Stomageno nmr struktūra rodo stomatinio tankio reguliavimo augaliniais peptidais hormonais pagrindą | gamtos komunikacijos

Stomageno nmr struktūra rodo stomatinio tankio reguliavimo augaliniais peptidais hormonais pagrindą | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Augalų vystymasis
  • Augalų hormonai
  • Augalų molekulinė biologija
  • Stomata

Anotacija

Stomatalinį vystymąsi augaluose reguliuoja į defensiną panašūs sekreciniai epidermio modeliavimo faktoriai (EPF) - peptidų hormonai. Tik vienas iš jų, stomagenas, yra teigiamas reguliatorius, tuo tarpu EPF1, EPF2 ir galbūt kiti yra neigiami reguliatoriai. Čia tiriame EPF struktūros ir funkcijos ryšį, integruodami NMR ir pusiau in vitro stomageno eksperimentus. Mes parodome, kad stomageną sudaro kilpa ir pastoliai, kuriuose yra trys disulfido jungtys. Mutatas, sudarytas iš stomageno kilpos ir EPF2 pastolių, teigiamai sureguliuoja stomatito tankį Arabidopsis skydliaukėse. Abipusis mutantas, sudarytas iš EPF2 kilpos ir stomageno pastolių, veikia neigiamai. Dėl disulfido jungties pašalinimo atsiranda išsiskleidimas ir neveiklumas. Mūsų rezultatai rodo, kad kilpa suteikia EPF funkcinį specifiškumą ir kad pastoliai yra struktūriškai reikalingi jų veiklai. Šis struktūrinio skilimo metodas funkcinei vietai išsiaiškinti galėtų būti pritaikytas analizuoti kitas peptidų, kuriuose gausu cisteino, grupes.

Įvadas

Dujų mainus sausumos augaluose tarpina stomata, mažos poros, kurias sudaro apsauginės ląstelės lapų ir stiebų paviršiaus epidermio audiniuose 1, 2 . Gimdos vystymąsi ir tankį neigiamai reguliuoja membraniniai baltymai, įskaitant per daug burnos (TMM) ir į ERECTA receptorius primenančių kinazių (ERf) šeimą, kuriose yra ER, ERL1 ir ERL2 (žr. 3.4). Manoma, kad TMM ir ERf receptoriai mažėja ir veikia specifiniam audiniui būdingu būdu 4, 5 . Bent du galimi TMM – ERf komplekso ligandai, epidermio modeliavimo faktorius 1 (EPF1) ir EPF2, yra neigiami 3, 6, 7, 8, 9 stomatalinio tankio reguliatoriai .

Išsamios bioinforminės Arabidopsis genomo analizės parodė, kad keli genai, kurių funkcija nežinoma, yra panašūs į EPF1 ir EPF2 , o jų produktai laikomi EPF šeimos nariais. Šie homologiniai peptidai yra į defensiną panašūs sekreciniai peptidai, kuriuose gausu cisteino ir yra klasifikuojami kaip augalų peptidų hormonai. Keli EPF šeimos nariai, įskaitant EPF1 ir EPF2, veikia kaip neigiami gimdos vystymosi reguliatoriai. Kitų narių funkcijos išlieka neaiškios. Įdomu tai, kad šiuo metu žinoma, kad stomagenas (EPFL9) veikia kaip teigiamas reguliatorius 10, 11, 12 . Vienas iš labiausiai intriguojančių klausimų šioje srityje yra tai, kaip ir kodėl tos pačios šeimos peptidai gali sukelti priešingą poveikį gimdos tankumui. Norėdami suprasti EPF struktūros ir funkcijos ryšį, mes integruojame NMR ir pusiau in vitro stomageno eksperimentus. Trimačią stomageno struktūrą išsprendžiame tirpalo BMR. Kiek mums yra žinoma, tai yra pirmoji trimatė augalinio peptido hormono struktūros analizė. Be to, mes pastebime, kad kilpa suteikia EPF funkcinį specifiškumą ir kad pastoliai yra struktūriškai reikalingi šių peptidų veikimui.

