Neuroninio nogoa reguliavimas neprisideda prie su stresu susijusios apoptozės, tačiau dalyvauja regeneraciniame atsake aksotomizuotoje suaugusiųjų tinklainėje | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Neuroninio nogoa reguliavimas neprisideda prie su stresu susijusios apoptozės, tačiau dalyvauja regeneraciniame atsake aksotomizuotoje suaugusiųjų tinklainėje | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Anotacija

Po suaugusiųjų pelių regos nervo sužalojimo Nogo-A, aksonų augimą slopinantis baltymas, kurio, kaip žinoma, daugiausia yra CNS mieline, buvo sureguliuotas tinklainės ganglinėse ląstelėse (RGC). Nogo-A padidėjo kartu su endoplazminio retikulinio streso (ER streso) žymeklio C / EBP homologiniu baltymu (CHOP), tačiau CHOP imuninis dažymas ir apoptozės žymeklis aneksinas V neatsirado kartu su Nogo-A atskirų RGC ląstelių kūnuose, kas rodo, kad traumos sukeltas Nogo-A reguliavimas nėra susijęs su aksotomijos sukelta ląstelių mirtimi. „Nogo-A“ nutildymas su adeno-2 viruso serotipu, turinčiu trumpą plaukų segtuko RNR (AAV2.shRNA-Nogo-A) arba „ Nogo-A“ geno abliaciją išmuštiems (KO) gyvūnams, nedaro įtakos pažeidimo sukeltam ląstelių stresui. arba mirtis. Kita vertus, „Nogo-A“ ekspresija, kurią sąlygojo AAV2.Nogo-A pasunkino RGC ląstelių mirtį po sužalojimo. Nepaisant to, AAV2.shRNA-Nogo-A pastebimai sumažino sužalojimo sukeltų supjaustytų aksonų sudygimą ir su augimu susijusių molekulių ekspresiją. Aksoninis regos nervo augimas, suaktyvinamas uždegimo molekulės „Pam3Cys“ intraokulinės injekcijos būdu, buvo mažesnis „Nogo-A KO“ pelėms nei WT pelėms. „Nogo-A“ per didelis RGC ekspresija in vivo arba neuronų ląstelių linijoje F11 in vitro skatino regeneraciją, parodydamas teigiamą ląstelių autonomiškumą neuronų Nogo-A vaidmeniui keičiant aksonų regeneraciją.

Pagrindinis

Membraninis baltymas Nogo-A yra vienas iš geriausiai apibūdinamų mielino inhibitorių, sukeliančių neurito augimą. 1 „Nogo-A“ arba jo receptorių blokada arba sisteminis „Nogo-A“ trynimas išmuitintomis pelėmis (KO) padidino sužalotų nugaros smegenų aksonų plastiškumą ir pagerino motorinių funkcijų atsistatymą. 2, 3 Po regos nervo sutriuškinimo „Nogo-A“ arba giminingų molekulių blokada leido tinklainės ganglinių ląstelių (RGC) aksonams ataugti, tačiau tik ribotai. 4, 5, 6 Neuronų augimo programos stimuliavimas uždegiminėmis molekulėmis, tokiomis kaip rinkliavos pavidalo receptoriaus 2 agonistai zymosan ar Pam3Cys, turėjo šiek tiek stipresnį poveikį optinio aksonų regeneracijai. 7, 8, 9 Nogo-A receptoriaus NgR1 arba jo tarpininko Rho-A slopinimas turėjo sinergetinį poveikį optinio aksonų augimui, kai jie derinami su uždegiminėmis molekulėmis. 4, 10

Tačiau naujausi tyrimai taip pat rodo, kad pažeisti tinklainės neuronų vidiniai augimo gebėjimai ir jų jautrumas išoriniam augimo faktoriaus stimuliavimui yra susilpnėję po aksonų sužalojimo; po regos nervo pažeidimo padidėjęs fosfatazės ir tenzino homologo (PTEN) bei gumbelinės sklerozės kompleksas 1 (TSC1) slopino žinduolių taikinį, priklausomą nuo rapamicino (mTOR), priklausomo baltymų sintezės. Be to, buvo pranešta, kad RGC jautrumui ciliariniam neurotrofiniam faktoriui (CNTF) gali pakenkti citokinų signalizacijos 3 slopintuvo (SOCS3) , ląstelių viduje, padidinimas ląstelėje , neigiamas Janus kinazės 3 / signalo keitiklio reguliatorius ir 3 transkripcijos aktyvatorius. (Jak3 ​​/ Stat3) kelias. 12

Nors Nogo-A dažniausiai būna suaugusiųjų CNS oligodendrocituose, neuronų potipiai taip pat išreiškia baltymą, tačiau jo funkcija šiose ląstelėse nežinoma. Čia mes nustatėme, kad po regos nervo sužalojimo padidėjo RGC neuronų neuronų kiekis Nogo-A, panašūs į rezultatus, kurie neseniai aprašyti žievės ir thalamicų neuronams po insulto. 13, 14 Tai atveria galimybę, kad neuronas Nogo-A gali turėti įtakos ląstelių mirčiai / išgyvenimui ir (arba) sužalotų CNS neuronų regeneracijos reakcijai. Įdomu tai, kad genetinis Nogo-A / B trynimas pelių mutantais pablogino motorinį ir kognityvinį deficitą po trauminės smegenų traumos ir paspartino motorneurono aksonų degeneraciją pagal amiotrofinės šoninės sklerozės (ALS) modelį. 14, 15, 16 Buvo siūloma, kad „Nogo“ neuroprotekcinis poveikis būtų susijęs su endoplazminio retikulinio (ER) streso silpnėjimu. Apie tokį „Nogo“ (retikulonas 4 (RTN4)) ar kitų RTN baltymų vaidmenį yra tik keletas ir prieštaringų pastebėjimų, ir jie daugiausia remiasi in vitro arba per daug išreikštais eksperimentais. 15, 17, 18, 19, 20, 21 Todėl mes ištyrėme RGC aksonų atsinaujinimą ir išgyvenimą po regos nervo sutriuškinimo pelėse su sistemine Nogo-A delecija (KO) ar neuronui specifiniu numušimu, naudojant adeno-2 viruso virusą, serotipą. (AAV2), kuris selektyviai užkrečia RGC tinklainėje. Pirmą kartą mūsų darbas parodo, kad AAV2.Nogo-A sąlygotas išorinis neuronų Nogo-A padidėjimas, bet ne endogeninis neurono Nogo-A padidėjęs reguliavimas dėl aksonų pažeidimo padidino RGC ląstelių praradimą. Mūsų rezultatai taip pat parodo teigiamą neurono Nogo-A funkciją pažeistų neuronų vidinėms augimo savybėms.

