Naujas estrogeno sukeltas genas eig121 reguliuoja autofagiją ir skatina ląstelių išgyvenimą patiriant stresą | ląstelių mirtis ir liga

Naujas estrogeno sukeltas genas eig121 reguliuoja autofagiją ir skatina ląstelių išgyvenimą patiriant stresą | ląstelių mirtis ir liga

Anonim

Dalykai

  • Autofagija
  • Endometriumo vėžys
  • Genų reguliavimas
  • Lizosomos

Anotacija

Anksčiau nustatėme naują estrogeno sukeltą geną EIG121 kaip skirtingai reguliuojamą endometrioidinę ir nonendometrioidinę endometriumo karcinomą. EIG121 funkcija nebuvo žinoma. Naudodamiesi tetraciklinu indukuojama sistema, mes nustatėme, kad per didelis EIG121, bet ne LacZ ekspresija sukėlė didžiulį ląstelių augimo slopinimą. Po ląstelienos frakcionavimas ir imunofluorescencinis žymėjimas parodė, kad EIG121 yra transmembraninis baltymas, lokalizuotas plazminės membranos vėlyvuosiuose endosomų – ​​lizosomų skyriuose. Tariamo transmembraninio domeno ištrynimas panaikino membranų asociaciją. Ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja EIG121, citoplazmos vakuolės susikaupia po EIG121 indukcijos, o autofagosomų žymeklis LC3 persikelia į skyrybos, taškelio pavidalo struktūras. Elektronų mikroskopija atskleidė, kad ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja EIG121, autofagosomos buvo žymiai padidėjusios. Dėl per didelio EIG121 ekspresijos padaugėjo ląstelių, turinčių rūgščių pūslelių, ir paskatino lizosominį ilgalaikių baltymų skilimą. MCF-7 ląstelėse EIG121 ir LC3 po badavimo greitai suskaidomos lizosominiu mechanizmu. EIG121 sunaikinimas blokavo badavimo sukeltą LC3 skilimą. Pats savaime EIG121 numušimas neturėjo įtakos ląstelių išgyvenimui. Kartu su badavimo ar citotoksiniais preparatais EIG121 numušimas smarkiai padidino apoptozę. Mūsų rezultatai rodo, kad EIG121 yra susijęs su endosomų – ​​lizosomų skyriais ir gali turėti svarbų vaidmenį autofagijoje. Esant nepalankioms sąlygoms, tokioms kaip badas ir veikiant citotoksiniams agentams, EIG121 gali apsaugoti ląsteles nuo ląstelių mirties, sureguliuodamas autofagijos kelią.

Pagrindinis

Taikydami cDNR mikrotraumos atrankos metodą, anksčiau pranešėme apie naujo estrogeno sukelto geno EIG121 identifikavimą. 1 EIG121 buvo per daug ekspresuojamas endometriumo hiperplazijos ir endometrioidinio tipo endometriumo karcinomos, dviejų patologinių endometriumo proliferacijų, susijusių su nekontroliuojamu estrogeno poveikiu, metu. Priešingai, EIG121 buvo stipriai slopinamas esant gimdos papiliarinei serozinei karcinomai (UPSC) ir piktybiniam mišriam Mullerio navikui (MMMT), neendometrioidinėms endometriumo karcinomoms, kurios beveik nepriklauso nuo estrogeno poveikio ir yra susijusios su neigiamais klinikiniais rezultatais. Sutikus su mūsų pastebėjimais, kai kuriuose naujausiuose endometriumo vėžio geno ekspresijos profiliavimo tyrimuose taip pat nustatyta, kad EIG121 (KIAA1324) parodė didžiausią skirtumą genų ekspresijos lygiuose tarp endometrioidinės karcinomos ir UPSC bei MMMT. 2 Šie intriguojantys atradimai rodo, kad EIG121 vaidmuo ankstyvos stadijos endometroidinės endometriumo karcinomos vystymesi gali būti labai skirtingas, palyginti su labiau pažengusių endometrioidinių ar neendometrioidinių karcinomų progresavimu.

