Mazgas padidina foxo3a aktyvumą ir jo sinergetinę sąveiką su smaigaliais, siekiant reguliuoti ciklino g2 transkripciją kiaušidžių vėžio ląstelėse | onkogenas

Mazgas padidina foxo3a aktyvumą ir jo sinergetinę sąveiką su smaigaliais, siekiant reguliuoti ciklino g2 transkripciją kiaušidžių vėžio ląstelėse | onkogenas

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių signalizavimas
  • Genų reguliavimas
  • Kiaušidžių vėžys

Anotacija

Neseniai įrodyta, kad Nodal, transformuojančio augimo faktoriaus β superšeimos narys, slopina ląstelių dauginimąsi ir stimuliuoja ciklino G2 (CCNG2) ekspresiją žmogaus epitelinio kiaušidžių vėžio ląstelėse. Tačiau tikslūs šių įvykių mechanizmai nėra visiškai suprantami. Šiame tyrime mes ištyrėme CCNG2 transkripcinį reguliavimą Nodal signalizacijos keliu. Kiaušidžių vėžio ląstelėse padidėjęs mazgo ar jo receptorių, į aktyvino receptorius panašios kinazės 7 (ALK7) arba ALK4, padidėjimas paskatino CCNG2 promotoriaus aktyvumą. Žmogaus CCNG2 promotoriuje yra keletas numanomų Forkhead dėžutės O klasės (FoxO) 3a rišančių vietų, o per didelis FoxO3a ekspresija padidino CCNG2 promotoriaus aktyvumą. Funkcinis FoxO3a surišantis elementas (FBE) buvo suskirstytas į proksimalinę sritį, esančią tarp –398 ir –380 bp (FBE1), atliekant delecijos ir mutacijos analizę, taip pat atliekant chromatino imunoprecipitacijos (IP) tyrimą. Įdomu tai, kad FBE1 mutacija ne tik panaikino FoxO3a poveikį, bet ir užblokavo Nodal sukeltą CCNG2 transkripciją. Mazgas stimuliavo FoxO3a mRNR ir baltymų ekspresiją kanoniniu Smad keliu ir slopino FoxO3a inaktyvaciją slopindamas AKT aktyvumą. „FoxO3a“ nutildymas naudojant mažas trukdančias RNR reikšmingai sumažino „ Nodal“ poveikį CCNG2 promotoriaus aktyvumui. Kita vertus, per didelis Smad2 ir Smad3 ekspresija sustiprino FoxO3a sukeltą CCNG2 promotoriaus aktyvumą, o Smad4 numušimas blokavo FoxO3a aktyvumą. Be to, IP tyrimai atskleidė, kad FoxO3a sudarė kompleksus su Smad baltymais ir kad Nodal sustiprino FoxO3a prisijungimą prie CCNG2 promotoriaus. Galiausiai FoxO3a nutildymas panaikino slopinantį Nodal poveikį ląstelių dauginimuisi. Apibendrinant, šie radiniai parodė, kad Nodal signalizavimas skatina CCNG2 transkripciją padidindamas FoxO3a ekspresiją, slopindamas FoxO3a fosforilinimą ir sustiprindamas sinergetinę sąveiką su Smads. Šie rezultatai taip pat rodo, kad FoxO3a yra svarbus tarpinių signalų tarpininkas kiaušidžių vėžio ląstelėse.

Įvadas

Nodal, kuris keičiasi augimo faktoriaus β (TGF-β) šeima, vaidina svarbų vaidmenį embriogenezės metu, tokius kaip mezodermos formavimas ir kairės-dešinės ašies modeliavimas (Schier ir Shen, 2000; Shen, 2007; Baker ir kt.) ., 2008). Neseniai mes parodėme, kad Nodal ir jo receptoriai, į aktyvino receptorius panašios kinazės 7 (ALK7) ir ALK4, yra ekspresuojami žmogaus kiaušidžių vėžio ląstelėse (Xu ir kt., 2004). Be to, Nodal taip pat buvo aptiktas žiurkių kiaušidžių folikulų ląstelėse, normaliose ir piktybinėse žmogaus endometriumo ląstelėse (Papageorgiou ir kt., 2009), žindančiuose žinduoliuose (Kenney ir kt., 2004) bei krūties vėžio ląstelėse (Strizzi ir kt., 2008). taip pat salelių ląstelės kasoje (Zhang ir kt., 2008). Nodal išraiška įvairiuose audiniuose rodo, kad jo biologinė funkcija gali būti išplėsta už embriono vystymosi ribų. Iš tiesų, kaip pranešta, Nodal slopina proliferaciją ir sukelia apoptozę žmogaus trofoblastinėse ląstelėse (Munir ir kt., 2004), žmogaus kiaušidžių vėžio ląstelėse (Xu ir kt., 2004, 2006, 2008), žiurkių kiaušidžių granuliozinėse ląstelėse (Wang et al. ., 2006) ir pelių bei žmogaus kasos β ląstelės (Zhang ir kt., 2008). Priešingai, Nodal skatina kamieninių ląstelių atsinaujinimą (Ogawa ir kt., 2007) ir melanomos tumorigeninį poveikį (Topczewska ir kt., 2006).

Kanoninis mazgo signalizavimas primena TGF-β / Smad kelią (Kumar ir kt., 2001; Derynck ir Zhang, 2003; Massague ir kt., 2005). Mazgas jungiasi prie membraninių serino / treonino kinazės receptorių komplekso, susidedančio iš I tipo (ALK4 arba ALK7) ir II tipo (ActRIIA arba ActRIIB) serino / teronino kinazės receptorių, kad suaktyvintų Smad2 ir Smad3 (Kumar ir kt., 2001; Reissmann ir kt.)., 2001). Fosforilinti Smad2 / 3 baltymai jungiasi prie Smad4 ir vėliau vyksta branduolio translokacija, leidžianti surinkti aktyvius transkripcijos kompleksus ant Nodal taikinių genų promotoriaus (Schier, 2003; Massague et al., 2005).

Žmogaus ciklinas G2 (CCNG2) priklauso netradicinių ciklinų „G“ šeimai (Bates ir kt., 1996; Horne ir kt., 1996). Skirtingai nuo kitų ciklinų, veikiančių ląstelių ciklo progresavimą, nebuvo nustatyta, kad CCNG2 sudarytų kompleksus su jokiomis nuo ciklino priklausomomis baltymų kinazėmis. Vietoj to, CCNG2 slopina ląstelių ciklo progresavimą galbūt sąveikaudamas su baltymo 2A ​​fosfatazės kataliziniu ir reguliavimo subvienetais (Bennin et al., 2002). CCNG2 pusinės eliminacijos laikas yra trumpas ir greitai skaidomas pagal ubikvitino – proteasomos kelią (Xu ir kt., 2008), sudarydamas būdą, kuriuo sulaikytos arba ramios ląstelės gali vėl patekti į ląstelių ciklą. Negimdinis CCNG2 ekspresas slopino ląstelių dauginimąsi ir paskatino ląstelių ciklo sustojimą pelių B ląstelėse (Horne ir kt., 1997), HEK293, Kinijos žiurkėno kiaušidžių ląstelėse (Bennin et al., 2002) ir keliose vėžio ląstelių linijose (Kim et al., 2004; Le ir kt., 2007; Xu ir kt., 2008). Krūties vėžio ląstelėse HER2 slopina CCNG2 ekspresiją keliais tarpląsteliniais keliais, įskaitant fosfoinositido 3-kinazę (PI3K), c-jun NH2-galinę kinazę ir rapamicino taikinį žinduoliams (Le et al., 2007).

