Tinkle atliekamas viruso ir atsparumo antibiotikams sistemų tyrimas pseudomonas aeruginosa | mokslinės ataskaitos

Tinkle atliekamas viruso ir atsparumo antibiotikams sistemų tyrimas pseudomonas aeruginosa | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Bakterijų genetika
  • Genų reguliavimo tinklai

Anotacija

Pseudomonas aeruginosa yra klinikinės reikšmės gramneigiama bakterija. Nors PAO1, P. aeruginosa padermės prototipo, genomas buvo išsamiai ištirtas, maždaug trečdalis funkcinio genomo vis dar nežinoma. Atsiradus antibiotikams atsparioms P. aeruginosa padermėms, reikia skubiai sukurti naujas antibiotikų ir antivirusinio gydymo strategijas, kurias gali palengvinti metodas, tiriantis P. aeruginosa geno funkciją sistemų lygio modeliuose. Čia pateikiame genomo mastu veikiantį P. aeruginosa genų tinklą „PseudomonasNet“, kuris apima 98% kodavimo genomo, ir papildomą žiniatinklio serverį, skirtą generuoti funkcines hipotezes naudojant įvairius tinklo paieškos algoritmus. Mes parodėme, kad „PseudomonasNet“ pagalba teikiamos prognozės gali veiksmingai nustatyti naujus genus, susijusius su virulencija ir atsparumu antibiotikams. Be to, „PseudomonasNet“ pagrindu sukurtas atsparumo antibiotikams tinklas atskleidžia, kad P. aeruginosa turi bendras modulines genetines organizacijas, kurios suteikia padidėjusį ar sumažėjusį atsparumą įvairiems antibiotikams, o tai lemia kryžminio atsparumo paplitimą keliems vaistams. Tas pats tinklas taip pat rodo, kad P. aeruginosa sukūrė skirtingų vaistų atsparumo kompensavimo mechanizmą, pakeisdamas genetinę sąveiką. Visi šie rezultatai aiškiai parodo genomo masto funkcinio tinklo naudingumą tiriant P. aeruginosa patogenines sistemas.

Įvadas

Pseudomonas aeruginosa yra klinikinės reikšmės gramneigiama bakterija. P. aeruginosa yra oportunistinis žmogaus patogenas, kuris gali plisti nenormaliuose žmogaus kvėpavimo takuose 1, nudegimo pažeistoje odoje 2 ir dirbtinai implantuotuose organuose 3, 4, taip pat gali sukelti ligoninėse įgytą antrinę infekciją pacientams, kurių imuninis reaktyvumas yra susilpnėjęs 5 . P. aeruginosa infekciją dažnai pagilina susidariusi bioplėvelė, bakterijų augimo būdas, susijęs su tolerancija antibiotikams 6 .

P. aeruginosa infekcijos gydymas susiduria su dideliais iššūkiais dėl nuolat atsirandančių antibiotikams atsparių variantų. Antibiotikų atsparumas P. aeruginosa padidina ligos pasireiškimą ir mirtingumą 5, 7 . Priešingai, naujų FDA patvirtintų antibakterinių preparatų skaičius per pastaruosius tris dešimtmečius labai sumažėjo 8 . Norint veiksmingai kontroliuoti P. aeruginosa infekciją, skubiai reikia alternatyvių strategijų. Neseniai buvo bandoma nustatyti cheminius veiksnius, galinčius sumažinti P. aeruginosa virulentiškumą nepakenkiant jo gyvybingumui 9 . Šis požiūris rodo galimą kovos su virulencija strategijos pranašumą, priešingai nei vyraujanti kovos su gyvybingumu strategija, kuri buvo taikoma nuo antibiotikų atradimo.

PAO1, kuris yra vienas P. aeruginosa kamienas, turi genomą, kurį sudaro 6, 264 mln. Bazinių porų ir 5 572 atvirus skaitymo rėmus 10 . PAO1 genomas yra vienas didžiausių bakterijų genomų; tik kelios bakterijų rūšys, įskaitant Myxococcus xanthus 11, Gemmata obscuriglobus 12 ir Mycobacterium smegmatis 13, turi didesnius genomus. PAO1 genome yra daug genų, susijusių su reguliavimu. Genų anotacijos analizė parodė, kad PAO1 gali pagaminti net 487 baltymus, kurie arba veikia kaip transkripcijos veiksniai, arba yra įtraukti į dviejų komponentų reguliavimo sistemas10. Ši savybė buvo priskirta įvairiapusiam PAO1 pritaikymui daugybei aplinkos sąlygų. Remiantis funkcijų klasės paieška, kurią teikia „Pseudomonas“ genomo svetainė (www.pseudomonas.com), PAO1 turi 2 025 genus, kurių ląstelių funkcijos išlieka hipotetinės arba nežinomos. Taigi, norint nustatyti tikslias blogai apibūdintų genų tikslias ląstelių funkcijas, reikalingas tolesnis tyrimas. Be to, kad trūksta atskirų genų funkcinio supratimo, klinikinės svarbos bruožų, tokių kaip virulentiškumas ir atsparumas vaistams, genetinė struktūra iš esmės nežinoma. Nors siekiant nustatyti kliniškai svarbius bruožus buvo atlikti keli genomo masto eksperimentai, apimantys priekinę arba atvirkštinę genetinę analizę, šiuose eksperimentuose dažnai trūksta genų, kurių išmušimai turi subtilius fenotipus arba daro įtaką virulentiškumui tik konkrečioje šeimininko aplinkoje14.

