Naujos įžvalgos apie substratų, prekiaujančių prekybos glioksilato / hidroksipiruvato reduktazėmis, mechanizmą | mokslinės ataskaitos

Naujos įžvalgos apie substratų, prekiaujančių prekybos glioksilato / hidroksipiruvato reduktazėmis, mechanizmą | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Fermentų mechanizmai
  • Rentgeno kristalografija
  • Šio straipsnio „Erratum“ buvo paskelbta 2016 m. Balandžio 20 d

Šis straipsnis buvo atnaujintas

Anotacija

Gliukoksilato kaupimasis ląstelėse yra labai toksiškas. Žmonėms jis susijęs su 2 tipo hiperoksalurija (PH2), sukeliančiu inkstų nepakankamumą. Glikoksilato kiekį ląstelėse reguliuoja nuo NADPH / NADH priklausomi glioksilato / hidroksipiruvato reduktazės (GRHPR). Tai labai konservuoti fermentai, turintys dvigubą aktyvumą, nes jie sugeba redukuoti glioksilatą į glikolitą ir paversti hidroksipiruvatą D-gliceridu. Nepaisant aukštos skiriamosios gebos rentgeno struktūrų nustatymo, šios klasės fermentų substrato atpažinimo būdas išlieka neaiškus. Mes nustatėme termostabiliojo GRHPR iš Archaea, kaip tribriaunio komplekso, esant 2, 0 D skyriui, esant D-glicerrato ir NADPH. Tai rodo jungimosi būdą, išsaugotą tarp žmogaus ir archealinių fermentų. Taip pat nustatėme pirmąją GRHPR struktūrą esant glikoksilatui, kurio skiriamoji geba 1, 40 Å. Tai atskleidė esminį „Leu53“ ir „Trp138“ vaidmenį prekiaujant substratais. Šios liekanos veikia kaip vartininkai prie tunelio, jungiančio aktyviąją vietą su baltymų paviršiumi, įėjimo. Visi šie rezultatai leido mums pasiūlyti bendrą GRHPR veikimo būdo modelį.

Įvadas

Glioksilatas yra maža ir labai reaktyvi dikarboksirūgšties molekulė, kurią sintezuoja dauguma eukariotų ir prokariotų. Laikomas toksišku tarpiniu junginiu, šis junginys yra metabolizuojamas neįprasto fermento, priskirto D-2-hidroksi-rūgšties dehidrogenazės superšeimai, glioksilato reduktazės / hidroksipiruvato reduktazės (GRHPR). GRHPRs yra labai konservuoti ir yra daugelyje žinomų organizmų, įskaitant žinduolius ir aukštesnius augalus 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 . Pirma, GRHPR yra dvigubo aktyvumo fermentas. Tai katalizuoja glioksilato redukciją į glikoladą, kuris arba išsiskiria, arba yra paverčiamas į glioksilatą (beprasmis ciklas), ir hidroksipiruvato pavertimą D-gliceridu - pirmtaku, teikiančiu gliukoneogeninio kelio anglis 8, 9, 10 . Antra, skirtingai nuo daugelio D-2-hidroksi-rūgšties dehidrogenazės superšeimos fermentų, kuriuose kaip koeficientas buvo naudojamas tik NADH, GRHPR gali naudoti NADH arba NADPH kaip elektronų donorus, tam tikru atžvilgiu pasirinkdami NADPH 6, 11 .

Pastaroji savybė suteikia GRHPR pranašumą prieš L-laktato dehidrogenazę (L-LDH), kitą D-2-hidroksi-rūgšties dehidrogenazę, kuri tiesiogiai konkuruoja dėl tų pačių dviejų substratų. Iš tiesų, didžiulė NADPH koncentracija, palyginti su NADH, žmogaus citozolyje normaliomis sąlygomis yra palankesnė glikolato ir D-glicerido susidarymui GRHPR, o ne oksalato (iš glioksilato) ir L-glicerrato (iš hidroksipiruvato) L-LDH 11 . Dėl šios priežasties NADPH / NADH santykis gali būti kritinis reguliuojant glioksilato konversiją, nes tai yra būdas suderinti GRHPR redukuotą glioksilato redukciją per L-LDH 12 . Kai dėl sumažėjusio GRHPR aktyvumo gliukoksilato negalima veiksmingai paversti glikolatu, ši pusiausvyra sutrinka, todėl ląstelėse kaupiasi glioksilatas. Taigi tai skatina glikoksilato virtimą oksalatu L-LDH, o ne glikolato pavidalu. Žmonėms šis oksalato perprodukcija hepatocitų citozoliuose yra nedidelių hGRHPR geno mutacijų, sukeliančių hiperoksaluriją, pasekmė; liga, sukelianti kalcio oksalato nusėdimą inkstų dubens ir inkstų parenchimoje 13 .

2006 m. Booth ir kt . nustatė žmogaus GRHPR struktūrą, sudarytą iš trijų komponentų komplekso su D-gliceridu ir NADPH, ir tai leido tiksliai suprasti substrato surišimą ir aktyvios vietos išdėstymą esant D-gliceritui 12 . Fermentinė rekombinantinio hGRHPR analizė rodo didesnį hidroksipiruvato specifiškumo konstantą nei glioksilato, kurio kaupimasis sukelia fiziologinius sutrikimus. Tai rodo, kad hGRHPR tikriausiai vaidina pagrindinį vaidmenį maitinant gliukoneogenezę mažinant hidroksipiruvatą 11 . Priešingai nei eukariotinis fermentas, GRHPR apykaita dėl glioksilato vyksta archeologinių fermentų efektyvumu 1, 6 . Hipertermofilinis archeonas „ Thermococcus litoralis“ (TliGRHPR) GRHPR rodo didesnį glikoksilato pasirinkimą nei hidroksipiruvatas, esant NADH, tuo tarpu, esant NADPH 6, jokio aktyvumo nenustatyta. Be to, GRHPR iš Pyrococcus horikoshii (PhoGRHPR), kitos hipertermofilinės archajos, buvo apibūdintas kaip glioksilato reduktazė, tačiau pirmenybė teikiama NADH kofaktoriui. PhoGRHPR kristalų struktūra buvo nustatyta kaip dvejetainis kompleksas, esant NADPH 1 . Anksčiau bakterija GRHPR iš Hyphomicrobium mehylovorum GM2 buvo tiriama apo forma 14 . Iki šiol nė viena GRHPR struktūra nebuvo išspręsta esant glikoksilatui, neleidžianti tiksliai apibūdinti substrato poveikio aktyviajai vietai, taip pat likučių, susijusių su GRHPR specifiškumu.