„FoxO3a“ priklauso „Forkhead box O“ klasės (FoxO) transkripcijos faktorių šeimai (Anderson ir kt., 1998; Huang ir Tindall, 2007). FoxO transkripcijos faktoriai reguliuoja įvairias ląstelių funkcijas (Accili ir Arden, 2004), reguliuodami genus, susijusius su ląstelių dauginimu ir apoptozė (Weidinger ir kt., 2008). Konkrečiai, buvo pranešta, kad FoxO3a suaktyvina genus, sukeliančius ląstelių ciklo sustojimą, tokius kaip p27 (Dijkers et al., 2000), p21 (Seoane et al., 2004), p15 ir p19 (Katayama et al., 2008) ir slopinti ciklino D2 raišką (Fernandez de Mattos ir kt., 2004). FoxO3a taip pat dalyvauja apoptozėje, aktyvuodamas proapoptozinius genus Bim (Sunters et al., 2003), Puma (You et al., 2006), TRAIL (Cornforth et al., 2008) ir Fas ligandą (Brunet et al., 1999). . FoxO3a ekspresijos slopinimas skatina ląstelių transformaciją, naviko progresavimą ir angiogenezę, tai rodo, kad FoxO3a atlieka auglį slopinančius vaidmenis (Ramaswamy ir kt., 2002). FoxO3a aktyvumas daugiausia reguliuojamas pooperacinių modifikacijų, tokių kaip fosforilinimas (Brunet ir kt., 1999; Hu ir kt., 2004), deacetilinimas (Brunet ir kt., 2004) bei skilimas (Yang ir kt.), Lygmeniu. 2008). Aktyvinant PI3K / AKT ir IkappaB kinazės / branduolio faktoriaus-κB signalizacijos kaskadą, reaguojant į augimo dirgiklius, FoxO3a fosforilėja ir po to vyksta branduolio pašalinimas.

Anksčiau mes pranešėme, kad Nodal veikia per ALK7, kad slopintų nemirtingų kiaušidžių epitelio ląstelių ir epitelio kiaušidžių vėžio ląstelių proliferaciją (Xu ir kt., 2004) ir kad antideproliferacinis Nodal poveikis kiaušidžių ląstelėms iš dalies yra susijęs su padidėjusiu CCNG2 ekspresija (Xu ir kt., 2008). Šiame tyrime mes ištyrėme, kaip Nodal signalizacija reguliuoja CCNG2 raišką transkripcijos lygiu. Čia pranešame, kad Nodal padidino CCNG2 transkripciją per FoxO3a.

Rezultatai

Nodal pagerina CCNG2 transkripciją žmogaus kiaušidžių vėžio ląstelėse

Anksčiau mes pastebėjome, kad dėl pernelyg didelio mazgo ekspresijos ar ALK7 aktyvavimo padidėjo CCNG2 mRNR lygis (Xu ir kt., 2008). Norėdami ištirti molekulinius mechanizmus, kuriais Nodal indukuoja CCNG2 geno ekspresiją žmogaus kiaušidžių vėžio ląstelėse, sukūrėme CCNG2 promotoriaus konstrukcijas ir atlikome luciferazės tyrimus. OV2008 ląstelėse per didelis Nodal ekspresas reikšmingai padidino CCNG2 promotoriaus aktyvumą (1a pav.). Panašiai transfekcija su konstituciškai aktyviais receptorių konstruktais, ALK7ca arba ALK4ca, taip pat padidino luciferazės aktyvumą (1b pav.). Be to, gydymas rekombinantiniu žmogaus mazgu (rhNodal) padidino CCNG2 mRNR (1c paveikslas) ir baltymų (1d paveikslas) lygius. LY294002, PI3K inhibitorius, taip pat padidino CCNG2 baltymų kiekį (1d pav.). Kita vertus, SB431542, ALK4 / 5/7 kinazės inhibitorius (Matsuyama et al., 2003), sumažino CCNG2 baltymo ekspresiją (1d pav.).

Image

Mazgas indukuoja CCNG2 promotoriaus aktyvumą, mRNR ir baltymų kiekį kiaušidžių vėžio ląstelėse. a ) mazgo sukelta CCNG2 transkripcija. OV2008 ląstelės buvo transfekuotos viso ilgio CCNG2 promotoriaus konstruktu, luciferazės vektoriais kartu su kontroliniu pCS2 (EV) arba pCS2, turinčiu komplementarią DNR (cDNR), koduojančiu subrendusį mazgą (300 ng kiekvienoje duobutėje). Liuciferazės tyrimai buvo atlikti per 24 valandas po transfekcijos. Mazgo išraiška ląstelėje ir sekrecija į auginimo terpę buvo patvirtinta Western blot metodu. ( b ) konstitutiškai aktyvus ALK7 (ALK7ca) ir ALK4 (ALK4ca) sukeltas CCNG2 promotoriaus aktyvumas. Ląstelės buvo transfekuotos kontroliniu (EV), ALK7ca arba ALK4ca (300 ng kiekvienoje duobutėje) ir luciferazės tyrimai buvo atlikti kaip ( a ) punkte. c ) mazgas padidino CCNG2 mRNR lygį. OV2008 ląstelės 24 valandas buvo apdorotos rhNodal (500 ng / ml), o CCNG2 mRNR buvo išmatuota realaus laiko PGR. d ) mazgas padidino CCNG2 baltymų kiekį. IOSE 398 ląstelės buvo apdorotos rhNodal (500 ng / ml), LY294002 (10 μM) ir SB431542 (10 μM), ir ląstelių lizatai buvo paruošti per 24 valandas po apdorojimo. Skirtingomis raidėmis pažymėti brūkšniai rodo reikšmingą skirtumą, kai P <0, 05.