Rezultatai

Stomageno struktūra

Stabilūs izotopu pažymėti BMR mėginiai buvo paruošti per baltymų ekspresijos sistemą, naudojant indukuojamą viruso vektorių ir suspensijoje auginamas augalų ląsteles 13 . Šio BMR mėginio paruošimo metodo, kurį iš pradžių sukūrė mūsų grupė, pranašumas yra tas, kad leidžiami išreikšti baltymai, kuriuose yra daug cisteino, sulankstyti tinkamai suformuojant disulfidinius ryšius 14 . Mes taikėme šį mėginio paruošimo metodą, nes EPF turi šešis konservuotus cisteino likučius (1a pav.). 1b paveiksle pavaizduota 1 H- 15 N HSQC stomageno. Siauros linijos forma ir signalų sklaida rodo vieningą stabilią struktūrą. Dvimatės 1 H- 1 H branduolinės Overhauserio stiprinimo spektroskopijos (NOESY) α 1 H-α 1 H sritis, parodyta 1c paveiksle, rodo β-sruogų buvimą 15 . Iš NMR gauto struktūrinio išaiškinimo rezultatai pateikti 1d – g paveiksle. Struktūrinės charakteristikos apibendrintos papildomoje S1 lentelėje. DALI (//ekhidna.biocenter.helsinki.fi/dali_server/) analizė parodė, kad stomagenas naudoja naują lankstymo modelį.

Image

a ) Pagrindinės EPF šeimos narių iš Arabidopsis struktūros . Sekų derinimas buvo atliktas naudojant „ClustalW“. Konservuoti cisteino likučiai yra raudonos spalvos. Trys poros stomageno disulfido jungčių žymimos linijomis. Cilindras ir strėlės žymi atitinkamai spiralę ir sruogą. b ) Stomageno 1 H – 15 N HSQC. Žvaigždutės rodo labai silpno smailės viršūnę. Penki Arg šoninės grandinės ɛ signalai rodomi kaip sulankstytos smailės. c ) dvimačio 1 H- 1 H NOESY spektro stomageno α 1 H-α 1 H sritis žemyn. Punktyrinės linijos žymi α 1 H-α 1 H NOE poras β lape. Kai kurios smailės yra pažymėtos jų aminorūgščių tipu ir liekanų skaičiumi. d ) Steremino 20 TMR struktūrų stereo vaizdas. Pavaizduotas tik jų stuburas. e ) Stomageno juostelės modelis. Rutulio ir lazdelės modelyje pavaizduotos trys poros disulfidinių jungčių. Antriniai struktūriniai regionai buvo įvertinti naudojant MOLMOL. f ) { 1 H} - 15 N NOE eksperimentų rezultatai. Klaidų juostos rodo sd ( n = 2). g ) elektrostatinis potencialo pasiskirstymas ant stomageno molekulinio paviršiaus. Raudona, mėlyna ir balta reiškia atitinkamai neigiamą, teigiamą ir hidrofobinį. Kai kurie likučiai yra pažymėti amino rūgščių tipu ir liekanų numeriu.

Visas dydis

Stomageno struktūroje dvi anti-paralelinės β-gijos (liekanos 19–24 ir 39–44) yra sujungtos 14 liekanų kilpa. Antiparalelinis β lakštas supakuotas su aminoterminale esančia sritimi, kurioje yra vieno posūkio 3 10- spiralė (liekanos 10–13), palaikoma trimis disulfidiniais ryšiais, kurių vietos (Cys8-Cys41, Cys13- Cys20 ir Cys16-Cys43) buvo identiški tiems, kurie anksčiau buvo gauti fermentinio skaidymo ir masių spektrometrijos (MS) 11 būdu . Ši stomageno šerdis, susidedanti iš β lakšto ir vieno posūkio 3 10- spiralės, neatitinka nė vieno ištisinio aminorūgščių sekos ruožo; jis yra padalintas į N- ir karboksi-galines sritis (liekanos 8–24 ir 39–44). Buvo nustatyta, kad šie du regionai, atitinkantys šerdį, apima palyginti konservuotus regionus, kuriuose aminorūgščių seka yra suderinta su šeima (1a pav.). Šešios cisteino liekanos, esančios šerdyje, yra ypač gerai konservuotos.

Priešingai nei šerdis, kilpa apima labai skirtingą EPF šeimos narių aminorūgščių sekos suderinimo sritį. Kilpos sritis įterpiama į aminorūgščių sekos vidurinę padėtį (1a pav.). Skirtingai nuo pastolių, 14 likučių stomageno kilpa turi tam tikrą lankstumą, tai parodo santykinai mažos vertės { 1 H} - 15 N branduolinio overhauserio efekto (NOE) rezultatuose (1f pav.).

