Į naviko kamieninių ląstelių tinklo biologiją nustatyta cbx5 reguliavimo funkcija plaučių vėžyje | mokslinės ataskaitos

Į naviko kamieninių ląstelių tinklo biologiją nustatyta cbx5 reguliavimo funkcija plaučių vėžyje | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Vėžinės kamieninės ląstelės
  • Kompiuterinė biologija ir bioinformatika
  • Onkogenezė
  • Sistemų biologija

Anotacija

Remiantis įrodymais, vėžiai, turintys į kamieną panašias savybes, susiejami su blogesne prognoze. Tinklo biologija su signalo apdorojimo mechanika buvo ištirta naudojant naviko kamieninių kamieninių ląstelių grupės (TSLC) ekspresijos profilius. Profiliai buvo palyginti su jų tėvų navikinėmis ląstelėmis (PTC) ir žmogaus embriono kamieninėmis ląstelėmis (hESC), siekiant nustatyti geno chromobox homolog 5, CBX5 , kaip galimą plaučių vėžio taikinį. Buvo nustatyta, kad CBX5 reguliuoja į kamieną panašias plaučių TSLC savybes ir prognozavo plaučių vėžio prognozę. Tyrimą palengvino ieškant taikinių genų, pagrįstų epistatinės signalizacijos mechanikos modeliavimu, naudojant prognozuojamą ir keičiamą tinkle pagrįstą išgyvenimo modelį. Topologiškai įvertinti CBX5 matavimai buvo sinchronizuoti su BIRC5 , DNMT1 , E2F1 , ESR1 , MLH1 , MSH2 , RB1 , SMAD1 ir TAF5 matavimais . Savo išvadas patvirtinome kitoje Taivano plaučių vėžio kohortoje, taip pat atliekant numušimo eksperimentus, naudojant „sh-CBX5 RNAi“ tiek in vitro, tiek in vivo .

Įvadas

Jau seniai suprantama, kad vėžys atsiranda dėl nuosekliai besivystančių genetinių įvykių. Esant solidiems navikams, piktybiniai navikai yra traktuojami kaip heterogeniško pobūdžio ligų rinkinys: genomika, transkriptominiai pokyčiai ir klinikiniai rezultatai. Pastaruoju metu įrodymai patvirtina teiginį, kad vėžys, turintis į kamieną panašias savybes, paprastai turi blogesnę prognozę 1, 2 . Kiti tyrimai parodė, kad epitelio-mezenchiminių pereinamųjų transkripcijos veiksnių per didelis ekspresija sustiprino į kamieną panašias savybes ir padidino navikinių ląstelių agresyvumą 3, 4, 5 . Mes sukūrėme keletą navikinių kamieninių ląstelių (TSLC) plokšteles galvos ir kaklo 2, 6, 7 smegenyse ir 8 krūtyse. Čia pagrindinis dėmesys skiriamas plaučių adenokarcinomoms (LAC), kurioms anksčiau mes esame sudarę plaučių TSLC grupę 9 . Iš tiesų, plaučių vėžys yra viena iš pagrindinių su vėžiu susijusių mirčių priežasčių visame pasaulyje 10 . Jo labai invaziniai ir metastazavę fenotipai yra pagrindinės nesėkmingo gydymo ir blogos prognozės priežastys 11 .

Tyrimo tikslas - nustatyti kritinį tikslą, reguliuojantį plaučių vėžio išgyvenimą ir į kamieną panašias plaučių TSLC savybes. Pastaruoju metu buvo įrodyta, kad epigenetiniai reguliatoriai, tokie kaip chromatino modifikatoriai ir polikombo grupės baltymai, yra svarbūs dalyviai priimant sprendimus dėl ląstelių likimo ir perprogramuojant 12 . Taip pat buvo žinoma, kad branduolinis pasipiktinimas vaidina svarbų vaidmenį vėžio biologijoje 13 . Atsižvelgiant į triukšmingą ir menką TSLC pobūdį, pirmiausia bandome įtvirtinti sutarimą dėl mažo variacijos ir nuoseklaus genų aktyvumo genų signalo įvairios kilmės audinių TSLC grupėje. Toks geno parašas yra svarbus, kad jis galėtų atskirti TSLC nuo tėvų navikinių ląstelių (PTC) ir nuo žmogaus embriono kamieninių ląstelių (hESC). Šiame tyrime buvo rasti praturtinti DNR metilinimo signalizacijos keliai ir chromatino architektūros nustatymas ir (arba) palaikymas konsensuso TSLC tinkluose, kuriuos sukuria konsensuso geno parašas. Remdamiesi plaučių TSLC specifiniu genų parašu, mes toliau kūrėme plaučių TSLC tinklo modelį išgyvenimo prognozei. CBX5 , chromatino reguliatorius polikombo grupėje, buvo nustatytas kaip reikšmingas taikinys atliekant plaučių vėžio išgyvenamumo analizę per keičiamą tinklą pagrįstą taikinio identifikavimo procesą. Svarbu tai, kad įsitikinome, jog CBX5 taip pat yra būtinas norint išlaikyti agresyvumą ir į kamieną panašias savybes plaučių TSLC. Mes tikime, kad mūsų darbas palaiko tvirtesnį epigenetinių veiksmų planą būsimam plaučių vėžio ir plaučių TSLC supratimui.

Mūsų tinklo modeliai yra gauti iš genų ekspresijos parašo, atsižvelgiant į naviko kamieną primenančias būsenas. Į tinklo modelį įtraukta topologiškai svertinė signalų mechanika skirta išskaidyti galimą funkcinio triukšmo vaidmenį. Kelios įrodymų eilutės parodė, kad embriono kamieninėse ląstelėse buvo stebimi stochastiniai genų ekspresijos svyravimai, dėl kurių susidarė skirtingos linijos ir ląstelių likimai 14, 15, 16 . Tyrinėtojai taip pat bandė integruoti elektrinius potencialus neuronuose ir smegenų funkcinio magnetinio rezonanso vaizdus 17 santykinio tinklo modeliais, kad suprastų triukšmingus signalus. Todėl mes siūlome tokį tinklu pagrįstą topologiškai įvertintą signalo modelį, kad būtų galima įvertinti atskirų vėžio išgyvenamumo laiką.