Visas dydis

CCNG2 genas yra transkripcinis FoxO3a taikinys

Norėdami nustatyti, kaip Nodal reguliuoja CCNG 2 transkripciją, mes ieškojome transkripcijos faktorių surišimo vietų CCNG 2 promotoriuje ir nustatėme bendrą FoxO rišančią vietą (FBE3, 5′-GTAAACA-3 ′) (Lin ir kt., 1997; Furuyama). et al., 2000), esant nuo –1345 iki –1338 bp (1 papildomas paveikslas). Be to, promotoriaus regione, esančiame nuo –1139 iki –1134 bp (FBE2), rastas pagrindinis FoxO3a surišantis motyvas 5′ – AAACA-3 ′ (Tsai et al., 2007), taip pat trys pagrindiniai motyvo kartojimai taip pat buvo trys. stebimas regione nuo –398 iki –380 bp (FBE1) (1 papildomas paveikslas). Taip pat CCNG 2 promotoriuje mes radome keletą Smad surišančių vietų (5′-AGAC-3 ′), iš kurių dvi yra arti FBE. Kadangi FoxO transkripcijos veiksniai gali sąveikauti su Smads norėdami reguliuoti genų ekspresiją (Seoane et al., 2004), mes hipotezuojame, kad Nodal per FoxO3a sukelia CCNG2 ir jo sąveiką su Smads. Norėdami patikrinti šią hipotezę, pirmiausia ištyrėme, ar FoxO3a sukėlė CCNG2 transkripciją. Laukinio tipo FoxO3a (FoxO3a-WT) ir jo konstitucinės aktyvuotos formos, FoxO3a-AAA, turinčios mutacijas AKT fosforilinimo vietose, ekspresija (Kops et al., 1999; Ramaswamy et al., 2002) padidino CCNG2 promotoriaus aktyvumą. priklausomai nuo dozės ir laiko, OV2008 ląstelėse (2a ir b paveikslai). Kadangi FoxO3a yra neaktyvuota AKT signalizacijos, mes taip pat išbandėme, ar PI3K kelio blokavimas turės įtakos CCNG2 transkripcijai. Kaip parodyta 2c paveiksle, LY294002 sukėlė nuo dozės priklausomą luciferazės aktyvumo padidėjimą. Toliau atlikome promotoriaus trynimo analizę, norėdami apibrėžti FoxO3a ir Nodal reaguojančias sritis CCNG2 promotoriuje (3a pav.). Per didelis „FoxO3a-WT“ ir –AAA (3b paveikslas) arba mazgo (3c paveikslas) ekspresija sukėlė viso ilgio promotoriaus (−1491 bp, F6) aktyvumą, o indukuojantis poveikis buvo išlaikytas panašus lygis, ištrynant priešais esančias dalis. promotoriaus iki –601 bp srities (3b pav.), kas rodo, kad šiame regione esantys FBE3 ir FBE2 bei Smad surišantys elementai (SBE) nefunkcionuoja tarpininkaujant FoxO3a ir Nodal indukcijai CCNG2 geno transkripcijai. Tolesnis promotoriaus srities ištrynimas iš –601 iki –361 bp sukėlė reikšmingą bazinio ir FoxO3a ir Nodal sukeltų CCNG2 promotorių aktyvumo sumažėjimą (3b pav.). Norint patvirtinti, kad FBE1 yra kritinis FoxO3a ir Nodal reguliuojamos CCNG2 transkripcijos metu, buvo sukurtas F3 mutanto konstruktas (3c paveikslas). Palyginus su WT F3 konstruktu, FBE1 mutacija reikšmingai sumažino bazinį, taip pat FoxO3a-, LY294002- ir Nodal sukeltą promotoriaus aktyvumą (3c paveikslas).

Image

FoxO3a stimuliuoja CCNG2 promotoriaus aktyvumą. a ) Nuo dozės priklausomas „FoxO3a-WT“ ir jo konstituciškai aktyvios formos (AAA) ekspresijos poveikis CCNG2 promotoriaus aktyvumui. Ląstelės buvo transfekuotos skirtingais kiekiais FoxO3a-WT, FoxO3a-AAA arba jų tuščiojo vektoriaus (EV) kontrole. Praėjus 24 val. Po transfekcijos, buvo atliktas luciferazės tyrimas. FoxO3a ekspresija buvo patvirtinta naudojant Western blot analizę, naudojant anti-flag vėliavą. ( b ) FoxO3a-WT arba -AAA (0, 3 μg) per didelis ekspresijos poveikis CCNG2 promotoriaus aktyvumui pagal laiką. Ląstelės buvo transfekuotos nurodyta plazmidė, praėjus 3 - 36 valandoms po transfekcijos; buvo atlikti luciferazės tyrimai ir Western blot. ( c ) PI3K inhibitorius LY294002 sukėlė CCNG2 promotoriaus aktyvumą priklausomai nuo dozės. Grupės, žymimos skirtingomis raidėmis, žymi reikšmingą skirtumą, kai P <0, 05.

Visas dydis

Image

CCNG2 promotoriaus regiono, reaguojančio į FoxO3a ir Nodal, apibūdinimas. a ) CCNG2 promotoriaus, kuriame yra potencialios FBE, SBE ir kitos transkripcijos faktorių surišimo vietos, tokios kaip AP2 ir SP1, scheminis vaizdas. Sukurtos šešios CCNG2 promotoriaus delecijos konstrukcijos nuo –1491 bp (F6) iki –149 bp (F1). ( b ) FoxO3a ir Nodal poveikis CCNG2 promotoriaus delecijos konstruktų aktyvumui. Ląstelės buvo transfekuotos promotoriaus konstruktu ir tuščio vektoriaus (EV) kontrole FoxO3a-WT, konstituciškai aktyviu FoxO3a (FoxO3a-AAA) arba subrendusiu mazgu. pGL4 basic taip pat buvo naudojamas kaip neigiama kontrolė. Pašalinus nuo –601 iki –361 bp, žymiai sumažėjo bazinio, FoxO3a ir Nodal sukeltų promotorių aktyvumas. ( c ) mutantinis promotorius (F3-Mut), turintis mutavusią FBE1 vietą, buvo sugeneruotas tiesioginės mutagenezės vietoje. Mutantinis promotorius F3-Mut sumažino pagrindinio promotoriaus F3 bazinį aktyvumą ir panaikino FoxO3a-, LY294002- ir Nodal sukeltą promotoriaus aktyvumą. Skirtingomis raidėmis pažymėti brūkšniai rodo reikšmingą skirtumą, kai P <0, 05.

Visas dydis

Mazgas padidina FoxO3a aktyvumą ir išraišką

Yra žinoma, kad FoxO3a fosforilinimas ir branduolio eksportas įvyksta suaktyvinus onkogenines kinazes, tokias kaip AKT ir IkappaB kinazės (Hu ir kt., 2004). Norėdami dar labiau išsiaiškinti, ar Nodal reguliuoja CCNG2 transkripciją per FoxO3a aktyvaciją, mes ištyrėme, ar Nodal ir jo receptoriai moduliuoja FoxO3a aktyvumą. Inkubacija su Nodal sumažino fosforilinto FoxO3a lygį ir padidino bendrą FoxO3a ekspresiją IOSE-398 ir OV2008 (4a paveikslas). Gydymas Nodal taip pat sukėlė Smad2 ir 3 fosforilinimą, tačiau slopino AKT fosforilinimą (4a pav.). Panašūs rezultatai buvo gauti, kai OV2008 ląstelės buvo transfekuotos Nodal, ALK7ca arba ALK4ca (4a pav.). Be to, tiek po tarpląstelinio frakcionavimo, tiek atlikus imunoblotų nustatymą ir imunofluorescencinius tyrimus paaiškėjo, kad Nodal, ALK7ca ir ALK4ca transfekcija sąlygojo FoxO3a branduolinį susilaikymą (4b paveikslas). Norėdami ištirti, ar Nodal taip pat padidina FoxO3a aktyvumą, reguliuodamas jo genų ekspresiją, išmatuojome FoxO3a mRNR ir baltymų lygį. Inkubacija su rhNodal arba transfekcija su Nodal plazmidės DNR padidėjo, o endogeninio ALK7 ar Smad4 nutildymas naudojant mažas trukdančias RNR (siRNR) sumažėjo, FoxO3a baltymų lygis (4c pav.). Be to, FoxO3a mRNR lygį taip pat sukėlė rhNodal gydymas IOSE398 keliose kiaušidžių vėžio ląstelių linijose, įskaitant OV2008, Skov3 ir ES2, didžiausias padidėjimas pastebėtas IOSE398 ląstelėse (4d pav.).

