Nauja klostridiumo perfringenų enterotoksino savižudybių genų terapija selektyviam claudin-3 ir -4 padidėjusių navikų gydymui | genų terapija

Nauja klostridiumo perfringenų enterotoksino savižudybių genų terapija selektyviam claudin-3 ir -4 padidėjusių navikų gydymui | genų terapija

Anonim

Anotacija

Bakteriniai toksinai yra veiksmingi gydant vėžį. Clostridium perfringens enterotoksinas (CPE) gaminamas bakterinio A tipo Clostridium kamieno. Transmembraniniai baltymai claudin-3 ir -4, dažnai per daug ekspresuojami daugybėje žmogaus epitelio navikų (pavyzdžiui, storosios žarnos, krūties, kasos, prostatos ir kiaušidžių), yra tiksliniai CPE receptoriai. CPE prisijungimas prie jų sukelia membranos porų kompleksų susidarymą, dėl kurio ląstelės greitai miršta. Šiame tyrime mes siekėme selektyvaus naviko ląstelių žudymo perduodant CPE geną. Mes sukūrėme ekspresijos vektorius, turinčius bakterinio laukinio tipo CPE cDNR (wtCPE) arba transliacijai optimizuotą CPE (optCPE) cDNR, kad galėtumėte in vitro ir in vivo atlikti genų terapiją claudin-3 ir -4-ekspresuojančiuose navikuose. CPE ekspresijos analizė pasiuntinių RNR ir baltymų lygyje parodė efektyvesnę optCPE ekspresiją, palyginti su wtCPE. OptCPE ekspresija parodė greitą citotoksinį aktyvumą, kurį padidino CPE išsiskyrimas kaip pašalinio poveikio. Iki 100% citotoksiškumas buvo pastebėtas praėjus 72 valandoms po genų perdavimo ir apsiriboja klaudiną-3 ir -4 ekspresuojančiomis naviko linijomis. MCF-7 ir HCT116 ląstelės, pasižyminčios aukšta claudin-4 ekspresija, parodė dramatišką jautrumą CPE toksiškumui. Tačiau claudin neigiama melanomos linija SKMel-5 nebuvo jautri CPE geno perdavimui. Dėl nevirusinio intratumorinio opCPE genų perkėlimo sumažėjo naviko augimas MCF-7 ir HCT116 navikus turinčiose pelėse, palyginti su vektorių perneštomis kontrolinėmis grupėmis. Šis naujas požiūris parodo, kad CPE genų perkėlimas gali būti naudojamas tiksliniam savižudybių genų terapijai, susijusiam su claudin-3 ir -4-per daug ekspresuojančiais navikais, dėl kurių greitas ir efektyvus naviko ląstelių žudymas in vitro ir in vivo .

Įvadas

Vėžys vis dar yra vienas pagrindinių genų terapijos taikinių dėl didelio dažnio. 1 Vėžio genų terapijos sėkmė labai priklauso nuo tinkamo terapinio geno pasirinkimo. 2, 3 Bakteriniai toksinai yra patrauklūs kandidatai, pasižymintys efektyviu ląstelių naikinimo pajėgumu. 4 Visų pirma, atsparių ugniai navikų gydymui, toksinų naudojimas yra tinkama galimybė, jis buvo išbandytas in vitro ir in vivo gydant įvairius vėžinius susirgimus, taip pat buvo efektyviai naudojamas genų terapijoje. 5, 6, 7, 8 Plačiausiai naudojami toksinai yra difterijos toksinas ( Corynebacterium diphteriae ) ir Pseudomonas egzotoksinas A ( Pseudomonas aeruginosa ), kurie abu slopina baltymų sintezę specifiniu pailgėjimo faktoriaus 2 ribosilinimu. 4, 9 Du toksinai buvo naudojami gydant prostatą, kasą, kiaušidžių, plaučių karcinomą ir glioblastomą, pasižyminčius daug žadančiu terapiniu veiksmingumu, be to, jie buvo gydomi genų terapijos metodais. 5, 6, 7, 8, 10, 11, 12, 13, 14 Alternatyviai, kaip perspektyvūs vėžio terapijos atvejai, akcentuojami porus formuojantys toksinai streptolizinas O ( Streptococcus pyrogenes ) ir Clostridium perfringens enterotoksinas (CPE). 15, 16, 17, 18 dienomis

CPE gamina anaerobinis gramteigiamas A tipo Clostridium perfringens štamas, kuris, kaip žinoma, sukelia apsinuodijimą maistu. 19 CPE yra 35 kDa baltymas, kuris padidina ląstelių membranos pralaidumą, formuodamas didelius priešporinius kompleksus. Jie įsitvirtina plazmos membranoje, todėl prarandama osmosinė pusiausvyra ir ląstelės žūva. 20, 21, 22 CPE jungiasi su tampriųjų jungčių baltymų, tokių kaip claudinas-3 ir -4, claudinų šeimos pogrupiu, iš pradžių apibrėžtu kaip CPE receptoriai. CPE C-galas leidžia šį rišimąsi, tuo tarpu CPE N-galas yra labiau susijęs su citotoksiškumu. 24, 25 CPE pirmiausia jungiasi su claudin-4 ir mažesniu afinitetu su claudin-3. 23, 26 Claudin-3 ir -4 reguliuoja tarpląstelinio pralaidumą, palaiko epitelio ląstelių poliškumą ir dažnai yra per daug ekspresuojami epitelio navikuose, tokiuose kaip storosios žarnos, krūties, kasos, prostatos, kiaušidžių ar endometriumo vėžys. 27, 28, 29, 30, 31, 32 Taigi, ypač šie du claudinai yra patrauklūs taikiniai selektyviam kietų navikų gydymui CPE. Naudojant rekombinantinį CPE baltymą, nuo dozės priklausomas greitas kasos, krūties ar storosios žarnos vėžio ląstelių , turinčių inkstuose ir in vivo, likvidavimas kasos, krūties ar storosios žarnos vėžio ląstelėse yra greitas. 17, 18, 33, 34, 35, 36, 37 Intratumorinis rekombinantinio CPE pritaikymas in vivo nesukėlė su toksinu susijusio šalutinio poveikio, palaikydamas jo didelį terapinį potencialą. Tačiau norint pasiekti gydomąjį poveikį, norint naudoti šiuos metodus, reikia pakartotinio, beveik tęstinio rekombinantinio CPE taikymo regioniniu ar lokaliniu regionu, naudojant dozes nuo 0, 5 iki 1, 0 μg CPE. 33, 36, 37 Be to, didelis intersticinis slėgis auglyje gali trukdyti tinkamai paskirstyti išorėje naudojamą CPE ir apriboti jo terapinį poveikį. 38 Kaip alternatyva, intratumorinis CPE ekspresuojančių vektorių genų perdavimas galėtų žymiai pagerinti toksinų prieinamumo trukmę, susijusią su optimizuotu intratumoraliniu pasiskirstymu ir kaupimu. Keista, tačiau iki šiol nebuvo atliktas toks genų terapijos tyrimas, kuriame būtų naudojamas CPE genų perdavimas, kad būtų tiesiogiai panaudotas išreikšto toksino citotoksinis aktyvumas.

