Tinkliniai proteominiai metodai atskleidžia neurodegeneracinius, neuroprotekcinius ir su skausmu susijusius mechanizmus, susijusius su aksonų retrogradiniais pažeidimais | mokslinės ataskaitos

Tinkliniai proteominiai metodai atskleidžia neurodegeneracinius, neuroprotekcinius ir su skausmu susijusius mechanizmus, susijusius su aksonų retrogradiniais pažeidimais | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių mirtis nervų sistemoje
  • Nervų sistemos ligos

Anotacija

Neurodegeneraciniai procesai vyksta prieš neuronų disfunkciją ir sinapsių atsijungimą. Stuburo motoneurono (MN) somos ir sinapsinio taikinio atsiribojimas sukelia degeneracinį retrogradinį procesą arba regeneracinę reakciją, atsižvelgiant į traumos artumą tarp kitų veiksnių. Išskirtiniai pagrindiniai įvykiai, susiję su vienokiais ar kitokiais procesais, gali duoti užuominų į naujus terapinius metodus, pagrįstus endogeninių neuroprotekcinių mechanizmų stiprinimu. Šaknies mechaninis sukibimas lemia MN degeneraciją atgal, tačiau pasitaiko bendri pradiniai molekuliniai mechanizmai, kurių regeneracinis procesas prasideda distalinės aksotomijos ir susiuvimo metu. Praėjus 7 dienoms po traumos, pagrindiniai molekuliniai įvykiai pradeda skirtis ir ženklinti kiekvieną likimą. Šiems paradams apibrėžti mes naudojome palyginamąją nešališką proteomiką, kartu pateikdami naują, tinklu pagrįstą analizę, kad gautume biologinę prasmę. Procedūra suponavo ankstesnės kartos kombinuotos topologinės informacijos, gautos iš rankiniu būdu kuruojamų 19 susijusių biologinių procesų, palyginimą su baltymų sąrašu, naudojant genų praturtinimo analizės įrankius. Nauji ir netikėti rezultatai leido manyti, kad motoneurodegeneracija geriau paaiškinama daugiausia tuo, kad kartu suaktyvinamos anoikio, antiapoptotinės ir neuropatinio skausmo programos. Atvirkščiai, endogeniniai neuroprotekciniai mechanizmai, veikiantys po distalinės aksotomijos, apėmė specifiškai gana anti-anoikines ir selektyvias autofagijas. Diskusijoje pabrėžiami patvirtinti baltymų mazgai ir procesai.

Įvadas

Aksonų sužalojimai dažnai lemia nuolatinį gyvybinių neuronų funkcijų praradimą, atsirandantį dėl nervų atrofijos ir mirties retrogradinio proceso. Šis reiškinys stebimas akivaizdžiai skirtingais atvejais, tokiais kaip neurodegeneracinės ligos, kai nesveiko neurono aksonas išsigimsta per keletą mėnesių iki sumušimo arba po ūminių periferinių nervų ligų ar traumos. Visų pirma, trauminę nervų aksotomiją ar mechaninį sukibimą (sužalojimą) sukelia eismo įvykiai ar darbas bei sportinė veikla arba dėl akušerinių komplikacijų, sukeliančių sunkius negrįžtamus funkcijos sutrikimus ir (arba) monoplegiją 1 . Šiuos pažeidimus sudėtinga atkurti chirurginiu būdu, nes nėra proksimalinio nervo kelmo, atitraukiant jo galus. Atlikus sėkmingą pakartotinę implantaciją, perorientuojant kitus nervus, gaunamas nedidelis funkcijos atsistatymas 2, 3 . Šaknų sužalojimas taip pat dažnai sukelia ankstyvą deferentacijos skausmą, kuris gali išsivystyti į centrinę sensibilizaciją ir stiprų neuropatinį skausmą. Ši skausminga būsena paprastai nėra atspari farmakoterapijai. Nugaros smegenų nugarinio rago centrinė sensibilizacija yra susijusi su neuronų padidėjusiu jautrumu ir gleivinės imunoreaktyvumo padidėjimu 4 . Kaip ūmus sužalojimas virsta lėtiniu skausmu, išlieka ilgai neišspręstas klausimas, turintis svarbią medicininę reikšmę. Eksperimentiškai galime atkurti trauminį šaknies užpultą, sukeliantį nuo laiko priklausomą maždaug 80% motoneurono (MN) praradimą per pirmąjį mėnesį po sužalojimo 5 . Pakartotinai pranešta, kad retrogradinė degeneracija priklauso nuo keleto veiksnių, tokių kaip amžius, sužalojimo regionas (gimdos kaklelis ir juosmens sritis), tirtų gyvūnų rūšys (žiurkė ir pelė) ir aksonų sužalojimo atstumas iki somos. Poveikis yra sunkesnis, jei aksotomija įvyksta arčiau somos, pavyzdžiui, po šaknies užpylimo (RA modelis). Atvirkščiai, distalinio nervo aksotomija ir siūlė lemia MN išgyvenimą ir aksonų regeneraciją (distalinės aksotomijos (DA) modelis) 6. Nepaisant pastarojo meto pažangos, molekuliniai mechanizmai, lemiantys retrogradinę MN degeneraciją, toli gražu nėra aiškūs. Neatrodo, kad suaugę MN miršta dėl apoptozės, kaip tai daro naujagimių neuronai po šaknies užsiplieskimo. Tačiau tai vis dar ginčytinas dalykas ir kiti autoriai spėja, kad jie gali mirti nekrozę. 7, 8, 9, 10, 11 Pastaraisiais metais, norėdami sužinoti daugiau apie šį neurodegeneracinį procesą, surinkome vis daugiau įrodymų, kad RA ir DA sukėlė pradinius pradinius molekulinius įvykius, kurie pradeda skirtis nuo 7 dienų po sužalojimo (dpo). Šiems skirtingiems įvykiams būdingas nesubalansuotas išgyvenamumo skatinimo mechanizmų atsakas, pavyzdžiui, atsakas į išskleistus baltymus ar autofagiją 11 . Vis dėlto neaiški klausimai, kaip miršta MN ir kuriais mechanizmais. Be to, nepavyko sužinoti apie endogeninį mechanizmą, kurį suveikė distaliniai aksotomizuoti MN, kad jie galėtų išgyventi. Šiame rankraštyje mes pateiksime viso tinklo baltymų analizę, skirtą atskleisti šiuos mechanizmus, kurių svarba taip pat aptariama traumų terapijoje.