Tuo tikslu mes nustatėme GRHPR specifiškumą iš Pyrococcus furiosus ir Pyrococcus yayanosii (atitinkamai PfuGRHPR ir PyaGRHPR) ir palyginkime savo rezultatus su specifiškumu, anksčiau nustatytu „PhoGRHPR 1“ . Netikėtai mūsų rezultatai skyrėsi nuo jau paskelbtų. Tai leido mums visiškai apibūdinti trijų GRHPR fermentinį elgesį išmatuojant keturių galimų substrato-kofaktorių derinių kinetinius parametrus. Nors anksčiau archeologinis GRHPR buvo pasiūlytas kaip NADH priklausomas glioksilato reduktazė 1, 6, šis darbas nedviprasmiškai parodė, kad Pyrococcus rūšių GRHPR yra nuo NADH priklausomi hidroksipiripurato reduktazės. Galiausiai, susiedami su šiais išsamiais fermentiniais matavimais, čia pateikiame ir P. furiosus, ir P. yayanosii GRHPR fermentų kristalų struktūras. Įdomu tai, kad PfuGRHPR struktūra pirmą kartą atskleidžia trijų komponentų kompleksą, esant glioksilatui / glikolatui. Tai leido pasiūlyti modelį, paaiškinantį šios klasės fermentų specifiškumą ir veikimo būdą.

Rezultatai

PfuGRHPR, PhoGRHPR ir PyaGRHRPR fermentai yra labai termiškai aktyvuojami

Norėdami nustatyti GRHPR funkcinį tapatumą nuo termokokų rūšių, nustatėme jų specifinį aktyvumą ir fermentinius parametrus. Buvo gaminami įvairūs rekombinantiniai GRHPR fermentai, atsirandantys iš P. furiosus (PfuGRHPR), P. horikoshii (PhoGRHPR) ir P. yayanosii (PyaGRHPR). Išgryninę iki homogeniškumo, mes nustatėme jų atitinkamą specifinį aktyvumą, kaip substratus naudodami glioksilatą arba hidroksipiruvatą, o NADH arba NADPH - kaip kofermentus. Trijų fermentų aktyvumo profilis, atsižvelgiant į temperatūrą, buvo panašus visuose substratuose ir jų veiksnių deriniuose (žr. Papildomą S1 pav. Internete). Trys fermentai yra labai termiškai aktyvuojami. Fermentiniam apibūdinimui visi tyrimai buvo atlikti 50 ° C temperatūroje, siekiant sulėtinti reakciją, ypač esant mažoms substrato koncentracijoms.

Išryškinamas archealinio GRHPR ypatumai

Pirmiausia nustatėme pradinį reakcijos greitį. Remiantis pradiniu išmatuotos kreivės nuolydžiu, reakcijos greitis buvo apskaičiuotas mol.min −1 . Duomenys buvo pritaikyti Michaelis – Menteno modelyje arba substrato slopinimo modelyje, kad būtų gauta Michaelio konstanta (K M ), katalizinis aktyvumas (k kat ) ir substrato slopinimo konstanta Ki (1 lentelė). Sistemingai buvo atliekami trigubai tyrimai, kurių metu prisotinta kofaktoriaus arba substrato koncentracija.

Pilno dydžio lentelė

Buvo ištirta GRHPR apykaita dėl glioksilato ir hidroksipiruvato (1 lentelė). Kaip parodyta 1A pav., K katio glioksilato arba hidroksipiruvato vertės yra panašios PfuGRHPR, esant NADH (atitinkamai 13, 0 ir 10 s – 1 ) ir esant NADPH (1, 2 s – 1 abiems substratams). Panaši tendencija stebima ir PHGRHPR, kai k kat reikšmės yra 4, 0 ir 4, 5 s −1, esant NADH atitinkamai glioksilatui ir hidroksipiruvatui, ir 0, 6 s – 1, esant NADPH abiem substratams. PyaGRHPR atveju hidroksipiruvato vertės yra didesnės nei glioksilato, esant NADH (atitinkamai 25, 0 ir 4, 8 s – 1 ) ir esant NADPH (atitinkamai 6, 5 ir 1, 1 s – 1 ). Visų fermentų aktyvumas buvo didesnis su NADH, kuris, palyginti su NADPH, mažiausiai 5 kartus stimuliuoja fermentų aktyvumą (1.A pav.). Esant didelei (ne fiziologinei) substrato koncentracijai, slopinimas stebimas tik naudojant hidroksipiruvatą ir NADH, išskyrus PyaGRHPR, kuris taip pat slopina esant NADPH (1 lentelė). Tokį elgesį jau aprašė (Mdlui ir kt ., 2007). Norėdami patikslinti GRHPR substrato specifiškumą fiziologinėmis sąlygomis, nustatėme jų afiniteto parametrus, kurie esant žemiausioms (fiziologinėms) substrato koncentracijoms rodo fermentų efektyvumą ribojantį veiksnį. Kaip parodyta 1 pav. 1 ir apibendrinta 1 lentelėje, fermentų akivaizdumas hidroksipiruvatai (20–410 μM) yra didesnis nei glikoksilato (160–1800 μM). „PhoGRHPR“ rodo stipriausią afinitetą hidroksipiruvatui (atitinkamai 70 μM ir 20 μM su NADH ir NADPH). Fermentams akivaizdu, kad hidroksipiruvatas teikia pirmenybę, todėl jie gali būti vienareikšmiškai priskirti hidroksipiruvato reduktazėms (HPR).

Image

Visų plokščių matavimai, esant hidroksipiruvatui ir glioksilatui, pateikiami atitinkamai balta ir juoda spalvomis. ( A ) GRHPR fermentų katalitinis poveikis substratams. ( B ) GRHPR fermentų afinitetų vertės substratams. ( C ) GRHPR fermentų afinitetų vertės kofaktoriams. ( D ) Specifinis aktyvumas (mmol.min −1 .mg −1 ) pateikiamas kaip hidroksipiruvato koncentracijos (mM) funkcija PfuGRHPR (kvadratas), PhoGRHPR (apskritimas) ir PyaGRHPR (deimantas) su NADH (juoda) ir NADPH (pilka) kaip kofaktoriai. Dešiniajame kampe parodytas GRHPR aktyvumas esant žemai hidroksipiruvatų koncentracijai (0–900 μM). Parodyti kreivės atitikimas Michaelis-Menten arba substrato slopinimo modeliai. Klaidų juostos nematomos, kai jos yra mažesnės nei duomenų taškui naudojamas šrifto dydis. Tyrimai buvo atlikti kaip aprašyta skyriuje „Metodai“.