Image

Signalų mazgas padidina FoxO3a aktyvumą. a ) mazgas ir jo receptoriai suaktyvino Smad2 / 3 ir slopino AKT aktyvaciją ir FoxO3a inaktyvaciją. Kairės plokštės: IOSE398 ir OV2008 ląstelės buvo gydomos su rhNodal arba be jo 1 valandą po 6 valandų badavimo. Western blotting buvo atliktas naudojant įvairius antikūnus, kaip nurodyta. Dešinės plokštės: OV2008 ląstelės buvo transfekuotos Nodal, ALK7ca, ALK4ca arba jų tuščiojo vektoriaus (EV) kontrole 6 h, po to 12 h atsigauna. Egzogeninių Nodal, ALK7ca ir ALK4ca ekspresija buvo patvirtinta imunoblotu. ( b ) mazgas ir jo receptoriai sukėlė FoxO3a kaupimąsi branduolyje. OV2008 ląstelės buvo transfekuotos 6 valandas naudojant tuščią kontrolinį vektorių, Nodal, ALK4ca arba ALK7ca. Po 12–15 val. Pasigaminimo kultūros terpėje ląstelės buvo frakcionuojamos tarpląsteliniu būdu (kairysis skydelis) ir imunofluorescencija (dešinysis skydelis). Kairiajame skydelyje Nodal, ALK7ca ar ALK4ca padidino FoxO3a lygį branduolyje ir sumažino fosforilinto FoxO3a (pFoxO3a) lygį citoplazmoje. Kaip teigiama kontrolė, Nodal taip pat paskatino Smad2, 3 ir 4 kaupimąsi branduolyje. Nodal, ALK7ca ar ALK4ca ekspresija citoplazmoje buvo patvirtinta antikūnais prieš Nodal, c-Myc ir HA, ir, norint parodyti įkrovos kontrolę, blotai buvo pakartoti lamino B ir glicerraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) antikūnais. Dešiniajame skydelyje, EV-transfekuotose ląstelėse, ir ne-transfekcijose, FoxO3a signalai daugiausia buvo stebimi citoplazmoje. Tačiau Nodal transfekuotoje grupėje ir ALK4 / 7 transfekuotose ląstelėse FoxO3a daugiausia buvo rasta branduolyje. ALK7ca arba ALK4ca transfekuotos ląstelės buvo paveiktos dviguba imunofluorescencija naudojant FoxO3a antikūną (raudonas signalas) ir c-Myc arba HA antikūną (žalias signalas identifikuoti transfekuotas ląsteles). Masto juosta = 10 μm. c ) mazginis signalizavimas padidino FoxO3a baltymo ekspresiją. „RhNodal“ (500 ng / ml) apdorojimas IOSE398 arba OV2008 ląstelėse 24 valandas indukuota FoxO3a baltymo ekspresija (viršutinė panelė). Nodalinio signalo slopinimas, nutildžius ALK7 (kairysis apatinis skydelis) arba Smad4 (dešinysis apatinis skydas), naudojant specifines siRNR, sumažino FoxO3a baltymo ekspresiją OV2008 ląstelėse. β-aktinas buvo naudojamas kaip apkrovos kontrolė. ( d ) mazgas padidino FoxO3a mRNR lygį. IOSE398 ir kelios kiaušidžių vėžio ląstelių linijos 24 valandas buvo gydomos rhNodal (500 ng / ml), o FoxO3a mRNR lygis buvo matuojamas realaus laiko PGR. * P <0, 05 palyginti su atitinkama kontrole.

Visas dydis

„Nodal“ skatina „Smads“ ir „FoxO3a“ ryšį, taip pat „FoxO3a“ prisijungimą prie CCNG2 promotoriaus.

Kadangi du spėjami SBE (nuo –507 iki –504 bp ir nuo –352 iki –349 bp) yra 100 nt aukščiau ir žemiau funkcinio FBE1 proksimaliniame promotoriaus regione (3a pav.), Mes išbandėme, ar Smad baltymai ir FoxO3a sąveikauja su reguliuoti CCNG2 transkripciją. Per didelis Smad2 arba Smad3 ekspresija reikšmingai padidino FoxO3a sukeltą CCNG2 promotoriaus aktyvumą (5a pav.). Smad4 ekspresijos nutildymas naudojant siRNR, atvirkščiai, reikšmingai sumažino bazinio ir FoxO3a sukeltą (5b paveikslas), taip pat Nodal, ALK7ca ir ALK4ca sukeltus (5c paveikslas) CCNG2 promotoriaus aktyvumą ir mRNR raišką. Bendras imunoprecipitacija (IP) atskleidė, kad išoriškai ekspresuotas FoxO3a gali sudaryti kompleksą su išoriškai išreikštais Smad3 ir Smad4 HEK293T ląstelėse (6a pav.). Nuosekliai ši fizikinė sąveika tarp endogeninių Smad4 ir endogeninių FoxO3a baltymų taip pat buvo nustatyta ir nustatyta, kad jie suaktyvėjo reaguojant į Nodal gydymą OV2008 ląstelėse (6b paveikslas). FoxO3a ir Smad4 ryšį taip pat sustiprino Nodal, ALK7ca arba ALK4ca transfekcija (6b paveikslas, apatinė plokštė).

Image

Šunys dalyvauja FoxO3a ir Nodal reguliuojamų CCNG2 promotorių veikloje ir mRNR ekspresijoje. ( a ) „FoxO3a“ CCNG2 promotoriaus aktyvumo indukciją sustiprino „Smad2“ ir „Smad3“. OV2008 ląstelės buvo laikinai transfekuotos tuščiu vektoriumi (EV), FoxO3a-WT arba FoxO3a-AAA (200 ng kiekvienoje duobutėje), atskirai arba su 200 ng kiekvienoje duobutėje Smad2 (kairysis skydelis) arba Smad3 (dešinysis skydas). FoxO3a ir Smad ekspresija buvo patvirtinta Western blot. ( b ) Smad4 nutildymas naudojant siRNR užblokuotą FoxO3a sukeltą CCNG2 promotoriaus aktyvumą ir mRNR lygius. ( c ) Smad4 nutildymas visiškai panaikino Nodal, ALK7ca ir ALK4ca poveikį CCNG2 promotoriaus aktyvumui ir mRNR raiškai. Skirtingomis raidėmis pažymėti brūkšniai rodo reikšmingą skirtumą, kai P <0, 05.

Visas dydis

Image

Asociacija tarp FoxO3a ir Smad baltymų. a ) FoxO3a ir Smad3 arba Smad4 fiziškai sąveikaujantys išoriniai reiškiniai. HEK293 ląstelės buvo kartu transfekuotos su FoxO3a-Flag ir tuščiu vektoriu (EV), Smad3 arba Smad4 vektoriais. IP buvo atliktas naudojant anti-Flag antikūną. FoxO3a, Smad3 arba Smad4 IP mėginiuose arba ląstelių lizatuose buvo aptikti Western blot metodu. ( b ) Fizinę endogeninių FoxO3a ir Smad4 sąveiką OV2008 ląstelėse sukėlė Nodal. OV2008 ląstelės buvo gydomos rhNodal 1 valandą po serumo badavimo 12 valandų. IP buvo atliktas naudojant anti-FoxO3 arba anti-Smad4 antikūnus. Atskirtuose eksperimentuose ląstelės buvo transfekuotos kontrolinėmis, Nodal, ALK7ca arba ALK4ca 6 val. Po 15 h atsistatymo ląstelių lizatas buvo surinktas ir IP panaudotas antikūnui prieš Smad4, po to atlikus imunoblotus su FoxO3a, Smad2, 3 ir 4 antikūnais. Imunoglobulino G (IgG) IP kontrolė taip pat buvo įtraukta į kiekvienos grupės ląstelių lizatą.

