Naivūs cd8 + t ląstelių išvestiniai navikams būdingi citotoksiniai efektoriai kaip potenciali priemonė siekiant įveikti tgf-β imunosupresiją naviko mikroaplinkoje | mokslinės ataskaitos

Naivūs cd8 + t ląstelių išvestiniai navikams būdingi citotoksiniai efektoriai kaip potenciali priemonė siekiant įveikti tgf-β imunosupresiją naviko mikroaplinkoje | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vėžio imunoterapija
  • Vėžinė mikroaplinka

Anotacija

Nepaisant galimo poveikio vėžio imunoterapijai, įprastiniai metodai, naudojant in vitro išplėstas CD8 + T ląsteles, neturi optimalaus rezultato, daugiausia dėl to, kad prarandamas ląstelių funkcionalumas. Todėl mes ištyrėme fenotipinius ir funkcinius skirtumus tarp in vitro aktyvuotų CD8 + T ląstelių iš trijų skirtingų šaltinių, būtent naivių (NT eff ), atminties (MT eff ) ir navikuose infiltruojančių limfocitų (TIL eff ) iš žmogaus ir pelių, kad geriau suprastume. Stiprių efektoriaus funkcijų mechanizmai ir potencialas įveikti dabartinius apribojimus. Atsižvelgiant į didesnį NT eff populiacijų proliferacijos aktyvumą ir ilgesnį telomerų ilgį, naivios kilmės ląstelėse buvo žymiai mažiau T ląstelių išsekimo žymenų, nei MT eff ir TIL eff, ir, be to, įgytos skirtingos atmintį skatinančios transkripcijos raiškos formos. veiksniai, T-bet ir Eomes, paskatinti greitai ir tvariai. Atrodė, kad NT eff ląstelės pasižymi mažesne Foxp1 ekspresija ir yra atsparios apoptozei po TGF-β kondicionavimo, tai reiškia geresnį išgyvenimo potencialą ir atsparumą naviko sukeltam imuniniam slopinimui. Iš CD8 + T ląstelių telkinių, suaktyvintų specifinių navikų CTL, naivių ląstelių generuoti efektoriai pasižymėjo pačiu stipriausiu citotoksiniu aktyvumu, patvirtindami implikacijas racionalaus įgyjamosios imunoterapijos planavimui.

Įvadas

Priimtina imunoterapija arba ex vivo aktyvuotų ir išplėstų navikui būdingų CD8 + T ląstelių infuzija vėžiu sergantiems pacientams - strategija, apimanti CD8 + T ląstelių pašalinimą iš naviko aplinkos ir stimuliuojančių sąlygų, būtinų optimaliam jų aktyvavimui, sudarymą, bandant įveikti prastą T ląstelių reakciją į navikus. Priimamoji T ląstelių perdavimo terapija pirmą kartą buvo bandyta devintojo dešimtmečio pabaigoje – dešimtojo dešimtmečio pradžioje, nustačius pirmuosius su naviku susijusius antigenus ir išskiriant navikui reaktyvius CD8 + T ląstelių klonus nuo vėžiu sergančių pacientų. Buvo gautas pakankamas skaičius aktyvuotų CD8 + efektorinių T ląstelių ir vėliau į veną perkeltos pacientams, tarpininkaujant naviko pašalinimui 1 . Tačiau dabartiniuose straipsniuose teigiama, kad imunoterapiją, kurioje naudojami CD8 + citotoksiniai T limfocitai (KTL), riboja lėtinis aktyvatorių ir funkcinių funkcijų sutrikimas, kurį sukelia imunosupresiniai veiksniai, 2, 3, 4 . Ištyrus šias ląsteles paaiškėjo vadinamasis „išsekimo profilis“, apimantis ląstelių disfunkciją, efektoriaus funkcijos praradimą ir laipsnišką kontrolinio taško inhibitorių, tokių kaip užprogramuotas ląstelės mirties baltymas 1 (PD1), citotoksinio T limfocitų antigeno, kiekio ir įvairovės padidėjimą. 4 (CTLA4), 3 limfocitų aktyvacijos geno baltymas (LAG3) ir žudiklyje esančio lektino tipo receptoriaus G1 (KLRG1) 2, 3, 4 . Taip pat buvo parodyta, kad CTL funkcija keičiasi keičiant augimo faktorių β (TGF-β) - limfocitų inhibitorių, kuris dažnai būna per daug ekspresuojamas daugelio navikų navikų mero aplinkoje (TME) 5, 6 . Steponas ir kt. 7 aprašytas T ląstelių nereagavimo į TME mechanizmas, kurį sukelia Forkhead dėžutės baltymo P1 (Foxp1) padidėjęs reguliavimas, reaguojant į TGF-β, kuriuo antigenu gruntuotos CD8 + T ląstelės neleidžiamos daugintis ir skatinti citotoksinę funkciją.

Limfocitų fondas, naudojamas įvaikinamai imunoterapijai, gali būti gaunamas iš bet kurio iš CD8 + pogrupių, įskaitant navikus infiltruojančius limfocitus (TIL), naivesnes T ląsteles (T N ) ir antigeno turinčias atminties T ląsteles (T M ), kurios gali būti padalyti į centrinės atminties (T CM ) ir efektorinės atminties (T EM ) pogrupius, kurie skiriasi fenotipu, prigimtimi ir funkcija 8 . Atminties CD8 + T-ląstelių pogrupiai tiriami dažniau nei anksčiau negydytos ląstelės dėl jų naviko specifiškumo ir didesnio gebėjimo greitai daugintis, kai yra veikiami anksčiau aptiktų antigenų. Be to, Bergeris ir kt. 9 parodyta, kad efektorinės ląstelės, gautos iš T CM, o ne T EM, turi padidintą potencialą išgyventi ir sukurti imunologinę atmintį po infuzijos makakose. Šios išvados buvo vienodos pelių atminties pogrupiuose 10 . Tačiau naujesnis tyrimas pasiūlė, kad TN pogrupiai gali būti tinkami imunoterapijos kandidatai dėl mažo efektorių ląstelių „išsekimo“ lygio, ilgalaikio replikacijos potencialo, koreguojamo pagal telomerų ilgį, ir dėl minimalaus efektoriaus diferenciacijos, užtikrinančio didesnį efektyvumą. infuzija 11 . Nors savarankiškai ar į auglį reaguojančios nebenaudotos CD8 + T ląstelės gali reaguoti į naviko antigenus ir diferencijuotis į citotoksines efektorines ląsteles, kai kurie pagrindiniai apribojimai yra santykinai mažas savęs / naviko specifinių limfocitų skaičius, atsirandantis dėl neigiamos atrankos užkrūčio brendimo metu ir nepakankamas antigenų stimuliavimas naviko aplinkoje 12 . Tyrimai parodė, kad CD8 + T ląstelės gali būti išplėstos T ląstelių augimo faktoriaus interleukino-2 (IL-2) trūkumu, kai nėra T ląstelių receptorių (TCR) signalų, ir šioje situacijoje IL-2 gali sukelti unikalų signalą kelias, susijęs su stipriu limfocitų specifiniam baltymo tirozino kinaze / nuo JAK3 priklausomu PI3K / AKT kelio aktyvavimu 13, 14 . Tokie signalizacijos keliai ne tik skatina greitą IL-2 aktyvuotų naivių CD8 + T ląstelių dauginimąsi, bet ir padidina eomesodermino (Eomes) ekspresiją, nurodydami pirminių naivių efektorių diferenciaciją į ilgaamžes atminties ląsteles. Keletas dabartinių tyrimų, atliktų su pelių modeliais, parodė T-box transkripcijos veiksnių, T-bet ir Eomes, vaidmenį reguliuojant efektoriaus ir atminties funkcijas, kai aukšta T-bet ekspresija skatina efektoriaus funkciją, o Eomes yra susijęs su ilgalaikės atminties populiacija 15, 16, 17 .