Visas dydis

Kofaktoriaus priklausomybė

Buvo tiriamas trijų fermentų kofaktoriaus pasirinkimas. Archealinis GRHPR rodo didesnį afinitetą NADPH, palyginti su NADH (atitinkamai 30–90 μM ir 40–290 μM, 1 pav. C). Esant PhoGRHPR, abiejų kofaktorių K M reikšmės yra mažesnės, esant glioksilatui, tuo tarpu substrato parinkimas neturi įtakos afinitetui kofaktorių atžvilgiu tiek PyaGRHPR, tiek PfuGRHPR atveju. Viena vertus, KM vertės, susijusios su NADPH, yra mažesnės, palyginti su NADH (1 lentelė), tačiau, kita vertus, esant NADH, fermentų HPR aktyvumas yra didesnis. Taigi, norint tiksliai nustatyti kofaktorių, atsakingą už didžiausią fermento efektyvumą, svarbu palyginti katalizinį efektyvumą, k cat / K M, atsižvelgiant į substrato koncentraciją (1 lentelė). Kaip rodo k cat / K M santykis, NADH padidina HPR aktyvumą. Be to, fermentinio aktyvumo kaip hidroksipiruvato koncentracijos funkcijos vaizdavimas patvirtina, kad NADH padidina trijų nagrinėjamų fermentų HPR aktyvumą (1 pav. D). Remiantis šiais fermentiniais matavimais, galima daryti išvadą, kad GRHPR iš Thermococcales rūšių yra pirmiausia nuo NADH priklausomos hidroksipiruvatų reduktazės.

Konstrukcijų nustatymas ir bendras struktūros aprašymas

GRHPR specifiškumas, ypač substrato atskyrimas tarp glioksilato ir hidroksipiruvato, išlieka sunkus. Norėdami įsigilinti į šių fermentų specifiškumą, nustatėme PfuGRHPR ir PyaGRHPR kristalų struktūras atitinkamai 1, 4 Å ir 2, 0 Å (2 lentelė). PfuGRHPR struktūra buvo nustatyta de novo fazėmis SIRAS metodu, o PyaGRHPR struktūra buvo nustatyta naudojant molekulinį pakeitimą. Kaip tikimasi iš didelės sekos identiškumo tarp dviejų fermentų (84%), PfuGRHPR ir PyaGRHPR struktūros rodo glaudų struktūrinį panašumą (RMSD: 0, 36 Å monomerų superpozicijai su antrinės struktūros atitikimo protokolu, įgyvendintam COOT 15 ). Palyginimui, PyaGRHPR ir PhoGRHPR (PDB ID kodas: 2DBQ) 1 turi 85% sekos tapatumą ir RMSD yra 0, 46 Å. GRHPR sudaro homodimerą 1, 12 tirpale. PfuGRHPR asimetriniame bloke yra monomeras, fiziologinį dimerą sukuria I4 1 erdvės grupės kristalų simetrijos operatoriai. Asimetrinis „PyaGRHPR“ kristalo vienetas rodo visą dimerą.

Pilno dydžio lentelė

Kiekvienas GRHPR monomeras turi du skirtingus α / β / α kamuolinius domenus (2A pav.). Jie vadinami kofermentą rišančiu domenu (NBD) su klasikiniu NAD (P) surišančiu Rossmann raukšle (liekanos 99–117 ir 146–292) ir substratą surišančiu (arba kataliziniu) domenu (SBD) su flavodoksinu. panašus raukšlėtis (likučiai 1–99 ir 293–333). Aktyvioji vieta yra plyšyje, suformuotame tarp dviejų sričių. „Re-to-back“ dimeris apima didelę sąsają, apimančią tarpmolekulinius kontaktus, sudarytus tik tarp koenzimą rišančio domeno liekanų (2 pav. A), kuriame yra dimerizacijos kilpa (liekanos 118–146).

Image

( A ) GRHPRs yra simetriški homodimerai su didele dimerizacijos sąsaja. Vienas monomeras pavaizduotas karikatūroje, o gretimas subvienetas parodytas kaip molekulinis paviršius ir baltas. NADPH rodomas rutuliu ir geltona spalva. NADH jungiantis domenas (liekanos 99–117 ir 146–292), substratą surišanti sritis (1–99 ir 293–333) ir dimerizacijos kilpa (118–146) pavaizduoti atitinkamai raudonai, mėlynai ir juodai. ( B - D ) PyaGRHPR aktyvių vietų vaizdas esant D-gliceritui: ( B ) D-glicerido skeleto formulė, ( C ) PyaGRHPR aktyvios vietos esant D-gliceritui, ( D ) Alternatyvus PyaGRHPR aktyvus vaizdas vietoje, kur yra D-gliceratas, parodantis NADPH fragmentą. ( E – G ) PfuGRHPR aktyvių vietų vaizdas esant glioksilatui: ( E ) Skeleto pavidalo glioksilato formulė, ( F ) PfuGRHPR aktyvios vietos liekanos esant glioksilatui, ( G ) Alternatyvus PfuGRHPR aktyvios vietos vaizdas esant glioksilatui parodantis NADPH fragmentą. D-gliceratas ir glioksilatas yra nudažyti atitinkamai žalsvai melsva ir balta. Išdėstytas sigmaA svertinis Fo - Fc OMIT žemėlapis, kontūruotas ties 3, 0 σ, vaizduojant substratą / produktą, pagrindines vandens molekules, taip pat Arg241. Atstumas nurodomas angstromoje. PyaGRHPR atveju nurodyti atstumai atitinka dviejų molekulių, esančių asimetriniame vienete, vidurkį (3 lentelė).

Visas dydis

Panašių struktūrų paieška PBP naudojant serverį DALI 16 atskleidžia, kad GRHPR (PfuGRHPR, taip pat PyaGRHPR) antrinė struktūra turi didelį panašumą su fosfito dehidrogenaze (PTDH), ypač su PTDH iš Pseudomonas stutzeri 17, 18 (PBP ID kodas). : 4E5N (dvejetainis kompleksas) ir 4E5K (trijų komponentų kompleksas)). Iš tiesų PstPTDH (4E5K) superpozicija su PfuGRHPR arba PyaGRHPR suteikia RMSD reikšmes 1, 32 Å ir 1, 29 Å, kurių sekos tapatumas yra tik artimas 34%. Palyginimui, PfuGRHPR ir žmogaus GRHPR turi tą patį RSMD 1, 23 Å su 40% sekos tapatumo tuo pačiu palyginimo metodu. Kiekvieno domeno antrinės struktūros yra nepaprastai išsaugotos tarp GRHPR ir PTDH fermentų. Šiame straipsnyje likučių numeracija nurodo Pyrococcales GRHPR sekas.

