Naujas kardiotoksinis visuotinio teršalo mechanizmas | mokslinės ataskaitos

Naujas kardiotoksinis visuotinio teršalo mechanizmas | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Širdies ir kraujagyslių biologija
  • Poveikis aplinkai

Anotacija

„Deepwater Horizon“ katastrofa atkreipė viso pasaulio dėmesį į žalios naftos toksiškumą ir galimą neigiamą poveikį jūros gyvybei ir reagavusiems į avarijos likvidavimo atvejus šiaurinėje Meksikos įlankoje. Išpūtimas išleido sudėtinius policiklinių aromatinių angliavandenilių (PAH) mišinius į kritines pelaginių nerštavietių buveines tunams, jūrų ešeriams ir kitiems ekologiškai svarbiems plėšrūnams. Žalia nafta sutrikdo širdies veiklą ir buvo susijusi su širdies išsigimimais, besivystančiomis žuvimis. Tačiau tikslus kardiotoksinių PAH tapatumas ir kontraktilinės disfunkcijos mechanizmai nėra žinomi. Čia parodome, kad fenantrenas, PAH, turintis benzeno 3 žiedų struktūrą, yra pagrindinė dalis, sutrikdanti širdies raumens ląstelių fiziologiją. Fenantrenas yra visur esantis teršalas vandenyje ir ore, o šio junginio ląstelių taikiniai yra labai saugūs stuburiniams gyvūnams. Todėl mūsų išvados rodo, kad fenantrenas gali būti pagrindinė stuburo širdies disfunkcijos priežastis visame pasaulyje.

Įvadas

Policikliniai aromatiniai angliavandeniliai (PAH), sudaryti iš dviejų ar daugiau lydytų benzeno žiedų, yra visur esantys vandens teršalai. Iš žalių aliejų paprastai gaunami PAH mišiniai, turintys didelę 2–3, 4 ir 4 žiedų PAH grupių koncentraciją ir atitinkamai žemą ≥ 5 žiedų junginių kiekį, o deginant iškastinį kurą ir kitus anglies šaltinius susidaro mišiniai, kuriuose gali vyrauti didesni 4–6 žiedų junginiai. Nors pramoninių PAH išmetamųjų teršalų kiekis išsivysčiusiame pasaulyje sumažėjo, tačiau padidėjus žmonių populiacijai ir padidėjus motorinių transporto priemonių naudojimui, vandens telkiniuose padidėjo jų apkrova 1, 2 . Lėtinis vandens PAH įkrovimas vyksta keliais būdais, įskaitant suodžių ir išmetamųjų dalelių 1, 3 nusėdimą ore, nuotėkį iš nelaidžių paviršių 4 ir tiesioginę garų fazės junginių absorbciją iš oro 5 . Priešingai, katastrofiški naftos išsiliejimai, tokie kaip 1989 m. Tanklaivio „Exxon Valdez“ įžeminimas 6 ir 2010 m. „Deepwater Horizon“ šulinio išpūtimas, išleido labai didelius PAH kiekius tiesiai į jūrų aplinką 7 . Tam tikruose heterocikliuose yra azoto, sieros ar deguonies, ir techniškai jie yra vadinami policikliais aromatiniais junginiais (PAC). Tačiau laikydamiesi bendrosios konvencijos, čia heterociklus vadiname PAH.

Kaip tikimasi didelėje ir sudėtingoje struktūriškai susijusių junginių grupėje, PAH biologinis aktyvumas yra tiek persidengiantis, tiek daugialypis. Pagrindinis iššūkis buvo nustatyti, kurie pavieniai junginiai prisideda prie bendro sudėtingų mišinių su skirtingomis cheminėmis kompozicijomis toksiškumo. 4–6 žiedais pažymėtų PAH, tokių kaip benzo (a) pireno, kancerogeniškumas buvo pripažintas daugiau nei prieš pusmetį 8 ir yra aptinkamas sausumos ir vandens organizmuose. Tačiau 3 žiedo PAH kardiotoksiškumas nebuvo įtariamas iki 1989 m. Exxon Valdez katastrofos, kai tyrimais buvo užfiksuoti vystymosi defektai ir žuvų embrionų mirtingumas, paveikti Aliaskos šiaurinio šlaito žalios naftos 6 . Nustatyta, kad embrionai kaupia iš aliejaus ištirpintus PAH, o toksiškumas didėja, kai mišinys praturtinamas 2 žiedų junginiais (ty naftalenais), keičiantis oro sąlygoms. ) 9, 10 . Vėlesni tyrimai, visų pirma vandens sistemose, atskleidė, kad praktiškai visų PAH pošeimių ir net atskirų junginių pavienių grupių veikla yra skirtinga. Tačiau atliekant mechanistinius atskirų junginių tyrimus dažnai naudojama daug didesnė koncentracija nei nustatyta užterštose buveinėse. Norint suprasti aplinkai svarbius sudėtinius mišinius, reikia daugiau darbo.