Prognozavimu grindžiamas genetikos metodas gali papildyti didelio pralaidumo ekranus, atidžiau ištyrus palyginti mažus labai tikėtinų kandidatų rinkinius, kurie gali nustatyti klaidingus neigiamus rezultatus didelio našumo tyrimuose. Neseniai nuspėjami funkciniai genų tinklai, padaryti iš įvairių genomikos duomenų, pasirodė naudingi tiriant P. aeruginosa 15, taip pat kitus bakterinius patogenus, tokius kaip augalų patogenai Fusarium graminearum 16 ir Phytophthora infestans 17 . Funkcinių asociacijų, gautų iš įvairios eksperimentinės ir skaičiavimo analizės, integracija leidžia sukurti labai tikslius ir išsamius kofunkcinius tinklus. Vėliau, siekiant palengvinti naujų virusų virulentiškumo ir atsparumo vaistams identifikavimą, naudojamas principas „kaltė pagal asociaciją“, pagal kurį du sujungti genai tinkle gali atlikti tą pačią funkciją. Nors ankstesni bakterinių patogenų funkciniai tinklai buvo patvirtinti skaičiavimo būdu, tačiau nebuvo įmanoma parodyti naujų genų patogeniškumo ir atsparumo vaistams nustatymo eksperimentiniu patvirtinimu. Šiame tyrime pateikiamas P. aeruginosa padermės PAO1, vadinamo PseudomonasNet, genomo masto funkcinis tinklas, kuris nusako 203 118 saitus tarp 5456 genų (~ 98% koduojančio genomo), kurių prognozės buvo patvirtintos eksperimentais. Eksperimentiškai patvirtindami, ar tinkle yra įmanoma identifikuoti naujus virusus ir atsparumą antibiotikams, yra įmanoma. Taip pat parodome, kad atsparumo antibiotikams tinklas „PseudomonasNet“ gali atspindėti kryžminio atsparumo paplitimą, kai geno išmušimas ta pačia kryptimi reaguoja į įvairius vaistus (ty, padidėjusį ar sumažėjusį atsparumą). Šis tinklas taip pat suteikia mechaninių įžvalgų apie atsparumo įvairiems vaistams kompromisą. Siekdami praktiškiau prisidėti prie mokslinių tyrimų bendruomenės, mes taip pat sukūrėme internetinę platformą, skirtą hipotezių generavimui tinkle, kuri, mūsų žiniomis, yra pirmoji tokio pobūdžio P. aeruginosa . Visas čia parodytas tinklo remiamas prognozes galima lengvai atkurti ir pritaikyti daugeliui kitų kliniškai svarbių P. aeruginosa bruožų naudojant papildomą interneto serverį (www.inetbio.org/pseudomonasnet/).

Rezultatai

P. aeruginosa genų kofunkcinio tinklo genomo mastu sukūrimas

P. aeruginosa PAO1 funkcinio tinklo kūrimas yra apibendrintas 1A pav. Ir 1 lentelėje bei išsamiai aprašytas papildomuose internetiniuose metoduose. P. aeruginosa genų poros, veikiančios tuo pačiu keliu, buvo išvestos iš penkių skirtingų tipų P. aeruginosa duomenų: citatos Medline straipsniuose (PA-CC), koekspresija per mikrotraumos eksperimentus (PA-CX), baltymų domenų profiliai (PA-DP), filogenetinių profilių (PA-PG) koreliacija 18 ir bakterinių ortologų (PA-GN) genomo kaimynystė 19 . Be to, remiantis E. coli genų (EC-CC) citatomis, E. coli genų (EC-CX) 21, bakterinių baltymų koekstacija, buvo išaiškintos keturios ortologinėmis funkcijomis pagrįstų asociacijų (asocialogų) 20 rinkiniai 20 baltymų sąveika, gauta atlikus didelio pralaidumo testus (BA-HT), ir literatūros, kuriančios nedidelės apimties analizę, analizė (BA-LC). Šie devyni tinklai buvo integruoti naudojant Bajeso statistinę sistemą 22 . Norėdami nustatyti palyginamus kofunkcinius genų porus, mes panaudojome aukso standartinius P. aeruginosa genų poras, turinčius anotacijas Gene Ontology (GO) biologinio proceso duomenų bazėje 23, kurioje buvo tik 906 P. aeruginosa genai (~ 16% visų 5572 kodavimo). genai) su komentarais, pagrįstais patikimais įrodymais (ty eksperimentiniais ar literatūros duomenimis). Galutiniame integruotame tinkle „PseudomonasNet“ yra 203 118 kofunkcinių ryšių tarp 5456 genų, kurie apima ~ 98% koduojančio genomo. Todėl „PseudomonasNet“ suteikia naujų galimybių daugelio nepatyrusių genų funkcinėms prognozėms.

Image

( A ) P. aeruginosa integruoto bendro funkcinio tinklo kūrimo santrauka. Kofunkciniai ryšiai tarp P. aeruginosa genų buvo gauti iš devynių skirtingų duomenų rinkinių: penkių P. aeruginosa ko-funkcinių tinklų, įskaitant bendra citatą (CC), koekspresiją (CX), baltymų domenų profilių koreliaciją (DP)., bakterinių ortologų (GN) kaimynystė ir filogenetinių profilių (PG) koreliacija bei keturi asocialo logų tinklai, atsirandantys dėl kartu pateiktų ir kartu išreikštų E. coli ortologų ir bakterinių baltymų-baltymų sąveikos. „PseudomonasNet“ buvo sukonstruotas remiantis mašininio mokymosi metodu su etaloninėmis aukso standarto funkcinių genų poromis, kurios dalijasi genų ontologijos biologinio proceso anotacijomis, naudodamos Bajeso duomenų integravimo sistemą. ( B ) Integruotojo „PseudomonasNet“ ir atskirų komponentų tinklų tikslumas buvo įvertintas palyginus su KEGG kelio komentarais. Mes išmatuojome KEGG komentuotų genų porų, turinčių vienodus keliavimo terminus, proporciją kiekvienoje iš 1000 genų porų šiukšlių iš aukščiausio balo. Integruotas tinklas apima maždaug 98% P. aeruginosa koduojančių genų, kurių tikslumas yra didesnis nei visų atskirų komponentų tinkluose, o tai patvirtina duomenų integracijos efektyvumą konstruojant P. aeruginosa genų funkcinį genomo mastelį. ( C ) Tinklo narkotikų taikinių ir esminių genų centrai yra žymiai didesni nei genomo vidurkis, remiantis tiek laipsnio, tiek skirtumo pagrindu pagrįstais balais „PseudomonasNet“, o tai rodo, kad kiti genai, kurių centrinis balas yra aukštas, yra tinkami kandidatai į narkotikų taikinius.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Poriniai devynių komponentų tinklų palyginimai parodė tik nedidelius sutapimus (papildomas S1 pav.), O tai rodo didelį tinklų papildomumą arba netikslumą. Todėl mes įvertinome bendrą „PseudomonasNet“, taip pat atskirų komponentų tinklų kokybę, naudodamiesi genų poromis, kurios dalijasi anotacijomis KEGG kelio duomenų bazėje 24, kuri yra nepriklausoma nuo tinklo mokymui naudojamos genų ontologijos biologinio proceso duomenų bazės. Visi komponentų tinklai parodė gana aukštą KEGG kelio nuorodų tikslumą, o tai rodo, kad maži tinklo sutapimai atsiranda dėl jų papildomumo, o ne netikslumo. Mes taip pat pastebėjome, kad žymiai pagerėjo integruoto „PseudomonasNet“ tikslumas ir genominis aprėptis atskiruose komponentų tinkluose (1 pav. B), o tai rodo, kad tinklas buvo patobulintas integruojant įvairius eksperimentinius ir skaičiavimo duomenis.