Rezultatai

Po aksomijos Nogo-A yra specialiai reguliuojamas RGC

Nepažeistoje suaugusių pelių tinklainėje Nogo-A buvo aptiktas imunofluorescencijos būdu išimtinai Müller ląstelėse; šviežiai izoliuotose Müller ląstelėse baltymas buvo lokalizuotas vidiniuose Müller glia procesuose (galinėse pėdose) (1a ir b pav.). Baltymas „Nogo-B“, nedidelė „Nogo-A“ suskaidymo forma, buvo panašiai koncentruotas Müller ląstelių plėtiniuose (duomenys nepateikti). Atlikus aksotomiją, Nogo-A išliko nepakitęs žandikaulio galinėse kojose, tuo tarpu gliozės žymeklis „Glial Fibrillary Acidic Protein“ (GFAP) buvo stipriai sureguliuotas ir apikiškai pasklido Miulerio ląstelių radialiniuose procesuose (1c ir d paveikslai). Nogo-A imuninio dažymo specifiškumas buvo patikrintas ant nepažeisto ir sužeisto Nogo-A KO tinklainės plokščiojo stovo, kuriame nebuvo galima aptikti jokio signalo (papildomas paveikslas S1). Naudojant specifinį Nogo-A / B antikūną, bendras Nogo-A ir Nogo-B baltymų lygis, stebimas atliekant Western blot analizę, buvo nepakitęs ir aksotomizuotoje tinklainėje panašus (1e paveikslas, papildomas S2A – C paveikslas). Palyginus WT ir Nogo-A KO tinklainius, atlikus pusiau qRT-PGR, praėjus 5 dienoms po sužalojimo, vimentino ir GFAP , dviejų gliozės rodiklių, mRNR padidėjęs reguliavimas nesiskyrė tarp KO ir WT tinklainės (1f ir g paveikslai). . Tai rodo, kad didžioji „Nogo-A“ dalis tinklainėje yra konstituciškai išreikšta Müller glia ir jai, kitaip nei citoskeleto baltymams, įtakos neturi aksotomija. Norėdami gauti aukštesnę „Nogo-A“ lokalizacijos skiriamąją gebą, konokalinės mikroskopijos būdu ištyrėme tinklainės plokščiuosius tvirtinimus RGC sluoksnyje (2A ir B paveikslai). Nepažeistoje tinklainėje Nogo-A atsirado daugiausia Müller ląstelių galinėse kojose (EF, 2a-a pav. ″) Ir keliuose β 3Tubulinu pažymėtuose RGC ląstelių kūnuose (2a paveikslas ″ ′, rodyklės galvutė). Tačiau pažeistose tinklainėse Nogo-A dramatiškai padidėjo kai kuriuose RGC (2b paveikslas ″, rodyklės galvutės), tuo tarpu kituose RGC nebuvo Nogo-A aptinkamame lygyje (2b paveikslas ″ ′, rodyklė). Kiekybiškai Nogo-A buvo aptiktas ∼ 15% RGC nepažeistoje tinklainėje ir padidėjo iki ∼ 55% išgyvenusių RGC 7 ar 14 dienų po pažeidimo (2C paveikslas). Aukštesniajame kvadrante vidutinio somos skersmens matavimas parodė, kad Nogo-A ekspresuojantys neuronai buvo didesni nei RGC, kurių ląstelių kūnuose nebuvo Nogo-A (2D pav.). Didžioji dauguma RGC, kurių somatos skersmuo viršijo 13 μm , po sužalojimo išreiškė Nogo-A (2E – H paveikslai). Stebėtina, kad, priešingai nei „Nogo-A“, „Nogo-B“ niekada nebuvo pastebėtas nepažeistame ar sužeistame RGC (papildomas paveikslas S3). Ilgalaikis „Nogo-A“ reguliavimas pažeistose RGC rodo, kad ypatingas šios RTN izoformos vaidmuo neuronų reakcijoje į sužalojimą.

Image

Nogo-A raiška nepažeistos ir sužeistos tinklainės Müller glia. Nogo-A baltymų pasiskirstymas buvo tiriamas imunofluorescencijos būdu tinklainės pjūviuose ir neoperuotų ir sužeistų tinklainių tinklainės plokščiuose vietose po optinio nervo pjovimo. a ) Nepažeistos tinklainės pjūviuose „Nogo-A“, lokalizuotas kartu su GS, specifiniu Müller glia žymeniu, radialinių procesų, vadinamų galinėmis kojomis, vidinėje pusėje. ( b ) In vitro šviežiai atsiskyrusiose Miulerio ląstelėse buvo tas pats Nogo-A kaupimasis galinėse kojose, tuo tarpu GS buvo tolygiai pasiskirstęs visoje citoplazmoje. ( c ir d ) Septynias dienas po regos nervo aksotomijos GFAP smarkiai pasklido Miulerio ląstelių plėtiniuose (rodyklių galvutėse), tuo tarpu Nogo-A baltymas galinėse kojose liko ribotas. e ) Western blot analize nepavyko parodyti Nogo-A ir Nogo-B baltymų ekspresijos pokyčių skirtingais laikotarpiais po regos nervo pjovimo. ( f ir g ) Praėjus penkioms dienoms po sužalojimo, glicozės žymenų vimentino ir GFAP mRNR padidėjimas buvo panašus tarp Nogo-A KO ir WT lizatų. Mastelio juostos: A = 100 μm , B, C = 25 μm

