Inc“, JAV). Tada visureigio tirpalas buvo įpiltas į šviežiai susmulkintą plono žėručio diską (kelių mikronų storio) indo tipo kameroje („Live Cell Instrument“, Seulas, Korėja) mažiausiai 90 minučių 60 ° C temperatūroje. SLB buvo švelniai plaunami buferiniu tirpalu, kad būtų pašalintas visureigių perteklius. Atminkite, kad visos procedūros buvo atliktos kambario temperatūroje ruošiant vienalytes membranas. Galiausiai į SLB buvo įterpti 20 nm GNP, funkcionalizuoti su streptavidinu (BBI Solutions, Cardiff, UK) biotinilinto zondo lipido analogo žymėjimui hidrofilinėje galvos grupėje. Streptavidinas, kaip kryžminis jungiklis, yra tetrameras, galintis prisijungti prie daugiau nei vieno membranoje esančio biotino-dangtelio lipido. Norėdami, kad monovalentinis žymėjimas būtų labiau tikėtinas, mes įvertinome prieinamų streptavidino rišamųjų vietų skaičių GNP ir pasotinome juos, sumaišydami perteklinį kiekį biotino molekulių į GNP koloidinį tirpalą, prieš pradėdami juos žymėti membranomis. Stochastiškai kalbant, daugumai BNP neturėtų būti vienos rišamosios vietos arba jos nėra.

Vienos dalelės sekimas (SPT)

Norint tiksliai nustatyti BNP nanometriniu erdviniu tikslumu, būtina pradėti nuo švarios iSCAT BNP nuotraukos, turinčios labai vienodą foną. Todėl reikia pašalinti nehomogeninį CMOS fotoaparato pikselių atsaką, neišvengiamai nevienodą šviesos apšvietimą ir silpną membranų domenų iSCAT signalą. Šis poveikis yra gana nekintamas per mūsų stebėjimo laiką, ypač palyginti su greitai difunduojančiu GNP ant membranos. Iš vaizdų pluošto ištraukėme nejudantį foną, apskaičiuodami vidutinę kiekvieno atvaizdo taško vidutinę vertę 22 . „ISCAT“ be fono vaizdai buvo gauti pataisius iš neapdorotų vaizdų ištrauktą nejudantį foną. Pašalinus foną, galima aiškiai pamatyti difrakcijos ribotos taškų sklaidos funkciją, kaip tam tikrą BNP dėmę. Kiekvieno kadro tamsiosios vietos centras buvo nustatytas suderinant išmatuoto taško pasklidimo funkciją su dvimatė Gauso funkcija su namų užrašu kodu MATLAB. Difuzijos trajektorijos buvo gautos sujungiant atitinkamas lokalizacijos vietas iš eilės kadrų. Tipiškas vienkartinės 20 nm GNP difuzijos ant membranos, užfiksuotos 50 kHz dažniu, lokalizacijos tikslumas yra 3 nm (žr. S2 pav.).

Difuzinio elgesio charakterizavimui skirto MSD skaičiavimas per laiką

Kiekvienai trajektorijai dvimatis MSD kaip laiko intervalo Δt, svyruojančio nuo 20 μs iki 20 ms, funkcija buvo apskaičiuota pagal

Image

kur

Image
yra dalelės padėtis tuo metu
Image
ir
Image
yra trajektorijos ilgis. Difuzijos greitis,
Image
, apskaičiuojamas iš pirmųjų dviejų MSD 46 duomenų taškų, kurie nurodo mikroskopinės difuzijos greitį, išmatuotą 20 μs intervalu.