Tai yra pirmoji ataskaita, apibūdinanti šio požiūrio įgyvendinimą. Šiame tyrime mes klonavome CPE cDNR ir optimizavome jo seką žmogaus transliacijai, kad būtų galima ekspresuoti toksiną žmogaus navikinėse ląstelėse. Mes parodėme, kad CPE ekspresija skatina greitą ir selektyvų naviko ląstelių likvidavimą in vitro ir in vivo . Visų pirma, dėl CPE ekspresijos toksinas, paveikiantis neperkeltas ląsteles, išsiskiria kaip pašalinis poveikis, kuris padidina toksino efektyvumą. Tyrimas patvirtina didžiulį šios naujos savižudybių genų terapijos potencialą, ypač gydant vietinį claudin-3 ir -4-padidėjusių epitelio navikų gydymą.

Rezultatai

Claudino-3 ir -4 ekspresija žmogaus naviko ląstelių linijose ir jautrumas rekombinantiniam CPE

Kadangi CPE veikimas griežtai priklauso nuo CPE rišančių kladinų, kaip antai claudinas-3 ir -4, buvimo, mes išbandėme žmogaus vėžinių ląstelių linijas SKMel-5, HCT116, MCF-7 ir Pac-1, kad būtų galima pasakyti apie klavudiną. MCF-7 ląstelėse mes nustatėme aukštą claudin-3 ir -4 ekspresiją RNS ir baltymų pasiuntinyje (1a pav.). HCT116 ląstelės išreiškė claudin-4 ir -3 žemesniame lygyje, palyginti su MCF-7 ląstelėmis, tuo tarpu Panc-1 ląstelės išreiškė claudin-4 tik aptinkamu lygiu (1a pav.). Pusiau kiekybinė klaudino-3 baltymo ekspresijos analizė parodė, kad SKMel-5 ląstelėse claudin-3 raiška yra 0%, HCT116 ląstelėse - 84%, o „Panc-1“ ląstelėse - 0%, palyginti su aukščiausią claudin-3 ekspresuojančiu MCF-7. ląstelės (nustatyta kaip 100%). Klaudino-4 ekspresijai, lygis SKMel-5 ląstelėse buvo 0%, HCT116 ląstelėse 40% ir Panc-1 ląstelėse 14%, palyginti su ekspresija MCF-7 ląstelėse (nustatyta kaip 100%). Melanomos linija SKMel-5 neišreiškė nei claudin-3, nei claudin-4, todėl buvo naudojama kaip neigiama kontrolė visuose in vitro eksperimentuose. Išbandžius keturias ląstelių linijas jautrumui gydymui rekombinantiniu CPE, nustatyta griežta koreliacija tarp claudin-3 ir -4 ekspresijos ir jautrumo toksinui (1b paveikslas). Klaudiną-3 ir -4 ekspresuojančios linijos MCF-7 ir HCT116 parodė didelį jautrumą, pradedant nuo CPE koncentracijos nuo 0, 05 iki 0, 1 μg ml −1, ir išsivystė didžiausias, > 80%, toksiškumas esant 0, 25 μg ml −1 CPE. „Panc-1“ ląstelės buvo mažiau jautrios toksinų poveikiui dėl daug mažesnės claudin-4 ekspresijos. Klaudino neigiamos SKMel-5 ląstelės buvo visiškai nejautrios CPE.

Image

Claudino-3 ir -4 ekspresija naviko ląstelių linijose SKMel-5, HCT116, MCF-7 ir Panc-1 bei jautrumas rekombinantiniam CPE. a ) Kiekybinis realaus laiko RT-PGR, atitinkami PGR produktai ir Western blot tyrimas dėl claudin-3 (kairėje) ir claudin-4 ekspresijos (dešinėje), atskleidžiantį aukštą claudin-3 ir 4 ekspresiją MCF-7 ir HCT116 ląstelėse, žemą claudin-4 ekspresija Panc-1 ir jokio claudin-3 ar -4 ekspresijos SKMel-5 ląstelėse. Stulpeliai, trijų egzempliorių vidurkis; strypai, sd ( b ) Naviko ląstelių jautrumas rekombinantiniam CPE, nustatytas Alamar-blue citotoksiškumo tyrimu. Rekombinantinis CPE buvo dedamas į ląsteles nurodytomis koncentracijomis (0, 05–0, 25 μg CPE / ml, kas prilygsta 1, 4–7, 0 n M CPE) 72 valandas. Ryškus citotoksiškumas pastebimas HCT116 ir MCF-7 ląstelėse, mažesnis toksiškumas - „Panc-1“ ląstelėse. Stulpeliai, neapdorotų kontrolinių ląstelių procentinis vidurkis; barai, sd Matavimai buvo atlikti keturiais egzemplioriais. Reikšmingumo lygiai buvo apskaičiuoti Studentų t- testo; * P <0, 001.

Visas dydis

In vitro CPE ekspresija ir tarpląstelinis pasiskirstymas

CPE ekspresijai sukurti sukūrėme pCpG-wtCPE vektorių, nešantį bakterijos wtCPE cDNR, ir pCpG-optCPE vektorių, turintį transliacijai optimizuotą CPE (optCPE) cDNR. Dvi vektorių konstrukcijos buvo perkeltos į keturias naviko ląstelių linijas ir išanalizuota CPE raiška. Praėjus 24 valandoms po transfekcijos, mes nustatėme geriausią 4–40 kartų patobulintą Messenger RNR ir 3–36 kartus patobulintą baltymo ekspresiją optCPE, palyginti su wtCPE visose keturiose eilutėse (2a pav.). Toliau nustatėme išreikšto optCPE baltymo ląstelėje lokalizacijos pokyčius imunofluorescencijos būdu transfekuotose MCF-7 ir HCT116 ląstelėse, turinčiose aukščiausią CPE ekspresiją (2b paveikslas). Pastebėjome greitą citoplazminio toksino kaupimąsi praėjus 12 valandų po transfekcijos abiejose ląstelių linijose, kuris vėliau 24 valandas po transfekcijos pasikeičia į labiau membraninę lokalizaciją. Šis membraninis CPE lokalizavimas išliko net 48 val. Po transfekcijos mirštančiose ar negyvose MCF-7 arba HCT116 ląstelėse, kuriose citoplazmos kiekis beveik netenkamas, o tai atspindi citoplazminio Alexa 555 dažymo praradimas, ypač MCF-7 ląstelėse.

Image

CPE ekspresijos ir tarpląstelinės lokalizacijos analizė wtCPE arba optCPE perkeltose naviko ląstelėse. ( a ) Kiekybinis realaus laiko RT-PGR ir naviko ląstelių Western-blot tyrimas praėjus 24 val. po transfekcijos rodo geresnę opCPE varianto ekspresiją visose keturiose ląstelių linijose. Pusiau kokybinė „Western blot“ analizė („ChemiImager“, „Alpha Innotech“, San Leonardo, CA, JAV) atskleidė 36 kartus geresnę ekspresiją SKMel-5, 3, 4 karto patobulintą ekspresiją HCT116, 6, 7 karto pagerintą ekspresiją MCF-7 ir 12 kartų. pagerėjo optCPE ekspresija Pac-1 ląstelėse, palyginti su wtCPE. Stulpeliai, trijų egzempliorių vidurkis; strypai, sd ( b ) Nuo laiko priklausomo opCPE (žalio) pasiskirstymo ląstelėse imunofluorescencija HCT116 ir MCF-7 ląstelėse. Jei dažai dažomi naudojant „Alexa 555“, tai citoplazma (raudona) ir DAPI branduoliai (mėlyna). Vaizdai parodo pradinį citoplazminį optCPE baltymo kaupimąsi praėjus 12 valandų po transfekcijos, o tai 24–48 valandas po transfekcijos tampa membraniškesne mirštančių ląstelių lokalizacija. Svarstyklės, 20 μm.