Visas dydis

Image

Nogo-A reguliavimas pažeistose tinklainės gangliono ląstelėse. ( A ) Ant nepaliestų tinklainės plokščių tvirtinimų, Nogo-A teigiami Miulerio ląstelių galiniai pėdos buvo apsupti RGC ląstelių kūneliais (″, EF). Tik nedaugelyje RGC ląstelių viduje buvo „Nogo-A“ (a′-a ″ ′). ( B ) Po regos nervo sužalojimo kai kuriuose RGC, kurių ląstelių soma pasirodė didesnė nei daugumos ląstelių, Nogo-A išraiška dramatiškai išaugo, kur Nogo-A negalėjo būti vizualizuota. ( C ) Kiekybiškai Nogo-A pažymėtų RGC tankis reikšmingai padidėjo iki ∼ 55% išgyvenusių ląstelių 7 ir 14 dienų po pažeidimo (ANOVA, ** P <0, 01). ( D ) RGC, kurių sudėtyje yra „Nogo-A“, somos skersmuo buvo didesnis nei kitų RGC, bet kuriais ištirtais laiko momentais (ANOVA, *** P <0, 001). ( E – H ) Somos dydžio pasiskirstymas parodė, kad Nogo-A padidėjo visose ląstelių dydžio kategorijose. Bet proporcingai ląstelės, kurių somata buvo didesnė nei 13 μm , ekspresavo daugiau Nogo-A nei mažesnės ląstelės. Be to, ši neuronų pogrupis buvo geriau apsaugotas nuo ląstelių žūties nei likę RGC. Svarstyklės: A, B = 100 μm ; a ′, b ′ = 25 μm

Visas dydis

ER streso atsakas ir apoptozinė ląstelių mirtis atsiranda kartu su Nogo-A reguliavimu, bet ne tose pačiose ląstelėse po aksonų sužalojimo

Iki šiol ER streso aktyvacija nebuvo tiriama po aksonų sužalojimo. Kadangi Nogo-A priklauso RTN šeimai, kuri ypač praturtinta ER, mes pasidomėjome, ar neuronų Nogo-A padidėjęs reguliavimas gali atspindėti ER streso atsako suaktyvinimą. Atlikus pusiau qRT-PGR, proapoptotinių transkripcijos veiksnių C / EBP homologinis baltymas (CHOP) / GADD153 ir c-Jun padidėjo jau 1 dieną ir pasiekė aukščiausią reikšmę praėjus 3 dienoms po aksonotomijos (3a pav.). CHOP / GADD153 baltymo padidėjimas buvo patvirtintas praėjus 3 ir 5 dienoms po pažeidimo, naudojant Western blot (3c paveikslas, papildomas S2D paveikslas). Prieš CHOP aktyvus fosforilintas eIF2 α baltymas buvo aptiktas RGC praėjus 3 dienoms po aksotomijos (3b pav.), Kas rodo, kad eIF2 α / CHOP kelią stimuliuoja regos nervo pažeidimas. Atitinkamai tinklainės pjūviuose CHOP / GADD153 baltymas buvo smarkiai padidėjęs sužalotų RGC branduolyje ir jo nebuvo kituose tinklainės ląstelių sluoksniuose (3d pav.). Iš skirtingų aktyvinančio transkripcijos faktoriaus (ATF) šeimos narių nustatyta, kad sutrikus ankstesniam tyrimui, buvo sureguliuotas tik ATF3 (3a ir 6g paveikslai). 22

Image

ER streso žymens CHOP, Nogo-A ir aneksino V nustatymas aksotomizuotoje tinklainėje. ( a ) ER streso baltymo ekspresijos laikas buvo nustatytas pusiau qRT-PGR atlikus WT tinklainės regos nervo pažeidimą. Proapoptozinis transkripcijos faktorius CHOP / GADD153 ir c-Jun padidėjo jau 1 dieną ir pasiekė aukščiausią reikšmę praėjus 3 dienoms po pažeidimo. 5 dienomis padidėjęs sužalotos tinklainės kaulų apimtis žymiai padidėjo, palyginti su nepažeistais lizatais. ( b ) Atlikus imunohistochemiją, aktyvuota, fosforilinta eIF2 α forma RGC pasirodė intensyvesnė po aksotomijos (žr. 2 kartus padidintus vaizdus dešinėje). c ) Baltymų lygmeniu CHOP / GADD153 padidėjimas buvo patvirtintas pažeistiems gyvūnams atliekant Western blot analizę. ( d ) CHOP / GADD153 imunofluorescencinis signalas tinklainės skilimo metu parodė, kad tik axotomizuoti RGC padidino šį transkripcijos koeficientą. ( e ) Ant tinklainės plokščių tvirtinimų dideli somos dydžio RGC, turintys stiprų „Nogo-A“ signalą, buvo silpni arba nebuvo teigiami CHOP / GADD153. ( f ) Likus dviem valandoms iki perfuzijos, aksotomizuotiems WT gyvūnams į akis buvo sušvirkštas aneksinas V, kad būtų galima pažymėti apoptozinius neuronus. Tuomet fiksuoti tinklainės plokšti tvirtinimo elementai buvo dažomi β3 tubulinu ir Nogo-A. Konokokinėse optinėse dalyse aneksinas V pažymėjo kelių mirštančių RGC citoplazminę membraną. Dideli Soma dydžio RGC, išreiškiantys daugiausiai Nogo-A, nebuvo paženklinti aneksinu V. Skalės juostos: B, E = 100 μm ; D = 50 μm , įdėklas = 25 μm ; F = 10 μm

Visas dydis

Tada buvo tiriamas ryšys tarp neuronų Nogo-A padidėjusio reguliavimo, ER streso ir neuronų ląstelių žūties, naudojant dvigubą imunofluorescencinį dažymą Nogo-A ir CHOP / GADD153 arba apoptozės žymeniu aneksinu V atitinkamai (3e ir f paveikslai). Ant 5 dienų po aksotominės tinklainės plokščių tvirtinimų dideli Soma dydžio RGC, paženklinti Nogo-A, CHOP / GADD153 rodė silpną signalą arba jo neturėjo (3e pav.). Kadangi CHOP / GADD153 indėlis į RGC apoptozės procesą nežinomas, mes intraokuliniu būdu injekavome aneksiną V - baltymą, jungiantį ląstelės membraną ankstyvoje apoptozės stadijoje. 23 Visų tinklainės kvadrantų atžvilgiu Nogo-A nepavyko aptikti aneksino V teigiamų neuronų. Tai rodo, kad sužalojimo sukeltas Nogo-A padidėjimas nėra susijęs su ląstelių mirtimi (3f pav.). Nepaisant to, vis dar įmanoma, kad mažose RGC ląstelėse, kuriose Nogo-A buvo daug silpnesnis nei didelių dydžių RGC, Nogo-A buvo sureguliuotas prieš pat apoptozę, todėl buvo žemiau aptikimo lygio, nustatant imunohistochemiją.