Apskaičiuotas elektrostatinis potencialas ant stomageno molekulinio paviršiaus ir parodytas 1g paveiksle. Viena molekulinio paviršiaus pusė yra gana hidrofobinė, o šioje pusėje yra konservuoti cisteino likučiai pastoliuose. Stomageno kilpos paviršius turi neigiamai įkrautus regionus, bet nėra teigiamai įkrautų regionų.

Kaip papildoma struktūrinė analizė, neigiamas reguliatorius EPF2 buvo tiriamas MS ir BMR. Bandėme paruošti EPF2 be žymės sekos, naudodami BY-2 ląsteles, tačiau išeiga buvo per maža. Taigi, mes pridėjome 6 × His-etiketę ir „PreScission“ proteazės skaidymo vietą EPF2 N gale. Po proteazės suardymo ir išgryninimo, EPF2 ′ mėginio N-gale buvo du papildomi likučiai - Gly-Pro, palyginti su laukiniu veidu, tačiau jis išlaikė savo aktyvumą (papildomas S1 pav.). Palyginti su stomagenu, pačiame EPF2 yra du papildomi cisteino likučiai, esantys kilpos srityje, kaip parodyta 1a paveiksle. Fermentinio skaidymo būdu paruoštų produktų MS atskleidė, kad šie cisteino likučiai EPF2 ′ sudaro disulfidinį ryšį (papildomas S2a pav.). EPF2 ′ vieno matmens 1H-NMR turi mažesnio lauko poslinkio α 1 H rezonansus, o tai rodo, kad EPF2 turi β lakštus (-us) (papildomas S2b pav.) 15 . Šie struktūriniai suvaržymai rodo, kad EPF2 turi trijų matmenų struktūrą, panašią į stomageno. Vėliau mes panaudojome stomageno struktūrą bandydami modeliuoti visų kitų EPF homologiją. Šios struktūros prognozės rodo, kad visi EPF turi panašią molekulinę raukšlę (papildomas S3 pav.). Kilpoje buvo rastas didelis struktūrinių skirtumų tarp EPF, tačiau tai gali atitikti peptidų funkcinius skirtumus.

Stomageną antagonizuoja EPF2

Prieš pradedant pusiau in vitro eksperimentus, naudojant EPF ir mutantus, mūsų neigiama kontrolė patvirtino, kad išorinis peptido pritaikymas nekeičia stomatalinio vystymosi. Mes panaudojome plektaziną 16, 17, peptidą, turintį tris disulfidinius ryšius, kurio funkcija nėra susijusi su gimdos išsivystymu. Plectasin buvo taikomas 1DAG Arabidopsis augalams, kad būtų galima stebėti jų gebėjimą sukelti stomatų formavimąsi. Nustatyta, kad neigiamas kontrolinis peptidas nedaro įtakos gimdos vystymuisi (2a pav.). Be to, plektazinas neturėjo įtakos stomageno funkcijai (2b pav.). Šie plektazino rezultatai patvirtina mūsų pusiau in vitro eksperimentų patikimumą.

Image

a ) Neigiamos kontrolės plektazino poveikis Arabidopsis skydliaukės skrandžio tankiui. Klaidų juostos rodo sd ( n > 5). b ) Plektazino poveikis esant stomagenui. Plectasin nekonkuruoja su stomagenu. Klaidų juostos rodo sd ( n > 5). ** P <0, 01, palyginti su Wilcoxon dviejų mėginių bandymu. Tarp vidurio ir dešinės pusės reikšmingo skirtumo nepastebėta. c ) nuo dozės priklausomas stomageno ir EPF2 ′ poveikis Arabidopsis skydliaukių skrandžio tankumui. Klaidų juostos rodo sd ( n > 8). ** P <0, 01 pagal Wilcoxon dviejų mėginių bandymą. d ) 1H- 15 N HSQC su 15 N pažymėtu stomagenu, jei nėra (kairėje) ir nėra (dešinėje) nepaženklinto EPF2 ′. Rezonanso priskyrimai parodyti papildomame S1 paveiksle. Arg šoninių grandinių atlenktos smailės parodytos dėžutėse.