Rezultatai

Iš pradžių atlikome etiketės neturinčią proteominę analizę, leidžiančią išsiaiškinti tiek kiekybinius, tiek kokybinius skirtumus žiurkių RA ir DA modeliuose, atliktuose sėdynės nerve. Septynios dienos po sužalojimo buvo tikslus laikas, kai abiejuose modeliuose signalizacijos mechanizmas pradėjo skirtis, nurodydamas skirtingą pabaigą regeneracijos arba degeneracijos atžvilgiu 11 . LC-MS / MS analizė citozolinių frakcijų iš stuburo smegenų L4 – L5 segmentų iš viso nustatė 1420 baltymų su mažiausiai dviem peptidais iš baltymo (papildoma S1A lentelė). Iš viso 439 ir 481 baltymas arba peptidas buvo reikšmingai pakitę dėl DA ar RA kontrolės (p <0, 05) (atitinkamai S1B ir S1C lentelės). Norėdami atskirti neurodegeneracinius procesus iš endogeninių neuroprotekcinių programų, kurios gali būti suaktyvintos vienu metu, mes palyginome abu tipus dėl traumų tarp jų ir nustatėme, kad tarp 567 skirtingų baltymų (papildoma S2A lentelė), 109 buvo nustatyta, kad unikalūs gali būti keičiami tik po DA, o 148 pasirašė RA procesą (atitinkamai papildomos S2B ir S2C lentelės). Pabandėme šių unikalių baltymų funkcinį komentavimą naudodamiesi DAVID anotavimo įrankiu, kuris leido nustatyti svarbiausias biologines funkcijas duomenų rinkinyje (FDR <0, 05). Visų pirma, regeneracinio kurso metu, ląstelių komponentai buvo susieti su: apvalkalu, turinčiu t-komplekso (66% sodrinimo) ir SNARE komplekso (27%), taip pat su mikrotubulų citoskeletu (4, 3%) ir neuronų projekcija (3, 9%). Atvirkščiai, unikalūs baltymai degeneraciniame procese buvo susiję su ribosoma (41%) ir vertimo mechanizmais (41%). Abu modeliai buvo bendri tuo, kad labiausiai apibūdinti biologiniai keliai buvo susiję su ribosomų (KEGG # ko03010) keliais (dalyvavo 16 baltymų iš 73). Įdomu tai, kad rankinė kuratoriaus analizė atskleidė, kad 15 baltymų tarp šių parašų buvo fermentai, susiję su amino rūgščių, riebalų rūgščių ar citratų ciklų metabolizmais, pavyzdžiui, dihidrolipoamido s-sukciniltransferazė, riebalų rūgščių sintazė ar malato dehidrogenazė.

Nors informatyvūs, genų ontologijos (GO) terminai ir KEGG takų praturtėjimo analizės buvo sunkiai interpretuojami iš patofiziologinės perspektyvos, nes jie apibūdina bendruosius molekulinius procesus, būdingus daugeliui kitų sutrikimų. Taigi, mes sukūrėme skaičiavimo analizės darbo eigą, skirtą aiškinti visuotinę baltymų gausą, remiantis kuruotų biologinių tinklų, susijusių su aksonų sužalojimais, generavimu ir užpakalinės GSEA analize. Pirminis pagrindinių baltymų (sėklų), susijusių su molekuliniais procesais, galinčiais dalyvauti neuronų reakcijose į aksonų pažeidimus, sąrašas buvo išspausdintas literatūros tyrimais. Didelis kiekis kelių ir baltymų kompleksų yra susijęs su neuroprotekcija / regeneracija arba degeneracija / skausmu. Tada mes sukūrėme tinklus, susijusius su kiekvienu iš šių molekulinių procesų, tiesiogiai susijusių su aksonų sužalojimu, ir atlikome GSEA analizę, kad nustatytume, ar genų, susijusių su motyvais, ekspresija yra žymiai pakitusi bet kurioje iš sąlygų.

Mes nustatėme, kad kai kurie motyvai, pavyzdžiui, apoptozė ir anoikis, dažniausiai buvo reguliuojami aukštyn arba žemyn, pavyzdžiui, apoptozė ir anoikis - tai užprogramuota ląstelių žūtis, turinti keletą bendrų apoptozės būdų. GSEA atskleidė, kad genai, susiję su apoptozės keliais, buvo žymiai labiau sureguliuoti baltymų lygiu tiek DA (p vertė: 0, 009), tiek RA (p vertė: 0, 04) modeliuose, palyginti su kontrolinėmis, sėkloms, didelis pasitikėjimas (pirmasis ir antrasis) laipsnis) ir dvejetainiuose tinkluose (pirmasis ir antrasis laipsniai). Kalbant apie anoikius, nors DA modeliui reikšmingas buvo tik paskutinis tinklo tipas (p reikšmė: 0, 01), RA modeliui jis buvo reikšmingas didelio pasitikėjimo antrojo laipsnio tinklu (p reikšmė: 0, 032) ir VISU tinklu (p vertė: 0, 021). (1 pav.).

Image

Stulpeliai nurodo pagrindinių baltymų, naudojamų kaip sėklos tinklams sukurti, skaičių. Likusieji stulpeliai rodo rezultatus, gautus lyginant DA modelį ir kontrolę (2–7 stulpeliai), RA vs kontrolę (nuo 8–13) arba DA vs RA (nuo 14–20). Krypties stulpelis parodo, ar motyvas yra aukštyn, ar žemyn, atsižvelgiant į reikšmingus skirtumus, atsižvelgiant į p-vertę, kai lyginamas pirminis rezultatas, gautas iš sėklų (sėklų), arba tas, kuris gaunamas, kai įtraukiami ir pirmojo laipsnio tarpai (tinklas). Taip pat nurodomas praturtėjimo balas (ES).

Visas dydis

Atrodo, kad kai kurie kiti labai skirtingi įvykiai yra siejami tik su vienu iš modelių. Viena vertus, RA parodė reikšmingą antiapoptozės ir skausmo dėl sėklų sąrašų praturtėjimą, tačiau nė vienas iš jų nebuvo žymiai praturtintas DA modeliais. Skausmo motyvas buvo žymiai labiau sureguliuotas RA modelyje sėkloms (p vertė: 0, 02), didelio pasitikėjimo tinklams (pirmojo p vertė: 0, 009 ir antrojo laipsnio p vertė: 0, 014) ir dvejetainiams tinklams (pirmojo p vertė: 0, 001 ir antrojo laipsnio p vertė). : 0, 002). Panašiai anti-apoptozės mechanizmai buvo stipriai sureguliuoti sėkloms (p vertė: 0, 038), didelio pasitikėjimo tinklams (pirmojo p vertė: 0, 025 ir antrojo laipsnio p vertė: 0, 045), dvejetainiams ir antrojo laipsnio tinklams (p vertė: 0, 016) ir tinklams. turinčios VISAS sąveikas (p reikšmė: 0, 013) (1 pav.). Išanalizavus sėklų sąrašą daugiau mechanizmų nebuvo atskleista, tačiau, įvertinus VISUS tinklus, RA modelis buvo žymiai praturtintas anti-senėjimo ir molekuliniais mechanizmais, susijusiais su citoskeleto ir organelių motyvų persitvarkymu (anti-senėjimo p reikšmė: 0, 024, ir citoskeleto p reikšmė: 0, 028.).

Kita vertus, DA buvo žymiai praturtinta dėl penkių motyvų, palyginti su kontrole, kurie RA nebuvo reikšmingi. Visų pirma, sėkloms (p vertė: 0, 018), aukštam pasitikėjimui vienu laipsniu (p reikšmė: 0, 040) ir dvejetainiams vieno laipsnio tinklams (p vertė: 0, 038) buvo žymiai padidintas selektyvus autofagijos motyvas, tuo tarpu anti-anoikai, ROS hormesis, autofagosomos. membranos suliejimas ir branduolio streso įvykiai buvo žymiai sureguliuoti (1 pav.).