Zebrafish embrionų tyrimai parodė daugelio pavienių PAH junginių ir PAH mišinių kardiotoksinį poveikį, tačiau taip pat paaiškėjo, kad dvejetainis mechanizmų pasiskirstymas yra minimalus. PAH, kurie yra stiprūs kancerogenai, yra stiprūs arilo angliavandenilių receptorių (AHR) agonistai, sukeldami jų metabolizmą ir kancerogeninį aktyvavimą citochromo P4501A 8 dėka . Apskritai šie PAH taip pat yra kardiotoksiški besivystantiems žuvų embrionams, esant didelėms koncentracijoms. Panašiai kaip dioksinai ir polichlorinti bifenilai 11, 12, šie PAH netinkamai suaktyvina AHR kurdami kardiomiocitus, sukeldami pirminius širdies morfogenezės defektus (blogą kameros kilpą ir sumažintą kardiomiocitų proliferaciją), o po to antrinius funkcinius defektus. Ši toksiškumo forma visiškai priklauso nuo AHR ir užkerta kelią AHR genų numušimui. Tai įrodyta, pavyzdžiui, 4- ir 6 žiedų junginiams, tokiems kaip benz (a) antracenas ir benzo (a) pirenas 13, 14, 15, 16, ir C4-alkilintam 3 žiedų junginiui, retenui 17 . Priešingai, veikiant sudėtiniams PAH mišiniams, gautiems iš žalios naftos, arba pavieniams tricikliniams junginiams, kurie dominuoja šiuose mišiniuose, atsiranda širdies funkcijos defektai, po kurių atsiranda antriniai morfologiniai defektai. Iš tikrųjų daugelio žuvų rūšių embrionai, paveikti neapdorotų iš aliejaus gaunamų PAH, turi funkcinių anomalijų, įskaitant bradikardiją ir aritmijas, būdingas atrioventrikuliniam laidumo blokui, taip pat sumažintą skilvelių susitraukiamumą 18, 19, 20, 21, 22 . Svarbu tai, kad tiek žalios naftos, tiek pavienių nealkilintų triciklių PAH kardiotoksiškumas pasireiškia neaktyvinant AHR kardiomiocituose 18, 19, 20, 21, 22, ir to netrukdo AHR genų numušimas 11 . Be to, žalios naftos kardiotoksiškumą padidina cyp1a 23 numušimas, o tai rodo, kad iš neapdorotos naftos pagamintų PAH metabolizmas yra apsauginis. Frakcijų pagrindu toksiškumo tyrimai taip pat susiejo kardiotoksiškumą vystymuisi su tricikliais PAH šeimos 15, taip pat atlikta nedaug tyrimų su suaugusiais zebrafish (pvz., Nuoroda Nr. 24]. Bendrai šis darbas palaiko egzistuojantį nuo AHR nepriklausomą mechanizmą, pagal kurį iš naftos gaunami PAH sukelia širdies aritmiją ir mažina kardiomiocitų susitraukiamumą.

Neseniai parodėme, kad sudėtingi neapdorotos naftos PAH mišiniai turi įtakos sužadinimo-susitraukimo (EK) jungčiai žuvų širdyse 25 . EC jungimasis yra fiziologinis procesas, susiejantis elektrinį sužadinimą su susitraukimu kardiomiocitu 26, 27 . Scombridae šeimos žuvyse (pvz., Skumbrėse, tunuose 28, 29 ), kaip ir žinduoliuose 26, EB jungtis prasideda tada, kai veikimo potencialas (AP) depoliarizuoja kardiomiocito paviršiaus membraną ir atidaro įtampos jonų kanalus, sudarydamas kalcio ( Ca 2+ ) patekimas į ląstelę per L tipo Ca 2+ kanalus (I CaL ). Šis tarpląstelinis Ca 2+ antplūdis sukelia papildomo Ca 2+ išsiskyrimą iš sarkoplazminio retikulumo (SR) vidinių Ca 2+ atsargų, naudojant procesą, vadinamą „Ca 2+ sukeltas Ca 2+ išleidimas“ (CICR). Iš to išplaukiantis sistolinis Ca 2+ laipsnis, suaktyvinantis širdies raumens ląstelių susitraukimo mechanizmus, yra tokių lokalių Ca 2+ išsiskyrimų erdvinė ir laikinė suma 30, 31 . Atsipalaidavimas įvyksta, kai Ca 2+ grįžta į ramybės lygį, pakartotinai įsisavinant SR per SR Ca 2+ ATPazę (SERCA) ir ekstruzijos būdu iš ląstelės per natrio kalcio mainiklį (NCX). AP repolarizacijai kritiškai svarbūs yra natrio (Na + ), Ca 2+ ir kalio (K + ) kanalų, turinčių įtampą, atidarymas ir uždarymas, atnaujinantys EK jungimosi procesą kiekvieno širdies plakimo metu. Ankstesnis mūsų darbas 25 atskleidė, kad neapdoroti aliejai sutrikdo šiuos jungimosi kelius scombridų žuvų kardiomiocituose, ir tai paaiškina bradikardiją ir aritmiją, anksčiau stebėtą visa širdimi.

Nepaisant įrodymų, kad triciklinių PAH frakcija sukelia žalios naftos širdies nepakankamumo sindromą besivystančioms žuvims 20, tiesioginio ryšio tarp atskiro triciklinio PAH ir EB jungties sutrikimo nenustatyta. Šiuo darbu siekiama apibrėžti kardiotoksinių PAH iš žalios naftos molekulinę dalį (-es) trijose scombridžuvėse: Ramiojo vandenyno skumbrėje ( Scomber japonicas ), geltonpelekiame tune ( Thunnus albacares ) ir Ramiojo vandenyno paprastųjų tunų ( Thunnis orientalis ). Tada atskleisime šių pelaginių plėšrūnų prieširdžių ir skilvelių miocitų pažeidimo mechanizmą.