Visas dydis

Atrankinis CPE geno perdavimo citotoksiškumas ir pašalinis poveikis, atleidžiant CPE

CPE citotoksiškumo įrodymas perduodant geną yra svarbiausias dalykas. Tam mes perkėlėme wtCPE ir optCPE ekspresuojančius vektorius į keturias ląstelių linijas ir nustatėme ląstelių gyvybingumą. Šie eksperimentai rodo aukštą citotoksiškumą, ypač opCPE MCF-7 ir HCT116 ląstelėse 72 valandas po transfekcijos, toksiškumo laipsnis nuo 88% iki beveik 100% (3a paveikslas). „Panc-1“ ląstelėse optCPE sukelia iki 60% citotoksiškumą. Įvertinimas šviesos mikroskopu parodo didžiulį viengyslių sluoksnių suskaidymą, ląstelių išlyginimą ir pritvirtintų tuščių ląstelių liekanas, kurias sukėlė CPE geno perdavimas (3b pav.). Dėl neefektyvios wtCPE ekspresijos HCT116 ir MCF-7 ląstelėse citotoksiškumas yra daug mažesnis. Duomenys vėl patvirtina koreliaciją tarp claudin-4 ir -3 ekspresijos bei CPE toksiškumo. MCF-7 ir HCT116 ląstelės, kurios ekspresuoja claudin-4 ir -3, yra jautriausios CPE genų perdavimui. „Panc-1“ ląstelės, turinčios žemo lygio claudin-4 ir neturinčios claudin-3 ekspresijos, vis dėlto yra mažiau jautrios, iš dalies taip pat ir dėl mažesnio šios ląstelių linijos transfekcijos efektyvumo (2a paveikslas, 1 lentelė). Klaudino-3- ir -4-neigiamos SKMel-5 melanomos ląstelės nereagavo į wtCPE ar optCPE genų perdavimą, nurodydamos griežtą šio metodo selektyvumą.

Image

CPE geno perdavimo citotoksinis poveikis navikinėse ląstelėse ir klavino specifiškumo patikrinimas. a ) CPE citotoksiškumas wtCPE ir opCPE transfekuotų naviko ląstelių linijose. Alamar blue citotoksiškumo tyrimas buvo atliktas praėjus 72 valandoms po transfekcijos. Kontrolinės ląstelės yra apdorotos transfekcijos reagentais ir perneštos vektoriais. Stulpeliai - neapdorotų kontrolinių ląstelių procentinis vidurkis. Matavimai buvo atlikti keturiais egzemplioriais; barai, sd Reikšmingumo lygį apskaičiavo Studentai t- testas; * P 0.004; ** P <0, 001. Tyrimas rodo didžiausią citotoksiškumą opCPE ekspresuojančioms ląstelėms, kurios selektyviai veikia claudin-3 arba -4 teigiamas ląsteles, nepalikdamos įtakos claudin neigiamoms SKMel-5 ląstelėms. ( b ) Reprezentatyvūs vektorių ar optCPE transfekuotų ląstelių vaizdai praėjus 72 valandoms po transfekcijos (mastelio juosta, 100 μm). Jautriose ląstelėse atsiranda dideli negyvų ląstelių plotai. c ) ląstelių linijos, gautos iš SKMel-5 ląstelių, perkeltų laukinio tipo (wtCldn3) arba mutavusių pelių claudin-3 (mutCldn3) ekspresijos vektoriais. Klaudino-3 ekspresija buvo patikrinta atliekant Western blot analizę. ( d ) wtCldn3 ekspresuojančių SKMel-5 ląstelių apdorojimas rekombinantiniu CPE sukelia toksiškumą, tuo tarpu mutCld3 ekspresuojančios ląstelės liko nepakitusios. Kontrolės (Co) yra neperkeltos SKMel-5 ląstelės. ( e ) MTT citotoksiškumo tyrimas po wtCldn3 arba mutCldn3 ekspresuojančių SKMel-5 ląstelių transfekcijos optCPE daro toksinį poveikį wtCldn3 ekspresuojančioms ląstelėms, mutCldn3 ląstelės liko nepakitusios. Kontrolės yra neperkeltos (Co) arba perneštos per vektorius (vec) SKMel-5 ląstelės. Matavimai ( d ) ir ( e ) buvo atlikti lytiniuose kopijose; barai, sd ( d ) ir ( e ) reikšmingumo lygį apskaičiavo Studentai t- testas; * P <0, 05.

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Norėdami išsamiau išanalizuoti CPE geno perdavimo claudinui poveikį, mes sukūrėme izogeninę pora iš claudin-3- ir -4-neigiamų SKMel-5 ląstelių. Į šias ląsteles mes perkėlėme pelių laukinio tipo claudin-3 (wtCldn3) ir mutavusio claudin-3 (mutCldn3) variantą ir atrinkome stabiliai ekspresuojančius klonus (3c paveikslas). Gydant wtCldn3 transfekuotus SKMel-5 klonus 100 ng ml −1 rekombinantiniu CPE, 55% toksiškumas buvo lyginamas su neperkeltomis kontrolinėmis ląstelėmis, tuo tarpu mutCldn3 transfekuotos SKMel-5 ląstelės liko nejautrios, nes neperkeltos SKMel-5 ląstelės (pav. 3d). Tuomet šiuos klonus mes transfekavome optCPE ekspresuojančiu vektoriu ir tuščiuoju vektoriu ir stebėjome stiprų 64% toksiškumą wtCldn3 ekspresuojančiose ląstelėse, palyginti su vektorių transfekuotomis kontrolėmis (3e pav.). Priešingai, mutCldn3 ekspresuojančios ląstelės neatsakė į optCPE transfekciją. Šie duomenys patvirtina, kad CPE geno perdavimo sukeliamas toksiškumas konkrečiai priklauso nuo claudino ekspresijos ir nuo CPE surišančio motyvo (įskaitant N148 ir L150) tarpląstelinėje claudinų kilpoje.