Apibendrinant galima pasakyti, kad šiame darbe buvo sukurti tinkliniai modeliai, pagrįsti TSLC plokštėmis, siekiant padėti suprasti biologinį pasipiktinimą, dėl kurio keičiasi plaučių vėžiu sergantys pacientai. Buvo tikimasi, kad tokie tinklu pagrįsti modeliai galėtų papildomai išaiškinti reguliavimo mechanizmus, sukeliančius naviko invaziją ir metastazes. Duomenų galite rasti GEO GSE35603. Visų analizių R kodus galima pasiekti apsilankant //sites.google.com/site/nwtoposignalincancer/.

Rezultatai

Iš ankstesnės patirties, susijusios su TSLC, mes nustatėme, kad TSLC grupės buvo gana nevienalytės, priklausomai nuo eksperimentinių auginimo procedūrų ir (arba) pradinių naviko mėginių. Be to, dėl menko TSLC pobūdžio buvo sunku turėti išsamų TSLC transkriptą vieno naviko tipui. Todėl šiame tyrime pirmiausia siekėme išsiaiškinti, ar patikimumas ir svarba yra svarbūs TSLC skydelyje. Tada mes pradėjome kurti išgyvenamų plaučių vėžio taikymo modelį, pagrįstą bendrais ir nuosekliais genų ekspresijos profiliais plaučių CD133 + - TSLC.

Plaučių TSLC apibūdinimas

Naujausi tyrimai parodė, kad CD133 ekspresija sergant plaučių vėžiu rodo didelį tumorigeninį poveikį ir atsparumą citotoksiniam gydymui 18, 19 . Anksčiau pranešėme apie didesnį CD133 + -TSLC, atskirtų nuo nesmulkialąstelinių plaučių vėžio (NSCLC), cheminį atsparumą cheminiams spinduliams, palyginti su CD133 + -NSCLC 9 . Čia mes išskyrėme CD133 + -TSLC iš 7 NSCLC (1a pav.). Pavieniai plaučių CD133 + -TSLC skysčiai gali sudaryti plūduriuojančius sferoido pavidalo kūnelius terpėje, kurioje nėra serumo, lengviau nei CD133 -NSCLC. Kiekybiniai RT-PGR rezultatai parodė aukštesnį kamieninių genų ( Oct4 , Sox2 ir Nanog ) ir vaistams atsparių genų ( MDR1 , ABCG2 ) nuorašų kiekį plaučių CD133 + -TSLC (1b pav.). Plaučių CD133 + -TSLC parodė ne tik didesnį invazijos aktyvumą, padidėjusį židinių susidarymą, bet ir atsparumą cisplatinai, doksorubicinui ir taksoliui (1c – e pav.). In vivo plaučių CD133 + -TSLC transplantacijos parodė daugiau agresyvaus plaučių tumorigeniškumo (1 lentelė).

Image

(a) Plaučių CD133 + -TSLC buvo surūšiuoti ir apibūdinti FACS tyrimu ir kultivuoti bFGF ir EGF su DMEM terpe, kurioje nėra serumo. (b) PTC, CD133 -NSCLC ir plaučių CD133 + -TSLC buvo išmatuoti Oct4 , Sox2 , Nanog , MDR1 ir ABCG2 santykiniai mRNR lygiai. (c – e) Ląstelių gyvybingumo vertinimas gydant cisplatina, doksorubicinu ir taksoliu PTC, CD133 –NSCLC ir plaučių CD133 + –TSLC. (* P <0, 05) Visi pateikti rezultatai yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD. Mėginiai buvo paimti iš 1 lentelėje nurodyto paciento Nr. 1.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Skirtingi TSLC tinklų tarpmodulinių stebulių aiškūs transkripcijos modeliai