Rezultatai

Ląstelinės Ca 2+ dinamikos sutrikimas dėl vieno triciklio PAH

Šeši neapdorotame aliejuje esantys PAH (naftalenas, fluoras, dibenzotiofenas, karbazolas, fenantrenas ir pirenas; papildomas S1 pav.) Buvo atskirai naudojami iš Ramiojo vandenyno skumbrės išskirtiems skilvelių kardiomiocitams, o Ca 2+ dinamika buvo įvertinta naudojant konfokalinę mikroskopiją. 1A paveiksle parodytas kiekvieno PAH poveikis ląstelių Ca 2+ pereinamųjų elementų, užfiksuotų naudojant kalcio atžvilgiu jautrų dažą „Fluo-4“, erdvinėms ir laiko savybėms. Ląstelių Ca 2+ dinamikai nepadarė įtakos PAH su dviem benzeno žiedais, susiliejusiais su tiofeno ir pirolio žiedais. Priešingai, 3 žiedų PAH, fenantrenas, žymiai sumažino Ca 2+ pereinamąją amplitudę ir sulėtino skilimą (1 pav. B ir C). Ca 2+ srauto pokyčiai vieno miocito lygyje pasiekia sumažėjusį visos širdies stiprumą ir susitraukimo greitį 32 ir galėtų pakenkti žinomam embrioninių stuburinių širdies širdies veiklos sumažėjimui po žalio aliejaus ir PAH poveikio. Todėl toliau susitelkėme į tikslaus mechanizmo, kuriuo fenantrolis pakeitė Ca 2+ ciklą, išaiškinimą, naudodamas konfokalinio Ca 2+ vaizdavimo ir elektrofiziologijos derinius tiek prieširdžių, tiek skilvelių kardiomiocituose.

Image

( A ) Erdvinis ir laikinas Ca 2+ srautas Ramiojo vandenyno skumbrių skilvelių kardiomiocituose, inkubuotuose> 30 min. Su fenantenu (5 μM), fluorenu (5 μM), dibenzotiofenu (5 μM), karbazoliu (5 μM), naftalenu (5 μM). ), pirenas (5 μM), DMSO kontrolė (1/1000) arba neapdorota (kontrolinė). Kiekvienos dalies cheminės formulės pateiktos papildomame S1 pav. Čia parodyti tipiški neapibrėžtųjų kryžminių kryžminių linijų skenavimai, pavienių miocitų, apkrautų kalciui jautrių dažų AM forma (Fluo-4) (viršuje), ir atitinkamo Ca 2+ pereinamojo laikotarpio plotis, siekiant parodyti atskirų PAH slopinantį poveikį Ca 2+ dinamikos laiko ir erdvės charakteristikos (apačia). ( B ) Ca 2+ pereinamųjų elementų vidutinės amplitudės sumažėjimas, išreikštas kaip didžiausia fluorescencija, padalyta iš pradinės fluorescencijos (F / F 0 ). ( C ) Ca 2+ pereinamųjų medžiagų skilimo laiko konstantos padidėjimas (tau, laikas sumažėti iki 37% jo smailės). Duomenys yra kontrolės vidurkiai ± SEM (n = 39, N = 10), fenantrenas (n = 42, N = 4), fluoras (n = 21, N = 2), dibibenzotiofenas (n = 25, N = 3), karbazolas (n = 21, N = 2), naftalenas (n = 28, N = 4), pirenas (n = 23, N = 2) ir DMSO (n = 22, N = 5). * Nurodo reikšmingą skirtumą (P <0, 05, vienpusė ANOVA).

Visas dydis

Intraceliuliniai ir tarpląsteliniai pakitę Ca 2+ pereinamieji mechanizmai tuno miocituose

Panašiai kaip Ramiojo vandenyno skumbrė, fenantrenas (5 μM) sutrikdė Ca 2+ pereinamąją amplitudę ir skilimo greitį tiek Ramiojo vandenyno paprastųjų tunų (2A ir B pav.), Tiek geltonpelekių tunų skilvelių ir prieširdžių kardiomiocituose (papildomas S2 pav.). Taigi trijų ekologiškai ir komerciškai svarbių pelaginių rūšių toksinis vieno triciklio PAH poveikis širdies ląstelių dinamikai atspindi tą patį poveikį, kuris pastebimas reaguojant į chemiškai sudėtingesnę žalią naftą 25 . Ca 2+ pereinamosios amplitudės sumažėjimą gali sukelti sumažėjęs tarpląstelinis Ca 2+ antplūdis (I CaL ) per L tipo Ca 2+ kanalus ir (arba) mažesnis Ca 2+ išsiskyrimas iš SR vidinių Ca 2+ atsargų. Norėdami išsiaiškinti šį tašką, pirmiausia panaudojome visos ląstelės įtampos spaustuką, norėdami ištirti tarpląstelinio Ca 2+ antplūdį per I CaL . Mes nustatėme, kad fenantrenas sumažino I CaL amplitudę (3A – C pav.). I CaL yra pagrindinis tarpląstelinio Ca 2+ patekimo į sarkolemmą šaltinis, kai EK jungiasi su visais stuburinių širdžių, įskaitant tunus ir skumbrę, šaltinis . I CaL iš esmės prisideda prie pereinamojo laikotarpio Ca 2+ amplitudės ir taip pat yra pagrindinis tarpląstelinio Ca 2+ aktyviklis CICR iš tarpląstelinių SR Ca 2+ atsargų 26 . Todėl fenantreno poveikis trumpalaikiam Ca 2+ gali būti tiek tiesioginis, mažinant tarpląstelinio Ca 2+ antplūdį, tiek netiesioginis, mažinant citozolinį Ca 2+, galintį sukelti Ca 2+ išsiskyrimą iš (išeikvotų) vidinių SR atsargų.