Per didelis ekspresija, bet ne endogeninis Nogo-A padidėjęs reguliavimas daro įtaką RGC ląstelių praradimui po regos nervo pažeidimo

Norint tiesiogiai įvertinti „Nogo-A“ įtaką ER streso aktyvacijai ir RGC apoptozei, „Nogo-A“ buvo sumažintas arba padidintas, naudojant AAV2, turinčią atitinkamai trumpą plaukų segtuko RNR (shRNR) arba „ Nogo-A“ genų seką (4 paveikslas). . AAV2 pirmiausia užkrečia neuronus ir pasižymi dideliu RGC selektyvumu tinklainėje. Atlikus pusiau qRT-PGR analizę ir imunohistochemiją, AAV2.shRNA-Nogo-A visiškai panaikino žalos sukeltą Nogo-A raišką RGC, tuo tarpu AAV2.Nogo-A efektyviai padidino Nogo-A raišką nepažeistame ir sužeistame. tinklainė (4a – c paveikslai). AAV2.shRNA-Nogo-A užkrėsti RGC prieš ir po regos nervo išpjaustymo, kaip parodyta GFP reporterio baltymo aptikime ant tinklainės plokščiojo stovo (4b paveikslas). Pažymėtina, kad Müller ląstelių galinėse kojose Nogo-A lygis nebuvo sumažėjęs (4c paveikslas, rodyklė).

Image

Neuroninio Nogo-A moduliacija su adeno-susijusiu virusu. Nogo-A ekspresijos moduliavimas, susijęs su adeno-susijusiais viruso vektoriais (AAV), buvo patvirtintas pusiau qRT-PGR ir imunohistochemijos metodais. ( a ) Pusiau qRT-PGR matavimas atskleidė, kad „ Nogo-A“ buvo veiksmingai padidintas arba sumažintas RGC reguliuojant atitinkamai suleidus AAV2.Nogo-A ir AAV2.shRNA-Nogo-A. ( b ) In vivo AAV2.shRNA-Nogo-A buvo įšvirkštas į akies vidų 4 savaites prieš regos nervo sužalojimą. Kaip parodė RGC specifinio žymens β 3Tubulino ir GFP reporterio baltymo lokalizavimas ant sužalotų tinklainės plokščiųjų tvirtinimo elementų (ON = regos nervas), buvo transformuota daugybė RGC AAV2.shRNA-Nogo-A. c ) Atlikdami imunohistochemiją ant tinklainės plokščių sąnarių, užkrėsti RGC, kuriuose yra GFP baltymo ir β3Tubulinas, po sužalojimo nebereiškino tarpląstelinio Nogo-A, nors Nogo-A išliko aplink Miulerio ląstelių galines pėdas (rodyklė). Svarstyklės: B = 200 μm ; C = 25 μm

Visas dydis

Praėjus dviem savaitėms po regos nervo transekcijos, išgyvenusių neuronų tankis, įvertintas dažant β 3Tubulino RGC, ant tinklainės plokščiojo paviršiaus buvo sumažintas 75% (5 pav.), Palyginti su nepažeista tinklaine (papildomas S4C paveikslas). Visoje tinklainėje vidutinis išgyvenusių RGC tankis reikšmingai nepakito nei dėl „ Nogo-A“ numušimo, nei dėl „ Nogo-A“ perdėtos ekspresijos, palyginti su grupe, gaunančia AAV2.GFP, arba negydytais gyvūnais (5a paveikslas). Intraokulinė AAV2 virusų injekcija į aukštesnį tinklainės kvadrantą gali sukelti didesnį infekcijos laipsnį šiame regione, o tai gali padaryti stipresnį poveikį išgyvenimui. Todėl šioje tinklainės dalyje buvo atskirai ištirtas išgyvenusių RGC tankis. Įdomu tai, kad aukštesniame tinklainės kvadrante gyvūnams, užkrėstiems AAV2.Nogo-A, per 14 dienų AG2 sumažėjo žymiai daugiau aksotomijos nei bet kuriai kitai grupei (5b paveikslas, D; t- testas; * P <0, 05). . Mirtį didinantis AAV2.Nogo-A poveikis daugiausia pasireiškė ląstelėse, kurių somos dydis buvo mažesnis nei 13 μm (5c paveikslas, dvipusė ANOVA, ** P <0, 01; *** P <0, 001). Tai rodo, kad negimdinė Nogo-A ekspresija gali pabloginti ląstelių mirtį ląstelėse, kurių Nogo-A ekspresija yra maža, tuo tarpu didžioji dalis ląstelių, kurios po sužalojimo padidina Nogo-A, atrodė nepakitusios.

Image

„Nogo-A“ reguliavimo blokados poveikis RGC išgyvenimui. ( a) Visoje tinklainėje AAV2.shRNR ir AAV2.Nogo-A 2 savaites po regos nervo aksomijos, palyginti su AAV2.GFP, reikšmingų (NS) tankio pokyčių išgyvenusių RGC nesukėlė. ( b - d ) Aukštesniame pažeistos tinklainės kvadrante AAV2.Nogo-A sukėlė daugiau RGC ląstelių nuostolių nei AAV2.GFP ( t- testas, * P <0, 05). c ) Šiame tinklainės regione, analizuojant somos skersmens pasiskirstymą, paaiškėjo, kad didesnis AG2.Nogo-A sukeltas RGC nuostolis įvyko ląstelėms, mažesnėms nei 13 μm (dvipusė ANOVA, ** P <0, 01). ; *** P <0, 001). Masto juosta: D = 100 μm

Visas dydis

Nutildžius „ Nogo-A“ su AAV2.shRNA-Nogo-A, reikšmingai nepakito CHOP / GADD153 mRNR lygiai po pažeidimo, palyginti su AAV2.GFP apdorota tinklaine (papildomas paveikslas S4A). Vis dėlto AAV2.Nogo-A gydytoje grupėje pastebėtas nedidelis CHOP / GADD153 mRNR padidėjimas (papildomas S4A paveikslas). Be to, CHR / GADD153 mRNR lygis nebuvo skirtingai padidintas Nogo-A KO ir WT tinklainėse praėjus 5 dienoms po sužalojimo (papildomas S4B paveikslas). Remiantis tuo, RGC skaičius nedaug skyrėsi tarp WT ir Nogo-A KO tinklainių (papildomas S4C paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad aksotomijos sukeltas Nogo-A padidėjimas vyksta kartu, tačiau nepriklausomai nuo ER streso aktyvacijos po regos nervo transekcijos.