Pirmiausia atlikome diferencinės ekspresijos analizę tarp TSLC ir PTC grupių kiekvienam naviko audinio tipui arba eksperimentine technika, kad sudarytume aštuonis genų sąrašus. Šie sąrašai yra panašaus ilgio ir nustato filtravimo slenkstį 87, 5% absoliučiosios vertės pokyčių vertės kaip filtravimo slenkstį, sujungtą kaip A gensetas (S1 pav., S1 lentelė). Antra, mes įvertinome 500 geriausių zondų, turinčių minimalų transkripcijos kintamumą TSLC. Apibendrintas nerezultatyvus genų rinkinys B, susidedantis iš 459 zondų, turinčių mažą transkripcijos kintamumą TSLC, taip pat genų rinkinys A. Trečia, mes išfiltravome genų parašus su nenuosekliu TSLC aktyvumu, palyginti su PTC, kad būtų lygiavertis geno rinkinys C. Mes nustatėme 64-ų zondų, pasižyminčių mažu variacija ir bendrumu, genų konsensuso sąrašą ( lv_com ). Buvo nustatyta, kad jie ne tik turi lygiagretų genų aktyvumą mažiausiai dviejuose navikų tipuose / eksperimentinėse sąlygose, bet ir diferencijuotai išreiškiami mažiausiai dviejuose navikų tipuose / sąlygose (n = 18) arba pasižymi minimaliais transkripcijos pokyčiais TSLC (n = 46). Atliekant klasterizaciją, „ lv_com“ sutarimas dėl genų parašo parodė, kad jis geriausiai atsiskiria iš trijų ląstelių plokščių. TS2, PTC ir hESC hierarchinis grupavimas ir nemetrinis daugialypis mastelio keitimas, pagrįstas lv_com, buvo parodyti S2 pav. Naudojant lv_com kaip indėlį atliekant išradingumo kelių analizę (IPA), nustatyta, kad DNR metilinimo ir transkripcijos represinių signalų perdavimo būdai yra žymiai praturtinti (Fišerio tikslus testas, −log (P vertė) = 4, 17). Išvestiniai literatūros tinklai buvo sujungti su žmogaus baltymų ir baltymų sąveika (PPI). Mes sujungėme ryšius sujungtuose tinkluose, nustatydami genų ir genų saviraiškos slenkstį TSLC. Tarp visų TSLC yra 77 saitai, kurių abs (Pearson koreliacijos koeficientai; PCC) yra> 0, 4 ​​iš visų sujungtų tinklų 161 saitų (S3 pav.; S2 ir 3 lentelė). 77 jungčių PCC daugiausia buvo teigiamos, maksimalus 0, 92 tarp HNRNPD ir ILF3 . TSLC konsensuso tinkluose yra 49 genai, topologiškai suskirstyti į 12 modulinių centrų, 22 vidinius modulinius centrus ir 15 periferinių genų. Atkreiptinas dėmesys, kad tarpparlamentinių stebulių grupėje vidutinis genų aktyvumas ( Exprs ) ir TSLC SNR statistiškai skyrėsi nuo HESC ar PTC (S2 pav.). DNMT3A buvo vienintelis genas, išskiriantis tris plokštes (S4 pav.). Genų ontologijos (GO) funkcinis komentaras atskleidė biologinių procesų, kuriems būdingi šie du skirtingi tipai, tipus (2 lentelė). Visi moduliniai stebulės buvo membranos būdu sujungtos viduląstelinės organelės, ir 43% jų dalyvavo kuriant ir (arba) palaikant chromatino struktūrą. Visi tarpmoduliniai stebulės turėjo molekulinę baltymų jungimosi funkciją.

Pilno dydžio lentelė

Tinklo signalizavimas plaučių-TSLC tinkluose

Plaučių-TSLC tinkluose yra 96 ​​genai - 25 tarpparlamentiniai stebulės, 44 vidiniai moduliniai stebulės ir 27 periferijos genai - ir 144 saitai (S5 pav.; S4 ir 5 lentelė). Tinkle paremta išgyvenimo analizė buvo atlikta naudojant du skirtingus narių genų rinkinius, ty tik stebulinius genus ( Nj = 69) arba visus plaučių-TSLC tinklų genus ( Nj = 96), taip pat naudojant skirtingą svorių ir svertų genų derinį. ( Ni ): (1) moduliais išdėstytos stebulės, pasvertos laipsniais; 2) tarptinkliniai mazgai, pasverti laipsniais; 3) tarpląsteliniai mazgai, pasverti židiniu; 4) laipsnio svoriais įtaisyti ir moduliniai mazgai; ir (5) moduliais išdėstytos stebulės, pasvertos laipsniais, plius tarpląstelinės modulinės stebulės, pasvertos židiniu. Mes apskaičiavome „ Exprs“ , „ wt.Exprs“ , „ Mag“ , „ Specr“ ir SNR matavimus, gautus iš kiekvieno kombinuotojo tinklo modelio ( Ni prieš Nj ) ir išbandėme juos išgyvenimo analizėje. Suskirstę plaučių vėžiu sergančius pacientus į kvartilius, atsižvelgiant į tinkle atliktus matavimus, mes nustatėme, kad bent vienas matavimo tipas gali reikšmingai suskirstyti pacientus į 2–4 rizikos grupes (S6 lentelė). Norėdami išvengti galimybės, kad kiekviename duomenų rinkinyje yra per mažas imties dydis, mes toliau atlikome metaanalizes, naudodamos surinktus išgyvenimus be metastazių (MFS; n = 374) ir bendrą išgyvenamumą (OS; n = 828). Tarpmodulinių stebulių ekspreso vertės nuolat buvo reikšmingos OS ir MFS prognozės. Kalbant apie MFS, tiek vidinių , tiek tarpmodulinių stebulių „Exprs“ , „ wt.Exprs“ , „ Specr“ ir SNR matavimai parodė tendencijos panašumą (S6 lentelė). Mes spėliojome, kad plaučių-TSLC tinklo modelis gali būti jautresnis naviko progresavimui.

CBX5 reguliavimo vaidmens nustatymas plaučių-TSLC tinkluose, moduliuojančiuose plaučių vėžio išgyvenamumo pokyčius

Norėdami nustatyti galimus taikinius plaučių-TSLC tinkluose, išgyvenimo analizėje mes išbandėme kiekvieną atskirą geną kaip sveriantį geną ( Ni = 1; Nj = 69). Tinklu pagrįsti matavimai buvo apskaičiuoti ir pirmiausia išbandyti išgyvenamumo analizėmis, pagrįstomis kvartilėmis, o tada išbandyti tiesiniu modeliu, atitinkančiu išgyvenamumo laiką. Genai, rodantys statistinį reikšmingumą keliuose tyrimuose, buvo suskirstyti į 3 grupes: (1) susiję su OS; MLH1 ir SMAD1 ; (2) susijusios su MFS; CBX5 , CPSF1 , DNMT1 , HNF1 , IRS1 , KPNA2 , MSH2 ir RASA1 ; ir (3) susijusios su OS / DFS; CDC2 , COL18A1 , RACGAP1 ir SHC1 .