Image

Skilvelių ( A ) ir prieširdžių ( B ) kardiomiocituose Ca 2+ pereinamųjų elementų amplitudę (F / F 0 ) ir skilimą (Tau, ms) sumažino fenantrenas (Phe, 5 μM), palyginti su kontrole (suderintas laikas negydytas ). Paveikslėlyje pavaizduoti neapdoroti konokalinės linijos nuskaitymo vaizdai ir atitinkami laiko ruožai į kairę bei vidutiniai duomenys ± SEM dešinėje (kontrolė n = 19, N = 4; Phe n = 14, N = 3 skilveliui; kontrolė n = 38, N = 8; Phe n = 16, N = 4 prieširdžiui). * Nurodo reikšmingą skirtumą (P <0, 05, Studento testas).

Visas dydis

Image

( A ) L tipo Ca 2+ kanalo srovės (I CaL ) tankis, užregistruotas iš paprastųjų tunų skilvelių miocitų per visos ląstelės įtampos gnybtą, esant kontroliuojamai būsenai (juodi pėdsakai) ir didėjančiomis fenantreno (rožinės / raudonos spalvos pėdsakais) koncentracijomis, vėliau perfuzuotas per ta pati ląstelė. ( B ) Vidutiniai duomenys ± SEM (n = 6, N = 2) I CaL amplitudė kontrolėje (juoda juosta) ir didėjant fenantreno koncentracijai (rausva juosta, 5 μM; raudona juosta, 25 μM). ( C ) I CaL amplitudės pokytis (išreikštas kontrolinės dalies procentais) didėjančiomis fenantreno koncentracijomis (rausva juosta, 5 μM; raudona juosta, 25 μM). Panašus slopinamasis poveikis buvo rastas dviejuose prieširdžių miocituose (neparodyta). * Nurodo reikšmingą skirtumą (P <0, 05, Studento t-testas arba vienpusė ANOVA).

Visas dydis

Norėdami ištirti šią sąveiką, mes prieš tai atrijame prieširdžių ir skilvelių kardiomiocitus su farmakologiniais SR Ca 2+ išsiskyrimo inhibitoriais (5 μM ryanodino, kad slopintų SR Ca 2+ atpalaidavimo kanalą, ryanodino receptoriais) ir SR Ca 2+ įsisavinimu (2 μM thapsigargin, kad slopintų. SERCA) 30 minučių prieš veikiant fenantrenui. Kaip tikėtasi iš ankstesnio 28 darbo, SR slopinimas sumažino trumpalaikio paprastųjų tunų Ca 2+ pereinamojo laikotarpio amplitudę ir skilimo greitį (4 pav.). Tai patvirtina, kad šių aktyvių plėšrūnų širdyse EK jungimosi metu naudojamos SR Ca 2+ atsargos, skirtingai nuo daugelio sėslių žuvų rūšių 29 . Farmakologinis išankstinis SR Ca 2+ ciklo blokavimas pašalino fenantreno poveikį citozolinio Ca 2+ pereinamojo laikotarpio amplitudei ir skilimui (4A ir B pav.). Norėdami išsamiau ištirti SR vidinių Ca 2+ atsargų vaidmenį, prieširdžių miocitus paveikėme kofeino pūsleliu (20 mM), dėl kurio ryanodino receptoriai atidaro ir ištuštino SR Ca 2+ į citozolį. Mes nustatėme, kad SR Ca 2+ kiekis reikšmingai sumažėjo mianocituose, paveiktuose fenantreno (4 pav. C), ir tai rodo sumažėjusią SR Ca 2+ apkrovą. Visi šie rezultatai leidžia manyti, kad fenantrenas lėtina laikinojo skilimo procesą, ribodamas Ca 2+ patekimą į SR per SERCA. Mažesnę Ca 2+ pereinamąją amplitudę, kai yra fenantreno, gali sukelti sumažėjęs I Ca aktyviklis dėl SR išsiskyrimo, tiesioginis poveikis SR Ca 2+ išsiskyrimui per ryanodino receptorius arba abu.

Image

Ca 2+ ciklo su sarkoplazminiu retikulumi (SR) slopinimas kartu su ryanodinu (Rya, 5 uM) ir thapsigarginu (Tg, 2 uM) sumažino Ca 2+ pereinamojo laikotarpio amplitudę ir skilimo greitį skilveliuose ( A ) ir prieširdžiuose ( B ). kardiomiocitai. Svarbu ir tai, kad jis panaikino fenantreno poveikį (dešinysis skydelis). Vidutiniai duomenys yra ± SEM skilvelių (Rya / Tg, n = 13, N = 3; Rya / Tg + Phe, n = 20, N = 2) ir prieširdžių kardiomiocitų (Rya / Tg, n = 15, N = 3; Rya / Tg + Phe, n = 12, N = 2), pavaizduoti dešinėje. ( C ) Fenantrenas sumažino sarkoplazminio retikulumo Ca 2+ kiekį. Ca 2+ pereinamieji laikotarpiai užfiksuoti iš paprastojo tuno prieširdžių kardiomiocitų po greito kofeino užpylimo (Caf, 20 mM), jei nebuvo paruošto fenantreno. Parodyti neapdoroti konokalinės linijos nuskaitymo vaizdai ir atitinkami trumpalaikiai laiko kursai. Vidutiniai duomenys ± SEM, rodantys kofeino sukeltą Ca 2+ pereinamąją amplitudę (F / F0) kontroliniuose (Caf; n = 9, N = 2) ir fenantreno, paveikto iš anksto (Caf + Phe; n = 9, N = 2), yra parodyta dešinėje. * Nurodo reikšmingą skirtumą (P <0, 05, Studento testas).