Kofaktoriaus rišimo vieta

Gauti elektronų tankio žemėlapiai atskleidė, kad Pfu ir PyaGRHPR fermentai yra trijų komponentų (fermento + kofaktoriaus + substrato / produkto) pavidale. Nei kofaktoriai, nei substratai nebuvo pridedami kristalizacijos ar krioapsaugojimo metu. Abiejose struktūrose yra kofaktoriaus molekulė, vienareikšmiškai modeliuojama kaip NADP (H), kiekvienoje aktyviojoje vietoje, kurios rafinuotas užimtumas yra 100%. NADP (H) rišimosi vieta yra šalia dviejų domenų sąsajos ir yra orientuota, kaip anksčiau aprašyta žmogaus GRHPR 12 ir PhoGRHPR 1 . Iš tiesų, GRHPR turi bendro sutarimo seką (Gly-X-Gly-XX-Gly), susijusią su dinukleotidų surišimu 19 . Ši glicino turtinga kilpa (liekanos 157–162) atpažįsta kofaktoriaus pirofosfato dalį. Nors kofaktoriaus jungtis yra panaši žmonių ir archeologiniuose GRHPR, NADPH 2′-fosfato grupės apylinkėse yra keletas skirtumų. HGRHPR struktūroje 2′-fosfato grupė yra kišenėje, kurią sudaro Arg184 ir Arg188. Pyrococcales struktūrose Arg184 pakeičiamas lizinu. Šis pakeitimas gali suteikti NADH pranašumą prieš NADPH. Be to, hGRHPR argininai 184 ir 188 yra apsupti dviejų prolinų (Pro183 ir Pro185). Priešingai, PyaGRHPR struktūroje yra tik vienas prolinas, tuo tarpu PfuGRHPR ir PhoGRHPR nėra. Palyginti su hGRHPR, tai gali suteikti daugiau lankstumo šiam regionui, susijusiam su fermento specifiškumu NADH ar NADPH 12 .

D-glicerido jungimosi žmogaus ir archajos GRHPR palyginimas

„PyaGRHPR“ struktūroje yra D-gliceratas, ŽPR aktyvumo produktas, stebimas žmogaus GRHPR 12 holo pavidalu (2 pav. C). Stebimas hidroksipiruvato substrato elektronų tankis neleido mums vienareikšmiškai atskirti substrato ir produkto (žr. Metodus). Tačiau galime spėlioti, kad PyaGRHPR kristalų struktūroje yra produktas, o ne substratas, kaip siūloma žmogaus GRHPR struktūrai 12 . Iš tiesų, gryninimas apima apdorojimą šilumos smūgiu 85 ° C temperatūroje. Šio pirmojo gryninimo etapo metu fermentas gali katalizuoti hidroksipiruvato substratą, gaunamą iš Escherichia coli metabolizmo.

Abiejų PyaGRHPR struktūros monomerų A ir hGRHPR struktūros (PDB 2GCG) superpozicija, naudojant programą COOT 15, suteikia RMSD 1, 18 Å, nepaisant žemos sekos tapatumo (42%). Priešingai nei pastebėta hGRHPR struktūroje, abi aktyviosios PyaGRHPR dimerų vietos yra užimtos D-glicerrato molekulėmis. Sąveika, vykstanti PyaGRHPR substrato rišimo vietoje, atitinka anksčiau aprašytą 12 . Konservuotas histidinas His288 sudaro rūgšties / bazės katalizatorių, kurį laiko Glu270, kuris padeda išlaikyti histidino pKa (2 pav. C). Konservuotame Arg241 buvo pasiūlyta orientuotis ir laikyti substratą katalizei per du vandenilio ryšius su atitinkamai D-glicerido 2-hidroksilo ir karboksilo grupėmis 1, 12 . Papildoma sąveika substrato orientacijai yra teikiama per karboksilato deguonies atomus, formuojančius įkrautus vandenilio ryšius su Val76 ir Gly77 pagrindinės grandinės aminais (2 pav. C). Be to, Leu53 per savo CD2 metilo grupę sudaro van der Vaals kontaktą su D-gliceridu. Sąveikos atstumai aktyviose PyaGRHPR ir hGRHPR vietose yra panašūs (3 lentelė). Vienintelis skirtumas tarp PyaGRHPR ir hGRHPR aktyvių vietų yra šalia Ser291 ir Trp138 nuo gretimo monomero. Iš tikrųjų hGRHPR struktūroje D-glicerido hidroksimetilo grupė sąveikauja su Ser291 ir Trp138 per konservuotą vandens molekulę (W3169 PDB 2GCG) (2 pav. D). Nors ši vandens molekulė yra „PyaGRHPR“ struktūroje (W2372), ji netaiko D-glicerido sąveikos su Ser291 (2 pav. D). Tiesą sakant, D-glicerido hidroksimetilo grupė tiesiogiai sąveikauja su Trp138 (2 pav. D). Galiausiai, D-glicerido ir Ser291 sąveika panaikinama PyaGRHPR struktūroje.

Pilno dydžio lentelė

GRHPR aktyviosios vietos su glioksilatu aprašymas

Pirmą kartą nustatant PfuGRHPR struktūrą, paaiškėja trišalis kompleksas, esant glioksilatui. Iš tiesų, elektronų tankis vienareikšmiškai parodė mažesnį substratą, palyginti su D-gliceridu, ir buvo priskirtas visiškai užimtai glioksilato molekulei (2F pav.) (Žr. Metodus). Kalbant apie PyaGRHPR kristalų struktūrą, glioksilatas gaunamas dėl per didelės ekspresijos E. coli . Tačiau sunku pateikti preliminarų jo buvimo paaiškinimą, nes jo metu substrato slopinimo nepastebėta (1 lentelė).

Glioksilatas yra išdėstytas ir orientuotas kaip D-gliceritas PyaGRHPR struktūroje (2 pav. C). Kaip ir tikėtasi, didžiąją dalį glioksilato ir PfuGRHPR fermento sąveikos sudaro tie patys likučiai, kaip ir susiję su D-glicerrato jungimu ir anksčiau aprašyti PyaGRHPR ir hGRHPR struktūrose (His288, Arg241, Gly77 ir Val76). Kaip parodyta 3 lentelėje, sąveikos atstumai tarp glioksilato ir jį laikančių liekanų (Arg241, Gly77 ir Val76) yra bendrai mažesni, palyginti su atstumais, kai yra D-glicerrato.