Atsižvelgdami į kai kuriuos dabartinius įtėvių T ląstelių perkėlimo apribojimus, mes siekėme įvertinti efektorių, gautų iš naivių, atminties ir navikus infiltruojančių CD8 + T ląstelių, fenotipinius ir funkcinius skirtumus (atitinkamai NT eff, MT eff ir TIL eff ). ) ir toliau tirti galimybę sukurti optimalius į navikus reaguojančius CTL su didelėmis IL-2 dozėmis, kad būtų galima naudoti klinikiniuose tyrimuose. Mes pranešame, kad T-dėžutės transkripcijos faktorių išsekimo fenotipai ir ekspresijos kinetika NT eff ląstelių populiacijose rodo galimus pranašumus, palyginti su kitais pogrupiais, naudojami ląstelių perkėlimo terapijoje. Mūsų rezultatai taip pat rodo, kad naivios kilmės efektorinės ląstelės yra santykinai atsparios imunosupresiniam TGF-β poveikiui, esant mažesnei Foxp1 ekspresijos tendencijai. Didelių dozių IL-2 pradinis naivių T ląstelių panaudojimas sėkmingai išplečia navikams būdingų efektorių ląsteles, turinčias palankią citotoksinę funkciją, ir yra potenciali priemonė įveikti kai kuriuos dabartinius imunoterapijos barjerus.

Rezultatai

Sėkmingas žmogaus naivių, atminties ir TIL CD8 + T ląstelių išplėtimas in vitro

CD8 + T ląstelių pogrupius būtų galima apibrėžti naiviais (CCR7 + CD45RA + arba CD62L + CD45RO - ) ir atminties (CD45RA - arba CD45RO + ) ląstelėmis CD62L, CD45RO, CCR7 ir CD45RA. Į naviką įsiskverbiančios CD8 + T ląstelės buvo CD44 +, daugiausia praradusios CD62L ir CCR7 ekspresijos sąlygojančius receptorius, ir sudarytos iš dviejų pagrindinių pogrupių CD45RA ir CD45RA +, kas rodo santykinai diferencijuotą statusą. Po MACS išskyrimo ir stimuliavimo CD3 / CD28 Dynabeads ant anti-CD2 dengtose plokštelėse, sėkmingas ekspansija buvo įrodytas visose trijose grupėse, naudojant CFSE smailės NT eff ir MT eff pogrupius arba padidėjusias CD44 + CD8 + TIL eff ląstelių populiacijas ( 1A pav.). Buvo pastebėta, kad CFSE dažo TIL eff proliferaciją, tačiau smailių padalijimas buvo netikslus dėl nedidelio pradinių TILs skaičiaus (duomenys nepateikti). Aktyvacijos kinetika skyrėsi ląstelių pogrupiuose, kur eksponentinis išsiplėtimas ir kaupimasis buvo stebimas pradedant 3 dieną NT eff, o vėliau 5 dieną MT eff ir TIL eff ląstelėmis, todėl 5 dieną po stimuliacijos buvo atlikta tolesnė visų efektorinių ląstelių analizė.

Image

( A ) CD8 + T ląstelių pogrupių išskyrimas ir proliferacijos tyrimai. MACS izoliacija ir FACS Aria analizė parodė inaktyvių naivių (CCR7 + CD45RA + ), atminties (CD45RA - ) ir TIL (CD44 + ) subpopuliacijų augimą in vitro , praėjus 5 dienoms po TCR stimuliacijos. CFSE tyrimas parodė teigiamus proliferacijos rezultatus po 3–5 dienų auginimo. ( B ) Efektoriaus ląstelių pogrupių aktyvavimo žymekliai. Negyvos efektoriaus ir atminties CD8 + ląstelės (atitinkamai NT eff ir MT eff ) pasižymi CD62L - CD25 + CD44 + OX40 + ekspresija. Panašius fenotipus parodė ir pakartotinai stimuliuotos CD8 + TIL (TIL eff ) populiacijos. ( C ) OX40 + efektoriaus ląstelių pogrupių procentinė dalis. NT eff rodikliai buvo žymiai didesni, palyginti su MT eff ir TIL eff (* P <0, 05 vs TIL eff, ** P <0, 005 vs MT eff ). ( D ) Telomerų ilgio palyginimas parodė ilgiausius telomerus NT eff ir trumpiausius TIL eff ląstelėse (* P <0, 05). Efektorinių ląstelių RTL buvo išmatuotos naudojant DAKO Telomere PNA rinkinį, naudojant CCRF-CEM kontrolines ląsteles (santykis 1: 1, bendra 5, 0 x 105 ląstelių). Duomenys atspindi nuo trijų iki keturių nepriklausomų eksperimentų ir pateikiami kaip vidurkis ± SD.