Visas dydis

Norėdami ištirti, ar Nodal reguliuoja FoxO3a prisijungimą prie CCNG2 promotoriaus, chromatino-IP (ChIP) tyrimai buvo atlikti naudojant pradmenis, specifinius FBE1 turinčiam fragmentui (7a pav.). Pirmiausia FoxO3a prisijungimas prie FBE1 srities OV2008 ląstelėse buvo patvirtintas ChIP tyrimu, naudojant anti-FoxO3a antikūną (7b pav.). Tame pačiame eksperimente PGR signalas taip pat buvo aptiktas mėginiuose, kuriuose imunoprecipicuotas Smad2, 3 ir 4 antikūnai (7b paveikslas). FoxO3a ir FBE1 sąveika toliau buvo patvirtinta naudojant išoriškai išreikštą FoxO3a. Ląstelėse, transfekuotose FoxO3a-WT arba FoxO3a-AAA, PGR signalai buvo aptikti po ChIP naudojant anti-Flag antikūną (7c paveikslas). Galiausiai, norėdami toliau ištirti, ar prisijungimas prie CCNG2 promotoriaus reaguoja į Nodal signalizaciją, Nodal arba tuščias vektorius buvo pernešti į OV2008 ląsteles, po to atliktas ChIP tyrimas. FoxO3a surišimas su FBE1 sritimi žymiai padidėjo dėl Nodal perraiškos, matuojant tiek reguliariu, tiek kiekybiniu realaus laiko PGR (7d pav.).

Image

„FoxO3a“ ir „Smads“ įdarbinimas CCNG2 promotoriaus regione, kuriame yra FBE1. a ) CCNG2 geno promotoriaus eskizas, kuriame pavaizduotas FBE1 turintis fragmentas (183 bp), skirtas ChIP-PGR. ( b ) FoxO3a ir Smad baltymų surišimas su FBE1 turinčia sritimi. Chromatino mėginys iš OV2008 ląstelių buvo imuninės sistemos nusodintas FoxO3a arba Smad4, 2 ir 3 antikūnais, taip pat kaip imunoglobulinas G (IgG). Genominė DNR taip pat buvo įtraukta kaip teigiama kontrolė (+ ve) ir vanduo kaip neigiama kontrolė (−ve) PGR amplifikacijai. c ) Egzogeninio FoxO3a surišimas su FBE1 sritimi. OV2008 ląstelės buvo transfekuotos naudojant vėliava pažymėtą FoxO3a-WT, FoxO3a-AAA arba tuščio vektoriaus (EV) kontrolę. Chromatino mėginiai buvo tiriami IP su anti-Flag antikūnais arba IgG. ( d ) FodalO3a verbavimą FBE1 regione paskatino Nodal. OV2008 ląstelės buvo transfekuotos tuščiu vektoriu (EV) arba Nodal. Chromatino mėginiai buvo paveikti IP FoxO3a antikūnu arba kontroliniu IgG. Gelio nuotraukos rezultatai buvo generuojami įprastu ChIP-PGR metodu, o juostos grafikai pavaizdavo realaus laiko PGR rezultatus. Skirtingomis raidėmis pažymėti brūkšniai rodo reikšmingą skirtumą, kai P <0, 05.

Visas dydis

FoxO3a tarpininkauja Nodal / ALK7 veikimui CCNG2 geno ekspresijai ir ląstelių proliferacijai

Mūsų pastebėjimai, kad FBE1 mutacija panaikino mazgo sukeltą CCNG2 transkripciją ir kad mazgas bei jo receptoriai padidino FoxO3a aktyvumą, rodo, kad FoxO3a tarpininkauja signalizuojant mazgą, kad būtų sukelta CCNG2 geno transkripcija. Norėdami patvirtinti šią galimybę, buvo atlikti RNR trukdžių tyrimai, siekiant numušti endogeninę FoxO3a raišką, naudojant FoxO3a specifinę siRNR (8a pav.). „FoxO3a“ numušimas sumažino bazinį CCNG2 mRNR lygį ir panaikino ALK7ca stimuliuotos CCNG2 mRNR lygį (8b paveikslas). Panašiai, esant FoxO3a siRNR, rhNodal nesugebėjo sukelti CCNG2 promotoriaus aktyvumo (8c pav.). Šie radiniai patvirtino, kad FoxO3a yra būtinas komponentas baziniam lygiui ir Nodal indukuotos CCNG2 geno transkripcijai palaikyti .

Image

FoxO3a dalyvauja Nodal / ALK7 reguliuojamoje CCNG2 ekspresijoje. a ) FoxO3a numušimo patvirtinimas siRNR. OV2008 ląstelės buvo transfekuotos plaktine siRNR (-) arba FoxO3a siRNR (+) ir praėjus 24 ir 48 valandoms po transfekcijos buvo atliktas imunoblotavimas. ( b ) „FoxO3a“ ekspresijos nutildymas naudojant siRNR sumažino bazinę CCNG2 mRNR ir pakeitė ALK7ca poveikį CCNG2 ekspresijai. ( c ) FoxO3a siRNR blokavo rhNodal sukeltą CCNG2 promotoriaus aktyvumą. Skirtingomis raidėmis pažymėti brūkšniai rodo reikšmingą skirtumą, kai P <0, 05.

Visas dydis

Norint toliau ištirti „FoxO3a“ funkcinį reikšmingumą tarpininkaujant mazgo poveikiui, buvo atlikti WST-1 tyrimai. Pirmiausia, suderinę su Nodal ir ALK7ca (9a pav.), FoxO3a-WT ir FoxO3a-AAA žymiai sumažino gyvybingų ląstelių skaičių (9b paveikslas). FoxO3a siRNR, priešingai, padidino ląstelių gyvybingumą ir taip pat panaikino Nodal ir LY294002 augimą slopinantį poveikį (9c paveikslas). BrdU tyrimai taip pat parodė, kad CCNG2 ekspresijos nutildymas naudojant siRNR (9d pav.) Žymiai padidino ląstelių proliferaciją. Remiantis WST-1 rezultatais, Nodal ir ALK7ca (9e pav.), Taip pat FoxO3a-WT ir FoxO3a-AAA (9f pav.) Slopino ląstelių dauginimąsi ir šis poveikis buvo užblokuotas, kai siRNR numušė CCNG2.