EIG121 ląstelių funkcija yra visiškai nežinoma, todėl veiksmingas jo vaidmens vėžio srityje tyrimas yra nepraktiškas. Naudojant BLAST paiešką, žmogaus EIG121 genas priskiriamas 1p13.1 chromosomai. Įdomu tai, kad jo raiška evoliucijos metu yra labai konservuota tarp rūšių. Žmogaus ir graužikų baltymai yra 90% identiški. Žinduolių EIG121 seka yra labai panaši į nežinomų funkcijų genų C. elegans, Xenopus , žuvyje ir vištienoje seką. Tokia homologija tarp rūšių rodo, kad EIG121 turi svarbią ląstelės funkciją. Taigi, norėdami ištirti EIG121 vaidmenį ląstelių žūtyje ir augime, panaudojome perdėtos ekspresijos ir RNR strategijas. Mūsų nuostabai, per didelis EIG121 ekspresija slopino ląstelių augimą ir sukėlė autofagiją - skilimo ir perdirbimo mechanizmą, skirtą birių citoplazminių komponentų pašalinimui ir apyvartai. Naudodami EIG121 siRNR, mes parodėme, kad EIG121 sukelta autofagija skatino ląstelių išgyvenimą po maistinių medžiagų trūkumo ir sąlyčio su citotoksiniais chemoterapiniais preparatais.

Rezultatai

Per didelis EIG121 ekspresija sukelia ląstelių augimo slopinimą ir apoptozę

Anksčiau pastebėjome, kad EIG121 buvo labai padidėjęs endometrioidinio tipo endometriumo karcinoma. Tačiau mūsų pastangos iš esmės ekspresuoti EIG121 ekspozicijoje Ishikawa (endometriumo vėžio ląstelių linijoje), 293T ląstelėse ir NIH3T3 ląstelėse nepavyko, o per didelis LacZ ekspresija tame pačiame plazmidės stubure nesudarė jokių sunkumų. Tai mums parodė, kad didelis EIG121 kiekis gali būti toksiškas ląstelėms. Todėl mes perėjome prie tetraciklinų indukuojamos sistemos ir atskirtų T-Rex-293-EIG121 ląstelių klonų, kurie EIG121 ekspresuoja skirtingais lygmenimis. Per didelis EIG121 ekspresija reikšmingai slopino ląstelių augimą, o slopinimo laipsnis priklausė nuo EIG121 ekspresijos lygio (1a pav.). A klone, kuris ekspresuoja aukščiausius EIG121 lygius, ląstelių skaičius sumažėjo daugiau kaip 75%, palyginti su ląstelėmis, kurios neišreiškė EIG121.

Image

Per didelis EIG121 ekspresija sukelia augimo slopinimą ir apoptozę. ( a ) Buvo atrinktos T-Rex-293 ląstelės, kurios, reaguodamos į gydymą tetraciklinu, ekspresuoja EIG121 skirtingais lygiais. Viršutiniame skydelyje A, U ir X klonai, išreiškiantys atitinkamai aukštą, tarpinį ir nedidelį EIG121 lygį, buvo sudėti keturiais egzemplioriais šešių šulinėlių plokštelėse ir inkubuojami su tetraciklinu arba be jo 24 arba 48 valandas. Tada ląstelės buvo tripsinuotos ir suskaičiuotos. Atkreipkite dėmesį, kad plėvelė buvo eksponuota per daug, kad būtų atskleistas X klono EIG121 signalas. ( B ) T-Rex-293-EIG121 klono U arba T-Rex-293-LacZ ląstelės buvo pasėtos trimis egzemplioriais, o tetraciklinas pridėtas 0 arba 24 valandas. Reprezentatyvus srauto citometrijos profilis parodo aneksino-V FITC dažymą x ašyje, o PI - ašyje. Apatiniame dešiniajame kvadrante (ankstyva apoptozė) ir viršutiniame dešiniajame kvadrante (vėlyvoji apoptozė) ląstelių procentas reiškia apoptozines ląsteles, o viršutinis kairysis kvadrantas žymi negyvas ląsteles. Histogramose nubraižytos trigubų vertės vidurkis ± SD; * rodo reikšmingumą esant P <0, 05, palyginti su ląstelėmis be tetraciklino indukcijos, o ** rodo reikšmingumą, kai P <0, 01