Pagrindinis skirtumas tarp glioksilato ir D-glicerrato yra papildoma 3-hidroksimetilo grupė D-glicerine. Anksčiau Booth ir kt . aprašomas sąveikos tinklas tarp Arg297 guanidinio grupės, Ser291 hidroksilo grupės, Trp138 indolo žiedo azoto ir NADPH nikotinamido amido deguonies per konservuotą vandens molekulę 12 . Šis tinklas sąveikauja su substrato molekulėmis per 3-hidroksimetilo grupę ir buvo pasiūlyta dalyvauti GRHPR specifiškume 12 . Kai PyaGRHPR struktūroje yra tas pats substratas (2 pav. D), šis tinklas, apimantis Arg297, Ser291 ir Trp138, yra išsaugotas ir yra kruopščiai suderintas su tuo, kuris stebimas hGRHPR aktyviojoje vietoje, įskaitant konservuotą vandens molekulę. Priešingai, šis tinklas yra sutrikdytas esant glioksilato molekulėms. Iš tikrųjų, jei nėra hidroksimetilo grupės, tai modifikuoja sąveiką tinkle. Kaip parodyta 2G pav., Dvi vandens molekulės, atskirtos 2, 69 Å, pakeičia vieną stebimą vandens molekulę D-gliceridu. Tinkle sąveika yra padalinta tarp dviejų vandenų, Trp138, Arg297 ir Ser291 sąveikauja su W2351, tuo tarpu NADPH ir Ser291 sąveikauja su W2352. Be to, stebima dviguba Arg297 konformacija esant glioksilatui (2G pav.). Alternatyvi konformacija nenutraukia sąveikos, nes azoto atomai visame pasaulyje yra toje pačioje vietoje kaip Arg297 esant D-gliceritui, tačiau ši alternatyvi konformacija gali pakeisti substrato aplinką. Šio tinklo sutrikimas, susijęs su glioksilato fizikinėmis ir cheminėmis savybėmis, gali būti susijęs su prastu PfuGRHPR ir PyaGRHPR fermentų afinitetu jam (1 pav. B).

Tunelio, jungiančio baltymo paviršių su aktyvia vieta, buvimas

Palyginimas tarp GRHPR struktūrų su surištu D-gliceridu arba glioksilatu išryškina aktyviosios vietos liekanų konformacijų skirtumus. Netikėtai katalitinis Arg241, kuris, kaip spėjama, orientuoja substrato molekulę 12, yra dviem pavidalais, esant glikoksilatui (3 pav.). Iš esmės tas pats, kas D-glicerrato atveju, nukreiptas į atotrūkį („į“ formos, 3A pav.). Kita forma, priešingai, rodo baltymo paviršių, kurio šoninė grandinė yra nukreipta į aktyviąją vietą („out“ formacija, 3B pav.). Dar daugiau, „Leu53“ priima kitokią struktūrą, kuri saugo ją nuo „Trp138“ ir baigiasi arti „Arg241“ (3 pav. B). Be to, dėl glikoksilato buvimo buvo galima pastebėti aktyviosios vietos pasislinkimą 1, 20 Å Trp138 (3 pav. B) per baltymo pagrindinės grandinės judėjimą. Taigi, atstumas tarp Trp138 ir Leu53 yra didesnis, kai yra glioksilato, paliekant papildomos vietos (atitinkamai 4, 75 Å ir 6, 95 Å, naudojant D-gliceridą ir su glioksilatu). Iš tiesų, šalia Trp138 buvo pastebėtas papildomas elektronų tankis, kurio negalima susieti su motinos skysčio komponentais ar vandens molekulėmis. Antrąją glioksilato molekulę galima puikiai priskirti stebėtajam elektronų tankiui ir ji buvo sėkmingai patobulinta užimant 50% (3B pav.).

Image

Viršutinė plokštė, išsami informacija apie katalizinius likučius, rodančius kofaktorių, taip pat substratai, D-gliceratas ( A ) ir glioksilatas ( B ). Tunelis pažymėtas pilku apskritimu. Skydelyje ( B ) antroji glioksilato molekulė pavaizduota tunelyje, o narvelyje pavaizduotas modeliuotas atkaitinimo sigmaA svertinis Fo - Fc OMIT žemėlapis, kontūruotas 3 sigma. Apatinė plokštė, paviršiaus atvaizdo skerspjūvis, vaizduojantis tunelį uždaroje ( C ) ir atidarytoje ( D ) formoje. Substrato ir kofaktoriaus molekulės pavaizduotos lazdelėmis cianoje. Plokštės ( A, C ) yra iš PyaGRHPR struktūros su D-gliceridu, o plokštės ( B, D ) yra iš PfuGRHPR struktūros su glioksilatu.

Visas dydis

Buvo išanalizuotas šių alternatyvių variantų poveikis katalizinės kišenės erdviniam išdėstymui. Tai leido mums nustatyti tunelį, jungiantį katalizinę kišenę su baltymo išorine dalimi (3D pav.). Šį tunelį sudaro Met52, Leu53, Ser54, Tyr74, Ala75, Leu100, Trp138 (iš gretimo monomero), Glu270, Met300, Arg297 ir Arg241 ir uždarytas NADPH molekulės gale. Diafragma, nukreipta link baltymo išorės, nukreipta į priešingą vyrio pusę tarp dviejų domenų, arti dimerizacijos kilpos, pernešančios Trp138. Šis tunelis anksčiau nebuvo aprašytas, nes jis yra suformuotas uždaroje PyaGRHPR ir hGRHPR konstrukcijose dėl alternatyvių Trp138 ir Leu53 pokyčių (3 pav. C).

Diskusija

Šiame darbe fermentiniai rezultatai nedviprasmiškai rodo, kad Pyrococcus rūšių GRHPR yra hidroksipiruvato reduktazės. Iš tikrųjų HPR ir GR aktyvumų matavimai aiškiai parodo didesnį visų tirtų fermentų hidroksipiruvato katalizinį efektyvumą, palyginti su glioksilatu. PyaGRHPR Michaelio konstanta (K M ) hidroksipiripiruatui visada yra mažesnė, palyginti su glikoksilato K M, kad ir koks būtų kofaktorius, su tokiomis pačiomis vertėmis, kaip nustatyta žmogaus GRHPR 11, 12 . Tai gali paaiškinti, kodėl PyaGRHPR struktūra, išsamiai aprašyta šiame straipsnyje, yra trišalis kompleksas (D-gliceratas-NADPH-fermentas), pateikiantis antrą GRHPR struktūros pavyzdį kartu su žmogaus GRHPR 12 (PDB ID kodas: 2GCG). Šių dviejų struktūrų palyginimas rodo, kad D-glicerido orientacija ir vieta yra vienodi, esant panašiems atstumams tarp substrato ir katalizinių liekanų. „PyaGRHPR“ struktūroje esant D-gliceritui, tinklas Trp138, Ser291 ir Arg297 yra griežtai toje pačioje vietoje, nurodytoje žmogaus struktūroje 12 . Booth ir kt . pasiūlė, kad šis tinklas reguliuoja substrato jungimąsi, ypač dėl hidroksipiruvato 12 molekulės. Atrodo, kad konservuota vandens molekulė, esanti šio tinklo centre, sąveikauja su hidroksimetilo liekana ir tinkle esančiais likučiais. Taigi mūsų duomenys rodo, kad tiek žmonių, tiek archeologinis GRHPR turi bendrą D-glicerido surišimo būdą.