Visas dydis

I Kr blokada ir AP pailgėjimas yra širdies aritmogenezės pagrindas

EB jungtį inicijuoja AP. Norėdami įvertinti, ar fenantrenas nekeičia šios svarbios sužadinamų kardiomiocitų elektrinių savybių, mes panaudojome visos ląstelės srovės spaustuką, kad įrašytume AP prieš taikydami kylančias fenantreno koncentracijas ir jų metu. Fenantrenas sukėlė greitą (<1 min.) Ir reikšmingą AP trukmės (APD) pailgėjimą, susijusį su nuo dozės priklausančiu trikampio padidėjimu (APD 90 -APD 30 ) (5 pav.). Tokios proaritminės reakcijos buvo susijusios su prieširdžių ir skilvelių virpėjimu ir staigia širdies mirtimi daugeliui rūšių 34, 35 .

Image

( A ) Reprezentacinis veikimo potencialas (AP), užfiksuotas esant skilvelio miocito srovės spaustukui kontrolės sąlygomis (juoda) ir didėjant fenantreno koncentracijai (rožiniai / raudoni pėdsakai). ( B ) reiškia ± SEM (n = 9, N = 5), veikimo potencialo trukmė (APD) esant 10, 50 ir 90% repolarizacijai ir ( C ) AP trikampiui (apskaičiuotam kaip APD 90 - APD 30 ) prieš ir po fenantreno poveikio . ( D ) Uždelsto lygintuvo K + kanalo srovės (I Kr ) tankio sumažėjimas, užfiksuotas naudojant įtampos gnybtą kontrolės sąlygomis (juoda) ir didėjant fenantreno koncentracijai (rožiniai / raudoni pėdsakai) arba naudojant I Kr specifinį blokatorių E4031 ( pilkas pėdsakas). ( E ) reiškia ± SEM I kontrolinės smailės Kr uodegos (juoda juosta) ir didėjančią fenantreno koncentraciją (rausvos / raudonos juostos, n = 7, N = 3). ( F ) I Kr uodegos pokytis (išreikštas procentine kontroline dalimi) reaguojant į fenantreną. * Nurodo reikšmingą skirtumą (P <0, 05, vienpusė ANOVA).

Visas dydis

Uždelstoji lygintuvo K + kanalo srovė (I Kr ) yra pagrindinė jonų srovė, atsakinga už AP repolarizaciją. Norėdami nustatyti, ar pastebėtas AP pailgėjimas atsirado dėl išorinio K + laidumo slopinimo, įvertinome fenantreno poveikį I Kr . Kaip parodyta 5D – F pav., I Kr reikšmingai sumažėjo kylant fenantreno koncentracijai. Šis mechanizmas ne tik paaiškina AP pratęsimą, bet ir fenantreno bei žalios naftos sukeltą aritmogenezę ir atrioventrikulinio laidumo bloką, apie kurį anksčiau buvo pranešta kitoms žuvų rūšims 18, 20, 22 . Fenantrenas nepaveikė kardiomiocitų ramybės membranos potencialo, AP amplitudės ar AP padidėjimo greičio (ty AP pėdsakai 5A pav. Ir papildomame S3 pav.).

Diskusija

Mūsų duomenys rodo, kad žalingas naftos kardiotoksiškumą lemiantis veiksnys yra fenantreno pažeistas EK jungimasis kardiomiocituose. Šis sužadinamųjų ląstelių kelių sutrikimas dabar sukuria žalios naftos kardiotoksiškumo mechanizmą, kuris dešimtmečiais pasirodė neįmanomas. Pirmiausia fenantrenas paveikia membranos jaudrumą pratęsdamas AP trukmę, slopindamas K + ištekėjimą iš kardiomiocito per I Kr . Antra, fenantrenas sumažina Ca 2+ antplūdį į ląstelę, sumažindamas I CaL . Tai sumažina miofilamentų aktyvaciją ir taip miocitų susitraukimą. Trečia, I CaL slopinimas turi inovacinį poveikį, nes jis sumažina Ca 2+ išsiskyrimą iš SR, o tai dar labiau pablogina širdies susitraukiamumą. Kartu sudėjus, šie miocito EK jungimosi sutrikimai gali sukelti susitraukimo sutrikimą ir nenormalų susitraukimo ritmą. Mūsų išvados sutinka su ankstesniais tyrimais, rodančiais, kad SERCA funkcija yra pakitusi fenantreno paveiktoje zebrafish 36 ir miR-133a, mikroRNR, žinoma, kad reguliuoja hipertrofiją, sumažėja žiurkėms, sergančioms fenantreno sukelta širdies hipertrofija37. Nors buvo įrodyta, kad kai kurie didesni 4- ir 6 žiedų PAH keičia genų, dalyvaujančių SR kalcio tvarkyme (pvz., Atp2a2 / SERCA2 ir ryr2 / ryanodino receptoriai), šis poveikis turi būti pasroviui po AHR aktyvacijos. 38, 39 .