Paskutinė analizuota sąlyga buvo tiesioginis DA palyginimas su RA modeliais. Palyginus abu modelius, DA buvo sureguliuotas tik vienas motyvas, palyginti su RA. VISO tinklo anti-senėjimo motyvas buvo žymiai padidintas (p reikšmė: 0, 048). Kitoje vietoje buvo nustatyta, kad DA modeliuose, palyginti su RA, buvo sureguliuoti penki motyvai, tokie kaip regeneracija, antioksidantų mechanizmai, anti-anoikiai, autofagosomų membranų suliejimo įvykiai ir branduolinis stresas. Visi jie buvo reikšmingi analizuojant didelio pasitikėjimo pirmojo ir antrojo laipsnio tinklus ir VISUS tinklus, bet niekada, analizuojant sėklas. Galiausiai, anti-apoptozė ir skausmas, gerai žinomas fiziologinis procesas, susijęs su neurodegeneracija, taip pat buvo sureguliuoti regeneraciniame modelyje, analizuojant sėklas ir tinklus.

Apskritai šie rezultatai leido manyti, kad kai kurie įprasti įvykiai egzistuoja abiejuose modeliuose, tačiau kiti aiškiai jaučia neviltį, leisdami išskaidyti mechanizmus, apibrėžiančius endogeninius neuroprotekcijos mechanizmus, palyginti su tais, kurie yra pagrindiniai neurodegeneracijai. Gauti su motyvais susiję tinklai buvo toliau analizuojami, siekiant pasirinkti keletą pagrindinių molekulių, kurios patvirtintų ir padėtų aiškinant GSEA analizę. Apoptozės motyvo rezultatai buvo intriguojančiai reikšmingi ir sureguliuoti tiek RA, tiek DA modeliuose ir vis dar yra diskusijų tema RA modelio literatūroje. Anksčiau mes anksčiau pranešėme, kad nėra jokio kaspazės 3 priklausomos apoptozės pabaigos etapo 11 . Taigi, mes ieškome žymeklių tinkle, susijusių arba su nuo kaspazės nepriklausomais procesais, tokiais kaip apoptozę sukeliantis faktorius (AIF), arba su pradiniais apoptozės etapais, tokiais kaip katepsinas D (CTSD) (2 pav.). AIF paprastai būna mitochondrijose, bet persikelia į branduolį nuo kaspazės nepriklausomų, nuo apoptozės susijusių įvykių 12 . Mes aptikome jo buvimą iš MN branduolių bet kokiomis sąlygomis, nors RA modelyje pastebimas akivaizdus padidėjimas, palyginti su DA (2 pav.). Taigi tarpiniai apoptoziniai žymenys gali būti įdarbinami ir mobilizuojami ar keičiami, kad kažkaip rodo, kad programa yra suaktyvinta, tačiau tai nereiškia, kad bus pasiektas galutinis apoptozinis rezultatas. Taip pat CTSD yra pagrindinė lizosomų aspartilo proteazė, kuri iš jų gali išsiskirti į citozolį, kai įvyksta apoptozė. Mes pastebėjome, kad jis pasirodė kaip taškas, panašus į gausų dažymą kontrolėse, tačiau pastebimai sumažėjo tiek RA, tiek DA modeliuose, o imunohistochemija nepadidino MN citozolinio dumpio (2 pav. B). Be to, mes atlikome imunoblotologinę analizę, norėdami nustatyti skirtingas CTSD izoformas (nesubrendusios, neperdirbtos 48 kDa formos, palyginti su subrendusia 38 KDa forma) ir nustatėme perdirbimo trūkumą po RA (2 pav. C). Taigi abiejuose modeliuose buvo rasti pakitę su apoptoze žymenys, nors tai nereiškia vykdomosios apoptozės egzistavimo.

Image

Viršuje mazgai žymi baltymus, o kraštai - baltymų ir baltymų sąveiką. Žalia, violetinė ir mėlyna sėklos priklauso pradiniam motyvui, kuriam jie buvo anksčiau apibrėžti. Tamsiai žali kraštai atitinka tiesioginius interakcionierius (pirmieji kaimynai), o šviesiai žali - antrieji. Kvadratinis rėmelis yra sėklos, kurios taip pat yra žymiai skirtingos, pakitusių baltymų rezultatuose (kontrolė prieš RA). CTSD ir AIFm1 buvo pasirinkti tolesniam patvirtinimui pagal apoptozinį motyvą. Apatinės plokštės, (A). reprezentatyvios L4 stuburo smegenų veninio rago mikrofotografijos, parodančios AIFm1 (raudonos spalvos, tik kairiuose stulpeliuose) lokalizaciją Nissl pažymėtuose MN (mėlynos, sujungtos dešinėje skiltyje) iš DA arba RA modelių arba kontrolinių (Ctrl) gyvūnų. Atkreipkite dėmesį į skirtingą AIFm1 branduolį po RA. (B). CTSD (raudonos, kairės) lokalizacija ir gausa MN (mėlyna) kontroliniuose (Ctrl), RA ir DA modeliuose. (C). Aktino ir nesubrendusių (48 kDa) ar subrendusių (34 kDa) CTSD formų imunoblotai skirtinguose modeliuose ir juostinė diagrama, vaizduojanti dviejų CTSD izoformų santykio vidutinę +/− SEM kiekvienoje būklėje (* p <0, 05) . (D) Su nekroze susijęs žymeklis atitinkamame tinkle Hmgb1 yra gausiai aptinkamas išoriniuose neuronuose, tačiau yra lokalizuotas su mikrogliais (Iba1, žalia) tiek modeliuose, tiek priešingose ​​pusėse (Ctl). Masto juosta: 20 μm (A) arba 50 μm (D).

Visas dydis

Be to, mes norėjome patvirtinti, kad GSEA tyrime nėra jokios reikšmės, tiriant su nekroze susijusio formuotojo, esančio tinkle, pavyzdžiui, chromatino baltymo didelio judrumo grupėje B1 (HMGB1), raišką. Jei yra nekrozė, dėl membraninio kraujavimo iš neuronų reikia nustatyti gausų HMGB1 kiekį 13 . Bet taip pat pranešama, kad jis gausiai išreikštas aktyvintose mikroglia 14 . Atlikdami imunohistocheminę analizę, mes pastebėjome, kad gausus HMGB1 kaupiasi RA neuronų neuronuose ir išorėje, palyginti su DA ar kontroliniais mėginiais. Tačiau bendro ženklinimo su plačiai pripažintu mikrogliukozės žymeniu Iba1 analizė atskleidė, kad HMGB1 buvo mikrogliojose, užuot pasklidęs neorononinės aplinkos parenchimoje (2 pav. D). Taigi nebuvo pastebėtas į nekrozę panašus reiškinys, patvirtinantis prognozę pagal GSEA analizę.