Visas dydis

Biologiniams eksperimentams chemiškai susintetintas stomagenas buvo perdarytas iš naujo ir EPF2 ′ buvo paruoštas, kaip aprašyta. Tiek Stomagenas, tiek EPF2 ′ buvo naudojami 1DAG Arabidopsis augalams, kad būtų galima stebėti jų gebėjimą sukelti stomos formavimąsi. Stomageno pridėjimas padidino stomatalinį tankį, tačiau jį sumažino EPF2 ′ (2c pav.; Papildomas S1 pav.). Be to, EPF2 ′ poveikis buvo akivaizdus net esant stomagenui ir priklausė nuo koncentracijos (2c pav.). 2c paveikslas aiškiai parodo, kad stomageno ir EPF2 kiekio skirtumai nulemia bendrą jų poveikį gimdos vystymuisi. Mes taip pat stebėjome 15H-15N pažymėto stomageno 1H-15N HSQC spektrus, jei nėra ir nėra EPF2 '(2d pav.). Tarp šių dviejų spektrų reikšmingo skirtumo nerasta. NMR rezultatai rodo, kad stomagenas nesąveikauja su EPF2 ′ in vitro . Šie rezultatai rodo, kad 2c paveiksle pastebėta funkcinė konkurencija nebuvo sukelta tiesioginės sąveikos tarp stomageno ir EPF2 ′.

Disulfidinių jungčių vaidmuo

Toliau mes ištyrėme disulfidinių ryšių vaidmenį, naudojant chemiškai susintetintą stomageno mutantą, kuriame du iš šešių konservuotų cisteino liekanų buvo pakeisti serino liekanomis (3a pav.). Mes taip pat paruošėme chemiškai susintetintą stomageno mutantą C / S, kuriame visos cisteino liekanos buvo pakeistos serino liekanomis (3a pav.). Žemyn nukreipti α1 H signalai, rezonuojantys iš β lapą sudarančių likučių, dingo mutantų vienmačiuose 1H-NMR spektruose (3b pav.). NMR rezultatai tvirtai rodo, kad įvedus šias mutacijas buvo pažeista bendra struktūra 15 . Visų pirma C / S mutantui, paslinkusių α1 H signalų išnykimas rodė visišką β lakšto struktūros praradimą (3b pav.).

Image

a ) Stomageno aminorūgščių sekos ir ΔSS ir C / S mutantai. Raudonos raidės nurodo mutacijos taškus. b ) Stomageno (viršaus) ir mutantų 1H-NMR spektrų α1 H sritis žemyn α1 H srityje. ( c, d ) mutantų peptidų poveikis Arabidopsis skydliaukių stomataliniam tankiui; stomageno ir mutantų koncentracija yra 3 μM. Klaidų juostos rodo sd ( n > 8). ** P <0, 01, palyginti su Wilcoxon dviejų mėginių bandymu.

Visas dydis

Nors buvo tikimasi, kad visi ΔSS mutantai sudarys du disulfidinius ryšius, fermentinis skaidymas ir MS analizė parodė, kad susiformavo neteisingas disulfidinis ryšys (papildomos figūros S4-S6 ir papildomos lentelės S2-S4). Pavyzdžiui, tikėtasi, kad Δ (8–41) turės du disulfidinius ryšius Cys13 – Cys20 ir Cys16–43, tačiau mūsų rezultatai parodė, kad Cys20 – Cys43 buvo suformuotas disulfidinis ryšys, tačiau kiti du cisteino likučiai - Cys13 ir Cy43, nesudarė disulfido jungties. Todėl neteisingas disulfidinių jungčių susidarymas lemia netinkamą formą (3b pav.). Panašus netaisyklingo disulfidinio ryšio susidarymas buvo pastebėtas kitiems dviem variantams; ΔSS (13–20) ir ΔSS (16–43) atveju buvo suformuotos tik atitinkamai Cys8 – Cys16 ir Cys20 – Cys41 jungtys. Šie rezultatai aiškiai rodo, kad visos trys poros disulfidinių ryšių yra būtinos norint sudaryti sutarimo pagrindą.

Semi- in vitro eksperimentai parodė, kad mutacijos, pašalinančios vieną ar tris disulfidinius ryšius, neturėjo jokios įtakos gimdos tankumui (3c pav., D). Tikėtina, kad dėl disulfidinių ryšių trūkumo susidariusiems nestruktūriniams mutantams buvo sunku priimti aktyvią konformaciją.

Mes taip pat ištyrėme trumpus peptidus, atitinkančius pilnas arba dalines stomageno kilpos sritis. Šie peptidai neturėjo įtakos gimdos tankumui (papildomas S7 pav.). Šie duomenys rodo, kad maži peptidai, atitinkantys stomageno kilpą, nėra pakankamai reikšmingi, kad turėtų kokį nors poveikį. Todėl visą dėmesį skyrėme kilpos kontekstui visame peptide.