Mes taip pat ištyrėme „PseudomonasNet“ topologines savybes. Mes nustatėme, kad visi genai, išskyrus keturis, yra sujungti didžiausiame „PseudomonasNet“ komponente. Pasiskirstymas jungčių skaičiumi parodė, kad „PseudomonasNet“ yra mažo pasaulio tinklas, turintis plataus masto 25 (papildomas S2 pav.), Kurio jungčių pasiskirstymas turi galios dėsnio režimą, po kurio eina eksponentinis uodegos skilimas, kuris yra būdingas globaliai užduoties topologijai. - nuolatiniai socialiniai tinklai (pvz., direktorių valdyba) arba funkciniai baltymų tinklai 26 . Platus laipsnių pasiskirstymo laipsnis gali būti priskiriamas dideliam tinklo moduliškumui, praturtinant grupės viduje (pvz., Kelio viduje) ryšius, o tai reiškia, kad „PseudomonasNet“ nuskaito ryšius tarp genų, priklausančių tiems patiems keliams.

Antimikrobinių vaistų taikiniai labiau tikėtina, kad „PseudomonasNet“ yra pagrindiniai genai

Bakterijų genai, kurie yra kritiški gyvybingumui, paprastai yra sutelkti genų arba baltymų tinkle 27 . Tokie mikroorganizmų stebulės mikrobai, kurie neturi homologų šeimininko genome, yra galimi antimikrobinių vaistų tikslai 28 . Norėdami patikrinti, ar žinomi antibiotikų tiksliniai baltymai yra labiau tikėtini „PseudomonasNet“ centruose, ištyrėme 93 bakterinių baltymų, kurie anksčiau buvo paskelbti kaip antimikrobinių vaistų taikiniai, 73 P. aeruginosa ortologų tinklo centrinės reikšmės balus 29 . Šiai analizei buvo panaudotos dvi skirtingos tinklo centralizacijos priemonės: centralizacijos laipsnis, kai genas, turintis labiau sujungtus kaimynus, laikomas labiau centriniu, ir tarpingumas, kai genas yra trumpiausiu keliu tarp didesnio genų porų skaičiaus. labiau centrinis. Mes pastebėjome žymiai didesnį žinomų antimikrobinių vaistų taikinių tinklo centriškumo pasiskirstymą nei visų P. aeruginosa genų, esančių „PseudomonasNet“ (1 pav. C, P vertė = 2, 2e-16 ir 4, 81e-13 atitinkamai pagal laipsnį ir tarpcentriškumo centrą; Wilcoxon); eiliškumo testas), kuris leidžia manyti, kad „PseudomonasNet“ gali būti naudojamas numatyti naujus mikrobiologinių vaistų tikslus, siekiant sukurti antibiotikus prieš P. aeruginosa. Mes nustatėme, kad esminiai genai 30 taip pat paprastai yra koncentracijos taškai „PseudomonasNet“, o 48 iš 73 tikslinių vaistų (65, 8%) yra būtini genai.

Hipotezės generavimo tinkle algoritmai

Pagrindinis „PseudomonasNet“ kūrimo tikslas buvo suteikti eksperimentiniams biologams prieinamą tyrimų platformą, kad būtų galima sukurti patikrinamą hipotezę apie klinikinės svarbos bruožus. Tokiai hipotezės generavimui mes įdiegėme tris papildomus tinklo paieškos algoritmus: (i) į centrą nukreipta paieška, (ii) į geną orientuota paieška ir (iii) į kontekstą orientuota paieška.

Į kelią nukreipta paieška (2 pav. A) prasideda žinomų kelio ar bruožo genų rinkiniu. Darant prielaidą, kad visi tinkle esantys genai yra funkciškai susieti, tikimės, kad žinomi to paties kelio ar bruožo genai yra sujungti „PseudomonasNet“ tinkle, o papildomi genai, gerai sujungti su žinomais genais, taip pat greičiausiai bus įtraukti į tą patį kelią arba bruožas. Todėl, jei mes žinome dominančio kelio ar bruožo genus, šis paieškos metodas būtų geriausias pasirinkimas hipotezei generuoti. Atvirkščiai, į geną orientuota paieška (2B pav.), Kuri prasideda ne apibūdintu užklausos genu, gali padaryti išvadą apie užklausos geno funkciją ieškant praturtintos funkcijos tarp užklausos geno tinklo kaimynų.