CBX5 buvo pasirinktas kaip tolesnio jo galimo vaidmens išgyvenant plaučių vėžio ir plaučių TSLC patvirtinimo tikslą, remiantis MFS analizėmis, naudojant viešą plaučių vėžio transkriptą. Visų pirma, CBX5 ekspresų , specifinių parametrų ir SNR kiekiai kvartiliuose reikšmingai parodė panašų į dozę poveikį. Be to, CBS5 Exprs ir SNR lygiai buvo reikšmingai koreliuojami su MFS išgyvenamumo laiku grupėje, kurioje be metastazių (2a – c pav.). Be to, tarp CBX5 Spec ir MFS laiko abipusio metastazių grupės egzistavo bendras tiesinis modelis (2b pav.). Verta pažymėti, kad CBX5 iš pradžių buvo rastas diferencijuotai išreikštas netipinio teratoidinio / rabdoidinio naviko TSLC (AT / RT-TSLC) ir nuosekliai indukuojamas plaučių TSLC. Tinklo modelių topologinės CBX5 charakteristikos gali paaiškinti jo vaidmenį TSLC. CBX5 buvo modulinis šakotuvas, sujungtas su RB1 ir E2F1 plaučių-TSLC tinkluose, taip pat tarpsmodulinis šakotuvas, sujungtas su DNMT3A bendruose TSLC tinkluose.

Image

(a – c) CBX5 ekspresų , specifinių parametrų ir SNR kvartilinių grupių DFS analizė . Xy brėžiniai su bendru linijiniu modeliu (GLM) tinka CBX5 „Exprs“ ir SNR palyginimui su MFS laiku. Xy brėžiniai su GLM tinka CBX5 specifikacijai , palyginti su MFS laiku. Metastazėmis sergantys pacientai nusidažo raudona spalva ir geltona be metastazių. (* P <0, 05) (d) CBX5 mRNR kiekiai, naudojant kiekybinį realaus laiko PGR iš 20 pirminio LAC porų, palyginti su gretimais neaugliais plaučių audiniais. Taip pat buvo parodytas CBX5 mRNR lygis tarp vietinių plaučių ir metastazavusių 10 pacientų porų pažeidimų. Rezultatai yra trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± SD. e) Reprezentatyvūs skirtingo laipsnio LAK sergančių pacientų imunohistocheminio dažymo CBX5 dažymas (kairysis, žemas; dešinysis, aukštas). Bendro išgyvenamumo analizė pagal CBX5 ekspresijos lygius 125 Taivano LAC pacientams.

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar CBX5 dalyvavo plaučių augliogenezėje , mes ištyrėme CBX5 lygius 20 porų LAC mėginių (T), palyginti su atitinkamomis kontrolėmis (N), atlikdami qRT-PCR analizę. CBX5 RNR nuorašai buvo žymiai didesni navikų mėginiuose, taip pat ir metastazavusių pažeidimų atvejais (2d pav.). Toliau surinkome kitą Taivano LAC pacientų patvirtinimo kohortą imunohistocheminiam dažymui (S7 lentelė). Rezultatai patvirtino, kad CBX5 teigiami LAC atvejai buvo siejami su blogesniu išgyvenamumu (2e pav.).

CBX5 patvirtinimas reguliuojant plaučių TSLC atnaujinimą

Bandėme patikrinti CBX5 reikšmę plaučių vėžio tumorigeniškumui ir invaziškumui, atlikdami CBX5 sh-RNAi numušimą plaučių TSLC (3a pav.). Mes parodėme, kad sh-CBX5 RNRi gydomų CD133 + -TSLCs sferų formavimosi, kolonijų formavimosi ir migracijos / invaziškumo galimybės iš tikrųjų buvo žymiai slopinamos (3b – d pav.). Be to, dramatiškai sumažėjo CD133 + -TSLC ir šoninių populiacijos (SP) ląstelių, apdorotų sh-CBX5 RNRi, procentas (3e – g pav.).

Image

a) Dviejų pacientų (Nr. 1 ir 2) plaučių CD133 + -TSLC tiriamųjų CBX5 sunaikinimo Western blot analizė. (B) sferos formavimo, (c) kolonijų susidarymo ir (d) migracijos gebėjimai CD133 + -TSLC, apdorotuose sh-CBX5 RNR, buvo sumažėję. (E – f) CD133 + -TSLC ir (g) SP ląstelių procentas buvo žymiai sumažėjęs. (h) Taikydami RT-PCR, mes išmatuojome BIRC5 , SMAD1 , MSH2 , DNMT1 , E2F1 , RB1 , TAF5 , ESR1 , MLH1 ir SIN3A ekspresijos lygių slopinimą sh-CBX5 RNAi apdorotuose plaučių CD133 + -TSLC. Šie genai buvo identifikuoti statistiškai reikšmingu ryšiu su CBX5 atliekant plaučių vėžio išgyvenamumo analizę. Visi pateikti duomenys yra trijų eksperimentų vidurkis ± SD. (* P <0, 05)

Visas dydis

Norėdami suprasti CBX5 genų ir genų interpelius plaučių TSLC tinkluose, apskaičiavome porų koreliacijas tarp CBX5 Exprs , Mag , Spec ir SNR lygių su išgyvenamumo reikšmingų genų lygiais, naudodamiesi plaučių vėžio transkriptu. Mes nustatėme, kad CBX5 buvo reikšmingai koreliuojamas su išgyvenamumo genais, tokiais kaip BIRC5 ir DNMT1, tarp pacientų, kuriems be metastazių. Koreliacija tarp Spec arba SNR lygių buvo didesnė nei Exprs ar Mag . Šie rezultatai parodė, kad genų genų reguliavimo kontrolė iš tiesų buvo sinchronizuota pagal tokį tinklu pagrįstą modelį, ypač atsižvelgiant į genų narystę, tinklo topologiją, taip pat į signalo stochastiškumą. Toliau bandėme eksperimentiškai patvirtinti nustatytą koreliuotą sinchronizaciją tarp CBX5 ir išgyvenamumo reikšmingų genų, naudodami in vitro sh-CBX5 RNR slopinimą plaučių CD133 + -TSLC. Naudodami RT-PCR, mes nustatėme sumažėjusius BIRC5 , DNMT1 , E2F1 , ESR1 , MLH1, MSH2 , RB1, SMAD1, SIN3A ir TAF5 mRNR ekspresijos lygius ir plaučių CD133 + -TSLC, apdorotus sh-CBX5 RNR (3h pav.). . Mūsų rezultatai rodo, kad CBX5 numušimas plaučių TSLC gali tuo pat metu slopinti šiuos koreliuojamus išgyvenimo reikšmingus genus.