Mes radome anoikį, kitą ląstelių mirties programą, kuri taip pat yra susijusi su apoptoze, kuri taip pat turi būti reguliuojama abiejuose modeliuose. Anoikis yra apibrėžiamas kaip mirties procesas, kurį sukelia netinkama arba netinkama ląstelės ir matricos sąveika 15 . Mes pasirinkome integruotų junginių b1 subvienetą (Itgb1) kaip žymeklį, pateiktą tinkle ir padidintą proteomikos sąrašuose. Itgb1 paprastai yra membranoje, ir mes stebėjome šį modelį DA modelyje (3 pav.). RA modelyje, atvirkščiai, mes pastebėjome didelį Itgb1 kiekį citoplazmoje arba perinuklearinį dažymą MN viduje (3 pav.). Kadangi netinkamas Itgb1 susilaikymas ląstelėse gali lemti ląstelių mirtį 16, rezultatai parodė, kad anoikai yra svarbus MN degeneracijos procesas.

Image

Viršutinės, oranžinės ir mėlynos sėklos priklauso pradiniam motyvui, kuriam jos buvo atitinkamai apibrėžtos anoikis arba skausmas. Raudoni kraštai atitinka tiesioginius interaktorius (pirmieji kaimynai), o oranžiniai - antrus. Kvadratinis rėmas yra sėklos, kurių baltymų rezultatai taip pat skiriasi žymiai skirtingai (kontrolė prieš RA). Apatinė plokštė, reprezentatyvios sujungtos mikrofotografijos, kad būtų galima palyginti Itgb1 (raudona) lokalizaciją MN (mėlyna nissl) RA ir DA modeliuose. Taip pat pažymėti itgb1 gausos skirtumai aplinkinėse gliutose (rodyklių galvutės). Masto juosta: 20 μm.

Visas dydis

Kita vertus, degeneraciniame procese po RA, GSEA analizė atskleidė antiapoptozinį procesą. Norėdami tai patvirtinti, kaip žymeklį pasirinkome šilumos šoko baltymą 27 (Hspb1 arba Hsp27), nes tai yra chaperonas, kuris, kaip teigiama, turi svarbiausią vaidmenį, tarpininkaudamas išgyvenimo reakcijose, veikdamas kaip antioksidantas ir slopindamas ląstelių žūties kelią į daugelį centrinės nervų sistemos įžeidimų 17 . Mes pastebėjome, kad Hspb1 buvo paplitęs viso nugaros smegenų proceso metu, tačiau jų lygis RA mėginiuose buvo didesnis nei DA, kaip stebėta imunohistochemiškai (4 pav.). Priešingai, acetilinto tubulino, prie kurio jungiasi Hspb1, modelis buvo stebimas pasikeitus pagal priešingą profilį. Taigi, nepaisant padidėjusio anti-apoptozinių žymenų, tokių kaip Hspb1, ekspresijos, nesubalansuotas chaperono ir substrato santykis gali nepadėti veiksmingai išgyventi MN.

Image

Viršutinės, žaliosios ir violetinės sėklos priklauso pradiniam motyvui, dėl kurio jos anksčiau buvo apibrėžtos atitinkamai arba kaip apoptozė, arba priešapoptozė. Kvadratinis rėmas yra sėklos, kurių baltymų rezultatai taip pat skiriasi žymiai skirtingai (kontrolė prieš RA). Apatinė dalis, imunohistocheminė Hspb1 (raudona), chaperono, pasirinkto kaip motyvo patvirtinimo taikinys, ir acetilinio alfa tubulino (žalio), vieno iš jų substratų, stuburo smegenų vidurio rage iš DA ir RA analizė. Masto juosta: 100 μm.

Visas dydis

Galiausiai išanalizavome žymeklį, susijusį su neuropatiniu skausmu susijusiu tinklu (5 pav.). Paprastai manoma, kad neuropatinis skausmas yra nervinio plastiškumo išraiška, kuris gali atsirasti keliuose grandinės taškuose, įskaitant nocicepcinius neuronus nugaros nugaros smegenyse. Aktyvuotos C kinazės 1 receptoriai („Rack1“) yra daugialypis pastolių baltymas, sąveikaujantis su ribosomų mechanizmais, keliais ląstelių paviršiaus receptoriais ir baltymais, esančiais branduolyje 18 . Mes išanalizavome „Rack1“ tarpląstelinę lokalizaciją nugaros smegenų nugariniame rage, kur imunocistochemija nustatė nocicepcinius neuronus. Mes nustatėme, kad Rack1, paprastai dedamas į kontroliuojamų gyvūnų nugaros neuronų branduolį, pastebimai pakeitė savo tarpląstelinę lokalizaciją į labiau difuzinę struktūrą, ypač RA modelyje (5 pav.). To pokyčio reikšmė ir jo įtaka centriniam sensibilizavimui nusipelno tolesnės analizės, taip pat kitų šio skausmo susijusių tinklų išskirtų molekulių.

Image

Viršutinės, oranžinės ir mėlynos sėklos priklauso pradiniam motyvui, kuriam jos buvo atitinkamai apibrėžtos anoikis arba skausmas. Patvirtinimas buvo atliktas imunohistochemine Gnb2 / 1 (raudona) analize iš abiejų nugaros nervų (I – III sluoksniai, kairiosios plokštės) arba vidurinio rago MN (dešiniosios plokštės) (mėlynos spalvos Nissl) iš DA arba RA audinių. Svarstyklių juosta: 100 μm (kairė, nugaros ragas); 50 μm (dešinysis, vidurinis ragas).

Visas dydis

Galiausiai, 6 paveikslas parodo tinklus, susijusius su anti-anoikiais ir selektyviais autofagijos motyvais, turinčiais reikšmės DA modeliui. Keli baltymai, paryškinti žalia spalva, buvo pastebimai pakitę baltymų tyrimuose, palyginti su tokiais kontroliniais preparatais kaip Pacsin1, dar žinomu kaip sindapinas 1, tarpinis siūlinis vimentinas ir kalcineurino B homologinis baltymas 1 (Chp1), dalyvaujantys vezikulų prekyboje. Vimentinas (Vim) ir rūgštusis kalponinas (Cnn3) buvo stipriai sujungti baltymai tinkle, be to, jie buvo labai nereglamentuojami baltymų sąrašuose. Priešingai selektyviajam autofagijos tinklui, trūko pagrindinių baltymų, žymiai pakitusių baltymų sąrašuose, nors prisijungimo tendencijos atskleidė ir šio tinklo svarbą.

Image

Geltoni ir mėlyni žiedai yra sėklos, priklausančios pradiniam motyvui, dėl kurio jos anksčiau buvo apibrėžtos kaip anti-anoikis arba selektyvus autofagija. Šviesiai žali apvalūs baltymai sudaro baltymų sąrašą, smarkiai sumažintą (kontrolinis ir DA). Kvadratiniai rėmeliai rodė skirtingas reguliuojamas sėklas, taip pat aptinkamas žymiai skirtingas moduliuotų baltymų rezultatus.