Image

( A ) Į kelią nukreiptoje paieškoje prioritetai teikiami kelio ar bruožo kandidatams genams, sujungiant juos su vartotojo pateiktais sėklos genais. ( B ) Atliekant į geną orientuotą paiešką, prioritetas teikiamas užklausos geno funkciniams terminams (pvz., Genų ontologijos biologinio proceso terminams), pagrįstiems žinomų funkcinių terminų praturtinimu tarp kaimynų. ( C ) Atliekant į kontekstą orientuotą paiešką, prioritetai teikiami gedams kandidatams į kontekstą (pvz., Klinikinę būklę, tokią kaip atsakas į vaistą), kurį atspindi diferencijuoti genai (DEG). Statistinis stebulės geno kaimynų ir DEG ryšys matuojamas tiksliai atliekant vienos uodegos Fišerio testą.

Visas dydis

Kontekstinė paieška (2 pav. C) skiriasi nuo dviejų ankstesnių algoritmų tuo, kad kaip įvestį ji naudoja diferencijuotus genus (DEG). DEG yra specifinio biologinio konteksto molekulinis parašas. Pagrindinė šio algoritmo idėja yra ta, kad jei koncentratoriaus geno kaimynai reaguoja į tam tikrą ląstelės kontekstą, tada koncentratoriaus genas greičiausiai dalyvaus ląsteliniame kontekste. Jei tinklo centrinių kaimynų rinkinys turi reikšmingą klinikinės būklės sutapimą su įvestiniais DEG, galime kelti hipotezę, kad hubo genas yra susijęs su klinikine būkle. Atsižvelgiant į duotus klinikinės būklės raiškos profilius, šis tinklo paieškos metodas suteikia alternatyvų būdą nustatyti naujus genus, susijusius su patogeniniais požymiais, tokiais kaip atsparumas antibiotikams.

Įdiegėme visus tris tinklo paieškos algoritmus papildomame interneto serveryje į „PseudomonasNet“ (www.inetbio.org/pseudomonasnet). Pvz., Žiniatinklio serveris pateikia imtuvo veikimo charakteristikų (ROC) kreivę, nurodančią vartotojo įvestų genų gavimo greitį naudojant „PseudomonasNet“. REG analizės KEGG keliuose rodo, kad „PseudomonasNet“ labai gerai prognozuoja daugelį ląstelių procesų (papildomas S3 pav.). Mes taip pat ištyrėme P. aeruginosa specifinių duomenų indėlį į kelio prognozavimą, išbandydami tinklą, kuriame nėra nuorodų, gautų tik iš kitų bakterijų duomenų (1 lentelės EC-CC, EC-CX, BA-HT, BA-LC). Mes nustatėme, kad tik iš „Psedomonas“ išvestų nuorodų tinklas, kuriame yra 157 395 nuorodos (~ 77, 5% „PseudomonasNet“), yra labai nuspėjamas tais pačiais KEGG keliais, bet ne tiek, kiek „PsedomonasNet“, kurie rodo, kad reikšminga P numatomosios galios dalis P aeruginosa keliai atsirado iš jungčių, gautų iš E. coli ir kitų bakterijų rūšių. Žemiau parodysime, kaip šie tinklo paieškos algoritmai naudojami numatant naujus virusų virulentiškumo ir atsparumo antibiotikams genus. Visus šio rankraščio numatymus vartotojai gali atkurti pateikdami įvesties duomenų pavyzdžius, esančius žiniatinklio serveryje.

„PseudomonasNet“ prognozuoja naujus su virulencija susijusius genus

Be to, kad buvo aprašytas aukščiau aprašytas „PseudomonasNet“ numatomosios galios skaičiavimas, siekėme eksperimentiškai patvirtinti jo naudingumą numatant naujus genus, susijusius su infekcija, susijusiais su P. aeruginosa bruožais. Nors P. aeruginosa yra žmogaus patogenas, jo virulentiškumo veiksniai taip pat yra veiksmingi citotoksiškumui įvairiems infekcijos šeimininkams, įskaitant pelę 9, nematodą 31 ir 32 augalą. Neseniai atliktame viso genomo atrankos tyrime, kuriame kaip infekcijos šeimininkas buvo naudojamas Caenorhabditis elegans , nustatyta, kad 41 P. aeruginosa PA14 padermės genas daro įtaką virulencijai 33 . Ortologai 38 iš šių 41 PA14 genų, susijusių su virulentiškumu, yra PAO1 (papildoma S1 lentelė). Šie ortologai gali būti naudojami kaip sėkliniai genai, norint gauti daugiau virulentiškumo susijusių genų, susijusių su PAO1, naudojant „PseudomonasNet“.

Pirmiausia išmatuojome „PseudomonasNet“ numatomą 38 genų, susijusių su virulencija, galią. Darant prielaidą, kad tikslus funkcinis tinklas su gerai sujungtais funkciškai darniais genais, mes tikimės, kad virulentiškumo genai bus aukšti, kai įvertinimas bus pagrįstas ryšiu su žinomais virulentiškumu susijusiais genais. Imtuvų, apibūdinančių virulentiškumu susijusius genus, eksploatacinių charakteristikų (ROC) analizė, kurią galima apibendrinti pagal plotą po ROC kreivės (AUC) balais, gaunamas 0, 85 balas. Šis balas rodo, kad „PseudomonasNet“ labai prognozuoja C. elegans virulentiškumą. Todėl galime tikėtis, kad kiti genai, labai susiję su 38 virulentiškumo genais, taip pat yra stiprūs kandidatai.