CBX5 patvirtinimas moduliuojant plaučių karcinomos tumorigeninį ir agresyvų poveikį in vivo

In vivo modeliai buvo naudojami toliau tiriant „sh-CBX5 RNAi“ numušimo poveikį. Sušvirkšdami 2 × 10 5 sh-CBX5 RNRi apdorotus plaučių CD133 + -TSLC ir vs. sh-Luc kontrolinius mėginius per uodegos veną po 8 savaičių parodėme, kad tumorigeninis įsisavinimas, naviko augimo greitis (4a pav.) Ir metastazavęs polinkis plaučiams per plaučių CD133 + -TSLC (4b ir c pav.) buvo aiškiai užblokuoti „sh-CBX5 RNAi“ numušimu. Plaučių vėžiui chirurgija yra dabartinis priežiūros gydymo standartas. Tačiau lokaliai išplitusiems plaučių navikams (3b ar aukštesnei stadijai), kurių nepavyksta pašalinti chirurginiu būdu, gydymas kombinuotu radiacijos ir chemoterapijos būdu pagerins išgyvenamumą. Todėl, atsižvelgiant į agresyvų plaučių CD133 + -TSLC pobūdį, mes toliau bandėme parodyti, kad gydymas sh-CBX5 RNR reikšmingai padidina CD133 + -TSLCs radiacinį jautrumą ir in vitro (4d pav.). Pelėms, persodintoms naudojant sh-CBX5 RNAi apdorotus plaučių-TSLC, taip pat žymiai pailgėjo išgyvenamumas (duomenys neparodyti).

Image

2x105 plaučių CD133 + -TSLC, apdoroti sh-CBX5 RNR arba sh-Luc kontrole, buvo įšvirkšti per NOD-SCID pelių uodegos veną (n = 6 kiekvienoje grupėje). Gyvūnai buvo paaukoti ir ištirti praėjus 8 savaitėms po injekcijos. a) Naviko tūris ir b) metastazavusių židinių (strėlių) skaičius plaučiuose buvo analizuojami atliekant ex vivo GFP vaizdus ir histologinį tyrimą. (c) 2, 4, 6, 8 ir 10 Gy poveikis buvo įvertintas CD133 + -TSLC, apdorotais sh-Luc arba sh-CBX5 RNR. Pateikti duomenys yra 3 eksperimentų vidurkis ± SD. (d) CBX5 sunaikinimas plaučių CD133 + -TSLC efektyviai sumažino plaučių metastazių skaičių persodintose pelėse. SH-CBX5 RNR gydymas kartu su 4 Gy IR dar labiau padidino priešnavikinį efektyvumą (* P <0, 05).

Visas dydis

Diskusija

Mes nustatėme, kad CBX5 yra galimas taikinys, reguliuojantis plaučių vėžio išgyvenimą ir į kamieną panašias plaučių CD133 + -TSLC savybes. Be to, statistiškai patikrinta ir eksperimentiškai patvirtinta CBX5 sąsaja su kitais genais plaučių-TSLC tinklo modelyje. Pacientų, sergančių didesniu CBX5 geno aktyvumu, plaučių vėžiu prognozė buvo prastesnė, o CBX5 sunaikinimas naudojant sh-RNR plaučių CD133 + -TSLC parodė mažesnį agresyvumą in vivo . Mes pademonstravome, kad atsižvelgiant į tinklo topologijos ir signalizacijos mechanikos kontekstą yra įmanoma pritaikyti ir nuspėjamą taikinių identifikavimo metodą.

CBX5 , labai konservuotas nehistono baltymas, turintis chromatino organizacijos modifikatoriaus domeną, ty chromodomenas, priklauso heterochromatinų baltymų šeimai 20 . Buvo nustatyta, kad graužikų ir D. melanogasterio ląstelėse CBX5 sąveikauja su H3K9me3 arba kolokalizuotas su H3K9me į heterochromatino sritis 21 . Heterochromatino vaidmuo transkripciniame genų nutildyme ir tolimoje chromatino sąveikoje yra gerai žinomas. Tačiau buvo nustatyta, kad žinduolių ląstelėse CBX5 ir H3K9me yra susijusios su aktyvuotų genų kodavimo sritimis, nors galimas mechanizmas nebuvo aiškus. Įrodymai taip pat parodė, kad CBX5 tarnavo kaip bendras genų ekspresijos parašas, kurį dalijasi subrendę žmogaus oocitai ir embriono kamieninės ląstelės 22 . Neseniai Wongas ir kolegos nustatė, kad ATRX, dirbantis kartu su H3.3 ir CBX5, gali būti pagrindinis ES ląstelių telomero chromatino 23 reguliatorius. Čia CBX5 buvo identifikuotas tiek konsensuso TSLC, tiek plaučių-TSLC tinklo modeliuose. Mūsų išvados taip pat patvirtino naujausią išvadą 24, kad CBX5 buvo būtinas palaikant leukemijos kamienines ląsteles (LSC). Iki šiol mes pirmieji pranešėme apie CBX5, atliekantį esminį vaidmenį kontroliuojant plaučių TSLC, taip pat esant piktybinėms plaučių karcinomoms. Atliekant išgyvenimą svarbūs genai, nustatyti iš mūsų analizės, ypač identifikuotas tikslinis genas CBX5 , dar kartą pabrėžė epigenetinės reguliavimo kontrolės svarbą. Taigi, plaučių-TSLC tinklo modelis sudarė ryšį tarp eksperimentiškai auginamų plaučių-TSLC ir klinikinio plaučių vėžio išgyvenimo laiko, turintį statistinę reikšmę ir mechanistinį supratimą.