Pirmą kartą GRHPR struktūra buvo nustatyta esant glikoksilatui aktyviojoje vietoje ir paaiškino GRHPR fermentų substrato atskyrimo procesą. Jokie aiškūs kinetinių parametrų požymiai negalėjo paaiškinti glioksilato buvimo. Tačiau ši unikali struktūra suteikia naujų elementų aptarti GRHPR fermentų specifiškumą ir afinitetą. Palyginus GRHPR archealines struktūras su D-gliceridu (PyaGRHPR) arba su glioksilatu (PfuGRHPR), matyti, kad glioksilato molekulė yra išdėstyta visame pasaulyje ir orientuota kaip D-gliceratas. Nepaisant to, tai, kad glioksilato molekulėje nėra hidroksimetilgrupės (palyginti su D-gliceridu), sumažina sąveiką tarp glioksilato ir baltymo ir sukelia mažesnius sąveikos atstumus. Tai gali sukelti netinkamą substrato padėjimą ir dėl to pastebimas sumažėjęs glikoksilato reduktazės aktyvumas archeologiniams GRHPR.

Tinklas, apimantis Arg297, Ser291 ir Trp138, buvo pasiūlytas dalyvauti kontroliuojant GRHPR fermentų substrato atranką, sąveikaujant su D-gliceridu per 12 hidroksimetilo grupę. PfuGRHPR struktūroje ši sąveika akivaizdžiai panaikinama su glioksilatu. Nepaisant skirtingo substrato, fosfito dehidrogenazė (PTDH) pasižymi dideliu struktūriniu panašumu su GRHPR, o aktyviosios vietos likučiai yra griežtai konservuoti 17, 18 . PTDH atveju sistemingos trijų tinklą sudarančių liekanų (Arg297, Ser291 ir Trp138) mutacijos rodo aiškų poveikį substrato afinitetui 20 . Panašiai galima teigti, kad GRHPR šie likučiai dalyvauja substrato atrankoje reguliuojant substrato afinitetą. Tai gali būti siejama su prastu glikoksilato afinitetu su archealiniame GRHPR fermente, palyginti su hidroksipiruvatu.

Anksčiau Booth ir kt . atkreipė dėmesį į vandens molekulės, užmezgančios daugybę kontaktų su D-gliceridu, NADPH ir tinklu, buvimą 12 . PTDH metu ši vandens molekulė yra konservuota ir gali veikti kaip nukleofilas 20 . Stiprus Arg297 mutacijos poveikis PTDH aktyvumui paskatino pasiūlymą aktyvuoti šią liekaną konservuotai vandens molekulei. Esant glioksilatui, šios konservuotos vandens molekulės nėra aptinkamos. Dvi vandens molekulės jį pakeičia ir Arg297 įgauna dvigubą konformaciją. Vandens molekulių pertvarkymas GRHPR aktyviojoje vietoje galėtų leisti šiek tiek pakoreguoti substrato rišimo režimą. Tačiau tikslus vandens molekulių vaidmuo GRHPR veikloje vis dar nėra aiškiai nustatytas.

Mes išanalizavome struktūrines ypatybes, kontroliuojančias kofaktoriaus priklausomybę nuo GRHPR fermentų. Žmogaus GRHPR buvo įrodyta, kad kofaktoriaus pobūdis daro stiprų poveikį kinetiniams parametrams 11 . Nors NADPH linkęs skatinti fermento afinitetą substratui (nuo 3 iki 4 kartų), NADH padidino k kat vertybes 2 kartus 11 . Mdluli ir kt . padarė išvadą, kad hGRHPR abiejų substratų, turinčių NADPH, katalizinis efektyvumas yra didesnis (k kat / K M ), palyginti su NADH 11, 12 . Įrodyta , kad fermento iš archeologinio organizmo P. horikoshii palankiausias kofaktorius yra NADH 1 . Atsižvelgiant į kinetinius parametrus, gautus kaip substrato koncentracijos funkciją, mūsų tyrimas patvirtina, kad archeologiniai GRHPRs, įskaitant PhoGRHPR, yra nuo NADH priklausomi fermentai. Iš tikrųjų NADH padidino trijų archeologinių rūšių fermentų k kat vertes, iki 10 kartų padidindamas PfuGRHPR.

Archealinės ir žmogaus GRHPR struktūros buvo išspręstos NADPH molekulėmis aktyviojoje vietoje pagal aukštą visų GRHPR afinitetą NADPH 1, 11 . Be to, NADPH buvimas linkęs padidinti GRHPR afinitetą substratui. Kaip ir naudojant hGRHPR, archealiniame GRHPR argininas Arg188 yra artimas neigiamam NADPH 2'-fosfato fragmentui, kuris, kaip nustatyta, yra kritiškai svarbus nikotinamido kofaktoriaus specifiškumui kitose dehidrogenazėse 12, 21 . Be to, Lys184 (archealinis GRHPR) pakeitimas Arg184 (žmogaus GRHPR) sustiprina teigiamai įkrautą aplink neigiamą NADPH 2'-fosfato fragmentą esančią aplinką ir gali būti siejamas su didesniu žmogaus GRHPR afinitetu NADPH, palyginti su archealiniu.

2010 m. Baltymo duomenų banke buvo deponuota apo formos žmogaus GRHPR struktūra, 2, 82 Å skiriamoji geba (PBP ID kodas: 2WWR). Be to, struktūroje, kurią nustatė Booth et al . 12 pav., Asimetriniame vienete yra tiek dvejetainės (NADPH), tiek trijų komponentų formos (PDB ID kodas: 2GCG). Taigi hGRHPR yra abi katalizinės formos (apo ir holo). It gives us the possibility of comparing the angular variation between the two domains composing GRHPR and potentially relates the resulting movement with substrate and/or cofactor bindings. Indeed, we observe a closing motion of SBD domain relative to NBD domain leading to a reduced angular distance between apo and binary form. This motion induces a closing of the substrate-binding site. No extra closing is observed between the binary and ternary forms as already mentioned by Booth et al . 12 . In conclusion, cofactor binding initiates enzymatic reaction by forming a competent active site through the relative movement of the two GRHPR domains.