Pirmenybę teikėme PAO1 genais, naudodamiesi į kelią nukreipto paieškos algoritmu (žr. 2A pav.) „PseudomonasNet“ žiniatinklio serveryje, kaip įvesties duomenis naudodami 38 virulentiškumo genus. Remdamiesi galimybe atlikti transpozonų įterpimo mutantus tolesnei eksperimentinei analizei, atrinkome 27 genus iš aukščiausio rango kandidatų. Norėdami patvirtinti, ar atrinkti genai yra susiję su P. aeruginosa virulencija, mes ištyrėme kiekvieno geno sutrikimo poveikį bakterijų virulencijai C. elegans atžvilgiu . Mes stebėjome kirminų (n = 90), maitinamų kiekvienu mutantu, išgyvenamumą. PAO1 maitinamų C. elegans N2 kirminų vidutinė gyvenimo trukmė buvo 8, 38 ± 0, 40 dienos (3A pav., Juoda linija), tuo tarpu N2 kirminų, maitinamų standartiniu E. coli OP50 kamienu, gyvenimo trukmė buvo 11, 08 ± 0, 47 dienos (3A pav., Žalia linija). ). Tarp 27 patikrintų genų šešių genų sutrikimas reikšmingai pakeitė C. elegans N2 išgyvenamumą, palyginti su kirminais, maitinamais laukinio tipo PAO1 ( p-reikšmė <0, 05 pagal log-rank testą, papildoma S2 lentelė). Nustatyta, kad trys iš šių genų, PA0996 ( pqsA ), PA0999 ( pqsD ) ir PA3478 ( rhlB ), teigiamai reguliuoja PAO1 virulentiškumą. C. elegans išgyvenamumas žymiai padidėjo maitinant kiekvieną iš šių mutantų (3 pav. A, mėlynos linijos). „ PqsAD“ genai yra penkių genų operono komponentai, dalyvaujantys gaminant „Pseudomonas Quinolone Signal“ (PQS) - molekulę, tarpininkaujančią P. aeruginosa kvorumo jutimui (QS) 34, 35, 36 . RhlB genas koduoja ramosnosiltransferazės subvienetą. Pabrėžtina , kad rhlB genas yra greta rhlR - geno, kuris koduoja pagrindinį QS reguliatorių 37 . Nors anksčiau buvo apibūdinta, kad šie genai yra susiję su virulencija, jų akivaizdus vaidmuo C. elegans infekcijos modelyje nebuvo pripažintas ankstesniame viso genomo atrankos tyrime 33 . Todėl pagrįsta teigti, kad tinklu paremtas požiūris gali papildyti genetinę atranką, kuri kartais patiria klaidingą neigiamą identifikavimą.

Image

( A ) C. elegans, maitinto laukinio tipo E. coli OP50 ir kiekvienu iš šešių PAO1 mutantų, išgyvenimo kreivė. Vidutinis kiekvieno štamo 90 kirminų išgyvenimo laikas dieną yra nurodytas skliausteliuose. Trims mutantams, palyginti su laukinio tipo PAO1, išgyvenamumas (raudonos linijos) žymiai padidėjo (mėlynos linijos), tuo tarpu kitiems trim mutantams žymiai sumažėjo išgyvenamumas (raudonos linijos). Skirtumo laipsnis buvo statistiškai reikšmingas abiem atvejais, kaip nustatyta pagal log-rank analizę ( P <0, 05). ( B ) Parodytos laukinio tipo PAO1 ir keturių mutantų su ceftazidimu disko difuzijos anti-diagramos. Filtravimo diskai su didėjančia ceftazidimo koncentracija (kaip nurodyta viršuje) buvo dedami į LB agaro lėkšteles ir pasėjami nurodytais bakterijų kamienais. Po augimo per naktį buvo vizualizuotos išvalytos slopinimo zonos. Skaičiai po disko plokštelėmis rodo slopinimo zonos skersmenį (mm).

Visas dydis

Trijų kitų genų ( PA2553 , PA3329 ir PA3972 ) sutrikimai sąlygojo padidėjusį P. aeruginosa PAO1 virulentiškumą C. elegans (3A pav., Raudonos linijos). C. elegans išgyvenamumas žymiai sumažėjo, kai kirminai buvo šeriami kiekvienu iš šių trijų mutantų. Šis poveikis buvo pats reikšmingiausias PA2553 geno mutacijai; kirminų, maitintų šiuo mutantu, vidutinė gyvenimo trukmė buvo trumpesnė nei septynios dienos. Šių genų funkciniai vaidmenys nėra aiškiai apibrėžti. Norėdami ieškoti funkcinių užuominų apie šiuos naujus neigiamus virulencijos reguliatorius, „PseudomonasNet“ žiniatinklio serveryje panaudojome į geną orientuotą paieškos algoritmą (žr. 2B pav.), Kuriame kandidato GO biologinio proceso terminai yra prioritetiniai užklausos genui pagal jų praturtinimą. užklausos geno tinklo kaimynai. Genetiškai orientuotos PA2553 ir PA3972 paieškos numatė „fenilacetato katabolinius procesus“ trijuose svarbiausiuose su kandidatu susijusiuose keliuose (papildoma S3 lentelė). Anksčiau buvo pranešta, kad fenilacetato katabolinis kelias reikalingas Burkholderia cenocepacia , kuris yra dar vienas oportunistinis cistinės fibrozės patogenas, virulentiškumui C. elegans šeimininko modelyje 38 . Visi šie duomenys rodo, kad PA2553 ir PA3972 taip pat yra susiję su C. elegans virulencija šiuo metabolizmo keliu. Į geną orientuota PA3329 paieška numatė „kvorumo jutimą“ kaip trečiąjį kandidato kelią ir „fenazino biosintezės procesus“ kaip aštuntą vietą užimančią GO biologinio proceso sąvoką. Anksčiau buvo pranešta, kad fenazinas yra signalinis faktorius P. aeruginosa 39 kvorumo jutimo tinkle. Taigi į geną orientuotos paieškos ataskaita rodo, kad PA3329 mutacija padidina C. elegans šeimininko virulentiškumą moduliuodama fenazino biosintezę, kuri tarpininkauja kvorumo jutimui. Šie rezultatai kartu parodo į geną orientuoto paieškos metodo naudingumą nustatytų genų, susijusių su klinikiniais požymiais, molekuliniams mechanizmams.