Visuose šiuose eksperimentuose mes pastebėjome daug didesnį CPE sąlygotą toksiškumą, kaip būtų galima tikėtis transfekcijos greičiu nuo 40 iki 70% (1 lentelė). Tai rodo, kad CPE gali būti išleistas į terpę ir paveikti neperkeltas naviko ląsteles kaip pašalinis poveikis. Norėdami tai įrodyti, nustatėme CPE buvimą transfekuotų MCF-7 ir HCT116 ląstelių terpėje. Mes pastebėjome, kad CPE išsiskiria į terpę praėjus 24 ir 48 valandoms po transfekcijos (4a paveikslas). CPE-ELISA (iš fermento sujungto imunosorbento tyrimo) metu išsiskyrusio toksino kiekybinis įvertinimas patvirtino, kad per tam tikrą laiką jo sudėtyje yra iki 34 ng ml −1, išsilaisvinusio iš MCF-7 ląstelių, ir iki 468 ng ml −1, išlaisvinto iš HCT116 ląstelių (lentelė). 2). Norėdami patikrinti, ar išleistas CPE vis dar turi toksinį aktyvumą, mes pridėjome terpę, surinktą praėjus 48 valandoms po transfekcijos, į atitinkamas neperkrautas ląsteles (4b paveikslas). Citotoksiškumo tyrimas aiškiai rodo dramatišką, iki 92%, citotoksiškumą po 72 valandų inkubacijos HCT116 ir apie 72% citotoksiškumo MCF-7 ląstelėse. Pridėjus HCT116 supernatantų, SKMel-5 ląstelės liko nepakeistos. Tai tvirtai patvirtina, kad pašalinis poveikis yra susijęs su CPE genų perdavimu ir sukelia toksiškumo padidėjimą. Analizuojant opCPE transfekuotas SKMel-5 melanomos ląsteles, paaiškėjo, kad šios ląstelės ne tik kaupia CPE citoplazmoje, kaip parodyta MCF-7 ir HCT116 ląstelėms, bet ir išskiria biologiškai aktyvų CPE į terpę (4c ir d paveikslai). . Todėl atrodo, kad CPE išsiskyrimas į terpę perneštų ląstelių nepriklauso nuo CPE citotoksiškumo ir claudin-3 arba -4 ekspresijos.

Image

CPE išsiskyrimo analizė opCPE-transfekuotuose MCF-7, HCT116 ( a ) ir SKMel-5 ląstelėse ( c ). ( a ) Western blot parodo nuo laiko priklausomą CPE išsiskyrimą iš opCPE transfekuotų HCT116 ir MCF-7 ląstelių, galinčių veikti neperkeltas ląsteles. ( b ) OptCPE turinčių supernatantų, parodytų a punkte, citotoksinio aktyvumo analizė. Neperkeltų HCT116 ir MCF-7 ląstelių inkubacija su supernatantais, paimtais iš transfekuotų HCT116 arba MCF-7 ląstelių, praėjus 48 valandoms po transfekcijos, sukėlė stiprų citotoksiškumą, tuo tarpu SKMel-5 ląstelės neatsakė. Kontrolinės ląstelės buvo inkubuotos su supernatantais atitinkamai iš vektorių transfekuotų HCT116 arba MCF-7 ląstelių. c ) Western blot analizė taip pat rodo nuo laiko priklausomą CPE išsiskyrimą transfekuotose SKMel-5 ląstelėse, tai rodo, kad CPE išsiskyrimas nepriklauso nuo claudin-3 ar -4 ekspresijos. d ) CPE turinčių supernatantų (pažymėtų žvaigždutėmis) MTT citotoksiškumo bandymai su neperkrautomis HCT116 ląstelėmis rodo išsiskyrusio CPE toksiškumą. Stulpeliai - kontrolinės procentinės dalies vidurkis, nustatytas trimis dviem nepriklausomais eksperimentais; barai, sd

Visas dydis

Pilno dydžio lentelė

Citotoksiškumo mechanizmas CPE perkeltose naviko ląstelėse

Dėl greito CPE geno perdavimo ląstelių žudymo, pagrindinio mirties kelio analizė buvo įdomi. Mes nustatėme galimą apoptozinių ir nekrotinių kelių aktyvavimą optiškai modifikuotai modifikuotai modifikuotai modifikuotai MCF-7 ir HCT116 ląstelei, turinčioms aukščiausią jautrumą CPE. Galimas 3 ir 7 kapazių, kaip apoptozinių žymenų, aktyvavimas buvo tiriamas praėjus 12, 24 ir 48 valandoms po transfekcijos (5a paveikslas). Tyrimas nenustatė kasfazės 3 ar 7 aktyvacijos bet kuriuo metu MCF-7 ląstelėse, galbūt dėl ​​greito jų išnaikinimo. Priešingai, HCT116 ląstelėse, praėjus 24–48 valandoms po transfekcijos, buvo pastebėtas iki 6 kartų didesnis kaspazės 3 ir 7 aktyvumas. Kaspazės 1 analizė neatskleidė jos aktyvacijos perduodant CPE geną (5b pav.). Tačiau aneksino-V, propidium jodidu (PI) dažytų ląstelių FACS analizė atskleidė 74% PI teigiamumą HCT116 ląstelėse ir 43% PI teigiamą MCF-7 ląstelių 24 valandas po transfekcijos. Tai rodo atitinkamai 2, 3 arba 3 kartus padidėjusį PI ženklinimą (5c paveikslas). Aneksino-V teigiamų ląstelių nebuvo aptikta abiejose ląstelių linijose. Be to, mes išanalizavome laktato dehidrogenazės (LDH) išsiskyrimą į terpę optCPE transfekuotose MCF-7 ir HCT116 ląstelėse (5d pav.). Abiejose ląstelių linijose, praėjus 24 valandoms po optCPE geno perdavimo, buvo nustatytas> 2 kartus padidėjęs LDH išsiskyrimas, tai rodo CPE sąlygojamą ląstelių membranų ardymą. Tai sutampa su padidėjusiu CPE išsiskyrimu į terpę dėl nesandarumo (4 paveikslas). Be to, atidus CPE transfekuotų MCF-7 arba HCT116 ląstelių įvertinimas lengvu mikroskopu parodo nekrozinį lizuotų prijungtų ląstelių liekanų su piknotiniais branduoliais nekrozinį pasirodymą (4e paveikslas). Šie duomenys rodo, kad CPE geno perkėlimas pirmiausia skatina nekrozinių ląstelių mirtį.

Image

Kaspazės 3, 7 ir 1 aktyvumo analizė, LDH išsiskyrimas ir PI žymėjimas opCPE ekspresuojančiose MCF-7 ir HCT116 ląstelėse. a ) Aktyvioji kaspazė 3 ir 7 buvo nustatyta ląstelių kultūros terpėje nurodytu laiku po transfekcijos. HCT116, kaspazės 3 arba 7 aktyvumo padidėjimas buvo nustatytas praėjus 24 ir 48 valandoms po optCPE geno perdavimo. MCF-7 ląstelėse nebuvo nustatyta kaspazės 3 ar 7 aktyvacijos. ( b ) Aktyvioji kaspazė 1 buvo nustatyta nurodytu laiku po transfekcijos, nurodant optinį tankį (OD). Nei HCT116, nei MCF-7 kaspazės 1 aktyvacija nebuvo nustatyta po optCPE geno perdavimo. c ) PI žymėjimo nustatymas atlikus FACScan analizę transfekuotose HCT116 ir MCF-7 ląstelėse rodo, kad opCPE ekspresija lemia didelę dalį PI teigiamų ląstelių. ( d ) LDH išsiskyrimo transfekuotose MCF-7 ir HCT116 ląstelėse analizė, kurioje optCPE ekspresija padidina LDH išsiskyrimą praėjus 24 valandoms po transfekcijos. Visų tyrimų metu stulpeliai yra keturių egzempliorių vidurkiai; barai, sd Reikšmingumą apskaičiavo Studentai t- testas; * P <0, 001; ** P = 0, 002. ( e ) tipiškos H ir E dažytos MCF-7 arba HCT116 ląstelės praėjus 24 valandoms po optCPE transfekcijos ir atitinkamos kontrolės. Rodyklės rodo pritvirtintus lizuotų ląstelių likučius su piknotiniais branduoliais, nurodančius nekrotinius fenotipus (mastelio juosta, 50 μm).