Naujausi Bröske ir jo kolegų darbai parodė, kad DNMT1 yra būtinas ląstelių autonominiam hematopoetinių kamieninių ląstelių (HSC) ir LSC išgyvenimui 25 . DNMT3A ir DNTM3B atliekamas de novo metilinimas taip pat buvo įrodytas būtinas HSC atnaujinti, bet ne diferencijuoti 26 . Mūsų išvados apie DNMT3A TSLC-konsensuso tinkle ir DNMT1, sinchronizuotą su CBX5 plaučių-TSLC tinkluose, buvo suderinami su aukščiau paminėtomis ataskaitomis. Mes supratome, kad tinklo modeliai buvo sukurti remiantis žinoma genų sąveika ir žiniomis. Nepaisant to, aukšta saviraiškos reikšmė TSLC suteikė geresnį pagrindimą jų pagrįstumui. PCC, parodantis DNMT1 koekspressiją su E2F1, buvo 0, 98, o su BIRC5 - 0, 87; DNMT3A PCC ir CBX5 buvo atitinkamai 0, 72, EED - 0, 62 ir MYC - 0, 48. Bendrai mes palaikėme ir išplėtėme TSLC epigenetinių taisyklių svarbą. Tačiau norint suprasti pagrindinį reglamentą, jis lieka atviras.

Buvo sukurti tinklo pagrįsti išgyvenimo modeliai krūties vėžiui 27 ir glioblastomai 28 . Mes pirmieji atkreipėme dėmesį į stochastinių genų ekspresijos veiklą, įterptą į biologinius tinklus, apibendrindami juos į triukšmą primenančioje Spec ir SNR piktybinėse plaučių karcinomose. Šis metodas kiekvienam pacientui suteikia unikalų įvertintą profilį, kad būtų galima apibendrinti kintamąjį transkripcijos parašą tame pačiame genų rinkinyje tinklo modelyje. Pabaigoje mes parodėme, kad stochastinis plaučių vėžio transkripcijos profilių elementas, atsižvelgiant į santykinį modelį, pagrįstą plaučių-TSLC tinklais, gali būti naudingas įvertinant prognozuojamą išgyvenimo laiką. Galiausiai metodika yra bendro pobūdžio, o ateityje ją naudojant kitose tyrimų srityse bus nustatytas jos tvirtumo ir pritaikomumo pagrįstumas.

Metodai

Mikro matricų duomenys

(1) PTC ir TSLC: kultivuojami TSLC buvo šešių kilmės audinių: krūties, plaučių, storosios žarnos, galvos ir kaklo, glioblastomos ir AT / RT, kurių motininės ląstelės buvo MCF7, A549, SW480 ir HT29, FaDu ir SAS, PT1 (pirminė kultūra) ir U87, ATRT, BT, BT6 ir BT12. TSLC buvo kultivuoti metodais, aprašytais kitur 2, 3, 6, 7, 8, 9 . Norėdami nustatyti plaučių TSLC, mes išskyrėme CD133 + -TSLC iš NSCLC pacientų audinių mėginių, naudodami FACS tyrimo magnetinių granulių metodą. Mes ekstrahuojame ir išgryniname bendrą RNR pagal kitur paskelbtas procedūras 2 . RNR buvo hibridizuota „Affymetrix GeneChip HG-U133 plus 2.0“ mikropaveiksluose genomo branduolio objektuose Nacionaliniame Yang-Mingo universiteto genomo tyrimų centre. (2) hESC: Oocitų (GSE12034, N = 3) ir žmogaus embriono kamieninių ląstelių (hESC) mikrotraumai buvo atsisiųsti iš NCBI genų ekspresijos omnibuso (GEO) (GSE7879: VUB01, N = 3; SA01, N = 3; ir „Sheff4“ hESC, N = 3. GSE9440: T3ES, N = 3. H1 hESC, N = 4, gauti iš GSE9196 ir GSE9510. H9 hESC, N = 6, iš GSE9196, GSE9510 ir GSE9940). Išsamesnės informacijos ieškokite S1 lentelėje. Visų trijų grupių genų ekspresijos duomenis buvo galima atsisiųsti iš GEO GSE35603. (3) Plaučių vėžio transkriptas: Aštuoni duomenų rinkiniai su išgyvenusiais plaučių vėžiu buvo atsisiųsti iš GEO ir papildų, kaip aprašyta 29, 30, 31, 32 .

Iš anksto sudarytas genų rinkinys

Buvo sudarytas genų sąrašas (5812 GeneID), siekiant įtraukti migracijos 33, 34, kamieno 1, 35, su kalciu susijusius procesus 36 ir vėžiui būdingų nuorašo variantų 37, 38 savybes, skirtus genų ekspresijos analizei.

Genų ekspresijos analizė

Analizės srauto diagramą žr. S1 pav. Visos CEL bylos buvo iš anksto apdorotos ir standartizuotos, kai vidurkis lygus nuliui ir SD buvo 1. Analizei naudojome „R / Bioconductor“ programinę įrangą. Diferencialinė genų ekspresijos analizė buvo kontroliuojama, kai FDR <0, 05 39, ir buvo nustatyta atsižvelgiant į TSLC ir PTC kartų pokyčių slenkstį, kad būtų sugeneruotas genų rinkinys. Variacijos koeficientas 40 buvo apskaičiuotas taip, kad reitinguotų 500 geriausių zondo mažiausio transkripcijos kintamumo TSLC. Mes sujungėme A geno rinkinį ir mažo kintamumo genų parašus (kaip B geno rinkinį) ir toliau išskyrėme tuos geno parašus su nenuosekliu TSLC aktyvumu, palyginti su PTC (kaip C geno rinkinys). Tarp genų parašų su lygiaverčiu genų aktyvumu mažiausiai dviejuose navikų tipuose / eksperimentinėse sąlygose mes nustatėme pirmąjį 64 zondų sąrašą, diferencijuotai išreikštus bent dviem naviko tipais / eksperimentinėmis sąlygomis, arba iš mažo kintamumo genų TSLC, žymimų kaip konsensuso genų sąrašą, pasižymintį mažu pakitimu ir bendrumu ( lv_com ). Iš C genezės mes nustatėme antrąjį 145 zondų sąrašą (įskaitant 14 zondų iš lv_com ), kurių genų aktyvumas plaučių TSLC yra pastovus, palyginti su plaučių PTC.