Image

FoxO3a tarpininkauja Nodal / ALK7 slopinančiam ląstelių proliferacijai OV2008 ląstelėse. ( a - c ). Ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas WST-1 tyrimais 48 val. Po transfekcijos ar gydymo vaistais. Per didelis Nodal arba ALK7ca ( a ) ir FoxO3a-WT arba FoxO3a-AAA ( b ) ekspresija sumažino ląstelių gyvybingumą. „FoxO3a“ siRNR padidino ląstelių gyvybingumą ir išgelbėjo LY294002 ir „Nodal“ poveikį. ( d ) Realaus laiko PGR parodė CCNG2 siRNR plazmidės transfekciją sumažino CCNG2 mRNR lygį OV2008 ląstelėse. ( e, f ) CCNG2 nutildymas atliekant siRNR sukeltą ląstelių proliferaciją, analizuotas BrdU tyrimais praėjus 48 valandoms po transfekcijos. Slopinamasis Nodal / ALK7ca ( e ) ir FoxO3a-WT / FoxO3a-AAA ( f ) poveikis ląstelių proliferacijai buvo panaikintas, kai siRNR nutildė CCNG2 raišką. Skirtingomis raidėmis pažymėti brūkšniai rodo reikšmingą skirtumą, kai P <0, 05.

Visas dydis

Diskusija

Anksčiau pranešėme, kad Nodal slopina kiaušidžių vėžio ląstelių proliferaciją ir kad CCNG2 yra taikinio Nodal genas. Šiame tyrime mes toliau tyrėme molekulinius mechanizmus, kuriais Nodal reguliuoja CCNG2 raišką. Mes pademonstravome, kad Nodal sukelta CCNG2 transkripcija, atnaujinant FoxO3a ekspresiją, slopinant jos inaktyvaciją PI3K keliu ir sustiprinant jos ryšį su Smads, kuri savo ruožtu jungiasi su funkciniu FBE ant CCNG2 promotoriaus (10 paveikslas). Mes taip pat pateikėme įrodymų, kad FoxO3a aktyvumo reguliavimas yra svarbus Nodal signalizacijos įvykis, sukeliantis CCNG2 ekspresiją ir slopinantis ląstelių dauginimąsi.

Image

Siūlomi mechanizmai, kuriais mazgų signalizacijos kelias reguliuoja FoxO3a ir CCNG2. Mazgas skatina FoxO3a aktyvumą, slopindamas PI3K-AKT kelią, todėl FoxO3a kaupiasi branduolyje. „Nodal“ taip pat suaktyvina savo kanoninį „Smad“ signalizacijos kelią ir skatina „Smads“ ryšį su „FoxO3a“, kuris savo ruožtu jungiasi prie CCNG2 promotoriaus, kad stimuliuotų jo transkripciją. Be to, Nodal kelias taip pat skatina FoxO3a geno raišką. Reikia išsiaiškinti, ar šis reguliavimas pasireiškia per mechanizmą, į kurį įeina Škotų transkripcijos reguliavimas.

Visas dydis

Keletas tyrimų parodė, kad CCNG2 mRNR ir (arba) baltymų kiekį padidina augimą slopinantys signalai, įskaitant TGF-β (Horne ir kt., 1997), ir sumažina onkogeniniai keliai, tokie kaip PI3K-AKT pelių NIH 3T3 ląstelėse (Martinez). -Gac ir kt., 2004), HER2, c-jun NH2-galo kinazė ir rapamicino / p70S6K taikinys žinduoliams (Le et al., 2007) ir estrogeno signalizacijos (Stossi et al., 2006) krūties vėžio ląstelėse. . Nemirtingose ​​kiaušidžių paviršiaus epitelio ir kiaušidžių vėžio ląstelėse Nodal padidino CCNG2 mRNR ir baltymų lygį, taip pat CCNG2 baltymų stabilumą (Xu ir kt., 2008). Pateikėme įrodymų, kad Nodal taip pat skatina CCNG2 ekspresiją transkripcijos lygiu. Naudodamiesi luciferazės tyrimais, mes nustatėme, kad Nodal ir jo konstituciškai aktyvūs receptoriai ALK4ca ir ALK7ca padidino CCNG2 promotoriaus aktyvumą.

FoxO3a yra susijęs su įvairių ląstelių procesų ir vėžio progresavimo reguliavimu. Jis veikia kaip naviko slopintuvas, reguliuodamas daugelį genų, kontroliuojančių įvairius biologinius veiksmus, įskaitant ląstelių proliferaciją (Dijkers et al., 2000; Hauck et al., 2007) ir apoptozę (Sunters et al., 2003; Li et al., 2007). ). Šiame tyrime mes nustatėme, kad padidėjus FoxO3a ekspresijai, o nutildžius FoxO3a, sumažėjo CCNG2 promotoriaus aktyvumas. Ant CCNG2 promotoriaus buvo rasta kanoninė FoxO surišimo vieta, FBE3 ir du numanomi FBE, vienas iš kurių turi šerdies motyvą (5′-AAACA-3 ′), o kitas (FBE1), kuriame yra trys sugrupuotos šerdies motyvai. FBE1 srities ištrynimas proksimaliniame promotoriuje, bet ne kiti du FBE, lėmė dramatišką bazinio ir FoxO3a sukeltos CCNG2 transkripcijos sumažėjimą , kas rodo, kad FoxO3a jungtis prie šios srities yra svarbi CCNG2 transkripcijai. Šią mintį papildomai patvirtina mutagenezės tyrimas, kurio metu FBE1 mutacija panaikino FoxO3a poveikį CCNG2 transkripcijai. Galiausiai, ChIP tyrimai pateikė tiesioginius įrodymus, kad endogeninis ir egzogeninis FoxO3a gali tiesiogiai jungtis su FBE1. Skirtingai nuo nefunkcinių FBE3 ir FBE2, kuriuose yra tik vienas branduolio motyvas, funkcinėje FBE1 vietoje yra trys branduolio motyvai, kas leidžia manyti, kad nekanoninėje FBE1 vietoje esantys klasifikuotų branduolių motyvai gali sustiprinti FoxO3a afinitetą DNR. Be to, funkcinę FEB1 vietą riboja kelios kitų transkripcijos veiksnių, tokių kaip Smads, AP2 ir Sp1, surišimo vietos. Gali būti, kad FoxO3a ir šių transkripcijos veiksnių sąveika yra svarbi FoxO3a prisijungimui prie FBE1. Iš tiesų, mes pastebėjome, kad FoxO3a gali sąveikauti su Smad2, 3 ir 4, norėdamas reguliuoti CCNG2 transkripciją. Neseniai atliktas tyrimas taip pat parodė, kad Sp1 perdėta ekspresija padidino CCNG2 raišką (Marshall ir kt., 2010). Visi šie rezultatai rodo, kad FoxO3a jungiasi su FBE1 sritimi, kad sukeltų CCNG2 transkripciją. Mūsų išvados, kad FoxO3a yra transkripcinis žmogaus CCNG2 aktyvatorius, atitinka tyrimų su pelėmis duomenis (Martinez-Gac ir kt., 2004; Chen ir kt., 2006).