Taikant pavienius PAH tiesiogiai izoliuotiems kardiomiocitams, mes nustatėme nuo AHR nepriklausomus ląstelių mechanizmus, kurie, tikėtina, paremia visos širdies kardiotoksiškumo fenotipus, anksčiau pastebėtus su aliejumi paveiktuose žuvų embrionuose. Dėl labai mažo embrioninės žuvies širdies dydžio (pvz., Maždaug 300 kardiomiocitų zebražuvėse; nuoroda 11), jos ribotas CYP1A tarpininkaujamas detoksikacijos gebėjimas ir artimas PAH įsisavinimas embrioniniame epidermyje, sumažinant pirmąjį Jei CYP1A apsaugo metabolinę apsaugą kituose audiniuose, izoliuoti kardiomiocitai iš santykinai subrendusių žuvų yra tinkama priemonė nepaliestų besivystančių žuvų embrionų širdžiai. Prieš formuojant kepenis ir susijusį metabolinio detoksikacijos gebėjimą, žuvų embrionai triciklinių PAH biokoncentruoja iki labai aukštų audinių koncentracijų, ty esant mažoms milijoninėms dalims arba mikromoliams ( pvz., 18 ir 40 nuorodos). Pvz., Pradiniame fenantreno lygis yra didesnis nei alkilintų homologų Aliaskos žalioje naftoje ankstyvose oro sąlygų stadijose. Ramiojo vandenyno silkių embrionai, paveikti šio aliejaus, sukaupė pradinį fenantreną iki 2, 5 μM (450 dalių vienam milijardui) audinių koncentracijos ir jiems pasireiškė ryški širdies aritmija 18 . Taigi, čia naudojamos izoliuotų kardiomiocitų ekspozicijos koncentracijos atitinka audinių lygius, dėl kurių atsiranda embrionų širdies forma ir funkcijos sutrikimai. Papildomas iš AHR priklausomų būdų 17, 21 įnašas, jei tokių yra, padidintų kompleksinių PAH mišinių toksiškumą.

Mūsų išvados padės patikslinti gamtos išteklių sužalojimo įvertinimus, susijusius su būsimais naftos išsiliejimais žuvų neršto buveinėse. Dėl išsiliejusio aliejaus, jis tampa palyginti praturtintas fenantranais, todėl paaiškinama, kodėl atvėsęs aliejus (pagal masę) yra proporcingai toksiškesnis žuvies širdžiai. Mūsų rezultatai taip pat padeda paaiškinti, kodėl kai kurie geologiškai atskirti ir fenantru praturtinti neapdoroti aliejai daro didesnį kardiotoksinį poveikį, nors mes pripažįstame, kad daugelis PAH ir PAH mišiniai daro toksiškumą per įvairius skirtingus mechanizmus. Ši nauja įžvalga gali supaprastinti vandens mėginių, surinktų išsiliejus naftai, vertinimą siekiant įvertinti gamtinių išteklių žalą. Ateityje atliekant vertinimus, be sudėtingų PAH mišinių, kurie dinamiškai keičiasi erdvėje ir laike visuose regionuose, kuriuose paveikta išsiliejusi nafta, turėtų būti ypač svarbu išmatuoti ir modeliuojami fenantrenų lygiai.

Galiausiai, atsižvelgiant į tai, kad fenantrenai yra beveik visur esantis sudėtingas aplinkosauginių PAH mišinių vandenynuose ir atmosferoje komponentas, mūsų išvados turi poveikį žmonėms, kurie yra toli už „Deepwater Horizon“ išsiliejimo. Pastarąjį dešimtmetį pagrindinė visuomenės sveikatos tyrimų sritis buvo susijusi su ūmiu miesto oro užterštumo poveikiu širdžiai, tačiau tiksli šio poveikio etiologija tebėra neaiški 41 . Šiuo atžvilgiu ypač svarbūs gali būti aritminiai fenantreno poveikiai. Žmonėse I Kr sukuria kalio kanalai, kurių įtampos diapazonas yra hERG1 arba hERG2 42 . HERG kanalo blokada gali sukelti gyvybei pavojingas aritmijas, todėl šis kanalas yra svarbus terapinis taikinys. Genetiniai ir cheminiai zebrafish tyrimai rodo, kad šių kanalų funkcija ir farmakologija beveik nesiskiria nuo visų stuburinių gyvūnų 43, 44, 45 . Todėl mes siūlome, kad atmosferos fenantenas turėtų kelti susirūpinimą žmogaus kardiologijai, ypač dėl jo gausaus miesto oro 46 ir greito absorbcijos į kraują įkvėpus 47 . Šis tyrimas turėtų kelti visuotinį susidomėjimą šiuo svarbiu aplinkos teršėju, atsižvelgiant į naftos ir PAH paplitimą mūsų aplinkoje.

Išvada

Mes nustatėme širdžiai toksišką junginį, garsų žaliame aliejuje, ir parodėme, kaip jis keičia širdies jėgą ir širdies ritmą pelaginėse žuvyse. Tai suteikia naują PAH poveikio širdies funkcijai įvertinti sistemą, kuri, mūsų manymu, gali būti išplėsta daugelyje stuburinių, įskaitant žmones. Sumažinus būsimą šios aritmijos sukeliamos cheminės medžiagos išmetimą, tai turėtų būti naudinga žmonių ir ekologinei sveikatai.