Norint išanalizuoti, ar difuzija skiriasi nuo Brauno judesio, MSD duomenys buvo pritaikyti anomalios difuzijos modeliu, parodytu Eq. (1) kur

Image
, anomalus transportavimo koeficientas,
Image
, anomalinis eksponentas ir
Image
, poslinkis yra trys tinkami parametrai. Atkreipkite dėmesį, kad kompensuota
Image
MSD yra dinaminės lokalizacijos neapibrėžtis, kurią lemia dalelės lokalizacijos tikslumas, difuzijos greitis ir ekspozicijos laikas. Klaida apskaičiuojant
Image
gali klaidingai interpretuoti anomalios difuzijos duomenis, o tai ypač svarbu atliekant didelius greičio matavimus, kai tikrieji poslinkiai gali būti palyginami su dinaminės lokalizacijos netikrumu. Mes nustatėme, kad patikimiausias būdas sužinoti
Image
yra pritaikyti jį kaip nemokamą atskirų kaulų ir raumenų sistemos parametrą. Atėmus poslinkį iš MSD, pataisyto MSD dvigubas logaritminis grafikas ir laiko intervalas turi
Image
. Remiantis
Image
, dalelės difuzinės charakteristikos gali būti klasifikuojamos:
Image
Brownian difuzijai,
Image
ir
Image
nurodant atitinkamai subdiffusion ir superdiffusion.

Be to, norint statistiškai išsiaiškinti kelių dalelių dinaminį judesį, MSD duomenų vidurkis apskaičiuojamas sveriant duomenis pagal kiekvienos trajektorijos ilgį,

Image

MSD i (Δt) yra MSD

Image
th trajektorija su
Image
žingsniai ir
Image
(Δt) yra ansamblio vidurkis, įvertintas ND trajektorijų su
Image
viso žingsnių.

Norėdami įvertinti laikiną difuzijos konstantą, pradinę trajektoriją suskaidėme į 146 žingsnių segmentus ir apskaičiavome difuzijos greitį iš kiekvieno segmento MSD.

Pereinamojo laikotarpio aptikimas

L o domenuose vykstantys trumpalaikiai uždarumai buvo aptikti pagal Simsono ir kt . Pateiktą algoritmą. 31 Trumpai apskaičiuojame difuzijos greičio lipido tikimybės lygį L

Image

likti spindulio regione

Image
per laiko langą
Image
kaip

Image

kur

Image
yra apibrėžtas tašku laiko lange, kuriame didžiausias poslinkis nuo pradžios taško. Atlikdami analizę pasirinkome 25 žingsnius. Laikinas uždarumas buvo apibrėžtas kaip tikimybės lygis
Image
pranoko kritinę tikimybės lygį
Image
. Mūsų darbe vertė
Image
buvo pasirinktas vienas, atitinkantis 99% patikimumą, kad aptiktas trumpalaikis gimdymas yra tikrai ribojamas ne Brauno judėjimo. Gyvenimo laikas izoliatoriuje yra apibrėžiamas kaip trukmė, kai
Image
yra iš eilės didesnis nei
Image
. Siekdami sumažinti aptikimo neišvengiamų lokalizacijos klaidų trikdymą, mes apskaičiuojame neapdorotos tikimybės lygio slenkamąjį vidurkį kaip laiko funkciją su 10 žingsnių vidurkiu. Atlikdami aukščiau aprašytas procedūras, mes patikimai nustatėme daugybę laikino gimdymo L o srityje atvejų. Norėdami dar labiau patvirtinti aptiktus apribojimus L o domenuose nėra retas stochastinis Browno judesio elgesys, tą patį aptikimą atlikome kompiuterio sukurta to paties trajektorijos ilgio, difuzijos greičio Brownian difuzija.
Image
, ir lokalizacijos klaidos. Mes patvirtinome, kad aptikti trumpalaikiai Brauno judesių judesiai yra trumpalaikiai, tai rodo, kad L o domenuose išmatuoti uždarumai buvo tikri.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Wu, H.-M. et al . Skystu užsakomų membranų domenų nanoskopinės struktūros, atskleistos spartiu vienos dalelės sekimu. Mokslas. Rep. 6, 20542; „doi“: 10.1038 / srep20542 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Vaizdo įrašai

  1. 1.

    Papildomas filmas S1

  2. 2.

    Papildomas filmas S2

  3. 3.

    Papildomas filmas S3

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.