Visas dydis

Norėdami nustatyti mechanizmą, atsakingą už pastebėtą ląstelių praradimą, kurį sukelia EIG121 ekspresija, mes ištyrėme EIG121 arba LacZ perdėto ekspresijos poveikį apoptozei, atlikdami aneksino V dažytų ląstelių srauto citometrijos analizę. Kaip parodyta 1b paveiksle, net tarpiniai EIG121 ekspresijos lygiai reikšmingai padidino apoptozinių ląstelių procentą, tuo tarpu per didelis LacZ ekspresija apoptozės įtakos neturėjo.

Neterotinių ląstelių žūtis, išmatuota pagal laktato dehidrogenazės (LDH) aktyvumą, išsiskiriantį į terpę, ląstelėse, kurios ekspresuoja EIG121, nepadidėjo (duomenys nepateikti).

EIG121 yra transmembraninis baltymas, susijęs su plazmos membrana ir trans- Golgi / vėlyvųjų endosomų – ​​lizosomų skyriais

Norėdami sužinoti apie mechanizmus, kuriais grindžiamas EIG121 augimo slopinimas ir apoptozę skatinančios savybės, pirmiausia ištyrėme jo ląstelių lokalizaciją. Bioinformatikos programinė įranga numatė, kad EIG121 turėjo tariamą transmembraninį domeną tarp aminorūgščių liekanų 911 ir 931. Naudodami polikloninį antikūną prieš EIG121 C galą, nustatėme, kad MCF-7 ląstelėse EIG121 daugiausia lokalizuojasi plazmos membranoje ir citoplazmoje. perinuklearinė sritis, kurios citoplazminė lokalizacija paprastai yra poliarizuota vienoje branduolio pusėje (2a pav.). Kai kuriose ląstelėse EIG121 taip pat atrodė susijęs su citoskeleto siūlais. Po ląstelienos frakcionavimas naudojant MCF-7 ląstelių lizatus, kurie ekspresuoja santykinai aukštą endogeninio EIG121 kiekį, parodė, kad EIG121 buvo praturtintas membranos ekstrakte, bet ne branduoliniame ekstrakte ar citozolyje (2b paveikslas). Transmembraninio domeno delecijos mutanto baltymas (EIG121ΔTM) daugiausia rastas citozolyje (2b paveikslas) ir ląstelių kultūros terpėje (nerodyta), tuo tarpu laukinio tipo EIG121 ir mutantas, kurio delecija yra numanomame manozės-6-fosfato receptoriaus domene (EIG121ΔM6PR). ) vis dar buvo praturtinti membranų preparatu (neparodyta).

Image

EIG121 yra transmembraninis baltymas, susijęs su plazmos membrana ir endomembranomis. ( a ) MCF-7 ląstelės buvo užaugintos ant viršelių ir dažytos EIG121 antikūnu. Atkreipkite dėmesį į EIG121 dažymą plazmos membranoje ir perinuklearinę tarpląstelinę lokalizaciją. ( b ) Neapdorotos MCF-7 ląstelės arba Ishikawa ląstelės, transfekuotos plazmidėmis, ekspresuojančiomis laukinio tipo EIG121, arba mutantu EIG121, neturinčiu tariamo transmembraninio domeno (ΔTM), buvo auginamos 10 cm plokštelėse ir paruoštos tarpląstelinės frakcijos. Tada šios frakcijos buvo atskirtos SDS-PAGE geliu ir membrana buvo tiriama įvairiais antikūnais