Metodai

Žuvies kilmė ir priežiūra

Skumbrė (žuvies masė = 0, 69 ± 0, 14 kg, širdies masė = 1, 3 ± 0, 3 g, vidurkis ± SEM, N = 11), paprastasis tunas (žuvies masė = 14, 1 ± 1, 0 kg, širdies masė = 52, 9 ± 4, 8 g, vidurkis ± SEM, N = 16) ir geltonuodegis tunas (žuvų masė = 12, 2 ± 2, 0 kg, širdies masė = 30, 9 ± 37 g, vidurkis ± SEM, N = 6) buvo sugaunami iš San Diego, Kalifornijoje, laikomuose F / V Shogun laivu jūros vandens šuliniuose., o po to sunkvežimiu gabenama į Tunų tyrimų ir apsaugos centrą (Ramiojo vandenyno uostas, Kalifornija). Skumbrė ir tunai buvo laikomi atitinkamai 30 m 3 ir 109 m 3 talpykloje 20 ± 1 ° C temperatūroje ir buvo maitinami kalmarais, sardinėmis ir praturtinta želatina, kaip anksčiau aprašyta 48, 49 . Prieš eksperimentavimą žuvys mažiausiai 4 savaites buvo aklimatizuotos iki 20 ° C. Atskiri kardiomiocitai buvo išskirti naudojant anksčiau išsamiai aprašytus protokolus 28 . Visos procedūros vyko pagal Stenfordo universiteto Institucinio gyvūnų priežiūros ir naudojimo komiteto protokolus. Visus eksperimentinius protokolus patvirtino Stenfordo universiteto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

Chemikalai

Visi tirpalai buvo paruošti naudojant ypač gryną vandenį, tiekiamą iš „Milli-Q“ sistemos (Millipore, JAV). Cheminės medžiagos buvo reagento kokybės ir įsigytos iš „Sigma“ (Sent Luisas, MO), išskyrus TTX („Tocris“, JK), ryanodiną („Ascent Scientific“, MA), „Fluo-4“ („Molecular Probes“, NY) ir „E-4031“ („Enzo Life Sciences“). NY). Visų PAH grynumas buvo bent 99%. Pradiniai PAH tirpalai buvo sudaryti dimetilsulfokside (audinių kultūros laipsnis, Sigma) esant 5 mM.

Fiziologiniai sprendimai

Tarpląstelinio fiziologinio tirpalo (Ringer), naudojamo tiek Ca 2+ vaizdavimui, tiek elektrofiziologijai, sudėtis buvo pagrįsta ankstesniu darbu 33 ir jame buvo (mM) 150 NaCl, 5, 4 KCl, 1, 5 MgCl 2, 3, 2 CaCl 2, 10 gliukozės ir 10 HEPES., kai pH nustatytas iki 7, 7, naudojant NaOH. Įrašant I Kr ir I CaL, kad jonų srovės nesutampa, šis sprendimas buvo modifikuotas. I CaL matavimui KCl buvo pakeistas CsCl, kad būtų slopinami K + kanalai. Įrašant I Kr, į Ringerio tirpalą buvo įtraukti tetrodotoksinai (TTX, 0, 5 μM), nifedipinas (10 μM) ir glibenklamidas (10 μM), kad būtų slopinami atitinkamai Na +, Ca 2+ ir ATP jautrūs K + kanalai.

Pipetės tirpalai buvo optimizuoti kiekvienam elektrofiziologiniam tyrimui. AP matavimui pipetės tirpale buvo (mM): 10 NaCl, 140 KCl, 5 MgATP, 0, 025 EGTA, 1 MgCl2 ir 10 HEPES, kurio pH buvo nustatytas iki 7, 2 su KOH. I Ca matavimui pipetės tirpale buvo (mM) 130 CsCl, 15 TEA-Cl, 5 MgATP, 1 MgCl2, 5 Na2-fosfokreatino, 0, 025 EGTA, 10 HEPES ir 0, 03 Na 2 GTP, pH sureguliuotas iki 7, 2 su CsOH. CsCl ir TEA-Cl buvo įtraukti siekiant slopinti K + sroves. Į apytikslę fiziologinę Ca 2+ buferio talpą 50 buvo įtraukta maža EGTA koncentracija. I Kr pipetės tirpale buvo (mM): 10 NaCl, 140 KCl, 5 MgATP, 5 EGTA, 1 MgCl2 ir 10 HEPES, kurio pH buvo nustatytas iki 7, 2 su KOH. Didelė EGTA koncentracija buvo įtraukta į Na + -Ca 2+ šilumokaičio srovės blokavimą.

Intraceliuliniai [Ca 2+ ] matavimai

Konfokalinis Ca 2+ vaizdavimas buvo atliktas naudojant lazerinio skenavimo įrenginį, pritvirtintą prie „Olympus“ apversto mikroskopo. Kontroliniai ir PAH paveikti miocitai 20 minučių buvo įpilti į 4 μM Fluo-4 AM (molekulinius zondus), skiedžiami praskiedžiant, kad deesterifikuotų, ir po to perfuzuojami standartiniu Ringerio tirpalu. Dažai sužadinami 488 nm bangos ilgiu, o fluorescencija matuojama> 500 nm. Skersinės linijos skenavimas buvo atliekamas 5 ms intervalu. Ląstelės buvo stimuliuojamos elektriniu būdu, naudojant 0, 5 Hz, naudojant tarpląstelinius elektrodus. Miocitų partijos buvo inkubuotos su 5 μM PAH mažiausiai 1 valandą. Kontroliniai eksperimentai buvo atlikti su laiku suderintomis neapdorotomis ląstelėmis. Kai kurios kontrolinės ir PAH ekspozicijos grupių ląstelės buvo inkubuotos su SR inhibitoriais (5 μM ryanodino ir 2 μM thapsigarginu) mažiausiai 30 minučių prieš vaizdavimą. Kai kuriuose eksperimentuose kofeino impulsas (20 mM) buvo pritaikytas per namuose sukurtą greito tirpalo sistemą. Visi linijinio skenavimo vaizdai pateikiami kaip originali neapdorota fluorescencija (F). Fono fluorescencija (F 0 ) buvo matuojama kiekvienoje ląstelėje srityje, kurioje nebuvo lokalios ar trumpalaikės fluorescencijos padidėjimo.