Visas dydis

Diskusija

Tinklu pagrįsti metodai pasitelkia mintį, kad sudėtingas ligas galima geriau suprasti iš globalios perspektyvos, žiūrint į iš anksto apibrėžtus motyvus, o ne į atskirus genus. Šiame darbe mes parodėme, kaip proteominių duomenų derinimas su topologine informacija ir užpakalinė skaičiavimo analizė gali padėti mums kontekstualizuoti savo atradimus ir gali suteikti naujų molekulinių mechanizmų, kurie remiasi neištirtais. Mes sukūrėme 19 biologinių procesų, apimančių įvairius molekulinius įvykius, susijusius su motoneurodegeneracija atgal ir neuroprotekcija po aksonų pažeidimo, ir sujungėme juos į nešališką proteomikos duomenų rinkinį užpakalinei GSEA analizei. Nors buvo nustatyta, kad kai kurie abiejų procesų motyvai buvo praturtinti, kiti buvo konkrečiai siejami su vienu iš jų. Periferinių nervų šaknų sužalojimas, sukeliantis motoneurodegeneraciją, yra geriau paaiškinamas su skausmu susijusiais molekuliniais įvykiais, taip pat anoikiais, apoptozėmis, antiapoptozėmis ir su citoskeletu susijusių programų pertvarkymu. Atvirkščiai, distalinė aksotomijos procedūra, apimanti endogeninį neuroprotekcinį procesą, nors apimanti ir anoikioziją bei apoptozę, garsėja daugiausia anti-anoikių, ROS hormezės ir selektyvių autofaginių paprogramių buvimu. Diskusijoje sutelkiame dėmesį į kai kuriuos susijusius mazgus, išryškintus kiekviename iš šių reikšmingų motyvų, ir galimą jų įamžinimą, kad geriau paaiškintume visus šiuos mechanizmus. Išsami informacija apie šiuos neveiksmingus ir veiksmingus neuroprotekcijos paketus sudaro pagrindą eksperimentui nukreipti į geresnes terapines strategijas būsimiems klinikiniams pritaikymams.

Ankstesni bandymai nustatyti ir apibūdinti svarbiausius neurodegeneracinių procesų baltymus, kurie gali būti skirti terapijai, labai rėmėsi stebėdami padidėjusį ar žemyn esantį atskirų kandidatų reguliavimą įvertinant poveikį neuronų išgyvenimui. Neobjektyvaus baltymų, skirtingai reguliuojamų dėl neurodegeneracinio proceso, paieškos idėja nėra nauja, net naudojant tą patį čia pateiktą šaknies impulsų modelį, tačiau šie tyrimai rėmėsi tik paprasta mikrotraumų analize 19, 20 . Šio proteominio tyrimo rezultatai daugiau nei papildo transkriptų tyrimus, lemia tai, kad baltymų gausumui turi įtakos tiek sintezė, tiek apykaita, ir jų negalima numatyti vien remiantis mRNR lygiais 21 . Be to, mūsų ekranas buvo atliktas naudojant kiekybinę proteomiką be etikečių, kuri buvo įrodyta, kad yra geresnis metodas, palyginti su baltymų aprėptimi, palyginti su kitais metodais, pagrįstais etiketėmis. Tačiau kiekybiniai rezultatai gali neatspindėti griežto atskiro baltymo gausos skirtumų, nes po transdukcijos modifikacijos gali trukdyti virškinimui virškinimo trakte ir didinti kiekybinius kai kurių peptidų, kuriuos paveikė šios modifikacijos, skaičiaus skirtumus, sukeliančius kokybinius skirtumus. Taigi, nors GSEA analizės rezultatai parodė, kad motyvuose yra šiek tiek padidėjęs ar sumažėjęs reguliavimas, kadangi jie yra paremti pakitusiais baltymais (dėl gausos ar po translyčių modifikacijų), į atributus motyvų kryptimi reikėtų atsižvelgti atsargiai. Pavyzdžiui, tai buvo pastebėta CTSD, nes imunohistochemija patvirtino, kad DA ir RA yra skirtingi, nors ir priešinga, nei prognozavo proteominė analizė. Šis akivaizdus prieštaravimas gali kilti dėl abiejuose modeliuose pastebėto skirtingo baltymo perdirbimo, kuris buvo mažiau efektyvus RA modelyje. Tai rodo, kad skirtingas to paties baltymo skirtingų izoformų aptikimas peptidais gali sukelti netikslų rodymą aukštyn / žemyn. Taigi, rezultatų aiškinimas nusipelno kruopštaus konkretaus baltymo analizės, o ne tik ieško perraiškos / žemyn išraiškos, kaip padaryta transkriptominiuose tyrimuose. Ši duomenų rinkinio savybė privertė naudoti sudėtingesnę skaičiavimo analizę biologinės prasmės paieškai. Pagrindinis fenotipinių ir proteominių ligų skirtumų analizės tinklo kontekste pagrindinis pranašumas yra tas, kad susiedami savo sėklas su sąveikos tinklu ir ieškodami GSEA, mes padidiname savo analizės statistinę galią. Biologinė prasmė buvo geriau pasiekta atlikus GSEA analizę, nei naudojant bendruosius GO terminus ir KEGG kelių analizę, paprastai naudojamą norint gauti funkcinį praturtėjimą daugeliu kitų atvejų. Be to, įtraukdami į savo analizę tiesioginius mūsų sėklų interakcionierius, mes pastebėjome žymiai praturtintus motyvus, ne tik analizuodami sėklas, pateikdami naujus genus kandidatus, kurie gali būti susiję su mūsų modeliu, arba atskleisdami nežinomus veikimo mechanizmus. Tai buvo antianokio motyvo atvejis, kuris buvo reikšmingas tik tada, kai į DA modelio parašą buvo įtraukti tiesioginiai tarpininkai. Taigi mūsų metodinis metodas išskleidė tikslesnę mechanistinę informaciją nei bet kuri kita anksčiau pranešta transkriptų / proteomų analizė.

Kalbant apie aptiktus mechanizmus, kaip buvo tikėtasi, tie, kurie suveikė po šaknies užpylimo, buvo susiję su skausmu. Nors mūsų RA modelis nelaikomas klasikiniu neuropatinio skausmo tyrimo modeliu, pastaruoju metu jis apibūdinamas kaip nocicepciniai pakitimai 22 . Todėl mes atskleidėme tam tikrą tinklą, kuris gali padėti paaiškinti centrinio sensibilizacijos atsiradimą šiame modelyje. Tinklą sudaro kelios jau aprašytos molekulės, susijusios su skausmo pasireiškimu kituose tirtuose modeliuose, tokiuose kaip dlg4 ar PSD-95, NOS1-3, susietos tiek su uždegiminiu, tiek su neuropatiniu skausmu, ir Grin2a – 2b, atitinkamai atitinkančios NMDA receptorius, atitinkamai NR2A ir NR2B, o tai, dėl kurio per daug suaktyvinta, padidina nocicepcinės grandinės hiperaktyvumą 23 . Nauji santykiai, išryškėję iš mūsų analizės, yra susiję su skausmu ir MAPK3, dažniausiai literatūros šaltiniais susijusi su regeneracija 24 . Viduryje, jungdami NMDA ir MAPK3, radome baltymą Grbl / 2 arba aktyvuotos C kinazės 1 receptorių (RACK1). Kelios ataskaitos parodė jo dalyvavimą įvairiuose biocheminiuose keliuose; tačiau jo poveikis skausmo jautrinimui dar nėra susijęs. RACK1 jungiasi prie ribosomų, Src kinazių ir (arba) baltymų kinazės C kartu ir slopina Src kinazę. Buvo pranešta, kad Src šeimos baltymo tirozino kinazių aktyvavimas stuburo nugariniame rage yra būtinas norint pradėti ir plėtoti centrinę sensibilizaciją po periferinių audinių ir nervų pažeidimo 25 . Be to, vienas geriausiai apibūdinamų substratų yra NR2B subvienetas, kurio fosforilinimas sukėlė signalų transdukciją pasroviui 26 ir sukelia NR2B receptorių priklausomą neuronų plastiškumą ir jautrumą skausmui 27 . „Rack1“ paprastai yra ląstelių branduolyje, o 14–3–3 baltymas (dar vadinamas Ywhaq) skatina šią translokaciją 28 . Mes nustatėme, kad „Rack1“ buvo pažeisti iš branduolio nugaros nervų neuronuose. Stebėjimas atitinka tariamą Ywhaq žemąjį reguliavimą po RA proteomikos sąraše. Tikėtina, kad perkeltas „Rack1“ išleis aktyvuotą Src, o dėl padidėjusio NMDA aktyvumo padidės tinkamumas. Nors vis dar spekuliatyvi, Rack1, Src ir NMDA triodo forma atrodo įdomus kelias, į kurį reikia atsižvelgti atliekant neuropatinio skausmo tyrimus.