„PseudomonasNet“ prognozuoja naujus genus atsparumui antibiotikams

Tada mes ištyrėme, ar tinklinis tardymas gali nustatyti genus, susijusius su atsparumu antibiotikams, o tai yra svarbus P. aeruginosa, kaip pagrindinio nosokominio patogeno, bruožas. Norėdami numatyti genus, susijusius su atsparumu antibiotikams, mes panaudojome į kontekstą orientuotą paieškos algoritmą (žr. 2C pav.), Kuriame kaip įvesties duomenys naudojami DEG. Prognozavome genus, susijusius su atsparumu ceftazidimui, naudodamiesi 325 PAO1 genais, kurie, kaip nustatyta, buvo diferencijuoti, reaguojant į gydymą ceftazidimu (250 ng / ml) ( P -vertė <1, 0e-5) 40 . Remdamiesi į kontekstą orientuota paieška „PseudomonasNet“ atrinkome 30 genų iš geriausių kandidatų, remdamiesi transposono įterpimo mutantų prieinamumu, ir ištyrėme kiekvieno geno delecijos poveikį jautrumui ceftazidimui. Pažymėtina, kad keturi skirtingi mutantai, kuriuose buvo inaktyvuotas PA1556 , PA4067 , PA0511 arba PA0510 genas, parodė padidėjusį ceftazidimo atsparumą. Palyginti su ceftazidimo MIC plataus tipo PAO1 padermėse, kiekvienos iš šių mutantų minimalios slopinamosios koncentracijos (MIC) vertės padidėjo daugiau nei 3 kartus (papildoma S4 lentelė). Laikantis šio rezultato, padidėjęs atsparumas ceftazidimui buvo matomas disko difuzijos tyrime, kai buvo sutrikdytas kiekvienas iš šių keturių genų (3 pav. B).

Mes naudojome į geną orientuotą paieškos algoritmą „PseudomonasNet“ žiniatinklio serveryje, kad ieškotume keturių naujų genų, susijusių su atsparumu ceftazidime, funkcinių įkalčių (žr. 2B pav.). Įdomu tai, kad visi keturi genai buvo numatyti kaip „pirmtakų metabolitų ir energijos generavimo“ kategorija, kaip su pagrindiniais kandidatais susiję būdai (papildoma S5 lentelė). PA0510 ir PA0511 greičiausiai dalyvauja hemo biosintezėje, tuo tarpu PA1556 koduoja citochromo oksidazės subvienetą. Pranešama, kad kaip pagrindinis išorinės membranos baltymas OprG, kurį koduoja PA4067 , dalyvauja geležies pasisavinime 41 . MIC tyrimo metu buvo pastebėta, kad PA4067 , PA0510 ir PA0511 genų mutacijos lėmė bakterijų augimą, palyginti su laukinio tipo PAO1 kamienu. Po statinės naktinės kultūros LB, šių trijų mutantų OD 600 vertės buvo maždaug 87% laukinio tipo PAO1 padermės vertės (duomenys nepateikti). Šis rezultatas dar rodo, kad jautrumas antibiotikams yra glaudžiai susijęs su bakterijų augimo greičiu 42, 43 . Dar svarbiau yra tai, kad mūsų tinklo teikiamos funkcinės prognozės davė genų, parodančių nuoseklius fenotipus tam tikrame kontekste, rinkinį.

„PseudomonasNet“ aprašo kryžminio atsparumo paplitimą ir pateikia mechanistines įžvalgas apie atsparumo skirtingiems vaistams kompromisą.

Siekdami išplėsti savo tinklinį tyrimą, kad apimtų atsparumo antibiotikams sistemą, sukūrėme antibiotikams atsparių genų tinklą prieš kelis vaistus, pagrįstą „PseudomonasNet“. Iš ankstesnių tyrimų buvo surinkti 372 PAO1 genai, dalyvaujantys reguliuojant atsparumą šešiems skirtingiems antibiotikams: ceftazidimas 44, ciprofloksacinas 45, imipenemas 44, meropenemas 44, polimiksinas B 46 ir tobramicinas 47, 48 (papildoma S6 lentelė). Kiekvieno geno mutacinio poveikio atsparumui antibiotikams kryptis buvo nustatyta atsižvelgiant į atsparumo vaistams pokyčius po geno suirimo. Kiekvieno geno inaktyvacija padidino arba sumažino atsparumą vaistams, o tai rodo, kad kiekvienas genas reguliuoja atsparumą vaistams bet kuria kryptimi. Genai, kurie, kaip nustatyta, turi įtakos kiekvieno vaisto atsparumui kiekviena kryptimi, yra moduliniai ir labai nuspėjami „PseudomonasNet“, tai rodo aukšti AUC rodikliai (papildoma S6 lentelė). Į mūsų atsparumo antibiotikams sistemos tyrimą taip pat įtraukėme keturis naujai identifikuotus genus, kurių mutacija padidina atsparumą ceftazidimui - PA1556 , PA4067 , PA0511 arba PA0510 . „PseudomonasNet“ jungia 339 unikalius antibiotikams atsparius genus į didžiausią komponentų tinklą, kuris toliau bus vadinamas „atsparumo antibiotikams tinklu“. Stebėjome, kad atsparumo antibiotikams tinklas yra padalintas į dvi tinklo bendruomenes, kiekviena iš jų atitinka mutacinio poveikio vaistams atsparumo kryptį: genai, kurių inaktyvacija sukelia padidėjusį atsparumą (raudona), ir genai, kurių inaktyvacija lemia sumažėjusį atsparumą (mėlyna spalva) (pav. .4A). Mazgo dydis yra proporcingas antibiotikų, kurių atsparumui įtakos turi genų pertraukimai, skaičiui. Norėdami atlikti kiekybinę genų moduliarumo analizę kiekvienai mutacinio poveikio vaisto pasipriešinimui krypčiai, mes sugalvojome balą, pagal kurį būtų galima įvertinti sukibimą su bet kuria genų grupe (išsamesnės informacijos žr. „Metodai“). Mes patvirtinome, kad antibiotikams atsparūs genai žymiai labiau prilimpa prie kitų genų, turinčių tą pačią mutacinio poveikio kryptį (atitinkamai P = 6, 49e-11 ir P = 4, 29e-13 genų, kurių padidėjęs ir sumažėjęs atsparumas vaistams išmušimo metu; pasirašė Wilcoxon). rango testas, 4B pav.). Šie rezultatai rodo, kad P. aeruginosa atsparumo antibiotikams sistemos turi modulines genetines organizacijas, skirtas atskiriems vaistams, taip pat kiekvienai mutacinio poveikio rezistencijai krypčiai, o tai paaiškina kryžminio atsparumo paplitimą, kai geno nokautas veikia atsparumas keliems vaistams su ta pačia poveikio kryptimi.