Tinklo kūrimas iš literatūros žinių bazės, žmogaus baltymų ir baltymų sąveikos (PPI) ir kultivuotų TSLC saviraiškos profilių

Literatūros tinklai (svg failai), naudojantys „ lv_com“ ir „plaučių-TSLC“ lygiagrečius genų parašus kaip įvestis IPA, buvo išgauti, analizuoti ir sudaryti 41 . Norėdami rasti „Perl“ scenarijų ir R kodą, apsilankykite papildomoje svetainėje. Susiję iš IPA sugeneruoti išvestiniai genai, taip pat įvestieji genai buvo toliau susieti su žmogaus PPI, atsisiųsti iš NCBI (HPRD, BioGrid ir BIND). PPI bus gaunami tada ir tik tada, kai bus suabejota abiem reagentais. Tada IPA sugeneruoti tinklai buvo sujungti su suplanuotais žmonių PPI. Norėdami sujungti tinklo modelius, mes apskaičiavome kiekvienos sujungto tinklo genų ir genų sąveikos Pearson koreliacijos koeficientus (PCC), naudodamiesi tik TSLC ir tik plaučių TSLC. Absoliučios koekspressijos PCC vertės buvo apskaičiuotos naudojant visus TSLC ir 0, 4 buvo nustatyta kaip ribinė riba konsensuso TSLC tinklams. Plaučių-TSLC tinklams mes nustatėme abs absentūros ribinę vertę (PCC plaučių TSLC)> 0, 8. Slenksčiai buvo nustatyti taip, kad mazgų skaičius galutiniuose tinkluose būtų mažesnis nei 100. Funkcinių anotacinių genų grupavimas TSLC-konsensuso tinkluose buvo išanalizuotas DAVID (duomenų bazė anotacijos vizualizacijai ir integruotam atradimui, NIH) 42 .

Tinklo topologinė analizė ir prognoziniai matavimai, gauti iš signalo apdorojimo mechanikos

Tinklo topologinė analizė ir genų klasifikacija buvo atlikta pagal anksčiau paskelbtus metodus 41 . Tinklo signalo apdorojimo mechanikai apibūdinti mes sukūrėme penkis matavimus: išraiškos lygis ( Exprs ); topologiškai svertinis išraiškos lygis ( wx.eksprs ); 0 laipsnio dydis ( Mag ), ty transkripcinio signalo amplitudė; 1 eilės ypatybių spektras ( Spec ), ty santykinis transkripcijos triukšmas poromis; ir signalo bei triukšmo santykį ( SNR ). Tinklo modelyje būtų N i sveriantys genai, taip pat N j narių genai, keičiamo dydžio. Kiekvienam genui g priskyrėme topologinės savybės dydį, wt g . Svarbu tai, kad wt g skiriasi pagal topologinę grupę: tai yra nulis periferijos genams; laipsniai (sujungtų mazgų skaičius) vidinėms modulinėms stebulėms; ir tarpus, arba apskaičiuotas perturbacijos (židinio) poveikis 41 moduliniams stebuliams. Tada vieno sveriančio geno g atveju modelyje su N j genais išraiškos vertė ( Exprs ) buvo θ g ; wt.Exprs buvo wt g * θ g reikšmė; Magas būtų

Image

; Spec būtų apskaičiuojamas taip:

Image
; ir SNR būtų apibrėžti kaip
Image
. N i svorio genų grupei vidutinės vertės būtų „ Exprs“ , „ wt.Exprs“ ir „ Mag“ . Spec būtų apskaičiuojamas taip:
Image
ir SNR nepakito.

Statistinė ir išgyvenimo analizė

Statistiškai reikšmingų vidurkių ar pasiskirstymų reikšmingumui nustatyti buvo naudojamas Studentų t testas ir Kolmogorovo-Smirnovo testas. Kaplan-Meier išgyvenimo kreivės, pagrįstos tinklinių prognozinių matavimų kvartiliais, buvo patikrintos log-rank testais. Taip pat pritaikėme Cox proporcingo pavojaus regresijos modelį ir panaudojome Valdo bandymo statistiką, norėdami nustatyti genų dozavimo poveikio tendencijas. Nustatytas statistinis reikšmingumas esant P <0, 05. Norėdami sužinoti R kodus, naudojamus išgyvenamumo analizei, apsilankykite papildomoje svetainėje.

Klonogeninis tyrimas

Atliekant klonogeninį tyrimą, ląstelės buvo veikiamos skirtingais chemoterapiniais preparatais (cisplatina, doksorubicinu ir taksoliu) (10 μg / ml). Po 10 dienų inkubacijos kolonijos (> 50 ląstelių kiekvienoje kolonijoje) buvo fiksuotos ir dažytos 20 minučių tirpalu, kuriame buvo krištolo violetinė ir metanolio. Ląstelių išgyvenimas buvo nustatytas kolonijų susidarymo tyrimu. Plokštelės efektyvumas (PE) ir išgyvenamumo frakcija (SF) buvo apskaičiuoti taip: PE = (kolonijos skaičius / inokuliuotų ląstelių skaičius) x 100%. SF = suskaičiuotos kolonijos / (ląstelės pasėtos x (PE / 100)).