Įdomu, kad su skausmu susijęs tinklas buvo nepaprastai įsijautęs į kitus mūsų tinklus. Pavyzdžiui, Src iš tikrųjų yra abiejų modelių Anoikis pogrupyje. Anoikis yra ląstelių mirties būdas, uždegamas atsiskyrus nuo tarpląstelinės matricos (ECM) 29, kurios atsparumas buvo išsamiai ištirtas metastazavusiose ląstelėse. Nepaisant įrodytos EM prisirišimo svarbos neuronams, neurodegeneracinės srities tyrimų neatrasta 30 . Vystymosi metu MN, kurie negauna tinkamos trofinės atramos, nes trūksta tinkamų nervų ir raumenų jungčių, miršta anoikis 31, tačiau niekas neištyrė jo tinkamumo suaugusiųjų aksotomizuotiems MN. Integrinai, pritvirtinti prie plazminės membranos, leidžia sukibti su EM ir susijungia su viduląsteliniu aktino-citoskeleto rekonstrukcija per FAK-Src kompleksą, kad būtų išlaikytas ląstelių išgyvenimas lipniose ląstelėse. Aksotomizuotos MN gali nukentėti nuo anoikių ir gali suaktyvinti pasroviui pritaikytą programą tiek DA, tiek RA modeliuose, nors ir su dideliais skirtumais. Stebėjome Itgb1, bendrą visų integrinų kompleksų subvienetą, gausiai susikaupusį ląstelės viduje, užuot tinkamai gabenę į plazminę membraną po RA, priešingai nei DA. DA modelyje esančios MN gali inicijuoti atsiribojimą, kad galėtų pasiruošti aksonų pailgėjimui, kad atsinaujintų, o RA atveju Itgb1 yra beprasmis. Tai gali lemiamai prisidėti prie neuronų mirties. Abiejuose modeliuose egzistuojančios anoikio savybės atitinka apoptozinių programų įsitraukimą.

Jau seniai pranešta apie apoptozinių žymenų stebėjimą tokiuose avių impulsų modeliuose kaip BAX ir p53 32, 33. Naudojant viso sėdimojo nervo impulsijos modelį, distalinis pažeidimas panašus į DA, bet be siūlės, sukeliantis 20% MN mirties, Martin et al pastebėjo, kad BAX ir p53 KO pelės blokuoja tai ir padarė išvadą, kad tai yra apoptozinė mirties rūšis 33 . Naudojant suaugusias BAX-KO peles 32, nebuvo įmanoma išsiaiškinti BAX reikšmės MN praradimui po šaknies sukrėtimo. Besides differences in experimental models which are relevant to steer MNs toward one or other cell death program, it should be taken also into consideration that pleiotropic effect of p53 promote both apoptotic programs (BAX dependent) and inhibition of anti-anoikis programs mediated by AKT 34 (see below). Thus, from those experiments dual interpretation can be envisaged. From our work, we concluded that engagement of the anti-anoikis program may be the key successful one to boost endogenous neuroprotective process after axonal damage. So, the increased MN survival obtained by blocking p53 can be interpreted by reinforcing anti-anoikis program even when MN death is not apoptotic. We demonstrated that none of the models analysed presented degeneration ended up by apoptosis. This might be thanks to the presence of concurrent anti-apoptotic subroutines that prevents this in the RA model. Indeed, inhibitors X-linked Inhibitor of apoptosis proteins (XIAP) are already higher express in adult versus neonatal MNs and it seems to be key molecules to render adult MNs more resistant to axotomy injuries 35 . We validated this observation analysing the expression of Hspb1 as an anti-apoptotic molecule 36 . Hspb1 is a small multitarget chaperone that binds and influence on the stability of the tubulins. Mutations in hspb1 leading to excessive chaperone activity, have been recently found linked to peripheral neuropathy called Charcot Marie-Tooth disease probably due to microtubule stabilization 37 . Balanced stoichiometry between Hspb1 and acetylated tubulin is key for correct function of the cytoskeleton precluding any pro-survival effect 38 . We found that the ration was inverted after RA. So again, the overexpression of an anti-apoptotic molecule does not guarantee the successful recovery form death. The presence of opposite forces may contribute to slowness of the death process in RA which is definitely ending lacking apoptotic caspase-dependent or independent, executive action. This is interesting since we suggested dissociation between triggering or initiating programs and final outcome that has probably long contribute to the controversy present around this mechanism of neurodegeneration. Avulsed MNs will probably finally die due to a combination of detachment, isolation, and anoikis in addition to internal cytoskeletal blocking of the transport that may difficult resolve properly the programs engaged either towards apoptosis, that needs proper translocation and energy supply, or towards anti-apoptosis. Research should be reinforced to verify whether this corresponds to a new form of death that can be found in vivo in both acute process and in other chronic diseases specifically affecting MNs.

Although out of scope of the present manuscript, proteomic analysis also revealed some particular enzymes involved in amino acid, fatty acid or citrate cycle metabolism that sign the neurodegenerative process. Abnormal concentrations of metabolites that reflect axonal loss or dysfunction have been reported. The most common linked finding in the literature is a reduced concentration of N-acetyl-aspartate 39 . Recently, Kachramanoglou and collaborators reported that increased levels of myo-inositol/creatinine ratio may serve as a marker of avulsion injury 40 . However, this parameter seem to diminish with time cause it might be linked to persistent gliosis. Our present study proportionate information about other putative metabolites that can selectively associated with the neurodegenerative avulsion injury distinguished from a regenerative form. Analysis of this metabolic pathways and deductive subproducts might be of great value for clinical outcome measures in trials of repairing strategies.