Visas dydis

Efektorinių ląstelių populiacijų fenotipinės savybės buvo įvertintos pagal aktyvavimo žymenų CD62L, CD25, CD44 ir OX40 ekspresiją paviršiuje. Visų progenitorių (naiviųjų, atminties ir TIL) efektorinės ląstelės turėjo efektoriaus fenotipą su reikšmingu aktyvavimo žymenų padidinimu, palyginti su jų progenidais, ir buvo laikomos aktyvuotomis kaip CD62L - CD25 + CD44 + OX40 + populiacijos (1 pav. B). . Nepaisant donorų pagamintų efektorinių ląstelių procentinio kitimo, NT eff buvo žymiai didesnis OX40 ekspresuojančių ląstelių procentas, palyginti su MT eff (p <0, 05) arba TIL eff (p <0, 005) ląstelėmis (1 pav. C). Norint toliau palyginti proliferacinį ląstelių populiacijos potencialą, buvo tiriamas NT eff, MT eff ir TIL eff ląstelių santykinis telomerų ilgis (RTL), koreliuojantis su replikaciniu pajėgumu, lyginant su CCRF-CEM kontrolinių ląstelių linija. Telomerų ilgis buvo didžiausias NT eff, trumpesnis MT eff ir trumpiausias TIL eff ląstelių pogrupiuose (1 pav. D). Šis rezultatas atitiko anksčiau paskelbtas ataskaitas apie ilgesnius telomerus žmogaus naiviose T ląstelėse, dėl kurių padidėjo NT eff ląstelių proliferacija, palyginti su MT eff ląstelėmis po stimuliacijos in vitro 9 .

Išsekimo fenotipai skiriasi tarp in vitro sukurtų žmogaus ir pelių efektorinių ląstelių NT eff, MT eff ir TIL eff

Įrodyta, kad slopinantys receptoriai ant T ląstelių paviršių, tokių kaip PD-1, CTLA-4 ir KLRG-1, palengvina T ląstelių išsekimą, sąveikaujant su antigeną pateikiančių ląstelių arba naviko ląstelių ligandais 3, 4, 5 . Todėl palyginome šių slopinančių receptorių raišką trijuose efektorinių ląstelių potipiuose. Visos efektorinės ląstelės proliferacijos metu žymiai padidino išsekimo fenotipus, tačiau NT eff ląstelės parodė žymiai mažiau PD-1 ir CTLA4 ekspresijos, palyginti su MT eff ir TIL eff pogrupiais (2A pav.). Kontrolinio taško inhibitoriai rodė skirtingą išraiškos lygį, atsižvelgiant į laiką, praėjusį nuo aktyvacijos, kai didžiausia ekspresija pasireiškė 4–5 dienomis PD-1, 5–7 dienomis CTLA-4 ir 4–7 dienomis KLRG-1 (duomenys nepateikti) ). Norėdami ištirti išsekimo fenotipų funkcinę svarbą, tada įvertinome citotoksinių citokinų, tokių kaip granzimas B, perforinas ir IFN-secret, sekreciją iš skirtingų žmogaus efektorių. Per 3–5 dienas po stimuliavimo pamažu padidėjo granzimo B ir perforino sekrecija visose efektorinėse ląstelėse, gautose iš naivių, atminties ir TIL populiacijų (2 pav. C). Tarp visiškai aktyvuotų 5 dienos efektorinių ląstelių NT eff turėjo aukščiausią perforino ir granzyme B ekspresijos lygį ir panašų IFN-levels lygį (duomenys nepateikti), palyginti su MT eff ir TIL eff ląstelėmis. Pelių modelyje efektoriai, gauti iš CD8 + dar negyvų ir atminties fenotipo (MP) T ląstelių, ir TIL, surinkti iš OVAp ekspresuojančių EL4-EG7 navikų, buvo sėkmingai platinami CD44 + OX40 + fenotipais. Inhibitorinių receptorių PD-1, KLRG1 ir LAG3 ekspresijos lygiai pelių CD8 + efektoriuose parodė panašius modelius kaip žmogaus ląstelės (2B pav.).

Image

Efektoriaus ląstelės (OX40 + ), gautos iš naivių ląstelių (NT eff ), išreiškė mažesnį išsekimo žymenų PD1, CTLA4, KLRG1 ir LAG3 išsekimo žymenų lygį, palyginti su efektoriais iš atminties ląstelių arba TIL (MT eff arba TIL eff ) ( A ) žmogaus (*). P <0, 05 PD-1, ** P <0, 005 CTLA4) ir ( B ) pelėms 5 dienas po stimuliavimo anti-CD3 / CD28 ir anti-CD2. PFI lygiai yra vidutinis trijų eksperimentų rezultatas ir pateikiami kaip vidurkis ± SD. ( C ) Funkcinė žmogaus efektorinių ląstelių analizė in vitro gaminant citokinus. OX40 + efektoriams aktyvuotam lygiam skaičiui progenitorių (2 x 105 ląstelių kiekviename potipyje) buvo būdinga srauto citometrija, kad būtų galima tiesiogiai palyginti potipius. NT eff ląstelės parodė didesnį perforino + granzimo B + populiacijų padidėjimą, palyginti su MT eff ir TIL eff pogrupiais dviem laiko momentais (3 ir 5 dieną po stimuliacijos). Duomenys atspindi tris nepriklausomus eksperimentus.

Visas dydis

Transkripcijos veiksnių ekspresijos kinetika T-bet ir Eomes skiriasi CD8 + T ląstelių efektorių populiacijose

Tolesniam CD8 + T ląstelių subpopuliacijų apibūdinimui buvo tiriami dviejų T-dėžutės transkripcijos veiksnių, T-bet ir Eomes, ekspresijos lygiai, naudojant FACS analizei tarpląstelinį dažymą, ir patvirtinti Western blot. Nors naivios CD8 + T ląstelės prieš stimuliaciją išreiškė mažesnį T-bet ir Eomes lygį, palyginti su atminties ląstelėmis, aktyvuoti efektoriai NT eff, MT eff ir TIL eff parodė palyginti panašų TFI ​​ir Eomes MFI lygį, parodydami, kad naivios ar atminties ląstelės, norinčios sukelti panašias efektorių populiacijas (3A pav.). Tačiau atsižvelgiant į mažesnį iš anksto stimuliuotų naivių ląstelių MFI, šioje ląstelių populiacijoje yra didesnis T-bet ir Eomes ekspresijos lygio padidėjimas po stimuliavimo, palyginti su atminties T ląstelėmis.