Kilpa suteikia peptido funkciją

Mes suprojektavome ir paruošėme dviejų rūšių kilpinius mutantus, kad būtų galima įvertinti jų aktyvumą (4a pav.). Vienas iš jų buvo EPF2'-St, kurį sudarė EPF2 pastoliai ir stomageno kilpa; kitas buvo abipusė chimera St′-EPF2, kurią sudarė stomageno pastoliai ir EPF2 kilpa. Panašiai kaip EPF2 ′, abu šie peptidai turėjo du papildomus likučius N gale po fermento skaidymo mėginio paruošimo metu (4a pav.). Nustatyta, kad EPF2′-St padidina Arabidopsis skydliaukių skrandžio tankį priklausomai nuo koncentracijos (4b, c pav.). Taigi, duomenys rodo, kad EPF2′-St veikia kaip teigiamas reguliatorius, nors pats EPF2 yra neigiamas gimdos vystymosi reguliatorius. Skirtingai nuo EPF2′-St, abipusė chimera St′-EPF2 sumažino Arabidopsis skydliaukių stomatalinį tankį, nors poveikis atrodė šiek tiek silpnesnis nei EPF2 ′ (4d, e pav.). Šie mutantai, kuriuos pakeitė kilpa, aiškiai parodė, kad kilpa suteikia funkciją EPF peptidams.

Image

a ) Šiuose eksperimentuose naudojamų stomageno mutantų (EPF2′-St ir St′-EPF2) aminorūgščių sekos. Raudonos ir mėlynos raidės nurodo atitinkamai stomageno ir EPF2 aminorūgščių sekas. Pirmieji du likučiai, GP, yra papildomi likučiai, kurie lieka po proteazės skaidymo gryninimo metu. b ) A. thaliana skydliaukės abaksinio epidermio, esančio be peptido (viršuje) arba EPF2-St (apačioje), konfokaliniai vaizdai. Vaizdo mastelio juosta rodo 50 μm. c ) Stomatalinis tankis esant EPF2-St arba stomagenui esant skirtingoms koncentracijoms. Klaidų juostos rodo sd ( n > 8). ** P <0, 01, palyginti su kontrole, analizuota atliekant dviejų mėginių „Wilcoxon“ testą. d ) A. thaliana skydliaukės abaksinio epidermio, esančio be peptido (viršuje) arba St′-EPF2 (apačioje), konfokaliniai vaizdai. Vaizdo mastelio juosta rodo 50 μm. e ) Stomatalinis tankis, esant St′-EPF2 arba stomagenui, esant skirtingoms koncentracijoms. Klaidų juostos rodo atitinkamai sd ( n > 8), * P <0, 05 ir ** P <0, 01, palyginti su Wilcoxon dviejų imčių bandymo kontroliniais elementais. f ) Stomageno ir Ala mutantų aminorūgščių sekos. Raudonos raidės nurodo mutacijos taškus. ( g ) stomageno (viršuje) ir Ala mutantų (kiti) 1H-NMR spektrų α1H sritis α1 H srityje. h ) Mutantų peptidų poveikis Arabidopsis skydliaukių stomataliniam tankiui. Klaidų juostos rodo sd ( n > 8). ** P <0, 01, palyginti su Wilcoxon dviejų mėginių bandymo kontrolinėmis medžiagomis. ## P <0, 01 tarp dviejų nurodytų gydymo būdų Wilcoxon dviejų mėginių bandyme.

Visas dydis

Galiausiai savo dėmesį sutelkėme į krūvio pasiskirstymą ant stomageno kilpos paviršiaus. Kaip parodyta 1g paveiksle, funkcinės kilpos paviršiuje yra dvi neigiamai įkrautos sritys, kurias sudaro tirpikliu veikiamos įkrautos liekanos E28 ir D31. Mes atlikome mutacijos eksperimentus, kurių metu šie įkrauti likučiai buvo atskirai pakeisti alaninu (4f pav.). 1H-NMR duomenys patvirtino, kad šios mutacijos netrikdė stomageno konformacijos (4g pav.). Pusiau in vitro atlikti tyrimai parodė, kad E28A mutantas turi silpnesnį aktyvumą nei laukinio tipo stomagenas, tuo tarpu D31A mutantas veikia panašiai kaip stomagenas (4 pav.). Taigi mes padarėme išvadą, kad E28 prisideda prie stomageno aktyvumo, o D31 ne.