Regarding the neuroprotective process, what makes successful the distal axotomy model. One clue may be related to the choice of other neuroprotective routes instead of the anti-apoptotic one. In this regard, we found that anti-anoikis, ROS hormesis and autophagy-related events seem to be the successful choices. Indeed, recent work demonstrated that ECM detachment also robustly induces autophagy to presumably protect against this type of stress 41 . A basal level of autophagy has been shown to have a neuroprotective role, although excess autophagy is harmful 42, 43 and the autophagy of ubiquitylated cytosolic proteins is the second mechanism by which ubiquitin may signal protein degradation of selective unwanted proteins in lysosomes. For instance, Src, which is essential for the anoikis response as mentioned, can be entrapped and degraded by autophagosomes leading to cell survival 44 . Selective autophagy can be engaged to manage ubiquitylated cargo captured by the endosomal sorting complex for transport (ESCRT) machinery. ESCRT machinery directly or indirectly, regulates autophagy. By GSEA analysis we found significative enrichment of components of the ESCRT complex such as TSg101, putatively down-regulated in the DA model, and imbricated in the same motive with late-autophagic-related molecules such as p62/Sqstm1, the ubiquitin-binding protein 45 . Thus, these observations suggested that proper running of the ESCRT machinery and autophagy course might be key elements in promoting survival after axonal injury.

Finally, several of the proteins we related to both the anti-anoikis motive and the membrane fusion events were found down-regulated in the DA model such as Pacsin 1, scamp1, a secretory carrier membrane protein, NSF, Dlg4 and chp1 (Calcineurin B homologous protein 1) and SNAP25. All of this proteins are related to vesicle-mediating transport and endocytic/exocytic membrane traffic often involved in axonal growth 46 . These results suggested that proteins involved in axon tip extension might be transported to the lesion site, within the peripheral nerve and far away from the neuronal soma in the spinal cord object of our proteomic analysis. Interestingly, the connections we found between those and phosphatidylinositide 3-kinase (PI3K) in this network deserves special mention since it normally increases in both distal axons and cell bodies because required for both the neurotrophin-induced cell survival and distal axon growth 47 . The role of Pi3K-AKT activation as a survival-promoting factor in injured neurons is well documented 48 and so we highlighted here its importance in the anti-anoikis program together with selective autophagy as key elements for the endogenous neuroprotective mechanisms.

In conclusion, we have shed some light about the process involved in retrograde MN reactions to axotomy that are delicate balanced and can lead to either degeneration or neuroprotection depending on parameters such as distance of the lesion. The neurodegenerative process is leading to opposite forces, apoptosis, anoikis and anti-apoptotic programs, which may contribute to retard the fatal outcome as well as to give it a characteristic that is not definitely apoptotic, nor necrotic. Further establishment of the molecular parameters that define it may lead to the definition of a new form of neuronal death, not as pure as those observed in vitro and well established by the Nomenclature Committee of Cell Death but certainly present in an in vivo process. At present we do not know the incidence or implication of this process in other neurodegenerative processes but we think that this deserves further exploration. On the other hand, we have dissected out those neuroprotective programs that can lead to successful recovery after axotomy that include rather co-running of anti-anoikis and selective autophagy programs. These are relevant for therapeutical approaches. The unsuccessful approaches trying to impede the neurodegenerative process, using anti-apoptotic agents for instance, or any anti-death approach have been demonstrated to be unsuccessful in trauma or in neurodegenerative diseases. So, we show here that the tissue has the capacity to recover them self and knowing how to do it may be key for therapy and an alternative way of thinking for therapeutical strategies.

Metodai

Models

Sprague–Dawley female rats aged 12 weeks were kept under standard conditions of light and temperature and fed with food and water ad libitum. We performed surgical procedures under anesthesia with a cocktail of ketamine/xylazine 0.1 mL/100 g weight ip essentially as reported previously 5 . To perform extravertebral nerve root avulsion of the L4–L5 roots we made a midline skin incision to identify each side sciatic nerve and applying a moderate traction on selected roots away from the intervertebral foramina, obtaining the mixed spinal nerves that contained the motor and sensory roots and dorsal root ganglia out. To produce the distal axotomy plus suture model, the sciatic nerve was exposed at mid high and freed from surrounding tissues; then, the nerve was transected and immediately repaired by fascicular suture (10–0, Ethicon). After both types of lesions, the wound was sutured by planes, disinfected with povidone iodine and the animals allowed recovering in a warm environment. All procedures involving animals were carried out in accordance with the guidelines of our institution and experimental protocols were approved by the Ethics Committee of our institution, and following the European Community Council Directive 86/609/EEC.

Mėginio paruošimas

We anesthetized groups of rats (n = 4–5) with root avulsion or distal axotomy and un-operated controls at 7 dpo to obtain L4–L5 spinal cord segments (5-mm length) samples to be snap-frozen into liquid nitrogen. We homogenized the tissue in lysis buffer (Hepes 20 mM, Sucrose 250 mM, EDTA 1 mM, EGTA 1 mM and a cocktail of protease and phosphatase inhibitors) with potter homogenizer on ice. After centrifugation of lysates at 800 × g for 20 min at 4°C, we collected the supernatant as a cytosolic fraction and quantified by BCA assay (Pierce Chemical Co.; Rockford, IL, USA). For proteomic analysis, we solubilized 75 μg of each sample in 4% SDS, 8 M Urea, 0.1 M HEPES, 0.1 M DTT and subsequently reduced, alkylated in 0.05 M iodoacetamide and digested with trypsin (ratio enzyme:substrate 1:10) using the method FASP (Filter Aided Sample Preparation) as described 49 . All samples were treated in parallel.

Proteominė analizė

We analysed samples using an LTQ-OrbitrapVelos mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific) coupled to a ProxeonEasyLC (Thermo Fisher Scientific). We loaded the peptide mixtures directly onto the analytical column (2 μl·min −1 ) and separated them by reversed-phase chromatography using a 15-cm column with an inner diameter of 100 μm, packed with 5 μm C 18 particles (NikkyoTechnos Co., Ltd.). Chromatographic gradients started at 97% buffer A (0.1% formic acid (FA) in water), and 3% buffer B (acetonitrile, 0.1% FA) with a flow rate of 500 nl·min −1, and gradually increased to 85% buffer A + 15% buffer B in 4 min, and to 55% buffer A + 45% buffer B in 120 min. We operated the instrument in TOP20 DDA (Data Dependent Acquisition) mode with one full MS scan in the Orbitrap at a resolution of 60, 000, and a mass range of m/z 350–2, 000 followed by MSMS spectra of the 20 most intense ions. We utilized the Ion Trap by CID (collision induced dissociation) to produce fragment ion spectra and used normalized collision energy at 35%. We acquired all data with Xcalibur software v2.1. We used Proteome Discoverer software suite (v1.3.0.339, Thermo Fisher Scientific) and the Mascot search engine (v2.3.01, Matrix Science 50 ) for peptide identification and quantitation. We analysed the data against SwissProt Rat database (released July 2012) containing the most common contaminants (599 entries). We used a precursor ion mass tolerance of 7 ppm at the MS1 level and allowed up to three miscleavages for trypsin. The fragment ion mass tolerance was set to 0.5 Da. Oxidation of methionine and N-terminal protein acetylation were set as variable modifications whilst cysteine carbamidomethylation was set as fixed modification. We filtered the peptides based on their false discovery rate (FDR > 5% not considered). For peptide quantification, we considered the chromatographic peak of the peptides calculated by Proteome Discoverer, and median normalized the areas by log2 transformation using R 3.0.2. We quantified the data using the R package MSstats (v. 2.0.1) 51, 52, 53 . For each ratio, we calculated the adjusted p-value 54 (p < 0.05 for significance). Finally, we performed gene ontology and pathway analysis for regulated proteins with STRING 55 (//string-db.org/) and DAVID Web tools 56 (//david.niaid.nih.gov/david/version2/index.htm).