Neuronal Nogo-A prisideda prie aksonų augimo atsako RGC

Aksonų regeneracija buvo tiriama praėjus 2 savaitėms po regos nervo sutraiškymo ir neuroninio Nogo-A nutildymo AAV2.shRNA-Nogo-A. Negydant ar po AAV2.GFP arba AAV2.shRNR-luciferazės injekcijų, pažeisto optinio nervo distalinėje dalyje buvo nuolat stebimas ribotas skaičius aksoninių skaidulų (6a ir b paveikslai). Tuose atitinkamuose valdymo nervuose 100 μm atstumu nuo pažeidimo vietos buvo suskaičiuoti 58, 8 ± 5, 7 aksonų arba 58, 1 ± 12 aksonų regos nervo vidurkis (6d paveikslas). Tuo pačiu atstumu gyvūnams, kuriems buvo sušvirkšta AAV2.shRNA-Nogo-A, pažeidimo vietoje pasirodė daug mažiau aksonų (4, 4 ± 2, 5 aksonų / regos nervo) (6a – d pav.). Žalos sukeltas RGC augimo atsakas buvo toliau analizuojamas atlikus Sprr1A , GAP-43 ir ATF3 , trijų svarbių aksonų regeneracijos reguliatorių CNS ir PNS, genų ekspresijos pokyčius. 25, 26 Trijų augimo žymenų mRNR greitai padidėjo po sužalojimo ir pasiekė aukščiausią tašką praėjus 3–5 dienoms po optinio nervo transekcijos (duomenys nepateikti). Nuslopindamas neuroninį Nogo-A pažeistoje tinklainėje naudodamas AAV2.shRNA-Nogo-A sumažino Sprr1A , GAP-43 ir ATF3 mRNR indukciją (6e – g paveikslai; dispersijos analizė (ANOVA); * P <0, 05; ** P) <0, 01). Pernelyg didelis Nogo-A ekspresijavimas vartojant AAV2.Nogo-A nesutrikdė traumos sukeltų trijų augimo žymenų padidėjimo (duomenys nepateikti). Šie duomenys rodo, kad neuronų Nogo-A pakilimas, atsirandantis po aksotomijos, atrodo, teigiamai veikia ar prisideda prie neuronų augimo atsako.

Image

Nutildymas „Nogo-A“ RGC sumažina neuronų augimo atsaką ir aksonų sudygimą regos nerve. Norėdami ištirti sutraiškyto regos nervo aksonų regeneraciją, AAV2 vektoriai buvo sušvirkšti likus 4 savaitėms iki sužalojimo, o augančių aksonų sekos buvo sušvirkštos į akis prieš akis prieš žudymą choleros toksino β subvienetą, sujungtą su alexa 594 (CTb-594). Buvo tiriama aksonų regeneracija išilginiuose pjūviuose 100 μm atstumu nuo pažeidimo vietos. ( a ir b) Praėjus dviem savaitėms po sužalojimo, nedaug aksonų perėjo pažeidimo vietą (tamsios strėlės galvutes) negydytų pelių ir tų, kurie gavo kontrolinius virusus AAV2.GFP arba AAV2.shRNA-Luciferase. ( c) Pelių, gydomų AAV2.shRNA-Nogo-A (dešinė pusė), distaliniame optiniame nerve beveik negalėjo aksonų išplėsti. ( d) Kiekybiškai po pažeidimo AAV2.shRNA-Nogo-A injekcijos aksoninių skaidulų, augančių visoje pažeidimo vietoje, skaičius buvo statistiškai mažesnis nei grupėse, kurios buvo gydomos AAV2.GFP, AAV2.shRNR-luciferaze arba neinjekuotos (vidurkis ± SEM, ANOVA, Dunnett post hoc testas, * P <0, 05, ** P <0, 01). ( e – g ) AAV2.shRNA-Nogo-A sumažino su augimu susijusio baltymo Sprr1A , GAP-43 ir ATF3 mRNR, palyginti su pelėmis, kurioms buvo skiriama AAV2.GFP, arba tomis, kurioms buvo leista negydyti (ANOVA, * P <0, 05, * * P <0, 01). Atkreipkite dėmesį, kad per didelis Nogo-A ekspresija su AAV2.Nogo-A neturėjo įtakos su augimu susijusių baltymų ekspresijai (duomenys nepateikti). Mastelio juosta: intarpas = 100 μm