Diskusija

Šiame darbe mes papasakojome trimatę stomageno struktūrą ir panaudojome ją EPF šeimos struktūros ir funkcijos ryšiams ištirti. Mes nustatėme, kad stomageną sudaro kilpa ir pastoliai, o pusiau in vitro eksperimentai aiškiai parodė, kad kilpa suteikia funkciją.

Stomageno aktyvumą blokuoja EPF2, kuris parodo jų sąveiką, tačiau šis NMR tyrimas parodė, kad stomagenas nesąveikauja su EPF2. Todėl kyla trys galimi čia stebimo antagonistinio veiksmo paaiškinimai. Pirma, šie peptidai turi identišką jungiamąją vietą savo bendram taikiniui ir kad jie jungiasi konkuruodami. Antras variantas yra tai, kad jie sąveikauja su skirtingomis bendro taikinio vietomis; tokiu atveju pradinis įrišimas gali turėti įtakos tolesnei sąveikai. Galutinis scenarijus yra tas, kad jie suriša skirtingus tikslus. Gali būti, kad šioje reguliavimo sistemoje yra papildomų, dar nežinomų, veiksnių.

Iš NMR gauta struktūra parodė, kad stomageno funkcinė kilpa yra gana hidrofobinė. Be to, buvo nustatyta, kad kilpoje esantis E28 yra reikalingas visam stomageno veikimui. Kaip parodyta 1g paveiksle, E28 yra hidrofobinio molekulinio paviršiaus, kuriame yra konservuotos cisteino liekanos, esančios konsensuso rėmuose, šone. Jei šis paviršius tiesiogiai sąveikauja su taikiniu, tada taikinys greičiausiai turi hidrofobinį molekulinį paviršių, kuriame yra teigiami krūviai. Įdomu pastebėti, kad tiek TMM, tiek ERf, kurie greičiausiai sudaro heterodimerą, kuris, kaip manoma, yra stomageno taikinys, yra numatomi, kad jų išorinės membranos domenuose bus hidrofobinių leucino turtingų pakartojimų 4, 5 . Yra žinoma, kad molekuliniam atpažinimui dažnai naudojami pakartojimai, kuriuose gausu leucino 18 .

Stomageno pastoliai stabilizuojami trimis disulfidiniais ryšiais ir reiškia naują struktūrą struktūrinių klasifikacijų duomenų bazėje. Mutacijos eksperimentai parodė, kad trys poros disulfidinių ryšių, suformuotų iš šešių cisteino liekanų, yra būtinos, norint stabilizuoti EPF sutarimo pagrindą. Todėl šie cisteino likučiai turėjo būti išsaugoti molekulės evoliucijos metu. Tikimasi, kad, priešingai, mutacijas būtų lengviau įvesti į kilpą, o tai leistų diferencijuotis į daugelio rūšių EPF peptidus, turinčius įvairią veiklą. Daugybė skirtingų EPF šeimos peptidų, turinčių skirtingą aktyvumą, yra labai svarbūs norint pasiekti subtilų ir sudėtingą gimdos tankio reguliavimą. Vienas iš būdų suprasti jų funkcinį suderinimą gali būti jų erdvėsemorinės išraiškos profilio analizė. Tolesnė struktūrinė ir funkcinė analizė, sutelkianti dėmesį į EPF C-galinę sritį, kuri yra dar viena skirtinga sritis aminorūgšties sekos suderinime, taip pat gali parodyti tam tikrą biologinę reikšmę.

Panašiai kaip EPF, neseniai į defensiną panašios cisteino turinčios šeimos, tokios kaip SCRL ir LURE, neseniai buvo pripažintos augalų biologinių procesų reguliatoriais 19, 20 . Nors atrodo, kad jų trimatės struktūros skiriasi nuo stomageno raukšlės, panašus struktūrinio skaidymo metodas galėtų būti naudingas norint sužinoti apie jų funkcines vietas. Jų aminorūgščių sekų padalijimas į regioną, kuriame yra šeimos sutarimo disulfidiniai ryšiai, ir kitus mažiau konservuotus regionus, galėtų padėti atskirti jų funkcinę (-ias) vietą (-as).