Detailed analysis of substrate interactions in the PfuGRHPR structure described in this paper shows the existence of a tunnel that controls the substrate trafficking. Indeed, this tunnel connects the active site to the protein surface. Up to now, this tunnel has never been described due to alternative conformations of residues involved in it. Indeed, in presence of D-glycerate, the entrance of the active site is obstructed as observed in hGRHPR and PyaGRHPR. In particular, this tunnel is surrounded by Leu53, Trp138 and Arg241 and is large enough to accommodate a substrate molecule as illustrated by the presence of an additional glyoxylate molecule close to Trp138, providing a view of the substrate pathway. Arg241 has been proposed as a contributor to substrate orientation 12 . The observed double conformations of Arg241 in presence of glyoxylate suggests an additional role. These conformations may provide the two extreme positions of Arg241 and a view of the pathway that would be associated to carry one substrate molecule from the protein surface to the active site. As Arg241 interacts with keto and carboxylate oxygens present in both substrates, the substrate-guiding role would be relevant for both HPR and GR activities. Additionally, the structures described in this paper show that the tunnel has opened and closed forms associated with conformational changes of Trp138 and Leu53. In the conformation observed in PyaGRHPR and hGRHPR structures (with the tunnel in the closed form), Leu53 has been proposed to be involved in GRHPR specificity by preventing pyruvate binding 12 . A new conformation of Leu53 has been modeled in PfuGRHPR structure (with the tunnel in the opened form). These observations suggest that Leu53 is not only involved in substrate selectivity but is also associated with tunnel opening/closing. Moreover, as already mentioned, Trp138 acts on GRHPR specificity by interacting with hydroxymethyl moiety of hydroxypyruvate molecule favouring HPR activity 12 . This residue, provided by the adjacent monomer, is located on the dimerisation loop. Displacement of the dimerisation loop is related to the closing/opening of the tunnel through a lateral movement as illustrated by Trp138. This suggests that Trp138 and the dimerisation loop could be involved in allosteric regulation of the GRHPR dimer.

Analysis of domain movements associated with cofactor binding as well as new insights in the role of catalytic residues allows to propose a general model for the catalytic process of GRHPR as illustrated in Fig. 4. From the apo enzyme (Fig. 4, Panel A), the cofactor binding leads to the closure of active site through a relative movement of the two domains constituting the enzyme (Fig. 4, Panel B). The closure of the active site formed a tunnel connecting the protein surface to the active site. This tunnel allows the substrate to enter the active site protein (Fig. 4, Panel C). The Arg241 acts as a guide for substrate entering and substrate progression is facilitated by residues movement of Leu53 and Trp138 that regulates opening/closing of the tunnel (Fig. 4, Panel D). Substrate optimum position within the catalytic pocket is then raised thought interactions with catalytic residues (His288, Arg241, Val76 and Gly77).

Image

( A ) Schematic representation of GRHPR monomer with NBD domain in red and SBD domain in mauve. This corresponds to the apo form of the enzyme. ( B ) Binding of the cofactor induces a domains movement and formation of the tunnel. ( C ) Substrate binding. ( D ) Residue rearrangements associated with substrate trafficking. ( E ) Product release.

Visas dydis

In conclusion, the results presented here showed unambiguously that the GRHPR from Pyrococcus species are in fact NADH-dependent hydroxypyruvate reductases with a residual glyoxylate reductase activity. For the first time, the GRHPR structure was solved in presence of glyoxylate. The detailed analysis of this unique structure has highlighted the presence of a tunnel that we proposed to be involved in substrate trafficking. Based on these new insights, a model of the catalytic process of GRHPR is proposed.

Metodai

Protein overproduction and purification

For production of recombinants PfuGRHPR, and PhoGRHPR and PyaGRHPR genes were generated from synthetic DNA fragments optimized for codon usage in Escherichia coli and cloned in the overexpression plasmid pET41c by GeneCust Europe. BL21 (DE3)-RIL cells containing the respective plasmid were grown with shaking at 37 °C overnight in LB medium [20 g of LB broth (Sigma) l-1 of deionized water] containing 50 μg/ml kanamycine. Ten milliliters of this subculture was added to 1 l of LB medium supplemented with kanamycine to a final concentration 50 μg/ml. After incubation with shaking at 37 °C until the A600 reached 0.6–1.0, the induction was carried out by adding isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside to a final concentration of 0.5 mM, and shaking for a further 4 h. Cells were harvested by centrifugation for 15 min at 4500 g, and the pellet was resuspended in 50 mM Tris (pH 7.5) and 20 mM NaCl containing 0.1% Triton X-100.

After treated with Lysozyme 0.25 mg/ml, DNaseI 0.05 mg/ml RNAse 0.2 mg/ml, cOmplete Protease Inhibitor Cocktail Tablets (Roche) and MgSO 4 (0.01 mM), the disruption of the cells was achieved by sonication on Branson sonifier 150 3 times for 30 s with intermediary pauses of 30 s on ice. The crude extract was heated at 85 °C for 30 min and then clarified by centrifugation at 17000 g for 45 min at 4 °C.

The supernatant was loaded on a 6 ml Resource Q column (GE Healthcare) equilibrated with 20 mM Tris-HCl, 0.05 M NaCl, pH 7.5. After washing with 3 column volumes (CV) with this buffer, proteins were eluted at 3 ml min −1 with a 20 CV linear salt gradient (from 0.05 to 0.25 M NaCl in 20 mM Tris-HCl pH 7.5). Fractions of 3 ml were collected and those with GRHPR activity were pooled and concentrated using an Amicon cell (Millipore) with a molecular mass cutoff of 30 kDa. The protein was loaded onto a Superose 12 column (GE Healthcare). An elution peak corresponding to an apparent molecular mass of 66 kDa was observed. According to SDS-PAGE and mass spectrometry, the corresponding fractions contained pure GRHPR. The fractions were pooled and kept at 4 °C after concentration to about 10 mg/ml.

Enzymatic assay

Activity measurements were carried out in a UV-Vis 660 Jasco spectrophotometer (France) equipped with a Peltier-effect thermoregulated cell (20–100 °C). Activity was followed by NAD(P)H absorbance at 340 nm.

The effect of temperature on the activity was measured in the range from 50 °C to 90 °C with a prewarmed buffer containing sodium phosphate buffer 50 mM (pH 8.0). For the four possible substrate/cofactor combinations, concentrations of glyoxylate or hydroxypyruvate (0.2 mM) with NADH or NADPH (0.32 mM) were used with different protein concentrations depending on temperature: PfuGRHPR (3.1–20.0 μg/ml), PhoGRHPR (0.4–20.0 μg/ml) and PyaGRHPR(0.2–20.0 μg/ml). Each measurement was done in triplicate. Results are summarized in Supplementary Fig. S1 online (using GraphPad Prism version 6.00 for Mac, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com).