Image

( A ) T-bet ir Eomų intraląstelinis dažymas, išreikštas TCR stimuliuotais efektoriais NT eff, MT eff ir TIL eff . PFI lygis rodomas 0-ą dieną (pradinė smailė) ir 5-ą dieną (smailė dešinėje) po stimuliacijos. Dėl TILS 0 dienos smailės prarandamos dėl nepakankamo ląstelių kiekio išankstinio išsiplėtimo. ( B ) naivių ir atminties T ląstelių ir TILs Western blot analizė 0, 3, 5 ir 8 dienomis po TCR aktyvavimo. T-bet ir Eomes ekspresijos kinetika diferencijuojamosiose CD8 + T ląstelėse rodo greitą ir nuolatinę NT eff populiacijų stimuliaciją. Efektorių grupės nuo 5-osios dienos po stimuliavimo yra gydomos TGF-β (10 ng / ml) 48 valandas ir tikrinamos, ar nėra Foxp1 ekspresijos (7 diena po stimuliacijos) dažant ( F ) tarpląsteliniu FACS ir ( D ) Western blot. Foxp1 PFI lygio padidėjimas prieš ir po TGF-β kondicionavimo nebuvo minimalus naivioms efektorių ląstelėms, o NT eff parodė mažiausią Foxp1 baltymo ekspresiją, nors nebuvo statistiškai reikšmingas. PFI lygis ir baltymų tankio santykis yra trijų eksperimentų vidutinis rezultatas ir parodyti kaip vidurkis ± SD. ( E ) aneksino V tyrimas srauto citometrijos metodu. Kvadranto brėžiniai rodo ankstyvųjų ir vėlyvųjų apoptotinių ląstelių (pirmojo kvadranto) procentinį pasiskirstymą su 48 valandų TGF-β ekspozicija arba be jos. Naivūs ląstelių išvestiniai efektoriai (NT eff ) parodė minimalų apoptozinių ląstelių populiacijų padidėjimą, palyginti su MT eff ir TIL eff pogrupiais. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus ir juos pateikė vienas reprezentatyvus paveikslas.

Visas dydis

Norint išaiškinti ir patvirtinti šių T-dėžutės transkripcijos veiksnių ekspresijos profilį efektorių subpopuliacijose, Western blot analizė buvo atlikta naudojant naivių ir atminties T ląstelių sveikų ląstelių lizatus ir TILS 0, 3, 5 ir 8 dienomis po TCR aktyvavimo. Mūsų eksperimentai atskleidė aiškius T-bet ir Eomes ekspresijos kinetikos skirtumus CD8 + T ląstelių aktyvacijos metu (3B pav.). Iš naivių ląstelių išvestų efektorių T-bet ekspresija pastebimai padidėjo, pradedant nuo 3 dienos, maksimaliai pasiekiant 8 dieną, tuo tarpu atminties ląstelių išvestiniai efektoriai aukščiausią T-bet ekspresiją išgavo anksčiau 3 dieną ir greitai buvo sureguliuoti 5 – ą dieną. 8. TIL eff ląstelės demonstravo blogą T-bet ekspresiją per stimuliacijos laiką. Nors naiviose ir atminties ląstelėse buvo parodyta vis didesnė Eomes ekspresija stimuliacijos metu, po 5-osios dienos po aktyvacijos TILs intensyvumas mažėjo. Tokia kinetika rodo, kad NT eff ląstelės ekspresuoja aukštesnius tiek T-bet, tiek Eomes lygius, o ekspresija yra palaikoma ilgesnį laiką aktyvacijos metu, palyginti su kitomis efektorių grupėmis MT eff ir TIL eff . Atrodo, kad naivūs T ląstelių efektoriai santykinai greitai diferencijuojasi, aktyviai dauginasi ir gali virsti ilgaamžiškomis atminties ląstelėmis.

Foxp1 ekspresijos ir apoptozės tyrimai TGF-β kondicionavimo metu rodo teigiamus CD8 + NT eff ląstelių rezultatus

Norėdami nustatyti CD8 + NT eff ląstelių imunosupresinį atsparumą naviko mikroaplinkai, ištyrėme Foxp1 raišką efektorinėse ląstelėse, gautose iš naivių, atminties ir TIL palikuonių, esant TGF-β. Po 5 dienų proliferacijos efektorinės ląstelės 48 valandas buvo veikiamos TGF-β (10 ng / ml), o Foxp1 ekspresija (7 diena po stimuliacijos) buvo įvertinta dažant ląstelėse FACS. MT eff ir TIL eff populiacijose padidėjo Foxp1 raiška su TGF-β kondicionavimu, tuo tarpu NT eff ląstelės palaikė žemiausią ekspresijos lygį per tris nepriklausomus eksperimentus (3 pav. C). Norint patvirtinti padidėjusią Foxp1 raišką CD8 + efektorinėse ląstelėse naviko mikroaplinkoje, buvo atlikta T efekto T ląstelių pogrupių Western blot analizė, veikiant TGF-β, kaip kontrolę naudojant nestimuliuotas naivias ląsteles. Kaip ir tikėtasi, NT eff populiacijos išreiškė sumažintą Foxp1 baltymo ekspresijos kiekį, palyginti su kitomis efektorių grupėmis, atitinkančias tarpląstelinio dažymo rezultatus (3D pav.). Atlikus kondicionavimą TGF-β, apoptozės aptikimas srauto citometrijos metodu naudojant aneksiną V parodė ribotą NT eff ląstelių apoptozinių ląstelių populiacijų indukciją, palyginti su MT eff ir TIL eff pogrupiais (3 pav. E). Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad CD8 + efektorių pogrupiai skiriasi Foxp1 ekspresija ir apoptoziniu atsaku į TGF-β ekspoziciją, o NT eff ląstelės išlaiko atsparumą slopinamiesiems veiksniams, kuriuos sukelia naviko mikroaplinka.

Citotoksinis aktyvumas tikslinių navikinių ląstelių atžvilgiu yra pranašesnis naivių T ląstelių efektorinėms ląstelėms tiek žmogaus, tiek pelės modeliuose

Norint ištirti navikams būdingų žmogaus CTL citotoksinę funkciją, antigeno (U266 MM ląstelių linija) pakrautose autologinėse subrendusiose dendritinėse ląstelėse (mDC) 7 dienas buvo kultivuojamos su IL-2 gruntuotos naivios ir atminties CD8 + T ląstelės bei susidariusios CTL. buvo įvertinti naudojant IFN-ɤ ELISPOT testą ir LDH citotoksiškumo nustatymo rinkinį. Iš viso buvo surinktos penkios ląstelių grupės citotoksinei analizei, įskaitant CD8 + (naivus D14, naivus D7, naivus D0 ir atmintis) ir CD3 + CTL. Trumpai tariant, naiviosios D14 ir naiviosios D7 ląstelės reiškia CD8 + negydytas ląsteles, kartu auginamas kartu su didelėmis dozėmis IL-2 (1 μg / ml) atitinkamai 14 ir 7 dienas, tuo tarpu „Naive D0“ ir „Memory“ ląstelės auginamos kartu su įprasta doze. IL-2 (10 ng / ml) ir yra atitinkamai naivios ir atminties T ląstelių kilmės (žr. Metodus). IFN-ɤ ELISPOT buvo matuojamas esant arba nesant MHC I klasės specifinio monokloninio antikūno (W6 / 32, 20