Buvo pranešta, kad Smad ir šakutės transkripcijos veiksniai sąveikauja, norėdami reguliuoti savo taikinių genų ekspresiją (Gomis ir kt., 2006b). FoxO3a veikia kaip Smad koaktyvatorius, kad sureguliuotų p21 raišką ir tarpininkautų citostatiniam TGF-β poveikiui glioblastomos ląstelėse (Seoane et al., 2004). Šiame tyrime mes nustatėme, kad padidėjęs Smad2 ir 3 raiška padidėjo, o Smad4 nutildymas sumažėjo, o FoxO3a poveikis CCNG2 transkripcijai. IP eksperimentai atskleidė, kad Smad4 ir FoxO3a sudarė kompleksą ir šią sąveiką sustiprino Nodal signalizavimas. Be to, ChIP rezultatai parodė, kad Nodal skatino FoxO3a prisijungimą prie FEB1 srities. Therefore, it is possible that under Nodal stimulation, FoxO3a and Smad2/3/4 form a complex and this facilitates FoxO3a binding to the DNA, resulting in an increase in CCNG2 transcription. Several SBEs are located in the CCNG2 promoter. Deletion of the distal portion, which contains the first three SBEs did not interrupt the Nodal-regulated CCNG2 promoter activity. This result is not surprising as it has been reported that Smad proteins do not efficiently bind to a single SBE on promoters because of the low affinity (Gomis et al., 2006a). Although we did not attempt to characterize the functional SBE site in this study, it is possible that the two SBEs, located in close proximity to the FBE1, contribute to Nodal-induced CCNG2 transcription.

In addition to facilitate Smad/FoxO3a interaction, we found that Nodal also increased FoxO3a expression and inhibited its inactivation. FoxO3a is inactivated by phosphorylation and subsequent translocated from nucleus to cytoplasm. In this study, we showed that Nodal and its receptors suppressed the phosphorylation of AKT Ser473, inhibited the phosphorylation of FoxO3a Ser318/321 and induced the accumulation of FoxO3a in the nucleus, suggesting that the Nodal signaling pathway can inhibit the PI3K-AKT pathway to prevent FoxO3a inactivation. In addition to posttranslational modulation of FoxO3a activity, we further observed that Nodal-induced FoxO3a mRNA expression in IOSE-398 and several ovarian cancer cell lines. Induction of FoxO3a expression by Nodal is also confirmed by western blot analyses, which showed that Nodal increased, whereas silencing of ALK7 and Smad4 decreased, FoxO3a protein levels. Taken together, these results suggest that FoxO3a is a novel target gene of Nodal. The mechanism by which Nodal regulates FoxO3a expression remains to be investigated. However, as silencing Smad4 reduced FoxO3a expression, it is likely that Nodal acts through the canonical Smad pathway to regulate FoxO3a transcription.

The direct link between Nodal signaling and activation of FoxO3a expression and activity suggests that FoxO3a is a mediator of Nodal signaling pathway in ovarian cancer cells. Indeed, we observed that overexpression of FoxO3a mimicked, while silencing of FoxO3a reversed, the effect of Nodal on cell proliferation. Moreover, silencing of CCNG2 increased cell proliferation and abolished the inhibitory effect of FoxO3a and Nodal on cell proliferation. These findings demonstrate that FoxO3a and CCNG2 mediate, at least in part, the antiproliferative effect of Nodal. In addition to inhibit proliferation, the Nodal-ALK7 pathway also induces apoptosis in ovarian cancer (Xu et al., 2004, 2006) and several other types of cells (Munir et al., 2004; Wang et al., 2006; Zhang et al., 2006). Similarly, a role for FoxO3a in the induction of apoptosis is well established (Huang and Tindall, 2007). Interestingly, a recent study suggests that activation of FoxO3a is sufficient to reverse chemoresistance in human cancer (Yang et al., 2010). In ovarian cancer cells, we have also observed that knockdown of ALK7 promoted chemoresistance whereas overexpression of ALK7 enhanced sensitivity of cancer cells to cisplatin (Ye et al., 2011). More work is required to define the role of FoxO3a in Nodal/ALK7-regulated apoptosis and chemosensitivity.

To date, knowledge of how Nodal signaling has a role in cancer progression remains largely incomplete. Our earlier work on immortalized ovarian surface epithelial cells and some ovarian cancer cell lines showed that Nodal and ALK7 inhibit proliferation and induce apoptosis (Xu et al., 2004, 2006). The present findings that Nodal-induced CCNG2 transcription by upregulating FoxO3a expression, suppressing AKT phosphorylation and increasing FoxO3a activity are also consistent with the anti-proliferation and apoptosis-inducing effects of Nodal. However, Nodal was found to promote tumor progression in melanoma cells (Topczewska et al., 2006). We have also performed experiments to compare the effect of Nodal on OV2008 and U87 (a glioblastoma cell line) and found that Nodal exerts opposite effects on cell proliferation in these two cell lines (De Silva and Peng, unpublished results). Thus, it is possible that the effect of Nodal on cancer progression is also very complex and depends on such factors as the cellular environment, the type of cancer and/or the stage of tumor development. The complexity of TGF-β signaling in cancer progression is well documented with both tumor-suppressing and tumor-promoting effects (Derynck et al., 2001). Interestingly, a recent study suggests that CCNG2 may have metastasis-suppressive effects and that downregulation of CCNG2 is involved in TGF-β-induced breast cancer metastasis (Adorno et al., 2009). It remains to be determined whether Nodal differentially regulates CCNG2 to exerts tumor-suppressing and tumor-promoting effects.

Human epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecological malignancy diagnosed among women worldwide and the fifth leading cause of cancer death (Naora and Montell, 2005). It has been reported that low expression of FoxO3a in ovarian cancer is associated with poor prognosis of patients (Fei et al., 2009). Higher CCNG2 expression also correlates with recurrence-free survival in breast cancer patients (Adorno et al., 2009). Therefore, future studies to fully characterize the potential dysregulation of Nodal, CCNG2 and FoxO3a during ovarian cancer progression will improve our understanding of this devastating disease and may reveal novel therapeutic targets.

In summary, we have identified a novel mechanism by which Nodal signaling inhibits cell proliferation: Nodal regulates CCNG2 transcription through the induction of FoxO3a expression, the inhibition of FoxO3a inactivation by AKT, and the promotion of interaction between FoxO3a and Smad proteins. We have characterized a functional FoxO3a-binding site in the CCNG2 promoter region, through which FoxO3a and Smads, activated by Nodal signaling, were able to promote CCNG2 gene transcription (Figure 10). Whether or not induction of FoxO3a expression by Nodal involves transcriptional regulation via the Smad pathway remains to be investigated.

medžiagos ir metodai

Reagents and plasmids

rhNodal was purchased from R&D System (Minneapolis, MN, USA). SB431542 and LY294002 were purchased from Sigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada). Human full-length Nodal, ALK7ca expression plasmid in a c-Myc-tagged pcDNA4 and Smad2, Smad3 and Smad4 plasmids in pcDNA3 were established or obtained as previously described (Xu et al., 2004). ALK4ca expression plasmid in HA-tagged pCMV5 was kindly provided by Dr Liliana Attisano (University of Toronto, ON, Canada). A plasmid expressing only the mature peptide of Nodal in pCS2+ (Tian et al., 2008) was kindly provided by Dr Karuna Sampath (Nanyang Technological University, Singapore). Human Flag-tagged FoxO3a-WT and FoxO3a-AAA in a pcDNA3 vector (Ramaswamy et al., 2002) were obtained from Addgene (Cambridge, MA, USA). A plasmid expressing CCNG2 siRNA was generated as previously reported (Xu et al. , 2008).