Visas dydis

In vivo CPE ekspresija ir priešnavikinis veiksmingumas po nevirusinio intratumorinio CPE geno perdavimo

Pirmiausia išanalizavome intratumoralinę optCPE raišką po kombinuoto intratumorinio in vivo reaktyvinio injektavimo ir elektroporacijos geno perdavimo. Mes nustatėme efektyvią ir nuolatinę intratumorinę CPE baltymo ekspresiją nuo 1 iki 5 dienos (6a pav.). Imunohistochemija parodo dėmės, kuriose naviko audiniuose yra stiprios CPE ekspresija, kaip parodyta reprezentatyviose sekcijose, surinktose 1 ir 2 dienomis po genų perkėlimo (6b paveikslas). Šie duomenys rodo, kad CPE baltymas yra bent 5 dienas po geno perdavimo in vivo . Todėl terapinio gydymo grafikas buvo pakoreguotas pakartotinai naudojant in vivo genų perkėlimą su 7 dienų intervalu. Atliekant CPE genų terapijos eksperimentus, naudojant optCPE transfekuotus MCF-7 navikus pastebimas reikšmingas ( P = 0, 0317) naviko augimo sumažėjimas, palyginti su pernešamų vektorių kontroline grupe (6c pav.). Vidutinis naviko dydis buvo sumažintas iki 0, 322 ± 0, 08 cm 3 gydomoje grupėje, palyginti su vidutiniu 0, 714 ± 0, 12 cm 3 kontrolinės dalies dydžiu, tai rodo 55% naviko dydžio sumažėjimą. Tai yra susijusi su didelių naviko nekrozės sričių atsiradimu dėl CPE veikimo (6d pav.). Nekrozinių sričių mastas, palyginti su ribotomis CPE išraiškos sritimis (žr. 6b paveikslą), rodo panašų pašalinių žmonių CPE poveikį, stebėtą in vitro eksperimentuose. In vivo eksperimentai su HCT116 storosios žarnos karcinomos, ksenotransplantuotos pelėmis, taip pat parodė reikšmingą naviko tūrio sumažėjimą ( P = 0, 0317) HCT116 navikuose, kuriems buvo pernešti opCPE, palyginti su atitinkamais vektoriaus kontroliais (6e pav.). Čia vidutinis naviko tūris buvo sumažintas iki 1, 09 ± 0, 42 cm 3 gydomos grupės, palyginti su vidutiniu 3, 16 ± 0, 65 cm 3 kontrolinės dalies dydžiu, tai rodo 64% auglio dydžio sumažėjimą. Įvertinus opCPE perkeltų navikų HE dažytus pjūvius, paaiškėjo, kad auglių nekrotiniai plotai yra tokie, kokie buvo transfekuotų MCF-7 navikų atveju (6f pav.). Genų perdavimo eksperimentai HCT116 modelyje patvirtina, kad CPE transfekcija daro priešnavikinį in vivo poveikį skirtingiems navikų modeliams ir nurodo terapinį CPE genų terapijos potencialą. Lygiagrečiai mes įtraukėme papildomą gyvūnų grupę, kuri buvo gydoma intratumoralinėmis rekombinantinio CPE (recCPE) injekcijomis po 1, 0 μg recCPE dozę šešis kartus per 3 dienų intervalą, pritaikant anksčiau aprašytus gydymo in vivo planus. 17, 18 Taikant recCPE, naviko tūris taip pat sumažėjo iki vidutinio 1, 97 ± 0, 36 cm 3 dydžio, o tai reiškia 37, 7% sumažėjimą ( P = 0, 1508), palyginti su pernešėjų perneštais gyvūnais (6e pav.). Atliekant CPE genų perdavimo eksperimentus, sisteminio toksinio poveikio, pavyzdžiui, kūno svorio sumažėjimo, viduriavimo, kūno temperatūros padidėjimo, nepastebėta.

Image

Nevirusinis opCPE geno perdavimas in vivo MCF-7 ir HCT116 navikuose, naudojant kombinuotą elektroporaciją ir reaktyvinę injekciją, siekiant CPE ekspresijos analizės ir navikų terapijos. a ) Nuo laiko priklausoma CPE baltymo ekspresijos MCF-7 navikuose analizė, naudojant Western blot metodą nurodytu laiku. ( b ) Nuo laiko priklausomas intratumorinis CPE baltymo ekspresijos pasiskirstymas (pažymėtas rodyklėmis), aptiktas specifinės CPE imunohistocheminės analizės būdu MCF-7 navikuose. Vaizdai rodo reprezentacinius pjūvius, surinktus 1 ir 2 dienomis po genų perdavimo; 1 ir 2 dienų navikai atitinka tuos, kurie parodyti a punkte. Dešiniajame skydelyje pavaizduotos ląstelės, turinčios tipišką nekrozės morfologiją (pažymėtos rodyklėmis) transfekuotame navike (2 diena) didesniu padidinimu. Vektoriniu būdu perkeltas navikas tarnavo kaip kontrolė. c ) MCF-7 ksenotransplantato naviko augimo slopinimas po optCPE genų perdavimo. Vektoriais pervesta grupė tarnavo kaip kontrolė. Dėl CPE geno perdavimo reikšmingai sumažėjo naviko augimas ( P = 0, 0317); reikšmingumo lygis buvo nustatytas naudojant neparametrinį Manno – Whitney U testą; strypai, sem ( d ) H&E dėmė rodo didžiulės nekrozės atsiradimą optinuose opCPE perneštuose navikuose (mastelio juosta B 100 μm, D 200 μm). e ) HCT116 ksenotransplantato naviko augimo slopinimas po optCPE in vivo genų perkėlimo arba į auglį įšvirkštus 1, 0 μg rekombinantinio CPE (recCPE). Vektoriais pervesta grupė tarnavo kaip kontrolė. Dėl CPE geno perdavimo reikšmingai sumažėjo naviko augimas ( P = 0, 0317), tuo tarpu gydymas recCPE yra mažiau efektyvus, palyginti su optCPE geno perdavimu ( P = 0, 1508); reikšmingumo lygis buvo nustatytas naudojant neparametrinį Manno – Whitney U testą; strypai, sem ( f ) H&E dėmė vėl rodo didžiulės nekrozės atsiradimą optCPE perneštuose navikuose (mastelio juosta ( f ) 200 μm).