Image

g / ml), naudojant kontrolę tik CTL. Didelės dozės IL-2 gruntuotos naivios D14 efektorinės ląstelės parodė didžiausią IFN-retion sekreciją nuo tikslinių U266 ląstelių, kai vieną dieną buvo auginamos 10: 1 efektoriaus (E) ir tikslinių (T) ląstelių santykiu (4A pav. .). Nors CD3 + ląstelės taip pat išskiria didesnį IFN-levels kiekį, palyginti su naiviais D7, naiviais D0 ir atminties CD8 + ląstelėmis, jos taip pat išsiskyrė nespecifiškai, kaip stebėta tik kontrolinėje CTL grupėje. Tiesioginis citotoksiškumo tyrimas su U266 tikslinėmis ląstelėmis, naudojant LDH citotoksinį testą, parodė, kad Naive D14 ląstelių CTL aktyvumas buvo žymiai didesnis nei kitų efektorinių CTL, kai E: T santykis buvo bent 10: 1 (4B pav.). Pelių modelyje in vivo CTL aktyvumas prieš inokuliuotas OVAp ekspresuojančias EL4-EG7 limfomos ląsteles B6 pelėse buvo tiriamas dėl NT eff, MT eff ir TIL eff CD8 + efektorių pogrupių, gautų iš OT-1 Thy1.1 pelių. Pelių augimas buvo neigiamas mažiausiai 35 dienas po naviko užkrėtimo pelėms, į kurias buvo įšvirkštos NT eff ląstelės, tuo tarpu MT eff ir TIL eff injekuotoms pelėms per tą patį laiką buvo teigiamas naviko augimas (4 pav. C). Naviko augimas tapo teigiamas vienoje NT eff suleistoje pelėje praėjus 42 dienoms po inokuliacijos (duomenys nepateikti).

Image

( A ) IL-2 primintų žmogaus CD8 + T ląstelių navikams būdingų CTL funkcijų palyginimas in vitro su U266 MM ląstelėmis, naudojant IFN-ɤ ELISPOT analizę. Vien CTL žymi kontrolinę grupę, o U266 - efektorių citotoksinį aktyvumą prieš U266 tikslines ląsteles (E: T santykis 10: 1), jei nėra MHC I klasės apribojimų, išreikštų stebimų IFN-ɤ dėmių skaičiumi. Naivios T ląstelės, aktyvuotos naudojant didelę IL-2 dozę 14 dienų (naive D14), parodė didžiausią aktyvumą prieš U266 tikslines ląsteles. ( B) ILH 2 gruntuotų žmogaus CD8 + T ląstelių LDH citotoksiškumo tyrimas. Specifinis citotoksiškumo lizės procentas, palyginti su U266 MM tikslinėmis ląstelėmis, buvo didžiausias Naive D14 efektoriams, palyginti su kitomis grupėmis, kai E: T santykis buvo mažiausiai 10: 1 (* p <0, 05). ( C ) In vivo CTL aktyvumas pelių modelyje. Suleidus NT eff, MT eff ir TIL eff CD8 + T ląsteles, OVAp ekspresuojančios EL4-EG7 ląstelės (8 × 105 ląstelės / 200

Image
L) buvo įšvirkštos į poodį pelėms B6, gaunančioms poodį, tikslinio naviko ir efektorinių ląstelių santykiu 1: 2. Visoms B6 pelėms, kurioms buvo švirkščiama TIL eff, buvo gauta teigiama masė (1 cm 3 ) po 28 dienų, tuo tarpu auglių augimas buvo slopinamas NT eff turinčiose B6 pelėse ilgiau nei 35 dienas. Visi duomenys atspindi tris nepriklausomus eksperimentus ir parodyti kaip vidurkis ± SD.

Visas dydis

Diskusija

Dabartinė įvaikinė imunoterapija daugiausia apima CD3 surinktų T ląstelių arba autologinių genetiškai modifikuotų TILs naudojimą, didėjant CD8 + atminties ląstelių tikimybei 18, 19. Autologinių CD8 + subpopuliacijų privalumas yra tai, kad vėžiu sergantiems pacientams išvengiama imunosupresinių reguliuojamųjų T ląstelių užteršimo ir galinio diferenciacijos sumažėjimo, kartojant pakartotinį klonų proliferaciją. Norėdami parodyti geresnį navikams būdingų CTL, gautų iš naivių CD8 + populiacijų, fone, mes sutelkėme dėmesį į skirtingų išsekimo charakteristikų, įskaitant ekspresijos patikros taško inhibitorius ir transkripcijos faktorius, išsiaiškinimą ir citotoksinės funkcijos skirtumus tarp skirtingų efektorių grupių NT eff, MT eff, ir TIL eff . Mes nustatėme, kad naivūs CD8 + efektoriai turi palyginti palankų atsparumo imunosupresijai modelį ir stiprią CTL stiprumą prieš naviko taikinius. Tai galima paaiškinti „šviežiu“ šių ląstelių grupių, turinčių mažesnį slopinamų imuninio patikros taško receptorių, tokių kaip PD-1, CTLA-4 ir KLRG1, pobūdį, sukeliantį aktyvesnį ir dauginimosi potencialą 20 . Mūsų rezultatai atitiko Hinrichs et al. Remiantis KLRG1, CD57, CD27 ekspresijos ir telomerų ilgio įvertinimu, tinkamiausias imuninės terapijos T-ląstelių kandidatas gali būti 21, nurodantis efektorius, gautus iš naivių CD8 + T ląstelių. Tokie žymenys parodo MT eff arba TIL eff ląstelių tendenciją greitai pereiti į T ląstelių „išsekimo“ fazę, padidėjus slopinančių receptorių lygiui po ilgalaikio naviko antigeno poveikio, ir galiausiai įgyti nefunkcinę būseną 4, 22, 23 .