Elektrofiziologiniai įrašai

Elektrofiziologiniai duomenys buvo registruojami, kaip aprašyta anksčiau 51 . Trumpai tariant, kiekvieno tyrimo pradžioje miocitams buvo leista nusistovėti ~ 10 minučių registravimo kameroje, o po to perfuzija atlikta naudojant kontrolinį išorinį tirpalą. Membranos potencialai ir srovės buvo registruojami iš kiekvieno miocito visos ląstelės režimu pradinėmis (kontrolinėmis) sąlygomis ir vėl didinant fenantreno koncentracijas tarpląsteliniame tirpale. Stimulai, naudojami jonų srovėms ir AP sukelti, pateikiami paveikslo legendose. Trumpai tariant, L tipo Ca 2+ kanalo srovė (I CaL ) buvo iškviesta impulsu iki 0 mV (apytikslis kardiomiocitų srovės ir įtampos santykio pikas) po išankstinio impulso į –40 mV, kad būtų galima inaktyvuoti Na + srovę. . I CaL buvo matuojamas kaip skirtumas tarp impulsų srovės smailės ir pabaigos. Depolarizuojančių impulsų traukiniai buvo naudojami 0, 2 Hz dažniu. Veikimo potencialai (AP) buvo iškviesti naudojant 10 ms slenksčio srovės žingsnius, esant 0, 5 Hz dažniui. Atidėto lygintuvo K + srovė (I Kr ) buvo matuojama naudojant nustatytą protokolą, pritaikytą iš ankstesnių tyrimų dėl Ramiojo vandenyno 52 paprastųjų tunų 52 ir vaivorykštinių upėtakių 53 . I Kr buvo įjungtas išankstiniu impulsu iki +40 mV (kad būtų visiškai suaktyvinti K + kanalai) ir matuojamas kaip uodegos srovė esant –20 mV, didžiausiai uodegos srovei tuno miocituose 53 . Norint atskirti greitą K + srovę (I Kr ), buvo matuojama uodegos I K amplitudė kaip srovė, jautri specifiniam I Kr inhibitoriui (2 μM E-4031). Depolarizuojančių impulsų traukiniai buvo naudojami 0, 2 Hz kas 20 sekundžių. Duomenys buvo užfiksuoti per „Digidata 1322 A / D“ keitiklį („Axon Instruments“, CA), valdomą „Axopatch 200B“ („Axon Instruments“, CA) stiprintuvo, kuriame veikia „pClamp“ programinė įranga („Axon Instruments“, CA). Prieš skaitmeninimą 10–20 kHz dažniu ir saugojimą, signalai buvo filtruojami 1–10 kHz dažniu, naudojant 8 polių Bessel žemo dažnio filtrą. Kai pipetė užpildyta intraląsteliniu tirpalu (žemiau), paprastai buvo 1, 5–3 MΩ. Ląstelės membranos talpa buvo išmatuota naudojant „membranos bandymo modulį“ Clampex (pritaikant talpos srovės, užfiksuotos esant 10 mV depoliarizuojančiam impulsui, mažėjimą nuo –80 mV sulaikymo potencialo).

Duomenų analizė

Konokokalinių eksperimentų Ca 2+ pereinamieji elementai buvo analizuojami naudojant „Image J“, „Clampfit“ („Axon Instruments“, CA) ir „Origin“ („OriginLab Corporation“, MA). Buvo išanalizuoti ir vidutiniai bent trys pėdsakai esant pastoviai būsenai. Ca 2+ pereinamojo laikotarpio skilimas buvo įrengtas su vienu eksponentu, norint apskaičiuoti skilimo Tau (ty laikas sumažėti iki 37% smailės amplitudės). Ca 2+ pereinamojo laikotarpio amplitudė apibrėžiama kaip smailės padidėjimas ir bazinis Ca 2+ (F / F 0 ) 54 . Elektrofiziologiniai duomenys buvo analizuojami naudojant „Clampfit“ ir „Origin“ programinę įrangą. Visi AP parametrai buvo stabilūs per kontrolinį įrašymą (<10 min). Srovės yra išreikštos srovės tankiu (pA / pF). I CaL buvo matuojamas kaip skirtumas tarp smailės vidinės srovės ir srovės depolarizuojančio impulso pabaigoje. I Kr amplitudė buvo išmatuota kaip srovė, jautri E-4031.

Statistika

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SEM. Statistinė analizė buvo atlikta naudojant „SigmaStat“ programinę įrangą („Systat Software“, CA). Elektrofiziologiniai duomenys, turintys patvirtintą normalųjį pasiskirstymą ir vienodą dispersiją, buvo analizuojami naudojant vienpusių pakartotinių matavimų dispersijos analizę arba Friedmano pakartotinių matavimų dispersijos analizę ranguose, po to sekant Studento-Newmano-Keulso testą post hoc analizei. Konfokaliniams duomenims buvo naudojamas neporinis Studentų t-testas su tomis pačiomis tunų rūšimis, vienpusiai ANOVA buvo naudojami PAHS poveikio skumbrėms tyrimui, o dvipusiai ANOVA buvo naudojami rūšių sąveikai, SR slopinimui ir PAH. P <0, 05 buvo laikomas reikšmingu.

Papildoma informacija

Kaip cituoti šį straipsnį : Brette, F. et al . Naujų kardiotoksinių mechanizmų visuotiniam visame pasaulyje teršalui. Mokslas. Rep. 7, 41476; „doi“: 10.1038 / srep41476 (2017).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomi duomenys

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.