Visas dydis

Dvigubo ženklinimo eksperimentai parodė, kad EIG121 iš dalies kolokalizuotas su manozės-6-fosfato receptoriais (M6PR) (vaizdai nepavaizduoti) ir TGN38, dviem trans- Golgi žymekliais, ir Rab 7 (vėlyvasis endosomų žymeklis), bet ne su endoplazminiu retikulumi (kalretikulinu). ) (vaizdai nerodomi) ir mitochondrijų žymekliai. Be to, EIG121 gerai kolocalizavosi su lizosomų žymenimis, įskaitant LAMP1, katepsiną B ir katepsiną D (3 paveikslas). Šie rezultatai rodo, kad EIG121 yra transmembraninis baltymas, susijęs su plazmos membranos / trans- Golgi / vėlyvųjų endosomų – ​​lizosomų skyriais. EIG121 lokalizacija T-Rex-293-EIG121 ląstelėse, kurios per daug ekspresuoja EIG121, yra panaši kaip endogeninio EIG121 baltymo MCF-7 ląstelėse (duomenys nepateikti).

Image

EIG121 lokalizuojasi TGN vėlyvuose endosomų – ​​lizosomų skyriuose. Dvigubas endogeninio EIG121 (žalios spalvos), kartu su Rab7, katepsino D, lizotrackerio ir mitotrackerio (raudonos spalvos) žymėjimas MCF-7 ląstelėse

Visas dydis

EIG121 sukelia citoplazminį vakuolizaciją

T-Rex-293-EIG121 ląstelės ir MDA-231-t-EIG121 ląstelės (stabilūs ląstelių klonai, gauti iš MDA-MB-231 ląstelių, kad EIG121 ekspresuotų tetraciklino indukuojamu būdu), per daug ekspresuojanti EIG121, turi dideles vakuumas. Citoplazmos vakuolės susikaupė praėjus 8 valandoms po EIG121 indukcijos (nerodyta). Iki 24 val. Visa citoplazma buvo suplakta vakuumais (4a pav.). Nors bazinėse sąlygose MDA-MB-231 ląstelėse yra keletas vakuolių, tik EIG121, bet ne LacZ ekspressija labai padidino vakuolizaciją (4a pav.). Gali būti, kad vakuolizaciją gali lemti ne pats EIG121, o vietoj to, kad atsirado per didelis ekspresija. Norėdami atmesti šią galimybę, mes transfekavome ląsteles laukinio tipo EIG121, EIG121ΔTM, EIG121ΔM6PR ir LacZ ekspresijos vektoriais. Kadangi visų šių konstrukcijų C gale yra V5 epi-tag, mes pritaikėme V5 antikūną transfekuotoms ląstelėms, kad vizualizuotume egzogeninių baltymų ekspresijos lygius. Nors visos ląstelės ekspresuoja V5 sulietus baltymus, vakuolizaciją sukėlė tik laukinio tipo EIG121 ir EIG121ΔM6PR, bet ne EIG121ΔTM ir LacZ raiška (4b paveikslas).

Image

Laukinio EIG121, bet ne EIG121ΔTM ir LacZ ekspresija sukelia citoplazminę vakuolizaciją. ( a ) T-Rex-293-EIG121 A klono ląstelės, MDA-231-t-EIG121 arba MDA-231-t-LacZ ląstelės buvo auginamos ant dangtelių, o tetraciklinas pridedamas 0 arba 26 valandas. Tada ląstelės buvo fiksuotos ir dažytos H&E. ( b ) Plazmidės, ekspresuojančios laukinio tipo EIG121-V5, EIG121ΔTM-V5, EIG121AM6PR-V5 ar LacZ-V5 sulietus baltymus, buvo perplatuojamos į Ishikawa H ląsteles, o po 48 valandų ląstelės buvo fiksuotos ir nudažytos naudojant antikūną prieš V5.