Protein-protein interaction networks

Through manual curation of the literature, we identified the main biological processes (BP) described to be involved in either regenerative or/and degenerative processes and considering all possible events that may occur around 7 dpo after injury. By this time, in the RA model there might happen some problems in autophagy late-events and ER stress canonical response as we have previously suggested 11 . Besides, we wanted to determine whether apoptotic, necrotic or other death-associated pathways such as anoikis 31, nucleolar stress 57, and mitochondrial dysfunction 58 that has been described in other neurodegenerative processes, were also present. In addition, we included a pain-related motive since the apparition of neuropathic pain is markedly relevant after root avulsion 59 . In association with the the DA model, we included a list of motives classically involved in regeneration and some anti-cell death progrmams in order to reveal the endogenous neuroprotective mechanisms in the promotion of neuronal survival and regeneration such as anti-anoikis 60 or anti-apoptosis and anti-oxidant hormesis 61 . Subsequently, we classified all of them into 19 different motives comprised by altogether 331 different genes (that we named seeds) (Table 1, supplementary Table S3). From those 19 different motives, 10 of them accounted for processes related to neuron regeneration and 9 to neuron degeneration.

Pilno dydžio lentelė

For protein interaction data, we collected a subset of all the available Protein-Protein Interactions (PPIs) from an integrated database containing data from nine major public PPIs databases: Intact 62, MINT 63, DIP 64, MatrixDB 65, InnateDB 66, BioGRID 67, BIND 68, MPIDB 69, and HPRD 70, mapping protein identification codes to Uniprot Accession Codes (Uniprot KB version 2013_01). We collected all experimentally verified direct interactions adding only those described as binary according to the associated detection methods 71 . A part from the binary interactome we generated a second interactome by collecting all experimentally determined interactions using the 'spoke expanded' model in order to transform protein complexes into binary interactions when the bait of the given affinity purification was specified and the 'matrix expanded' model otherwise 72 .

From the previous mentioned interactomes, we constructed two types of networks. First degree networks, which consist of adding the direct interactors of the motive seeds, and second degree networks by adding an extra level of interactors to the first degree networks (ie also adding direct interactors of the seed interactors). We assigned a confidence score to each interaction, based on the size and type of experiment and the number of publications supporting the interaction 73, 74 and used it to build high-confidence networks by filtering out those interactions with a normalized confidence score below 0.5.

Gene set enrichment analyses (GSEA)

Gene Set Enrichment Analysis is a computational method that determines whether a predefined list of genes (that we name 'signatures') shows significant differences between two biological phenotypes under study (Subramanian, Tamayo et al. 2005). We performed a GSEA using as signatures our lists of biological process-associated genes (one for each motive) and our set of protein-protein interaction networks generated from them. We used GSEA as implemented in the Bioconductor library phenoTest (R package version 1.9.0) to assess if the proportion of genes associated with phenotype in each signature is greater than that outside of the signature. GSEA requires first ranking genes according to their association with a given phenotype (each neurodegenerative process), and then determining whether genes included in the signature tend to present either positive or negative enrichment values. Association with each model was measured using the previously estimated log2 fold changes obtained from our proteomic analysis. The output of the GSEA is an enrichment score (ES), a normalized enrichment score (NES) which accounts for the size of the gene set being tested, a P-value and an estimated False discovery rate. Computing NES, P-values and FDR requires a permutation-based approach for which we computed 10, 000 permutations per signature.

Data validation

We used immunohistochemistry and western blot for data validation. After deeply anesthetized with dolethal we transcardially perfused the animals with a saline solution containing heparin (10 U/ml), followed by 4% paraformaldehyde in a 0.1 M phosphate buffer, pH 7.2, for tissue fixation at 7 dpo (n = 4 at each time post lesion) and removed the L4 and L5 segments (5-mm total length) of the spinal cord, post-fixed in the same fixative for extra 4 h and cryopreserved in 30% sucrose overnight. We cut the samples into serial transverse sections (20-mm thick) onto gelatinized slides using a cryotome (Leica, Heidelberg, Germany) and preserved them at −20°C until used. For immunohistochemistry, we treated the slides with blocking solution in Tris-buffered saline (TBS) with 0.03% Triton-X-100 and 10% bovine serum for 1 h and incubated thereafter with different primary antibodies: Cathepsin D (CTSD), High-Mobility Group Box 1 (HMGB1), Apoptosis-Inducing Factor, Mitochondrion-Associated, 1 (AIFM1), Guanine Nucleotide Binding Protein (G Protein), beta Polypeptide 2-Like 1 (GNB2L1, RACK1), Heat Shock 27 kDa Protein 1 (HSPB1) (Antibodies-online, Aachen, Germany) overnight at 4°C. After several washes with TBS, 0.05% Tween-20, the sections were incubated for 2 h with Cy-2 or Cy-3 conjugated donkey anti-rabbit antibodies (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA, USA). We counterstained the sections with DAPI (Sigma, St Louis, MO, USA), or NeuroTrace Fluorescent Nissl Stain (Molecular Probes, Leiden, Netherlands) and mounted the slices with Fluoromount-G mounting medium (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA). Images of the spinal cord samples from different treatments and controls were taken under the same exposure time, sensibility, and resolution for each marker analysed, with the aid of a digital camera (Olympus DP50) attached to the microscope (Olympus BX51). Confocal microscope examinations were performed with a Confocal Laser Scanning Microscope (Zeiss LSM 700; Zeiss, Jena, Germany). For western blotting, we loaded thirty micrograms of cytosolic fractions of L4–L5 segments from each animal model onto 12% SDS-polyacrylamide gels to perform electrophoretic separation of the proteins following by its transference to a PVDF membrane in a BioRad cubette system in 25 mM Tris, 192 mM glycine, 20% (v/v) methanol, pH 8.4. We blocked the membranes with 10% non-fat dry milk in TBS for 1 h at room temperature and then incubated overnight with primary antibody anti cathepsin D (1:1000) or anti-actin (Sigma). After several washes, membranes were incubated for 2 h with an appropriate secondary antibody conjugated with horseradish peroxidase (1:3000) (anti-mouse-HRP, Dako Denmark; Glostrup, Denmark) and anti-rabbit-HRP (Invitrogen Corp.; Carlsbad, CA, USA). The membrane was visualized using a chemoluminiscent mix 1:1 [0.5 M luminol, 79.2 mM p-coumaric acid, 1 M Tris-HCl; pH 8.5] and [8.8 M hydrogen peroxide, 1 M Tris-HCl; pH 8.5], and the images analysed with Gene Snap and Gene Tools softwares, and Gene Genome apparatus (Syngene, Cambridge, UK).

Papildoma informacija

„Excel“ failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    supplementary table 1

  2. 2.

    Papildoma informacija

    supplementar table 2

  3. 3.

    Papildoma informacija

    supplementary table 3

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.