Ląstelių kultūra ir transfekcija

Ovarian cancer cell line OV2008 cells and immortalized ovarian surface epithelial cells (IOSE-398) were obtained and cultured as previously described (Xu et al., 2004). Human ovarian carcinoma cell lines Skov-3 and ES-2 cell lines (ATCC, Rockville, MD, USA) were grown in McCoy's 5a medium with 10% FBS and 1.5 m ML -glutamine. Transient transfection was carried out using Lipofectamine 2000 (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON, Canada) according to the manufacturer's suggested protocols.

Cloning of CCNG2 promoter constructs

The 1581-bp DNA fragment containing the sequence from +90 to −1491 bp of the CCNG2 gene promoter, referred as F6, was amplified by PCR using genomic DNA as the template. The genomic DNA was extracted from IOSE398 cells using a QIAamp DNA mini kit (QIAGEN, Mississauga, ON, Canada). PCR was performed using a reverse primer carrying a Nhe I site, RP and a forward primer carrying a Sac I site, FP6 and pfu turbo DNA polymerase (NEB Lab, Pickering, ON, Canada). The resulting DNA fragment was subcloned into pGL4 basic (Promega, Sunnyvale, CA, USA). The same reverse primer and a forward primer, FP1 to FP5, were used to make deletion constructs F1 to F5. A construct containing the mutated FBE1 was generated using the Quick Change multi site-directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA). Primer sequences are listed in Supplementary Table 1.

Real-time PCR analysis of CCNG2 and FoxO3a mRNA

Total RNA was extracted using Trizol reagent (Invitrogen Canada Inc., Burlington, ON, Canada) and reversed transcribed to complementary DNA using oligo(T)23VN primer (Sigma-Aldrich). Quantitative reverse transcriptase–PCR was carried out using gene-specific primers for CCNG2 and FoxO3a and SYBR Green Master Mix (Bio-Rad, Mississauga, ON, Canada). Expression levels of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase were also determined as an internal control. Primer sequences are listed in Supplementary Table 1.

Co-transfection and luciferase report assay

Cells were co-transfected with a CCNG2 promoter construct, firefly luciferase, Renilla luciferase and in some cases, FoxO3a-WT, FoxO3a-AAA, Nodal, ALK7ca, ALK4ca or their empty vector control (100 ng–300 ng per well) in a 24-well cell culture plate. Following 6-h transfection and 24-h recovery, cells lysates were harvested in passive lysis buffer and all luciferase activities were quantified using the Dual-Luciferase Reporter Assay system (Promega). Relative luciferase activity was calculated as the ratio of firefly/renilla luciferase.

Western blot analysis, subcellular fractionation and IP

Whole-cell extracts were prepared in radioimmunoprecipitation assay buffer supplemented with protease and phosphatase inhibitor cocktails (Thermo Scientific, Rockford, IL, USA). Western blotting was carried out using antibodies of pSmad2, pSmad3, total Smad2/3, pAKT (Ser473), total AKT and phosphorylated FoxO3a (Ser318/321) (Cell Signaling, Danvers, MA, USA), FoxO3a (Upstate Biotechnology, Temecula, CA, USA), CCNG2 and Smad4 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Protein bands were visualized with SuperSignal (Pierce, Rockford, IL USA). The membranes were lastly re-probed with an anti-β-actin antibody (Sigma-Aldrich) as loading controls. Subcellular fractionation was carried out using the NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagents (Thermo Scientific). Briefly, after 6-h transfection and 12-h recovery, OV2008 cells were harvested by Trypsin-EDTA and cytoplasmic and nuclear proteins extracted according to the product instructions. IP was performed as previously described (Xu et al., 2008) using anti-Flag (1:100), anti-FoxO3a (2 μg), anti-Smad4 (1:100) or anti-rabbit immunoglobulin G (1:100, Santa Cruz Biotechnology) at 4 °C for 16 h. After further incubation with protein G/A agarose beads (GE Healthcare, Waukesha, WI, USA) at 4 °C for 3 h, the complexes were collected by centrifugation (10 000 × g ), washed three times with IP buffer and eluted into 30 μl 2 × sodium dodecyl sulfate sample buffer.

Imunofluorescencija ir mikroskopija

Cells were fixed with cold methanol/acetone (1:1 volume), permeabilized with 0.2% Triton X-100 and then incubated with anti-FoxO3a antibody (1:200) in phosphate-buffered saline containing 1% bovine serum albumin. To verify transfected cells, anti-c-Myc or -HA antibody (1:300) was also used. Secondary antibodies used were Alexa Fluor 594 goat anti-rabbit or Alexa Fluor 488 goat anti-mouse immunoglobulin G (1:200, Molecular Probes, Eugene, OR, USA). Microscopy was performed using a Nikon Eclipse TE2000-U fluorescence microscope (Nikon, Melville, NY, USA).

RNR trukdžiai

Small interference RNA (50 n M ) was transfected into cells for 24 h using Lipofectamine 2000. To confirm gene-specific silencing effects, protein lysates were prepared at 48 h after transfection and subjected to western blot analysis. ALK7, FoxO3a and Smad3 siRNAs (see Supplementary Table 1 for sequences) and a scrambled control siRNA, which has no significant homology to any mammalian gene sequence (Supplementary Table 1) were purchased from GenePharma Co. (Shanghai, China).

ChIP tyrimas

OV2008 cells (2.5 × 10 6 cells), non-transfected or transfected with an empty pcDNA3 vector (Control), Flag-tagged FoxO3a-WT, FoxO3a-AAA or Nodal for 6 h followed by 15-h recovery in culture medium, were cross-linked by 37% formaldehyde for 10 min. The cells were then harvested and lysed with sodium dodecyl sulfate lysis buffer (1% sodium dodecyl sulfate, 10 m M EDTA, 50 m M Tris–Cl, pH8.1). The lysates were sonicated and pre-cleared by protein G agarose (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA). Anti-FoxO3a, anti-Smad2, anti-Smad3, anti-Smad4 antibody (2 μg) or normal rabbit immunoglobulin G was added to the lysate and incubated at 4 °C overnight. The subsequent steps were performed as indicated in the EZ ChIP Chromatin Immunoprecipitation kit (Upstate, Charlottesville, VA, USA). The precipitated DNA was amplified by PCR using a Hotstart Taq DNA polymerase (Qiagen Sciences, Germantown, MD, USA) or iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad). A 183-bp fragment containing target FBE1 in the CCNG2 promoter was monitored using ChIP-FP1 and ChIP-RP1 primers (Supplementary Table 1).

Ląstelių gyvybingumo ir proliferacijos tyrimas

Cell viability was determined by WST-1 assays (Roche, Mississauga, ON, Canada) and cell proliferation was measured using BrdU assays (EMD Biosciences, Inc., La Jolla, CA, USA). OV2008 cells were plated in 96-well plate at the density of 0.5–1 × 10 4 cells per well and transfected with various plasmid DNA or siRNAs. WST-1 or BrdU assays were performed according to the manufactory procedures and absorbance was measured at 450 nm using an enzyme-linked immunosorbent assay plate reader.

Statistinė analizė

All data are presented as mean±sem Each experiment was performed 3–5 times. Statistical analysis was done using Student's t -test for comparison between two groups or analysis of variance followed by a Tukey–Kramer test for multiple group comparison (Graph Pad InStat Software, San Diego, CA, USA). Groups denoted by different letters represent a significant difference at P <0.05.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Supplementary Table and Figure 1

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)