Visas dydis

EIG121 skatina autofagosomų susidarymą

Autofagija yra labai konservuotas procesas, kurio metu defektinės arba perteklinės organelės ir baltymų agregatai yra padalijami į dvigubos membranos pūsleles ir pristatomi į lizosomas suskaidyti ir perdirbti. Autofagija vaidina svarbų vaidmenį skatinant išgyvenimą maistingųjų medžiagų trūkumo metu, reguliuojant ląstelių atstatymą vystymosi ir diferenciacijos metu, užkertant kelią neurodegeneracijai ir nustatant gyvenimo trukmę. 3, 4 Kadangi citoplazminė vakuuliacija yra autofagijos požymis, o EIG121 yra išreiškiamas lizosomomis, kuriose skaidomi autofagosomų turiniai, mes hipoteze, kad EIG121 padidinta ekspresija sukelia autofagiją. Atliekant elektroninę mikroskopiją, ląstelės, kurios per daug ekspresuoja EIG121, turėjo gausų dvigubai ar daugiasluoksnę jungtį turinčių struktūrų, turinčių atpažįstamus ląstelių organelius ir elektronų tankesnes medžiagas, būdingas autofagosomoms ir autolizosomoms (5a paveikslas). Ląstelėse, indukuotose ekspresuoti LacZ, ar ne indukuotose tetraciklino, aptikta nedaug autofagosomų (duomenys nepateikti).

Image

Dėl per didelės EIG121 ekspresijos atsiranda autofagososomų formavimasis ir autofagosomų žymeklio LC3 translokacija į taškelį primenančias pūsleles. ( a ) T-Rex-293-EIG121 arba T-Rex-293-LacZ ląstelės buvo inkubuojamos su tetraciklinu arba be jo 24 valandas, fiksuojamos ir po to tiriamos elektronų mikroskopu. Atkreipkite dėmesį, kad viršutinėse plokštėse autofagomos buvo lengvai aptinkamos (strėlės), tuo tarpu ląstelėse, kurios neišreiškė EIG121 (apatinės plokštės), buvo suformuota nedaug autofagosomų. ( b ) T-Rex-293-EIG121 A klono ląstelės buvo auginamos ant dangtelių, o tetraciklinas buvo įpiltas į pusę šulinėlių 24 valandas. Tada ląstelės buvo fiksuotos ir nudažytos naudojant antikūną prieš LC3

Visas dydis

Autofagijos indukcija yra susijusi su fosfatidiletanolamino (PE) konjugacija su mikrotubuliu susijusiose baltymų lengvojoje grandinėje-3 (LC3). Konjuguotas LC3 juda į autofagosomas ir tvirtai jungiasi prie autofagosomų membranos. Taigi LC3 translokacija yra patikimas autofagijos biomarkeris. 6, 7 ląstelėse, kurios neišreiškia EIG121, LC3 buvo tolygiai pasiskirstęs citoplazmoje, tuo tarpu ląstelėse, indukuotose ekspresuoti EIG121, LC3 ekspresija vyravo skyrybos taškuose, panašiuose į autofagijos indukciją (5b pav.).

EIG121 pagerina lizosominį ilgalaikių baltymų skaidymą

Norėdami kiekybiškai įvertinti EIG121 sukeltos autofagijos mastą, išmatuojome rūgščių pūslelių organelių išsivystymą, naudodami dažymą akridino oranžine spalva, po to atlikdami srauto citometriją. Kaip ir kituose acidotropiniuose dažikliuose, raudona fluorescencija, susidaranti dažant akridino oranžinę spalvą, atspindi tik vėlesnės stadijos autofagosomas ir lizosomas; Taigi, akridino oranžinis dažymas nepakankamai įvertina autofagijos mastą. Nepaisant to, netaikant jokios tetraciklino kontrolės ar ląstelių, kurios per daug ekspresuoja LacZ, EIG121 per didelis ekspresija labai padidino ląstelių, kurios fluorescencija, procentą. EIG121 per 24 valandas padidinus ląstelių kiekį rūgščių organelių, 40% padidėjo, tuo tarpu 48 valandas po EIG121 ekspresijos ląstelių, turinčių rūgščių organelių, skaičius padidėjo 2, 5 karto (6a pav.). Kontrolės, padidinančios LacZ reikšmę, neparodė akridino oranžinių teigiamų rūgščių organelių padidėjimo (6b paveikslas).