Visas dydis

Diskusija

Toksinai įrodė savo terapinį efektyvumą gydant vėžį tiek kaip rekombinantinius baltymus, tiek kaip terapinius genus vėžio genų terapijoje. 5, 6, 7, 8, 10 Be difterijos toksino ir Pseudomonas egzotoksino, dėmesio centre buvo ir kiti toksinai, tokie kaip streptolizinas O ir CPE. Abu pastarieji toksinai yra porus formuojantys baltymai, iš kurių streptolizinas O yra gana neapibrėžtas, tuo tarpu CPE veikia specifiškai. 15, 16, 17 Tikslinis CPE veikimas yra vykdomas jungiantis prie tam tikro pogrupio claudinų, daugiausia prie claudin-3 ir -4, kurie dažnai būna ekspresuojami epitelio navikuose. 22, 24, 25 Šis jungimasis sukelia plazmos membranos dezintegraciją kartu su greita apdorotų ląstelių citolize. 34 Keli in vitro ir in vivo tyrimai parodė rekombinantinio CPE priešnavikinį aktyvumą, kurį riboja poreikis dažnai kartoti CPE, kad būtų pasiektas priešnavikinis poveikis. 17, 18 Kaip naują alternatyvų požiūrį siekėme CPE geno terapijos, kad pagerėtų ir pailgėtų toksinų veikimas mažesnėmis dozėmis, reikalingomis išoriniam CPE taikymui. Pirmą kartą pademonstravome, kad CPE gali būti veiksmingai ekspresuojamas in vitro ir in vivo , dramatiškai pagerintas naudojant transliacijai optimizuotą optCPE. Dar svarbiau, kad mes parodėme, kad tarpląstelinė CPE ekspresija ir kaupimasis lemia efektyvią naviko ląstelių lizę claudin-3 ir -4-teigiamose ląstelėse, ypač teikiant pirmenybę claudin-4-daugiau ekspresuojančioms ląstelėms, o klavino-neigiamos ląstelės liko nepaveiktos. 28

Tačiau, jei claudinas-3 buvo perkeltas į iš pradžių claudin-3 ir -4-neigiamas SKMel-5 ląsteles, išoriškai pritaikytas CPE ir CPE transfekcija sukelia stiprų citotoksiškumą. Tai palaiko tikslinį CPE genų perdavimo veiksmą. Šis požiūris yra pranašesnis už kitus toksinus, kurie naudojami terapijoje su vėžiu, nes jie veikia labiau visur esančius, navikams būdingus taikinius, pavyzdžiui, E2F difterijos toksinui arba membraninį cholesterolį streptolizinui O 4, 16. Norint tinkamai nukreipti naviką, modifikuoti juos. reikia toksinų, pavyzdžiui, sukuriant sulietus baltymus kaip imunotoksinus. 4 CPE taip pat buvo naudojamas sintezės baltymų generavimui. Čia ypač buvo panaudota specifinė CPE C-galinio domeno, turinčio specifinę claudino jungimosi savybę, nukreipimas į kitus toksinus, tokius kaip difterijos toksino fragmentas A (DT-A), Pseudomonas aeroginosa egzotoksinas (PE) arba TNF-α. 39, 40, 41, 42, 43 Šie metodai išnaudoja CPE tarpininkavimą nukreipiant toksinius baltymus į naviko ląsteles ir buvo įrodyta, kad jie yra veiksmingi in vitro ir in vivo . Šiomis strategijomis buvo siekiama pagerinti DT-A, PE ar TNF-α citotoksiškumą, o ne patį CPE. Tačiau norint pasiekti terapinį poveikį, in vivo reikėjo dažnai naudoti CPE ir su CPE sulietus baltymus. 39, 40, 41, 43, priešingai, CPE, kaip vienintelis pilno ilgio baltymas, sujungia ir stiprų taikinio specifiškumą, ir labai efektyvų citotoksiškumą, kuris yra svarbus in vivo taikymui, norint greitai sunaikinti naviką.

Šis tyrimas parodė, kad nors CPE gaminamas transfekuotų ląstelių viduje, jo išorinis veikimas poroms formuotis ir ląstelių lizei netrukdo. Panašūs stebėjimai buvo atlikti dėl streptolizino O geno perdavimo, kai viduląstelinio toksino ekspresija lemia ląstelių membranų perforaciją, patikrintą dėl LDH išsiskyrimo. 16 Taip pat parodėme, kad ląstelėse susikaupęs CPE sukelia membranos sutrikimą, susijusį su LDH relaze HCT116 ir MCF-7 ląstelėse (4 paveikslas). Įdomiau, kad transfekuotų ląstelių terpėje aptikome išsiskyrusį biologiškai aktyvų CPE, nors prie CPE nebuvo prijungta jokia signalo peptido seka. Be to, iš dalies atrodo, kad šis išsiskyrimas nepriklauso nuo CPE sąlygojamo toksiškumo ar nuo claudin-3 ar -4 ekspresijos, nes opCPE transfekuotos SKMel-5 ląstelės taip pat išleido CPE į terpę. Tai palaiko pašalinių žmonių toksiškumo, perduodant CPE geną, koncepciją. Tai patvirtina mūsų pastebėjimas, kad nors mūsų transfekcija paveikia 41–77% ląstelių, esančių keturiose naviko linijose, CPE geno perdavimas in vitro sunaikina beveik 100% ląstelių. Toks invazijos efektas ypač svarbus gydant CPE genų terapiją in vivo, kad terapinis veiksmingumas būtų labai svarbus. Kaip mes pastebėjome in vivo , atrodo, kad mūsų nevirusinis CPE geno perdavimas paveikė daugiau nei transfekuotas sritis, o tai atspindi didelė nekrozės dalis transfekuotuose MCF-7 ir HCT116 navikuose (6 paveikslas).

Susidomėjo transfekuoto CPE veikimo būdas, sukeliantis apoptozės ar neapoptozės kelius. Šiame kontekste mes neaptikome greito 3 ir 7 kaspazių aktyvavimo, kaip būtų galima tikėtis apoptozės atveju. Apibūdintas streptolizino O transfekuotų ląstelių poveikis. Tik HCT116 ląstelėse buvo aptiktas uždelstas (48 val. Po transfekcijos) 3 ir 7 kapazių išsiskyrimas. Tai galima priskirti prie vėlyvo išsilaisvinusio CPE poveikio neperkeltoms HCT116 ląstelėms, esant pašaliniam poveikiui. Duomenys labiau rodo nekrozės sukėlimą po CPE geno perdavimo. Tai palaiko dėl LDH išskiriamų CPE tarpininkaujamų porų susidarymas, aneksino-V trūkumas, tačiau didelis PI teigiamų ląstelių procentas ir nekrozinių ląstelių morfologijų atsiradimas (5 pav.), Pvz., Membranos plyšimas ir tuščių ląstelių liekanų su piknotiniais branduoliais atsiradimas. 44, 45 Tai, kad nėra kaspazės 1 aktyvacijos, atmeta piroptozę kaip galimą mirties kelią, kuris dažnai susijęs su membranos skilimu. 46 Kitose ataskaitose, susijusiose su mažos CPE dozės išoriniu pritaikymu, buvo įrodyta apoptozės indukcija, tuo tarpu gaubtinės žarnos karcinomos ląstelėse buvo aprašyta CPE onkozė ar nekrozė esant didelėms dozėms. 47 Mūsų in vitro ir in vivo eksperimentai patvirtina, kad ląstelių CPE kaupimasis po transfekcijos sukelia nekrozę. Kiti in vivo išorinio terapinio rekombinantinio CPE taikymo tyrimai taip pat pranešė apie stiprią naviko audinių nekrozę. 33, 35, 36, 37

Apibendrinant, mes pranešame apie sėkmingą į naviką nukreiptą CPE genų terapiją in vitro ir in vivo . Šis metodas efektyviai išnaikina navikines ląsteles ir suteikia patrauklų terapinį variantą, galintį vietiniu būdu gydyti ugniai atsparius kietus navikus (įskaitant neišmatuojamus naviko pakitimus, likusius navikus ar pasikartojimus), atsirandančius dėl storosios žarnos, pieno, kasos ar prostatos vėžio, kurie per daug parodo claudin-3. arba -4. Tai gali būti ypač vertinga, jei numatoma klinikinė naviko ligos lokali kontrolė naudojant ne virusinę ar virusinę genų terapiją, nes daugybė klinikinių tyrimų parodė vietinio vėžio genų terapijos pritaikomumą ir veiksmingumą. 48, 49

medžiagos ir metodai

Ląstelių auginimas

Žmogaus HCT116 storosios žarnos, MCF-7 pieno liaukos karcinomos, Panc-1 kasos karcinomos ir SKMel-5 melanomos ląstelių linijos buvo užaugintos RPMI (PAA, Kelbė, Vokietija), 10% FCS (Biochrom, Berlynas, Vokietija) 37 ° C temperatūroje. 5% CO 2 . Ląstelių linijų tapatumas buvo patvirtintas atliekant STR DNR tipą (DMSZ, Braunšveigas, Vokietija).