Image

( A ) Parodytas 339 antibiotikams atsparių genų, pagrįstų „PseudomonasNet“, tinklas. Mėlyni mazgai žymi genus, kuriuose atsparumas antibiotikams sumažėja išmušant (ty, teigiamas atsparumo antibiotikams reguliavimas), o raudoni mazgai - genai, kuriuose atsparumas antibiotikams padidėja išstūmimu (ty neigiamas atsparumo antibiotikams reguliavimas). Geltoni mazgai žymi genus, parodančius atsparumo įvairiems antibiotikams kompromisą. Mazgo dydis yra proporcingas antibiotikų, kurių atsparumą keičia geno pertraukimas, skaičiui. ( B ) Genų, turinčių kiekvieną mutacijos efektą, prilipimas prie tos pačios kryptinės genų grupės „PseudomonasNet“. Langeliai ir klaidų juostos parodo atitinkamai kiekvienos genų grupės vidutinio sukibimo balo ir standartinio nuokrypio pasiskirstymą. ( C ) Normalizuoti dviejų genų grupių, skirtų skirtingoms mutacinio poveikio kryptims, sujungimo taškai yra pavaizduoti kaip juostos, išsikišančios į priešingas puses: dešinėje tiems, kurie sumažina atsparumą antibiotikams išmušimo metu, ir kairėje toms, kurios padidina atsparumą antibiotikams išmušimo metu. Jei duotas genas sąveikauja su kitais genais, turinčiais tą pačią kiekvieno vaisto mutacinio poveikio kryptį, tada tikimasi, kad mėlynos juostos išsikiša į dešinę, o raudonos juostos - į kairę. Žvaigždutės simbolis (*) žymi genus, turinčius prilipimą prie tos pačios mutacijos efekto krypties. Paaiškėjo, kad paryškinti genai keičia savo sąveiką tarp mutacinio poveikio krypčių skirtingu gydymu antibiotikais. ( D ) Parodytas genų, keičiančių jų sąveiką tarp mutacinio poveikio krypčių skirtingomis antibiotikų sąlygomis, skaičiaus pasiskirstymas 1000 atsitiktinių imčių tinklų.

Visas dydis

Atsparumas antibiotikams taip pat apima 17 genų, dalyvaujančių abiem mutacijos efekto kryptimis (geltoni tinklo mazgai 4A pav.), Parodantys nereikšmingą abiejų mutacinio poveikio krypčių laikymąsi ( P = 0, 1075 pagal Wilcoxon pasirašytą rango testą, 4B pav.) ). The direction of mutational effect of these genes depends on the antibiotic that is used for treatment. We categorised these genes as those involved in the trade-off in resistance. Interestingly, the genes that show this trade-off in resistance are located between the two network communities for the two directions of mutational effect. Based on this network topology, we hypothesised that these genes change their directions of mutational effect for different drugs by switching interaction partners between the two groups of genes, whose mutations decrease resistance and those increase resistance. To test this hypothesis, we analysed the interaction-bias of these 17 genes towards genes for the same direction of mutational effect under different drug conditions (see Methods for details). We found that 13 of these 17 genes have connections to both groups of genes in the network of 339 antibiotic-resistant genes. From the interaction-bias analysis, we found that six ( PA0338, PA2023, PA4222, PA4223, PA4748 , and PA5000 ) of these 13 genes (46%) switch their interaction-bias towards the same direction of mutational effect between different drug conditions (Fig. 4B), which is a significant observation compared with those by randomised networks ( P-value = 0.01 by permutation test using 1, 000 randomised networks) (Fig. 4C). These results demonstrate that PseudomonasNet can facilitate the study of the underlying biology for the resistance of P. aeruginosa to different antibiotics.

Diskusija

The genetic system of the human opportunistic bacterial pathogen P. aeruginosa is highly complex, which enables P. aeruginosa to be robust and adaptable under many host and drug conditions. Functional gene network models have been utilised to facilitate the genetic dissection of complex traits such as human diseases 49 . Although bacteria are single-celled organisms, screening for their virulence and antibiotic resistance generally uncovers many associated genes. Moreover, the subset of these genes that form the network for clinically important traits varies across different infection conditions. To explore the large genetic search space for pathogenicity and antibiotic resistance in P. aeruginosa , a research platform for the systematic dissection of the genetic components of complex traits is needed. In this study, we presented a genome-scale functional network of P. aeruginosa genes, and demonstrated the feasibility of network-assisted gene identification for virulence and antibiotic resistance with experimental validation. We used two different network-assisted search algorithms to predict candidate genes for clinically important traits: the pathway-centric search, which starts with known genes for a pathway or trait, and the context-centric search, which starts with DEGs for a clinical condition. We achieved ~22% (6/27) and ~13% (4/30) discovery rates for genes involved in virulence within the C. elegans host and ceftazidime resistance, respectively. These discovery rates are ~32-fold and ~13-fold more effective than unbiased genome-wide screens for the genes involved in virulence within C. elegans (38/5572 = 0.68%) and ceftazidime resistance (55/5572 = 0.99%), respectively. Therefore, if some genes for virulence have already been identified from initial unbiased genome-wide screens, then it would be more effective to experimentally test only the candidates predicted from the pathway-centric search option of the web server using the seed genes identified from the screen than to repeat the same genome-wide screen. Similarly, if we have gene expression data for a condition related to a clinical trait, then the context-centric search would be a cost-effective approach for the next round of screen.