To determine the kinetic parameters, the initial velocity was examined by varying the concentration of one substrate while keeping the concentrations of the other substrates constant. A prewarmed buffer containing Tris-HCl 100 mM (pH 8.0) was used. Concentrations of glyoxylate (0.05–8 mM) and NADH (0.5 mM) or NADPH (0.5 mM) and hydroxypyruvate (0.05–8 mM) and NADH (0.5 mM) or NADPH (0.5 mM) were used. Enzyme concentration was determined by absorbance at 280 nm. Different range of protein concentrations were used according to the cofactor: in presence of NADH, 0.4, 1.6 and 0.4 μg/ml for PfuGRHPR, PhoGRHPR and PyaGRHPR respectively and in presence of NADPH, 1.2, 9.2 and 3.3 μg/ml for PfuGRHPR, PhoGRHPR and PyaGRHPR respectively. The data were fitted to a Michaelis–Menten equation or substrate inhibition equation to extract the values of the Michaelis constant K M, turnover number k cat and substrate inhibition constant using GraphPad Prism version 6.00 for Mac, GraphPad Software, San Diego California USA, www.graphpad.com. Values with their standard errors are summarized in Table 1. Each measurement was done in triplicate. All enzymatic tests were carried out at 50 °C.

Protein crystallization

Initial crystals hits were obtained by using the HTXlab platform at EMBL, Grenoble. Initial conditions were optimized by the hanging drop methode at 293 K using EasyXtalTool X-Seal plates (Qiagen). PfuGRHPR was found to crystallize with a mother liquor containing 100 mM sodium acetate, pH 5.2, 15% polyethylene glycol 400 and 100 mM NaCl. PyaGRHPR was found to crystallize with mother liquor containing 1.7 Malonate (Hampton), pH 7.0. For crystallization, 1 ml of mother liquor was placed in the well of the crystallization plate and the drop was formed by mixing 1.5 μl of protein solution at 10 mg.ml −1 and 1.5 μl of mother liquor.

Prior to data collection, crystals were cryo-cooled in liquid nitrogen using mother liquor containing 30% PEG 400 as cryo-protectant for PfuGRHPR and 2.5 M Malonate and 15% glycerol for PyaGRHPR. PfuGRHPR derivative crystals were obtained by a 10 seconds soaking of a native crystal in a 2.0 μL solution equivalent to the mother liquor containing 100 mM of GdHPDO3A lanthanide complex.

Data collection and data processing

X-ray diffraction data were collected on the FIP-BM30A beamline at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble, France) on a single crystal of PyaGRHPR and on the PROXIMA 1 beamline at the French national Synchrotron facility (SOLEIL, Paris, France) on a single crystal of PfuGRHPR for the native data set at 0.9796 Å at 100 K. Gd-derivative data were collected on the same beamline at 1.711 Å.

Diffraction frames were integrated using the program XDS 22 and the integrated intensities were scaled and merged using the CCP4 programs 23 SCALA and TRUNCATE, respectively. A summary of the processing statistics is given in Table 2.

PfuGRHPR crystals belong to the I4 1 space group with one monomer per asymmetric unit. PyaGRHPR crystals belong to the P6 2 22 space group with one dimer per asymmetric unit. Both crystal forms led to a solvent proportion of approximately 75%.

Eksperimentinis PfuGRHPR duomenų SIRAS fazavimas

PfuGRHPR struktūra buvo išspręsta de novo SIRAS (vienkartinis izomorfinis pakeitimas anomaliniu sklaidymu) metodu. Kaip parodyta 2 lentelėje, aukšta R ano reikšmė aiškiai parodė, kad yra GdHPDO3A sudėtingų jungimosi vietų, kurios vėliau buvo patvirtintos patikrinus anomalų Pattersono žemėlapį. Gadolinio vietos buvo nustatytos asimetriniame vienete naudojant programą SHELXD 24 . Sunkiųjų atomų patobulinimas ir pradinis etapavimas buvo atlikti naudojant programą SHARP 25 . Fazės iš SHARP buvo pagerintos modifikuojant tankį naudojant CCP4 programą SOLOMON 26, todėl nuopelnų rodikliai buvo atitinkamai 0, 907 po SHARP ir tankio modifikavimo. Automatinis modelio kūrimas buvo atliktas naudojant programą BUCCANEER 27 .

PyaGRHPR molekulinis pakeitimas

PyaGRHPR struktūra buvo nustatyta molekuliniu pakeitimu, naudojant PhoGRHPR monomero (PDB ID 2DBR) 3D struktūrą, kurios sekos identiškumas yra 84% su PyaGRHPR. Skaičiavimai buvo atlikti naudojant PHASER 28, naudojant visus turimus difrakcijos duomenis. Molekulinio pakaitinio tirpalo Z vertė yra 116, o log-tikimybės padidėjimas 672. Automatinis modelio kūrimas buvo atliktas naudojant programą BUCCANEER 27 .

Patikslinimas

Modeliai buvo patobulinti rankiniu būdu ir patobulinti COOT 15 prieš tobulinant su PHENIX 29 naudojant energijos minimizavimą ir atkaitinimą torsiono kampo erdvėje per pirmąjį turą. Tuomet šie modeliai buvo optimizuoti atliekant pakartotinius tobulinimo ir modelio kūrimo etapus. Patobulinimo etapuose TLS buvo naudojamas su TLS grupėmis, nustatytomis su TLSMD serveriu 30, 31, ir buvo pridėta vandenilio (išskyrus ligandus ir tirpiklio molekules). Šių galutinių modelių analizė (2 lentelė) nerodė likučių neleidžiamuose Ramachandrano siužeto regionuose (atitinkamai 99, 7% ir 99, 3% PyaGRHPR ir PfuGRHPR pageidaujamuose ir leistinuose regionuose).

Aktyviojoje vietoje esančių molekulių pobūdis buvo nustatytas patikslinant struktūrą, esant substratui arba produktui, ir apžiūrint, ar lFD yra / nėra likučių mFo-DFc elektronų tankio žemėlapiuose. Taip pat buvo atsižvelgiama į modeliuotą atkaitinimo sigmaA-svertinį Fo - Fc OMIT žemėlapį. Šis požiūris, susijęs su didele PfuGRHPR struktūros skiriamąja geba, leidžia mums vienareikšmiškai nustatyti, kad aktyviojoje vietoje yra glioksilato. Tačiau PyaGRHPR struktūros atveju nebuvo įmanoma atskirti substrato ir produkto.

Visi paveikslai buvo paruošti naudojant PyMOL („PyMOL Molecular Graphics System“, versija 1.5.0.4 „Schrödinger“, LLC). Konstrukcijų superpozicija atlikta su THESEUS 32 . Kristalografinę programinės įrangos paramą teikia „SBGrid 33“ .

PfuGRHPR ir PyaGRHPR atominės koordinatės ir išmatuotos struktūros koeficiento amplitudės buvo dedamos į baltymų duomenų banką atitinkamai su prisijungimo kodais 5AOV ir 5AOW.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Lassalle, L. et al . Naujos įžvalgos apie prekybos substratais mechanizmus, susijusius su glioksilato / hidroksipiruvato reduktazėmis. Mokslas. Rep. 6, 20629; „doi“: 10.1038 / srep20629 (2016).

Pokyčių istorija

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.