Kitas svarstymo taškas yra dviejų T-dėžutės transkripcijos veiksnių, T bet ir Eomes, išraiška, taip pat jų poveikis CTL diferenciacijai. Tarp įvairių transkripcijos veiksnių, veikiančių poromis ir reguliuojančių efektorių ir atminties CD8 + T ląstelių vystymąsi, T-bet ir Eomes trumpalaikis ir ilgalaikis poveikis buvo palyginti gerai identifikuotas pelių modelyje, tačiau vis dar apsiriboja infekcija ir žmonių ligos 16, 24, 25, 26, 27 . Ankstesniuose tyrimuose pabrėžiamas didelio T-bet išraiškos, susijusios su ilgalaikiu atsparumu, mažu slopinamųjų receptorių ekspresija ir apsauga nuo CD8 + T-ląstelių išsekimo 27, 28, vaidmuo, taip pat Eomes sukeltas ląstelių slopinimas. mirtis, lemianti atminties ląstelių generavimą ar išlikimą 17, 29 . Mūsų eksperimentuose duomenys parodė, kad NT eff ląstelės palaipsniui didina ir palaiko aukštą tiek T-bet, tiek Eomes ekspresijos lygį aktyvacijos metu, tuo tarpu kiti efektoriai greitai žemina šiuos veiksnius. Buvo teigiama, kad aukšta T-bet išraiška koreliuoja su B + perforino + fenotipu, kai didelis perforino sekrecija buvo aptinkamas tik T-bet hi Eomes hi / lo ląstelėse 15 . Stabili Eomes lygio ekspresija NT eff ir MT eff pogrupiuose rodo jų sugebėjimą tapti atminties pirmtakų efektoriais (MPEC), o TIL eff ląstelės patenka į galutinę diferenciacijos fazę, reguliuodamos Eomes. Bendrai kalbant, mūsų duomenys rodo, kad NT eff populiacijos kartu išreiškia tvarų, aukštą T-beta ir Eomų kiekį, o granzyme B + perforin + fenotipas reprezentuoja visišką citotoksinę funkciją.

Norėdami išsiaiškinti ryšį tarp Foxp1 ekspresijos modelių ir TGF-β, mes aktyvavome T ląsteles in vitro TCR stimuliacija ir įvertinome šių efektorių Foxp1 lygius prieš ir po TGF-β ekspozicijos, ketindami imituoti imunosupresinį TME. Kaip parodyta naujausiame 7 straipsnyje, manoma, kad per didelę „Foxp1“ raišką skatina TGF-β signalizacija per Smad baltymo sąveiką, kuri savo ruožtu tarpininkauja c-Myc ir c-Jun transkripcinėms represijoms ir tikimasi, kad ji bus sureguliuota po priglaudimo prie TME. Tačiau šiame tyrime buvo tiriamos tik ištisos pelių CD8 + ląstelės ir jos nenagrinėjo žmogaus CD8 + T ląstelių pogrupių. Remiantis mūsų rezultatais, CD8 + NT efektą mažiau įtakoja iš naviko kilęs slopinamasis faktorius TGF-β, ty efektoriams, gautiems iš naivių ląstelių, mažiau įtakos turi naviko slopinimo mechanizmai, kuriuos varo Foxp1, reaguodami į TGF-β. Svarbu tai, kad praėjus 48 valandoms po TGF-β apdorojimo, mažesnis procentas NT eff ląstelių pateko į apoptozę, palyginti su MT eff ir TIL eff pogrupiais, o tai dar labiau patvirtina naivių ląstelių išvestų efektorių, pasižyminčių atsparumu TGF-β, pranašumą. apoptozės efektas. Šie radiniai rodo TGF-β inhibitorių 29 naudojimą, NT eff, skirtą ekspresuoti dominuojantį neigiamą TGF-β receptoriaus 30 mutantą, ir Foxp1 deficitą turinčią NT eff, siekiant padidinti imunosupresinį limfocitų atsparumą TME įvairiose klinikinėse programose.

Esminis didelės dozės IL-2 vaidmuo sergant vėžiu dabar buvo plačiai aptariamas, ypač todėl, kad įtariama, kad IL-2 optimizuoja visus CD8 + T ląstelių atsako etapus, įskaitant pirminį išsiplėtimą, susitraukimą, atminties generavimą ir antrinę plėtrą 31 . Be to, didelės IL-2 dozės gali stipriai skatinti naivių CD8 + T ląstelių dauginimąsi ir stimuliavimą tiek in vitro, tiek in vivo 32 . Mūsų tyrime didelės dozės IL-2 (1 μg / ml) stimuliavo naivias CD8 + T ląsteles, kurios vėliau buvo kultivuojamos kartu su autologiniais DC, per trumpą laiką galėjo sėkmingai sukurti stiprius CTL. Įvertinus ELISPOT ir LDH analizę, tiek naivūs D14, tiek naivūs D7 sukūrė CTL, turinčius daug IFN-ɤ dėmių ir geresnį (Naïve D14) ar panašų (Naive D7) citotoksinį poveikį, palyginti su CD3 + CTL. Kaip minėta, CD8 + anksčiau negydytų T ląstelių stimuliavimui nuo antigeno nepriklausomu būdu yra būtinos didelės IL-2 koncentracijos (0, 1–1 μg / ml) 13 . Nors mūsų į antigeną pakrauti DC galėjo indukuoti antigenui specifinius CTL iš CD8 + naivių T ląstelių, didesnės nei įprastos IL-2 dozės reikėjo ne tik norint išplėsti ribotą kiekį antigenui specifinių naivių CD8 + T ląstelių, bet ir generuoti stiprūs CTL. Citokinų stimuliavimo metu didelės IL-2 dozės vaidina svarbų vaidmenį tiek suaktyvinant (per 7 dienas kartu kultivuojant naivias T ląsteles), tiek kartu suaktyvinant (per 7 dienas kartu su IL-2 gruntuotos T ląstelės ir DC). Koaktyvacijos laikotarpiu didelės IL-2 dozės gali būti naudojamos kartu su kitais ɤ c citokinais (IL-7, IL-15), kad būtų lengviau generuoti CTL. Vis dėlto reikia nustatyti optimalų didelės dozės IL-2 ekspozicijos laiką navikui specifinių CD8 + T ląstelių, kurios anksčiau nebuvo gautos.

Apibendrinant, mūsų rezultatai suteikia palyginti išsamų efektinių ląstelių, gautų iš naivios kilmės, surinkimo pagrindą ir pateikia praktinį metodą, leidžiantį efektyviai generuoti stipriai veikiančias NT efektų populiacijas, naudojant dideles IL-2 dozes (1 μg / ml). Šiais laikais žmogaus T limfocitai, kurie gali būti genetiškai modifikuoti prieš perkėlimą, gali ekspresuoti praktiškai bet kurį tikslinį geną, taikydami metodus, susijusius su genais, koduojančiais T ląstelių receptorius (TCR) arba chimerinius antigeno receptorius (CAR), kad gautų norimą T- ląstelių specifiškumas 11 . CAR nukreipti T limfocitai (CAR-T ląstelės) daugiausia dėl atminties ir efektorinių T ląstelių yra 33, 34, 35 dėl galingos citotoksinės funkcijos. Tačiau klinikiniam naudojimui tinkamas efektorinių T ląstelių substratas vis dar ginčytinas, o antigeno pabėgimo variantų vystymasis gali reikšti monokloninio specifiškumo apribojimą. Norėdami gauti pakankamą efektorinių ląstelių kiekį, viršijančią citotoksinę funkciją, mes siūlome manyti, kad negydytos ląstelės gali būti gydomos CAR-T.