PseudomonasNet revealed the functional communities of genes for each direction of mutational effect on antibiotic resistance across multiple drugs. Thus, the antibiotic resistance network suggest that direction of mutational effect on drug resistance is regulated by pathways rather than individual genes, and explains the frequently observed cross-resistance of P. aeruginosa genes to multiple drugs via the high functional coherence for each direction of mutational effect. In addition, PseudomonasNet provides mechanistic insights into the trade-off in resistance to different drugs by showing a switch in the interaction-bias towards genes with the same direction of mutational effect on different drugs. These results demonstrate the value of genome-scale functional networks to study the underlying mechanisms of multi-drug resistance in pathogenic microbes.

Functional networks map co-functional relationships between genes, which do not necessarily indicate specific underlying mechanisms for the functional associations. For example, co-cited genes are likely to be functionally coupled, albeit no clue whether they interact directly or indirectly. Functional networks are therefore inherently limited for the study of underlying molecular interactions for the phenotypes such as bacterial pathogenicity. However, as demonstrated in this study, combined use of the functional network in prioritizing candidate genes and loss-of-function analysis will accelerate discovery of new genetic components of bacterial pathogenicity. Investigation of specific molecular mechanisms of their involvement in the pathogenicity may need additional computational and experimental tools.

Recently, studies of the molecular evolution of P. aeruginosa that have sequenced bacterial clones isolated from patients have identified genes that show parallel evolution; these genes are suggested to be critical to host adaptation 50 . This sequencing-based approach has been applied to cancer genomes, which has uncovered several cancer gene candidates based on the mutation frequency among patients. However, these studies have revealed that somatic mutations in cancer genes occur in only a minority of patients 51, which suggests that the ability to identify cancer genes from mutational information is limited. A sequencing-based approach to study clinically important traits such as the virulence and drug resistance of bacterial pathogens in patients may suffer from similar limitations in the future. Cancer genomics now employ pathway and network approaches to analyse somatic mutation data derived from patients 52 . Similarly, the analysis of mutation data from pathogenic bacterial strains isolated from patients could benefit from these pathway and network approaches. For example, identification of subnetworks enriched for mutations among drug resistance strains may reveal genes or pathways that drives antibiotic resistance. Thus, genome-scale functional networks for these pathogenic microbes, such as PseudomonasNet, may be a useful resource for pathway and network approaches in the future analysis of clinical microbial genomics data.

P. aeruginosa is a versatile organism with a robust capability to adapt to diverse growth conditions. Microarray-based whole-genome typing indicates that P. aeruginosa strains, regardless of whether they are recovered from the environment or a patient, possess a highly conserved genome 53 . Inside the airway mucus layer of patients with cystic fibrosis, P. aeruginosa strains with mutations in the mucA gene, which encodes an anti-sigma factor 1, and lasR , a gene involved in QS 54, have been isolated. Together, these results suggest that P. aeruginosa can increase its survival fitness by selectively acquiring or losing only a small number of regulatory genes rather than by a larger degree of genome rearrangement. PseudomonasNet will be useful to explore the physiological consequences of a defined gene mutation, which may be detected in certain clinical isolates from patients with significant disease symptoms.

PseudomonasNet has proved its prediction power as described in the present study. Massive amount of genomics data generated by next generation sequencing in coming years can be incorporated into the current network by retraining and will potentially improve predictions. We anticipate that PseudomonasNet will accelerate the functional annotation of unknown genes as well as expand our understanding of clinically important traits of P. aeruginosa , which may lead to the development of novel antibiotics or anti-virulence therapies in the future.

Metodai

Sequences and functional annotation data for Pseudomonas aeruginosa

The genome sequence and 5, 572 protein-coding genes for P. aeruginosa PAO1 were downloaded from the Pseudomonas Genome Database 55, and the reference functional annotation data for P. aeruginosa were downloaded from Gene Ontology 23 .

Construction of PseudomonasNet

Co-functional links were inferred from nine distinct data types (see Table 1) using machine learning methods, and then integrated into PseudomonasNet using a Bayesian statistical framework. A detailed description of the network construction is provided in the Supplementary Online Methods.

Network visualisation and centrality analysis

All network visualisations are performed on Cytoscape software 56 with the organic layout option. The degree centrality for gene t represents the number of genes that have a direct link with gene t. The betweenness centrality for gene t ( B t ) is calculated as:

Image

Eq. (1), σ jk represents the number of shortest paths between node j and node k , and σ jk ( t ) represents the number of shortest paths between node j and node k that pass through node t . The edge weight score is ignored when calculating the betweenness centrality.

Adherence score and interaction-bias analysis

For the given network of genes involved in antibiotic resistance, we calculated the adherence of gene t to genes with increased or decreased resistance to drug d by knockout ( AI d ( t ) or AD d ( t ) respectively) by the following equations:

Image

Image

In eqs (2) and (3), NI and ND represent the number of neighbours with increased and decreased resistance by knockout, respectively, and SI and SD represent the number of genes with increased and decreased resistance by knockout, respectively. For a given drug d , naïve adherence scores

Image
ir
Image
need to be normalized by the ratio of SI and SD
Image
ir
Image
, respectively, to account for the difference in the total number of antibiotic resistance genes among drugs.

We determined whether gene t switches interactions between directions of mutational effect in different drugs using the following criteria: i) if t increases the resistance to d by knockout and

Image
or ii) if t decreases the resistance to d by knockout and
Image
.

Virulence test in C. elegans , MIC determination, and disc diffusion assay

Virulence tests were performed following procedures that have been described previously 57 . In brief, 10 μl each of overnight-grown bacterial culture was spotted on Nematode Growth Medium (NGM) agar plates. After incubation for 2 h at room temperature, each plate was seeded with 10 adult hermaphrodite worms (nine replicates per trial) and incubated at 20 °C. Viability of worms was monitored every 24 hr and live worms were transferred to fresh NGM plates every 48 hr to exclude the newborn larvae. PAO1 was used as a control. The MIC test and disc diffusion assay were performed as described previously 58 .

Papildoma informacija

How to cite this article : Hwang, S. et al. Network-assisted investigation of virulence and antibiotic-resistance systems in Pseudomonas aeruginosa . Mokslas. Rep. 6, 26223; doi: 10.1038/srep26223 (2016).

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.