„Western blot“ tyrimas

Penkiolika mikrolitrų mėginio buvo virinama 95 ° C temperatūroje 5 minutes ir atskirtos 10% SDS-PAGE. Baltymai pernešti į Hybond-ECL nitroceliuliozės popierių (Amersham) šlapio pernešimo sistema. Pagrindiniai naudoti antikūnai buvo triušio antikūnai prieš žmogaus žmogų CBX5 (ląstelių signalizacijos technologija). Reaktyviųjų baltymų juostos buvo aptiktos ECL aptikimo sistema (Amersham).

Ląstelių invazijos in vitro analizė ir minkšto agaro tyrimas

Buvo naudojama 24 šulinėlių plokštelė „Transwell®“ su polikarbonato filtro membrana (pora 8 μm; Koringas, Jungtinė Karalystė). Ląstelių suspensijos buvo pasėtos į viršutinį Transwello kameros skyrių, kurio tankis 1x105 ląstelių 100 µL terpės, kurioje nėra serumo. Priešingas filtro membranos paviršius, nukreiptas į apatinę kamerą, 3 minutes buvo dažytas Hoechst33342, o migruojančios ląstelės buvo vizualizuotos apverstu mikroskopu. Švelnaus agaro tyrimui šešių šulinėlių kultūros indo kiekvieno šulinio (35 mm) dugnas buvo padengtas 2 ml agaro mišinio (DMEM, 10% (v / v) FCS, 0, 6% (m / v)). agaras). Po to, kai apatinis sluoksnis sukietėjo, buvo pridėta 2 ml viršutinio agaro ir terpės mišinio (DMEM, 10% (v / v) FCS, 0, 3% (m / v) agaro), kuriame yra 2 x 104 ląstelių, ir inkubuota 37 ° C temperatūroje. 4 savaites. Plokštelės buvo nudažytos krištolo violetiniu. Kolonijų skaičius buvo suskaičiuotas naudojant pjaustymo mikroskopą.

Kiekybiniai realaus laiko RT-PGR ir pacientų bei audinių mėginiai

Plaučių adenokarcinomos (LAC) ir gretimi necceriniai audiniai operacijos metu buvo gauti iš 20 pacientų, esančių Taipėjaus veteranų bendrojoje ligoninėje. Visi pacientai davė informuotą sutikimą, gavę įstaigos patvirtinimą. Bendra RNR buvo išgauta iš audinių mėginių naudojant TRIzol pagal gamintojo protokolą (Invitrogen, Carlsbad, CA). Buvo atlikta amplifikacija ir PGR reakcija (Roche, Alameda, CA). Kiekvienam mėginiui buvo paruoštos standartinės kreivės (ciklo slenkstinės vertės prieš šablono koncentraciją) ir kiekvieno mėginio endogeninei atskaitai (GAPDH).

Pacientai ir imunohistochemija (IHC)

Nuo 1995 m. Iki 2009 m. Taipėjaus veteranų bendrojoje ligoninėje buvo operuota 125 pacientams, sergantiems operuojamais LAC, kuriems anksčiau nebuvo radiacijos ar chemoterapijos (S6 lentelė). Visi pavyzdžiai buvo gauti gavus informuotą sutikimą pagal Helsinkio deklaracijos principus. Audinių mėginiai buvo pastebėti ant stiklinių skaidrių, kad būtų galima dažyti IHC, deparafinuoti, rehidratuoti, apdoroti antigeno atrinkimu, naudojant 1x trilogiją, praskiestą H 2 O (Biogenika), 10 minučių panardinant į 3% H 2 O 2 ir 3 kartus plaunami PBS. Tada audinių dalys buvo užblokuotos serumu („Vestastain Elite ABC kit“, „Vector Laboratories“, Burlingame, CA) 30 min., Po to inkubuojamos su pirminiu triušio anti-žmogaus CBX5 (ląstelių signalizacijos technologija) antikūnu PBS tirpale kambario temperatūroje. val., tris kartus plaunamas PBS, inkubuojamas su biotinu pažymėtu antriniu antikūnu 30 min., inkubuojamas su streptavidino-krienų peroksidazės konjugatais 30 min., tris kartus plaunamas PBS ir panardinamas chromogenu 3-3′-diaminobenzidinu ir H2 . O 2 substrato tirpalas (Vector® DBA / Ni substrato rinkinys, SK-4100, Vector Laboratories, Burlingame, CA) 10 min. Hematoksilinas buvo uždėtas prieš dažymą („Sigma Chemical Co.“, JAV). Tyrimo patologai, aklai vartodami klinikinius duomenis, ištyrė ir įvertino IHC dažymą. Interpretacija buvo atlikta penkiais didelės galios vaizdais kiekvienoje skaidrėje, o analizei buvo suskaičiuota 100 langelių kiekviename rodinyje.

Ksenografų augliogeniškumo tyrimas

Visos procedūros, susijusios su gyvūnais, atitiko institucines gyvūnų gerovės gaires ir eksperimentą patvirtino Taipėjaus veteranų bendroji ligoninė. Virusu užkrėsti plaučių TSLC buvo surinkti, išplauti PBS ir pakartotinai suspenduoti įprastoje auginimo terpėje. Plaučių TSLC ląstelės (2x105), užkrėstos sh-CBX5 RNR arba kontroliniu vektoriu, buvo įšvirkštos per 8 savaičių amžiaus NOD-SCID pelių patino veną. Visos pelės buvo anestezuojamos ir nužudytos 56 dieną (8 savaites) po injekcijos. Naviko mazgelių skaičius ir naviko tūris transplantuotų pelių plaučiuose buvo išmatuotas ex vivo ir H&E tyrimais. Jonizuojančioji spinduliuotė (IR) buvo perduodama kobalto bloku (Theratronic International, Inc., Otava, Kanada), kai dozės greitis buvo 1, 1 Gy / min (atstumas nuo šaltinio iki paviršiaus = 57, 5 ​​cm). Plaučių CD133 + -TSLC, apdoroti sh-CBX5 RNR, buvo veikiami 2, 4, 6, 8 ir 10 Gy radiacijos dozėmis.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.