Apibendrinant galima pasakyti, kad pirminės efektorinės ląstelės, gautos iš naivių CD8 + T ląstelių, parodė didžiausią įgyjamųjų ląstelių perkėlimo terapijos potencialą: mažesnė slopinančio paviršiaus žymenų išraiška, didesnė citotoksinių citokinų sekrecija ir pagerėjęs atsparumas TGF-β sukeltam slopinimui TME, palyginti su antriniais efektoriais, gautais iš atminties ar TIL CD8 + ląstelių. Didelės dozės IL-2 padidina navikui nebūdingų CD8 + T ląstelių skaičių be kloninio išsekimo ir sukuria galingas į naviką reaguojančias CTL, galinčias įveikti naviko sukeliamą imuninį slopinimą.

Metodai

Etinis tyrimų patvirtinimas ir informuotas sutikimas

Visus eksperimentinius protokolus patvirtino ChonnamNational universiteto Hwasuno ligoninės institucinis etikos komitetas (CNUHH2014-146), o metodai buvo atlikti laikantis patvirtintų gairių. Žmogaus periferinis kraujas ir naviko masė buvo paaukoti iš sveikų donorų ar pacientų, sergančių plaučių vėžiu, gavus visų tiriamųjų rašytinį informuotą sutikimą. Tyrimai su gyvūnais buvo atliekami gavus etinį Čonnamo nacionalinio universiteto gyvūnų tyrimų komiteto leidimą (HCRL15001-2).

Žmogaus CD8 + T ląstelių pogrupių ir naviką infiltruojančių limfocitų (TIL) išskyrimas

Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) were obtained from healthy donors by density gradient centrifugation with Lymphoprep (AXIS-SHIED Rodelokka, Oslo, Norway). CD3 + and CD8 + lymphocytes were isolated by a magnetic-activated cell sorter (MACS) using CD3 Microbeads and a CD8 T cell isolation kit (MiltenyiBiotec), respectively. The cells were then labeled with anti-CD8, anti-CCR7, and anti-CD45RA (Ebiosciences) and sorted into naïve and memory CD8 + T cell subsets on a BD fluorescence activated cell sorting (FACS) Aria sorter (BD Biosciences). For extraction of TILs, tissue from lung tumor samples were minced and digested with collagenase (2.5 mg/ml collagenase I) at 37 °C for one hour. Cell suspension was then twice filtered through 100-μm and 40-μm cell strainers (BD Biosciences) to obtain single cells. TILs were isolated from single cells utilizing density gradient centrifugation with Lymphoprep and further purified using CD8 MicroBeads (MiltenyiBiotec).

Generation of human CD8 + effector subgroups and proliferation assay

Isolated naïve, memory, and TIL subpopulations were mixed in a 1:1 ratio with Human T-Activator CD3/CD28 Dynabeads (Gibco, Life Technologies) and cultured on CD2-coated plates (CD2-Biotin functional grade, MiltenyiBiotec). Carboxyl fluorescein succinimidyl ester (CFSE) studies were performed by labeling cells with 2.5 μM CFSE (Life Technologies) before stimulation. Three and 5 days post-stimulation, CFSE division of cells was determined by flow cytometry and analyzed using FlowJo Version 10.0.7 software. After 5 days of stimulation, activation of effector cells was determined by FACS analysis based on CD62L, CD25, CD44, and OX40 expression.

Telomere lengths

Relative telomere lengths (RTL) of effector cells were determined by comparing test cells to a control cell line (human T-cell lymphoblast-like cell line CCRF-CEM, Sigma-Aldrich) using a DAKO Telomere PNA Kit (DAKO). Test cells (NT eff, MT eff, and TIL eff ) and control cells (cell line 1301) were washed in PBS and mixed in a 1:1 ratio. A total of 5 × 10 5 cells were resuspended in 300 μl of hybridization solution containing 70% formamide either without a probe (unstained control) or with a fluorescein-conjugated telomere PNA probe. The cells were heated for 10 min at 82 °C for DNA denaturation and hybridization was performed overnight at room temperature. Subsequently, cells were washed and resuspended in 0.5 ml of DAKO DNA staining solution and incubated at 2–8 °C for 2 hours. Samples were then analyzed by flow cytometry using logarithmic scale FL1-H for probe fluorescence and linear scale FL3-H for DNA staining. RTLs of the sample cells were calculated per manufacturer's instructions and reported as mean ± standard deviation (SD) for triplicate samples.

Surface and intracellular staining using FACS

For surface staining, cells were labeled with mAbs against various targets including CD8, CD62L, CCR7, CD45RA, CD45RO, CD25, CD44, OX40, PD-1, CTLA-4, and KLRG-1 (Ebiosciences), incubated at 4 °C for 15 minutes, then washed twice with PBS 1% FBS (FACS buffer), and finally fixed in PBS containing 1% paraformaldehyde (Fix buffer). For T-bet (4B10) and Eomes (Dan11mag), and Foxp1 intracellular staining, cells were first labeled with surface markers CD8, CD62L, OX40 (Ebiosciences) for T-bet and Eomes, or CD25 (BD Biosciences), CD8, CD27, and CD44 (Ebiosciences) for Foxp1 detection, respectively, and then fixed and permeabilized with Foxp3/Transcription Factor Fixation/Permeabilization Concentrate and Diluent (Ebiosciences) in a 96-round-well plate. Intracellular labeling for T-bet and Eomes (Ebiosciences), and Foxp1 (LifeSpan Technologies) was performed according to manufacturer's instruction. For evaluation of Perforin, Granzyme B, and IFN-ɤ cytokine secretion, effector cells were incubated with brefeldin A for 4 hours at 37 °C to disrupt Golgi-mediated transport and accumulate cytokines. Cells were then surface stained, permeabilized with BD Cytofix/Cytoperm™ Fixation/Permeabilization Solution Kit (BD Biosciences), and intracellularly stained as recommended. Flow cytometry data was analyzed using FlowJo Version 10.0.7 software.