CPE ekspresuojančių vektorių generavimas

990 bp CPE cDNR buvo PGR amplifikuota iš Clostridium perfringens DNR (maloniai parūpinta MR Popoff, Pasteur institutas, Paryžius) ir klonuota į pCpG-mcsG2 ekspresijos vektoriaus Stu I / Bgl II vietas (Invivogen, San Diegas, CA, JAV), todėl gaunamas laukinio tipo CPE (wtCPE) ekspresuojantis konstruktas pCpG-wtCPE. Humanizuotam transliavimui CPE cDNR buvo kodono optCPE (Entelechon GmbH, Regensburgas, Vokietija) ir klonuotas į pCpG-mcsG2 vektoriaus Stu I / Bgl II vietas, gavus pCpG-optCPE konstrukciją. Abiejose konstrukcijose prie CPE cDNR buvo pridėta humanizuota Kozako sutarimo seka.

Žmogaus naviko ląstelių linijų transfekcija

Transfekcijai 4 × 105 ląstelės buvo pasėtos į 6 šulinėlių plokšteles ir perpiltos 2 μg atitinkamos plazmidės DNR, naudojant Fugene HD, kaip rekomendavo gamintojas (Roche Diagnostics, Manheimas, Vokietija). Kiekvienos ląstelių linijos transfekcijos efektyvumas buvo nustatytas žaliai fluorescencinius baltymus ekspresuojančios plazmidės pEGFP-N1 (Clontech, Mountain View, CA, JAV) transfekavimu ir analize naudojant FACScalibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, JAV) 48 val. transfekcija. Žaliavai fluorescencinius baltymus ekspresuojančių ląstelių skaičius buvo išmatuotas per tris nepriklausomus eksperimentus ir buvo nurodytas kaip% žaliųjų fluorescencinių baltymų teigiamų ląstelių% (1 lentelė).

Norėdami sugeneruoti wtCldn3 ir mutCldn3 ekspresuojančius SKMel-5 ląstelių klonus kaip neekspresuojančių laukinio tipo SKMel-5 ląstelių ekvivalentą, pelių wtCldn3 ekspresuojantis vektorius pECFP-N1cld3 ir mutCldn3 ekspresuojantis vektorius pECFP-N1cld3mut buvo pernešti. 50 Anksčiau buvo įrodyta, kad wtCldn3 turi stiprią homologiją su žmogaus claudin-3 ir specifiškai suriša CPE, tuo tarpu mutCldn3 variantas turi mutaciją antroje tarpląstelinėje kilpoje (Asn148: N148D; Leu150: L150A), kuris neleidžia prisijungti CPE. „MutCldn3“ ekspresuojantis klonas tarnavo kaip papildoma kontrolė, siekiant toliau palaikyti toksiškumo specifiškumą po CPE geno perdavimo. Stabiliai ekspresyvūs ląstelių klonai buvo atrinkti G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA, JAV) turinčioje terpėje. Klaudino-3 ekspresija buvo patikrinta Western blot metodu, o klonai buvo naudojami tolesniems eksperimentams.

Kiekybinis realaus laiko RT-PGR

Visa RNR iš ląstelių buvo išskirta naudojant Trizol (Invitrogen) ir atvirkščiai transkribuota. Kiekvienas realaus laiko PGR buvo atliktas naudojant „LightCycler480“ („Roche Diagnostics“). Buvo naudojami šie pradmenys: claudin-3: į priekį 5′-CTGCTCTGCTGCTCGTGTCC-3 ′; atvirkštinė 5′-TTAGACGTAGTCCTTGCGGTCGTAG-3 ′; claudin-4: į priekį 5′-CCTCTGCCAGACCCATATAA-3 ′; atvirkštinė 5′-CACCGTGAGTCAGGAGATAA-3 ′; wtCPE: į priekį 5′-GAAATCCTTGATTTAGCTGCTGC-3 ′; atvirkštinė 5′-AAGCTTTTGAGTCCAAGG GTATG-3 ′ ir „optCPE“: priekinė 5′-GCTAAGGAGGTGTTCCTCAT-3 ′; atvirkštinė 5′-GTGGCGTAGACCTTGTAGTA-3 ′. Normalizavimas atliktas naudojant namų ūkio geną gliukozės-6-fosfato dehidrogenazę, naudojant hG6PDH Roche rinkinį.

Vakarų botas

Atliekant „Western blot“ analizę, 25 μg ląstelių lizatų arba audinių kriosekcijų baltymai buvo elektroforezuojami 10% išankstinio paruošimo NuPAGE-gelių (Invitrogen), 1 valandą esant 200 V, pernešti į nitroceliuliozės membranas (Hybond-C Extra, Amersham, Freiburg, Vokietija). pusiau tirpimas („BioRad“, Miunchenas, Vokietija) esant 20 V, 1 val. Filtrai buvo blokuojami 1 val. Kambario temperatūroje (RT) TBS (50 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7, 5, 5% sauso pieno be riebalų) ir plaunami TBST (0, 05% Tween20 TBS), 10 min. RT. Triušio anti-CPE antikūnas (1: 5000, Biogenesis, Poole, UK), triušio anti-claudin-3 antikūnas (1: 2000, Abcam, Cambridge, UK), triušio anti-claudin-4 antikūnas (1: 2000, Abcam). arba pelės monokloninis anti-β-tubulino-IgM antikūnas (1: 500; BD Pharmingen, Heidelbergas, Vokietija) pridedamas per naktį 4 ° C temperatūroje ir plaunamas TBST. Antrinis antikūnas HRP pažymėtas anti-triušio-IgG antikūnas (1:10 000, Promega, Madison, WI, JAV) arba ožkos anti-pelės IgM antikūnas (1: 5000, Sigma, Taufkirchen, Vokietija) buvo pridėtas 1 val., RT. Filtrai buvo plaunami TBST ir aptikimas buvo atliktas naudojant ECL tirpalą (Amersham) ir veikiami „Kodak X-Omat AR“ plėvele (Kodak, Štutgartas, Vokietija).