Metodai

Peptidai

Šiame tyrime naudojami stomagenai, EPF2 ir stomageno mutantai buvo pernelyg ekspresuojami BY-2 ląstelėse, jei nenurodyta kitaip. Pirkti chemiškai susintetinti peptidai („Promega“).

Vektorių konstrukcija ir peptidų raiška

Šiame tyrime naudojami pradmenys yra apibendrinti papildomoje S5 lentelėje. Pomidorų mozaikos viruso ekspresijos vektorius, naudojamas stomageno EPF2 ′, EPF2′-St ir St′-EPF2 ekspresijai, buvo sukonstruotas naudojant pBICER8-C0.3-HuIFN-γ-SRz 21, kad pakeistų IFN geną papildomu. DNR, koduojančios stomageną, EPF2 ′, EPF2′-St arba St′-EPF2. Valymo tikslais EPF2 ', EPF2' -St ir St'-EPF2 turėjo savo žymėjimo seką (HHHHHHHLEVLFQGP) savo N-galo galuose. Šios cDNR buvo amplifikuotos PGR, naudojant pradmenis, parodytus papildomoje S5 lentelėje. Konstrukcijos buvo įvestos į transgenines BY-2 ląsteles, ekspresuojančias β-estrogenais aktyvinamą transkripcijos faktorių XVE. Kiekviena transgeninių BY2 suspensijos būdu auginamų ląstelių linija buvo palaikoma 26 ° C temperatūroje, kiekvieną savaitę perpilant 1 ml sočios suspensijos į 100 ml šviežios Murashige ir SKoog skystos terpės. Šių peptidų ekspresija buvo suaktyvinta pridedant 10 μM 17 β-estradiolio į kultūrą 2 dienas po subkultūros. Žymų sekos EPF2-St, išskiriamose į terpę, buvo suardytos proteazėmis šeimininke.

Stabilių izotopu pažymėtų peptidų ekspresija

BMR tyrimui buvo paruošti nepaženklinti, 15 N ir 13 C ir 15 N pažymėti mėginiai. Norint paruošti vienodus 15 N pažymėtus BMR mėginius, į terpę buvo ištirpinti stabilūs izotopu pažymėti K 15 NO 3 ir 15 NH 4 15 NO 3, atitinkamai esant 1, 900 ir 1, 650 mg l −1, kad jie būtų naudojami kaip azoto šaltiniai 14. . Panašiai 13 C žymėti buvo naudojama vienoda 13 C žymėta sacharozė. Kitas peptidų ekspresijos protokolas buvo identiškas aukščiau aprašytajam.

Peptidų valymas

BY-2 ląstelių, ekspresuojančių stomageną arba EPF2′-St, mitybinė terpė ultracentrifuguojama esant 1 000 000 g 30 minučių, o supernatantas filtruojamas per 0, 22 μm filtrą. Filtratas įpilamas į atvirkštinės fazės HPLC kolonėlę. Išplovus kolonėlę 5% metanolio ir 0, 5% TFA tirpalu, eliuacija atlikta tiesiniu metanolio gradientu (5–90%). EPF2 ′ ir St′-EPF2 buvo išgryninti afininės chromatografijos būdu, naudojant Hi-Trap chelatų kolonėlę, po kurios skaidomas „PreScission“ proteazės. Proteazės ir sukaupti baltymai-šeimininkai buvo pašalinti glutationo S- transferazės ir Ni 2+ afiniteto kolonomis. Mėginių grynumas buvo patikrintas naudojant SDS – PAGE ir matricinės lazerinės desorbcijos / jonizacijos – skrydžio laiko masės spektrometriją (MALDI – TOF-MS) (Voyager DE RP, Applied Biosystems).

Susintetintų peptidų perpakavimas

Chemiškai susintetintas stomagenas buvo ištirpintas 20 mM Tris – HCl, pH 8, 8 ir 50 mM NaCl. Mėginio tirpalas buvo dializuojamas 1 dieną 4 ° C temperatūroje prieš 0, 5 mM glutationo ir 200 mM L-arginino, esant pH 8, 0. Tada mėginio tirpalas tris kartus buvo dializuojamas, naudojant tinkamą BMR arba biologinio tyrimo buferį.