Apoptosis under TGF-β conditioning

For evaluation of apoptosis, individual effector CD8 + T cell populations were exposed under TGF-β (10 ng/mL) 48 hrs and stained with Annexin V FITC (FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I). Briefly, 1 × 10 6 cells were washed twice with cold PBS and stained with 5 μL of Annexin-V-FITC in binding buffer for 15 minutes at room temperature. Apoptotic cells were evaluated by flow cytometry according to the manufacturer's protocol (BD Pharmigen).

Western blot protocol

For Western analysis, whole-cell protein lysates were obtained from effector CD8 + T cells at 4 time points (0, 3, 5, and 8 days post-stimulation) with lysis buffer Proprep (INTRON Biotechnology) by suspending 106 cells in 10 μl buffer and incubating on ice for 30 minutes in the presence of Halt Protease & Phosphatase inhibitors cocktail (Thermo Scientific). Cell lysates were resolved by 10% Bis-Tris SDS PAGE Gel, transferred onto PVDF membrane (Merck), blocked with 5% skim milk in TBST buffer containing 0.1% Tween-20, and probed with the following mAbs: T-bet (4B10, Santa Cruz), Eomes (Y-20, Santa Cruz), Foxp1 (polyclonal, Abcam), and β-actin (C4, Santa Cruz). Quantification of detected protein was performed with an Intelligent Dark Box unit (LAS-3000; Fujifilm) and normalized for loading with the amount of β-actin (1:5000) detected in each lane.

Generation of human tumor-specific CTLs

Mature dendritic cells (mDCs) were pulsed with apoptotic body (irradiated U266 cell line) at a 2:1 ratio (2 × 10 5 DC: 10 5 U266) from day 6 to day 8 and then presented to CD8 + T cells at a 1:10 ratio (2 × 10 5 DC: 2 × 10 6 CD8 + T cell). Naïve and memory T cells were isolated from the same donor and cultured in different conditions. To visualize cytokine-activated proliferation and determine the optimal co-culturing start time with antigen-loaded mDCs post high-dose IL-2 activation, activated naïve CD8 + T cells were labeled with CFSE and analyzed at various time points (Supplementary Fig. S1). Initiation of peak expansion at 7 days post high-dose IL-2 lead to the decision to start co-culture of cells with mDCs after 7 days of high-dose IL-2 pretreatment. Naïve cells were activated with high-dose IL-2 (1

Image

g/mL) in two conditions; 14 day exposure to high-dose IL-2 (Naïve D14; 7 days pretreatment and during 7 days of mDC co-culture) and 7 day exposure to high-dose IL-2 (Naïve D7; 7 days pretreatment only followed by 7 days of mDC co-culture without high-dose IL-2). For control, we cultured naïve and memory cells under equal conditions; 7 day mDC co-culture with IL-2 (10 ng/mL) and IL-7 (10 ng/mL), labeled Naïve D0 and Memory, respectively. After mDC co-culture, 4 groups of CD8 + CTLs (Naïve D14, Naïve D7, Naïve D0, and Memory) and CD3 + CTLs (cultured as previously described) were harvested for cytotoxic analysis.

Cytotoxic functional evaluation of human tumor-specific CTLs

The U266 cell line was chosen as target cells for our cytotoxic assays based on its expression of E-Cadherin and PD-L1 (Supplementary Fig. S2), which are ligands of KLRG-1 and PD-1, respectively. ELISPOT assay (BD Biosience) was performed to quantify antigen-specific IFN-ɤ releasing effector T cells. 2 × 10 5 of the effector T cells were co-cultured with 2 × 10 4 U266 target cells in a 96-well nitrocellulose flat-bottom plate for 24 hours at 37 °C. IFN-ɤ ELISPOT was measured in the presence or absence of MHC class I specific monoclonal antibody (W6/32) with CTLs alone as the control, and spots were counted with ImmunoSpot Reader (Cellular Technology Ltd, Ohio). Data is presented as the mean number of spots ± SD of IFN- ɤ secreting cells per well of triplicate samples.

Evaluation of CD8 + and CD3 + CTL functional activity was performed using the Cytotoxicity Detection Kit LDH (Roche Applied Science, Basel, Switzerland) according to the manufacturer's protocol 36, 37 . Cytotoxicity of CTLs was calculated according to the following formula: % cell lysis = (experimental – effector spontaneous – low control) x 100/(high control – low control), where “experimental” corresponds to the experimental signal value, “effector spontaneous” to the spontaneous background signal value of the effector cells alone, “low control” to the spontaneous background signal value of target tumor cells alone, and “high control” to the maximum signal value of target cells in medium containing 1% Trixton X-100. Cytotoxicity assays were performed for varying effector cell (E) to target cell (T) ratios, and specific cytotoxicity lysis percentages are reported as the mean ± SD of triplicate samples.

T cell purification, in vitro stimulation, and in vivo CTL assay of the murine model

C57BL/6 (B6) mice were purchased from Orient Bio (Iksan, South Korea) and OT-1.Thy1.1 TCR transgenic mice on a B6 background were obtained from the Institute for Basic Science (IBS; Pohang, South Korea). All mice were used in experiments at 6 to 12 weeks of age according to protocol. Pooled lymph nodes from OT-1 transgenic mice were stained with fluorochrome-conjugated antibodies to CD4, CD8, CD25, CD44 and CD62L and sorted to obtain CD44 CD62L + naïve or CD44 + memory-phenotype (MP) CD8 + T cells using FACS. CD8 + TILs were obtained from B6 mice that were inoculated subcutaneously with OVAp-expressing EL4-EG7 tumor cell lines. For in vitro stimulation, sorted naïve, MP, and TIL CD8 + T cells were cultured on plate-bound anti-CD3 and anti-CD28 with IL-2 (10 ng/mL) and IL-15 (10 ng/mL). Effector cell surface staining procedure for PD-1, KLRG-1, and LAG3 labeling was identical to human cell methods previously described. In vivo CTL functional assay was performed using OVAp-expressing EL4-EG7 tumor cell lines as target cells. EL4-EG7 tumor cells (0.8 × 10 5 cells/200

Image

L) were inoculated subcutaneously in recipient B6 mice and 8 hours later, NT eff, MT eff, and TIL eff were injected intravenously in a 2:1 ratio of effector to target cells. A tumor mass growth of greater than 1 cm 3 was considered as positive tumor formation.

Statistinė analizė

The two-tailed student's t test was used to determine differences in the mean. P values of less than 0.05 were considered statistically significant.

Papildoma informacija

How to cite this article : Nguyen, HH et al. Naïve CD8 + T cell derived tumor-specific cytotoxic effectors as a potential remedy for overcoming TGF-β immunosuppression in the tumor microenvironment. Mokslas. Rep. 6, 28208; doi: 10.1038/srep28208 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.