Imunofluorescencija ir imunohistochemija

Imunofluorescencijai nustatyti 5 × 104 ląstelės buvo pasėtos į 4 šulinėlių kameros stiklelius („Thermo Fisher“, Ročesteris, NY, JAV). Kitą dieną optCPE buvo transfekuotas, kaip aprašyta. Ląstelės buvo plaunamos fosfatu buferiniu druskos tirpalu (PBS), fiksuotos 15 min 0, 04% gliutaraldehide, 10 min permeabilizuotos 0, 5% Triton X-100 PBS ir 1 min užblokuotos 5% galvijų serumo albuminu PBS tirpale. Triušio anti-CPE antikūnas (1: 1000, biogenezė) pridedamas 3 valandas, RT, ir ląstelės plaunamos TBST. Kaip antrinis antikūnas buvo pridėtas „Alexa 488“ pažymėtas anti-triušis-IgG (1: 1500, Invitrogen) 1 valandą kambario temperatūroje. Citoplazmos dažymui buvo naudojamas Alexa 555 (Invitrogen) ir branduolių dažymas DAPI (Sigma). Ląstelės buvo įvertintos Zeiss AxioObserver.Z1 fluorescenciniu mikroskopu (Zeiss, Jena, Vokietija).

Imunohistochemijos tikslais naviko 7 μm dydžio kristalizacijos buvo fiksuotos 15 min 0, 04% glutaraldehide, plaunamos PBS kambario temperatūroje, 20 min užblokuojamos 1% H 2 O 2, plaunamos PBS, permeabiliuotos 5% Triton X-100 tirpalu PBS 10 min. RT. Triušio anti-CPE antikūnas (1: 2000, Biogenezė) buvo dedamas 2 valandas, RT, ir dalys buvo plaunamos PBS 5 minutes. 1 valandą pridedama HRP pažymėto ožkų anti-triušio antikūno (1: 500, Abcam), RT, kristalinės reakcijos plaunamos PBS, inkubuojamos su diamino-benzidinu, 2 min. Kambario temperatūroje, plaunamos, palaikomos 1 min., Palaikomos hemalumu (Roth)., Karlsrūhė, Vokietija), išplautas vandenyje, uždengtas glicerilu (DAKO, Hamburgas, Vokietija) ir įvertintas šviesos mikroskopu (Zeiss).

Alamar-blue citotoksiškumo tyrimas

Tiriant keturių ląstelių linijų jautrumą rekombinantiniam CPE (R-Biopharm, Darmštatas, Vokietija), 5 × 10 3 ląstelės buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokšteles, o po 24 valandų toksinas buvo pridėtas skirtingomis koncentracijomis (0, 05, 0, 1, 0, 15, 0, 2 ir 0, 25 μg CPE / ml, kas prilygsta 1, 4, 2, 83, 4, 24, 5, 66 ir 7, 0 n M CPE) 72 valandas. Norint nustatyti CPE geno perdavimo citotoksiškumą, 1x105 ląstelės iš visų keturių naviko ląstelių linijų buvo transfekuotos 24 šulinėlių plokštelėse, naudojant 2 μg DNR ir Fugene HD, kaip rekomendavo gamintojas (Roche Diagnostics). Kaip kontrolė buvo naudojamos neperkeltos ir vektorių perneštos atitinkamos ląstelių linijos ląstelės.

Abiejuose parametruose po 72 valandų buvo pridėta Alamar-blue („Serotech“, Diuseldorfas, Vokietija) ir adsorbcija buvo matuojama trimis egzemplioriais mikrotekinių plokštelių skaitytuve (Tecan, Crailsheim, Vokietija), esant 620/560 nM. Reikšmės išreikštos neapdorotų kontrolinių medžiagų procentine dalimi.

MTT citotoksiškumo tyrimas

CPE turintys arba kontroliniai supernatantai buvo surinkti 48 valandas po transfekcijos. Ištirtų HCT116 arba MCF-7 ląstelių atpalaiduoto CPE biologiniam aktyvumui patikrinti buvo atliktas MTT citotoksiškumo tyrimas. For this, 5 × 10 3 non-transfected HCT116 or MCF-7 cells were seeded into 96-well plates. After 24 h, 50 μl of supernatants from optCPE or vector (controls)-transfected HCT116 or MCF-7 cells was added to the respective non-transfected cells and incubated for 72 h. MTT (3-(4, 5-dimethylthiazyol-2yl)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide (Sigma, 5 mg ml −1 ) was added and absorbance was measured in triplicates at 560 nm in a microplate reader (Tecan). Values are expressed as percentage of untreated controls.

CPE-specific ELISA

To quantify CPE in the supernatants 24 h and 48 h after optCPE transfection of HCT116 or MCF-7 cells, CPE-specific ELISA was performed. Supernatants (100 μl) were added to the 96-well Ridascreen CPE-ELISA plates (R-Biopharm) and detection was performed as recommended by the manufacturer. Recombinant CPE was used as standard at serial dilutions (0.4 to 25 ng CPE per ml). Measurements were done in duplicates at 450 nm in a microplate reader (Tecan). Values are expressed as ng CPE per ml supernatant.

Caspase 3, 7 and caspase 1 assays

After transfection, supernatants of transfected cells were collected at indicated times (0 to 48 h), and caspase 3 and 7 activity was determined using the Apo-One kit (Promega) as recommended by the manufacturer. The caspase 1 activity was determined using the Caspase-1 color assay kit (Bio Vision, Mountain View, CA, USA) as recommended, and optical densities were measured in a microplate reader (Tecan) at 405 nm.

LDH release assay

After transfection, supernatants of transfected cells were collected at indicated times (0 to 48 h), and LDH release was determined using the Cytotoxicity detection kit (Roche Diagnostics) as recommended by the manufacturer.

FACScan analysis of apoptosis

For analysis of possible optCPE-mediated apoptosis, cells were harvested 12, 24 and 48 h after transfection and labeled using the Annexin-V fluor staining kit as recommended (Roche Diagnostics). Propidium- and Annexin-V-positive cells were quantified using the FACScalibur (Becton Dickinson).

In vivo CPE gene transfer

For establishment of subcutaneous tumors, 1 × 10 7 MCF-7 cells were inoculated into female NMRI:nu/nu mice ( n =5 animals per group) or 1 × 10 7 HCT116 cells were inoculated into female NMRI:nu/nu mice ( n =5 animals per group). All MCF-7 inoculated mice received an estradiol supplementation. At tumor size of 5 × 5 mm, intratumoral non-viral in vivo gene transfer by combined jet injection and electroporation was performed in anesthetized animals. For this, 50 μg plasmid DNA of the respective vector construct was applied by 5 jet injections (jet injector, EMS Medical Systems SA, Nyon, Switzerland) of 10 μl per injection (1 μg DNA μl −1 PBS) followed by electroporation of 5 pulses 200 V cm −1 20 ms (CUY21 EDIT; Sonidel, Dublin, Ireland). The in vivo gene transfer was performed three times at an interval of 7 days. Tumor volumes, body temperature and body weight were measured at indicated time points. Animals were killed for tumor removal and further analysis. All experiments were performed in accordance with the UKCCCR guidelines and approved by the responsible local authorities (State Office of Health and Social Affairs, Berlin, Germany). For treatment of HCT116 tumors, animals received six times intratumoral injections of 1.0 μg CPE (R-Biopharm) at 3-day intervals.

Statistinė analizė

For statistical analyses of the in vitro experiments the Student's t -test was used, and for the analyses of the in vivo experiments the non-parametric Mann–Whitney test was used. Error values for the in vitro experiments are sd and for the in vivo experiments sem