Fermentinis virškinimas ir variantų MS

Kiekvienas perlenktas peptidas (30 μg) buvo liofilizuotas ir ištirpintas 40 μl 8 M karbamido tirpale. Šie mėginiai buvo praskiedžiami 400 μl amonio bikarbonato. Į kiekvieną tirpalą įpilama po du mikrogramus tripsino. Mėginiai buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 1 valandą, po to 1 valandą laikomi kambario temperatūroje. Be to, visi mėginiai buvo inkubuojami 4 ° C temperatūroje 6 valandas arba be DTT (5 μl kiekvienam 50 μl mėginiui). Kiekvienas suskaidytas peptido tirpalas buvo išgrynintas ir sukoncentruotas naudojant „ZipTip C18“ pipetės galiuką (Millipore). Šie išgryninti mėginiai buvo sumaišyti su α-ciano-4-hidroksicinaminės rūgšties matrica (50% acetonitrilo su 0, 1% TFA) ir analizuoti naudojant MALDI-TOF-MS.

Pusiau in vitro tyrimas

Mėginių peptidai buvo uždėti 1DAG Arabidopsis thaliana Columbia-0 augalams, kurie sudygo B5 sterilizuotoje skystoje terpėje. Po dar trijų inkubacinių dienų, esančių 22 ° C temperatūroje, stuburo tankis ant abaksinių skilčialapių buvo nustatytas tikrinant konokaliniu mikroskopu 12 .

BMR mėginiai

Visi BMR tyrimui skirti mėginiai buvo ištirpinti H 2 O / D 2 O = 90/10 arba 100% D 2 O, turinčiame 100 mM KCl, esant 5, 8 pH (tiesiogiai vertinant pH metro rodmenis). Mėginio koncentracija buvo ∼ 0, 6 mM.

BMR eksperimentai ir struktūros skaičiavimas

Visi BMR duomenys buvo gauti naudojant „Bruker AVANCE III 800“ spektrometrą su TCI kriogeniniu trigubo rezonanso zondu. BMR eksperimentų metu mėginio temperatūra buvo laikoma 25 ° C. Išmatuoti 1 H- 15 N HSQC, HNCO, HNCA, CBCA (CO) NH ir HNCACB stuburo rezonanso priskyrimai 22, 23, 24, 25 . Išmatuoti HCCH-TOCSY (maišymo laikas = 23 ms) ir 2D-TOCSY (maišymo laikas = 43 ms), kai šoninės grandinės rezonansas priskiriamas 26, 27 . Norėdami gauti atstumo informaciją 28, 29, buvo naudojami 2D-NOESY (maišymo laikas = 80, 150 ir 200 ms) ir 15 N redaguotas NOESY (maišymo laikas = 80, 150 ir 200 ms). BMR duomenų apdorojimas ir analizė buvo atlikti naudojant „NMRPipe 30“ . BMR spektrų analizė buvo atlikta naudojant „NMRView 31“ ir „Sparky 32“ . NOE, H jungtys, pagrįstos antrine struktūra, ir divalentiniai kampai antrinėse struktūrose buvo naudojami kaip apribojimai struktūros skaičiavimui 33 . Konstrukcijos buvo apskaičiuotos naudojant sa.inp protokolą Xplor-NIH 2.26. Apskaičiavimui buvo gauti 690 iš BMR gauti apribojimai. Buvo apskaičiuota šimtas konstrukcijų ir 93 struktūros buvo laikomos priimtinomis ir be didelių pažeidimų (papildoma S1 lentelė). Galiausiai buvo atrinktos ir išanalizuotos 20 konstrukcijų, turinčių mažiausią energiją. Konstrukcijų kokybė buvo patikrinta naudojant PROCHECK 34 . Visi struktūriniai skaičiai buvo sukurti naudojant MOLMOL 35 .

Kitų EPF homologinis modeliavimas

Kadangi stomagenas turi naujo tipo raukšlę, baltymų duomenų banke nebuvo panaši struktūra. Kadangi trūko tinkamo šablono, su duomenų baze susietos struktūros prognozavimo svetainės, tokios kaip „Swiss-Prot“, neveikė gerai. Todėl kaip šabloną mes panaudojome stomageno struktūrą, o homologinis modeliavimas buvo atliktas naudojant asmeninio kompiuterio programas „ Modelller 36, 37, 38, 39“ ir „EasyModeller 40“ . Konservuoti disulfidiniai ryšiai išliko fiksuoti modelio kūrimo etapuose.

Prisijungimai

Baltymų duomenų bankas

  • 2LIU
  • 2LIY 3D vaizdas

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Papildomi S1-7 paveikslai ir papildomos lentelės S1-S5.

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.