Visas dydis

Nuro-A delecija Nogo-A KO pelėse keičia RGC reakciją į augimo stimuliavimą

Tuomet mes ištyrėme, kaip visiškas glijos ir neuronų Nogo-A trynimas Nogo-A KO pelėse paveikė aksonų regeneraciją. Praėjus dviem savaitėms po sužalojimo, aksonų, augančių 100, 250, 500 ir 1000 mikronų atstumu per pažeidimo vietą, skaičius Nogo-A KO pelėse pasirodė labai panašus į WT pelių (7A pav.). Tai gali reikšti, kad sisteminio Nogo-A trynimo nepakanka, kad būtų skatinamas aksonų išsiveržimas. Norėdami sužeistą RGC padidinti augimo režimu, į pažeistų gyvūnų stiklakūnį mes sušvirkštėme uždegimą sukeliantį vaistą „Pam3Cys“. 9 „ Pam3Cys“ sušvirkštimas C57BL / 6 pelių stiklakūnio srityje stipriai suaktyvina regos nervo aksonų augimą (7A ir C pav.). Tačiau „Nogo-A KO“ optiniuose nervuose augančių aksonų tankis buvo mažesnis nei WT gyvūnams (7A, C ir D paveikslai). Norint įvertinti neuronų Nogo-A indėlį į aksonų augimą, stebėtą Nogo-A KO gyvūnams, AAV2.Nogo-A buvo suleistas 4 savaites prieš pažeidimą. Šios grupės augimo stimuliavimas naudojant „Pam3Cys“ sukėlė daug daugiau augančių aksonų nei Nogo-A KO pelėms (7B, D ir E paveikslai). Kontrolinis virusas AAV2.GFP, priešingai, nepadarė įtakos regeneruojančių skaidulų skaičiui WT asmenims, gydytiems „Pam3Cys“ (duomenys nepateikti). Taigi, priverstinė Nogo-A ekspresija RGC neuronuose gali modifikuoti aksonų augimą, kurį sukelia intraokulinis uždegimas.

Image

Aksonų regeneracija Nogo-A KO pelėse, apdorotose „Pam3Cys“. Atkuriantys aksonai buvo vizualizuoti ir kiekybiškai įvertinti WT ir Nogo-A KO pelėse praėjus 2 savaitėms po mikrotrauminio pažeidimo ir aksonų sekimo CTb-594, kaip aprašyta 6 paveiksle. ( A ) Nogo-A geno abliacija Nogo-A KO regos nervai nesugebėjo paskatinti didesnio aksonų užaugimo, palyginti su WT kontrole. ( A, C ir D ) Norėdami pakeisti RGC į augimo būseną, rinkliavai panašus 2 receptoriaus agonistas „Pam3Cys“ (5 μg ) buvo sušvirkštas tą pačią dieną kaip regos nervo sutraiškymas, o po 7 dienų kai kuriuose WT ir Nogo-A KO. akys. Intraokulinis uždegimas, kurį sukėlė „Pam3Cys“, dramatiškai padidino CTb-594 pažymėtų skaidulų skaičių WT optiniuose nervuose, tačiau buvo silpnesnis „Nogo-A KO“ pelėms. ( B ir E ) AAV2.Nogo-A injekcija kartu su Pam3Cys skyrimu žymiai padidino augančių aksonų skaičių Nogo-A KO pelėse, palyginti su Nogo-A KO gyvūnais, gydytais vien tik Pam3Cys (ANOVA, Dunnett post hoc testas, * P <0, 05; ** P <0, 01, *** P <0, 001)

Visas dydis

Įdomu tai, kad regos nervo pažeidimas sumažino „ Nogo-A“ receptorių komponentų NgR1 ir „ Lingo1 “ nuorašo lygius, leidžiančius manyti, kad RGC po sužalojimo gali būti jautrus mielino inhibitoriams (papildomi paveikslai S5A – B). Tačiau ekspresijos pokyčiai po pažeidimo nesiskyrė tarp Nogo-A KO ir WT gyvūnų. Be to, proapopotinio citokino TNFα ir išgyvenimo faktorių FGF2 , CNTF , LIF ir BDNF geno išraiška buvo panašiai sureguliuota Nogo-A KO ir WT pelių aksotomizuotoje tinklainėje (papildomi paveikslai S5C – D).

Nogo-A lygiai daro įtaką neurito augimui izoliuotose neuronų ląstelėse

Norint įvertinti, ar neuroninio Nogo-A poveikis neurito augimui buvo ląstelių autonominis, Nogo-A buvo modifikuotas kartu su AAV dorsalinės šaknies ganglijų gautų neuronų ląstelių linijoje F11, auginamoje esant vienų ląstelių tankiui. Nogo-A lygis buvo stebimas atliekant vienkartinių ląstelių imunocitochemiją po gydymo AAV ir forskolino sukeltą neurito augimą (8a – c pav.). GFP ekspresija kontroliniu virusu neturėjo įtakos Nogo-A dažymo intensyvumui (8a pav.). F11 ląstelių transfekavimas Nogo-A shRNR stipriai slopino Nogo-A raišką (8b pav.). Priešingai, Nogo-A lygis buvo padidintas tokiu būdu, kuris buvo glaudžiai susijęs su His-tag reporterio išraiška pridėjus AAV2.Nogo-A (8c pav.). AAV2.GFP arba AAV8.GFP reikšmingai nepakeitė neurito augimo, palyginti su vien gydymu forskolinu (8d, m pav.). „ Nogo-A“ numušimas su AAV8.shRNA-Nogo-A sukėlė statistiškai reikšmingą neurito išaugimo sumažėjimą (27%), palyginti su AAV8.GFP grupe (8d – i ir m paveikslai; ANOVA, * P <0, 05). Atvirkščiai, „Nogo-A“ reguliavimas reikšmingai padidino F11 neuritų ilgį 47% (8j – m pav .; ANOVA, *** P <0, 001). Svarbu tai, kad β 3 tubulino ir GAP-43 baltymų imunofluorescenciniai signalai buvo teigiamai koreliuojami su Nogo-A raiška F11 ląstelėse, užkrėstose AAV2.Nogo-A (papildomas paveikslas S6). Tiesioginė koreliacija tarp Nogo-A ekspresijos ir neurito išplėtimo palaiko autonominį ląstelių poveikį ir teigiamą Nogo-A poveikį neurito augimui.

Image

Neurito ataugų analizė F11 ląstelėse, apdorotose AAV vektoriais. a ) AAV8.GFP ir AAV2.GFP nedarė įtakos N11 tirpalo Nogo-A denitometriniam matavimui F11 ląstelėse. Vertikali punktyrinė linija rodo slenkstį, žemiau kurio GFP intensyvumas buvo panašus į neapdorotų ląstelių. AAV8.shRNA-Nogo-A stipriai blokavo Nogo-A ekspresiją, ( b ) tuo tarpu Nogo-A lygis tiesiškai padidėjo atsižvelgiant į His-tag intensyvumą AAV2.Nogo-A apdorotose ląstelėse ( c ). ( d - l ) F11 ląstelių neuritai buvo paženklinti anti-β3 tubulino antikūnu 48 valandas po forskolino sukeltos diferenciacijos. ( m ) AAV8.shRNA-Nogo-A sumažino bendrą F11 ląstelių neurito ilgį, tuo tarpu AAV2.Nogo-A turėjo priešingą poveikį (ANOVA, * P <0, 05, *** P <0, 001). Vidutinis bendras neurito ilgis buvo apskaičiuotas iš 3 nepriklausomų eksperimentų (± SEM). Masto juosta = 200 μm

Visas dydis

Diskusija

Po suaugusių pelių regos nervo sužalojimo, Nogo-A buvo greitai ir selektyviai reguliuojamas RGC. Nors ryškų ER streso atsaką sukėlė regos nervo aksotomija, mes negalėjome rasti koreliacijos su Nogo-A kaupimu RGC ląstelių kūnuose. Eksperimentinis „Nogo-A“ per didelis ekspresija ar sumažėjęs reguliavimas nepakeitė pažeistų RGC išgyvenamumo. Priešingai, Nogo-A KO gyvūnams ir WT pelėms, kuriose neuronų Nogo-A buvo sureguliuotas perkrovus shRNR, buvo sumažintas regeneracinis augimo atsakas ir aksonų sudygimas.

Keista, bet Nogo-A buvo rastas trijų skirtingų tipų ląstelėse suaugusiojo tinklainėje ir regos nerve: oligodendrocituose, kaip tikimasi iš daugelio kitų CNS regionų, neurono potipyje, tai yra, RGC po sužalojimo, ir Miulerio ląstelėse. Suaugusiųjų tinklainėje Müller glia buvo pagrindinis ląstelių tipas, gaminantis Nogo-A ir Nogo-B. Poliarizuotas Nogo-A ir B pasiskirstymas vidinėse Miulerio galinėse kojose panašus į RTN 3 arba mielino baltymo MAG pasiskirstymą. 27, 28 Kaip ir kiti du baltymai, Nogo-A ir -B fiziologinis vaidmuo Miulerio ląstelėse nežinomas. Miulerio ląstelės intensyviai reaguoja į RGC aksotomiją ir atlieka pagrindinį vaidmenį uždegiminiuose mechanizmuose, suaktyvindamos regos nervo aksonų regeneraciją po sužalojimo, greičiausiai, atpalaiduodamos tokius trofinius veiksnius kaip CNTF. 8, 29 Tačiau po regos nervo pažeidimo Müller glia ir Nogo-A praradimo Müller ląstelėse KO pelėms Nogo-A lygis nepakito, tai nepakeitė aksotomijos sukeltos gliozės.

Nors gerai žinoma, kad ląstelių paviršius Nogo-A daro augimą slopinantį poveikį kaimyninėms ląstelėms per specifinį Nogo-A receptorių kompleksą, aukšto tarpląstelinio Nogo-A lygio funkcijos, ypač neuronuose, dažniausiai nežinomos. Kadangi ląstelių mirtis po aksomijos RGC tinklainėje yra didžiulė, mes ištyrėme galimą neuronų Nogo-A funkciją RGC apoptozėje. Keista, bet „Nogo-A“ reikšmingai neprisidėjo nei prie išgyvenimo, nei dėl apoptozės ir ER streso. CHOP / GADD153 padidėjimas sužalotuose RGC nebuvo koreliuojamas su Nogo-A padidėjimu, priešingai nei buvo įrodyta RTN3 HeLa ląstelėse kultūroje. 20 Be to, nei per didelis Nogo-A ekspresija, nei per mažas AAV2 vektorių reguliavimas reikšmingai nepakeitė CHOP / GADD153 lygio tinklainėje. Tai atitinka neseniai atliktą tyrimą, rodantį, kad COS-7 ląstelių transfekavimas skirtingais RTN baltymais nesukėlė CHOP / GADD153 aktyvavimo in vitro. 15 Priešingai, RTN1C per didelis ekspresija žievės neuronuose sukėlė CHOP / GADD153 ir Bip padidėjimą, susijusį su apoptozine mirtimi in vivo. 19 RTN baltymai gali daryti priešingą poveikį ER streso baltymų ekspresijai ir ląstelių išgyvenimui. Kalbant apie Nogo-A, baltymo nebuvo galima aptikti apoptoziniuose RGC, paženklintuose aneksinu V, o Nogo-A žeminamasis reguliavimas neturėjo bendro poveikio RGC išgyvenimui. Todėl mažai tikėtina, kad axotomijos sukeltas Nogo-A reguliavimas turėtų didelę reikšmę tinklainės neuronų apoptozei. Tačiau AAV2 tarpininkaujantis Nogo-A nuvertinimas sukėlė mažiau ląstelių žūtį nei per didelis ekspozicija naudojant AAV2.Nogo-A vektorių, ypač viršutiniame tinklainės kvadrante. Be to, mes pastebėjome, kad negimdinė Nogo-A ekspresija naudojant AAV2.Nogo-A pasunkino ląstelių mirtį ir sukėlė aksonų patinimą kai kuriuose neuronuose, kur infekcija buvo didžiausia (duomenys nepateikti). Šis turbūt toksiškas per didelis išraiška atitinka ankstesnius panašius pastebėjimus. 18, 30 d. Taigi padėtis tinklainėje taip pat skiriasi nuo ALS modelio, kai Nogo-A / B geno abliacija pagreitino ventralinių motorinių neuronų aksonų degeneraciją, 15 o sisteminis Nogo-A nebuvimas sulėtino ligą, ir „Nogo-A“ padidinta raumenų galinės plokštelės degeneracijos raiška. 30 Naujausi tyrimai parodė, kad Lingo arba NgR1, 2 receptorių komponentų neutralizavimas Nogo-A, paskatino RGC išgyvenimą po regos nervo transekcijos. Todėl negalime atmesti galimybės, kad „Nogo“ receptorių kompleksas tarpininkauja tam tikram mirtį skatinančiam poveikiui, pastebėtam padidėjus Nogo-A neuronų ląstelėse. 31, 32

Nors dauguma RCG miršta per 1–2 savaites po regos nervo pažeidimo, likusiuose, daugiausia didelio skersmens, neuronuose atsiranda regeneracinis daigumas ir augimo žymenų reguliavimas. 33, 34 Nogo-A padidėjimas, ypač šiose didelėse ląstelėse, gali turėti įtakos RGC neuritų regeneracijai. Gali reikėti Nogo-A, nors to nepakako šiam neuronų pogrupiui suteikti didesnį vidinį augimo pajėgumą. Taigi, po neuronų Nogo-A nutildymo sumažėjo optinio aksonų sudygimas ir sumažėjo pažeidimų sukeltas Sprr1A , GAP-43 ir ATF3 mRNR padidėjimas . Savo ruožtu priverstinė Nogo-A ekspresija RGC išgelbėjo sumažėjusią aksonų regeneraciją „Nogo-A KO“ optiniuose nervuose, gydomuose „Pam3Cys“. Izoliuotose F11 ląstelėse Nogo-A ekspresija aiškiai darė teigiamą įtaką neurito ilgiui, kas rodo ląstelių autonominį Nogo-A poveikį neuronų augimui. Tikslus mechanizmas nėra aiškus, tačiau galima spėlioti, kad su ER susijęs Nogo-A prisideda prie neuronų homeostazės palaikymo, išsaugodamas ER struktūrą, baltymų sintezę ir tarpląstelinį transportą - visus procesus, reikalingus aksonų augimui ir regeneracijai.

Šiame tyrime Nogo-A KO regos nervo aksonai neatsinaujino geriau nei WT nervai. Šis rezultatas priešingai nei silpnesnis neurito dygimas, kurį stebėjome po ūmaus Nogo-A padidėjusio reguliavimo blokavimo naudojant AAV2.shRNR, ir tai galima paaiškinti kompensaciniais mechanizmais, atsirandančiais Nogo-A KO gyvūnams. Tačiau ankstesni tyrimai parodė padidėjusį regos nervo aksonų regeneraciją, užblokavus Nogo-A neutralizuojančiu antikūnu IN-1, kurį išskiria hibridomos ląstelės kartu su FGF2 arba CNTF. 6, 35. Rezultatai atitinka kortikospinalinių aksonų regeneracijos padidėjimą Nogo-A KO pelėse po stuburo smegenų pažeidimo ir rodo, kad Nogo-A inaktyvacija ląstelės paviršiuje yra naudinga optiniam aksonų augimui in vivo . 3 „Nogo-A KO“ pelėms didesnis reagavimas į kortikospinalinius takus gali būti dėl vidinių RGC ir žievės neuronų augimo savybių skirtumų arba dėl pažeidimo sunkumo. Pvz., RGC miršta po regos nervo sutriuškinimo, tuo tarpu nugaros smegenų sužalojimas sukelia lėtą žievės žievės nervų susitraukimą be reikšmingos ląstelių mirties. Taigi Nogo-A blokuojančių antikūnų paskyrimas yra gera strategija siekiant sumažinti oligodendrocitų / mielino Nogo-A sukeltą neurito augimo slopinimą nepažeidžiant viduląstelinio neurono Nogo-A.

Apibendrinant, mūsų rezultatai pirmą kartą rodo, kad in vivo Nogo-A reguliavimas neuronuose nedalyvauja su ER su stresu susijusioje apoptozėje, tačiau teigiamai veikia augimo reakciją po aksonų pažeidimo.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

  2. 2.

    Papildomas S2 paveikslas

  3. 3.

    Papildomas S3 paveikslas

  4. 4.

    Papildomas S4 paveikslas

  5. 5.

    Papildomas S5 paveikslas

  6. 6.

    Papildomas S6 paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos figūros legendos

Žodynas

AAV

su adeno susijęs virusas

ATF

aktyvinantis transkripcijos faktorių

BDNF

smegenų išvestas neurotrofinis faktorius

„Bip“ / GRP78

78 kDa gliukozės reguliuojamas baltymas

CHOP / GADD153

C / EBP homologinis baltymas / augimo sustabdymą ir DNR pažeidimą sukeliantis genas 153

CNTF

ciliarinis neurotrofinis faktorius

CTb-594

choleros toksino β subvienetas-alexa594

DRG

nugaros šaknies ganglionas

eIF2 α

eukariotų transliacijos iniciacijos faktorius 2 α

FGF2

fibroblastų augimo faktorius 2

FL

pluošto sluoksnis

GAP-43

su augimu susijęs baltymas 43

GAPDH

glicerraldehido 3-fosfato dehidrogenazė

GCL

gangliono ląstelių sluoksnis

GFAP

gliaudinės fibrozinės rūgšties baltymai

GFP

žali fluorescenciniai baltymai

GS

glutamino sintetazė

ILM

vidinė ribojanti membrana

INL

vidinis branduolinis sluoksnis

IPL

vidinis pleksiforminis sluoksnis

Jak3

janus kinazė 3

LIF

leukemiją slopinantis faktorius

LINGO1

daug leucino kartojantis ir Ig domenas, turintis 1

MAG

su mielinu susijęs glikoproteinas

mTOR

žinduolių rapamicino taikinys

NgR1

„Nogo66“ 1 receptorius

OLM

išorinė ribojanti membrana

ONL

išorinis branduolinis sluoksnis

OPL

išorinis pleksiforminis sluoksnis

OS

išorinis segmentas

„Pam3Cys“

(S) - (2, 3-bis (palmitoiloksi) - (2RS) -propil) -N-palmitoil- (R) -Cys- (S) -Ser (S) -Lys (4) -OH ^ trihidrochloridas

PTEN

fosfatazės ir tenzino homologas

qRT-PGR

kiekybinė realaus laiko polimerazės grandininė reakcija

RGC

tinklainės gangliono ląstelės

RTN

retikulonas

shRNR

maža plaukų smeigtuko ribonukleino rūgštis

SOCS3

citokinų signalizacijos slopiklis 3

Sprr1A

mažas baltymas, turtingas prolinu 1A

Stat3

signalo keitiklis ir transkripcijos aktyvatorius 3

TNF- α

naviko nekrozės faktorius α

TSC1

gumbelinės sklerozės kompleksas 1

Papildoma informacija pridedama prie dokumento apie ląstelių mirtį ir diferenciaciją svetainėje (//www.nature.com/cdd)