Image

Dėl per didelio EIG121 ekspresijos padidėja rūgštinės pūslelės ir ilgaamžių baltymų skilimas. T-Rex-293-EIG121 A klono ląstelės ( a ) arba T-Rex-293-LacZ ląstelės ( b ) buvo auginamos šešių šulinėlių plokštelėse ir inkubuojamos be arba su tetraciklinu 24 arba 48 valandas. Tada ląstelės buvo inkubuojamos terpėje, kurioje yra apelsino akridino, ir buvo surinktos tripsinu, kad būtų galima analizuoti srauto citometriją. Nubraižytos ląstelių, turinčių rūgščių vezikulinių organelių, padidėjimas kelis kartus. ( c ) T-Rex-293-EIG121 A klono ląstelės buvo auginamos 12 šulinėlių plokštelėse ir inkubuojamos esant arba nesant traciklino, 8 arba 24 valandas. Tada ląstelės buvo pažymėtos terpėje, kurioje yra 14 C-valino, ir pirmiausia 3 valandas persekiojo, kad išeikvotų trumpalaikius baltymus, o po to dar 16 valandų. Ilgaamžių baltymų skilimą parodo radioaktyvumas, išleistas į terpę per pastarąsias 16 valandų (TCA tirpaus radioaktyvumo ir bendro ląstelių radioaktyvumo santykis). Kiekvienoje grupėje buvo penki pakartojimai, ir pateikti duomenys (vidurkis ± SEM) atspindi tris nepriklausomus eksperimentus

Visas dydis

Kadangi autofagosomų kiekis galiausiai suskaidomas lizosomų viduje esančiais rūgščiais fermentais, mes toliau ištyrėme, ar EIG121 per didelis ekspresija paveikė lizosomų baltymų skilimą. T-RexEIG121 ląstelės buvo indukuojamos ekspresuoti EIG121, tada ląstelių baltymai buvo žymimi 14 C 24 valandas, po to sekė 3 valandų chase ir vienos nakties chase. Pirmąjį 3 valandų persekiojimą trumpalaikiai baltymai skaidė daugiausia proteosominiu mechanizmu, o terpė, kurioje buvo radioaktyvumas, buvo išmesta. Naktį vykstant ilgesniam laikui baltymai buvo skaidomi lizosomų fermentų. Po to, kai išskiriami baltymai ir ląstelių nuosėdos buvo pašalinti iš ląstelių kultūros terpės, nusodinant trichloracto rūgštį (TCA), terpėje likęs radioaktyvumas turėtų atspindėti baltymų skaidymo aktyvumą persekiojimo laikotarpiu. EIG121 ekspresija žymiai padidino ląstelių baltymų skaidymo aktyvumą (6c pav.). Ląstelėse, kurios EIG121 ekspresuoja per 8 arba 24 valandas, ilgaamžių baltymų skaidymasis padidėjo atitinkamai 30 ir 37%.

Badavimo sukeltos autofagijos metu EIG121 ir LC3 persikelia į tas pačias pūsleles ir yra skaidomos lizosominiu mechanizmu.

Taip pat galima kontroliuoti daugelį baltymų, kurie dalyvauja autofagijos cikle tarp skirtingų ląstelių skyrių ar organelių, ir jų gausą. 3 Taigi mes ištyrėme, ar badavimas, stiprus autofagijos induktorius, paveikė EIG121 gausą ar ląstelių lokalizaciją. Autofagijos metu autofagosomų žymeklis LC3 yra konjuguotas su PE ir persikelia į autofagosomų membranas ir mažesniu mastu į autolizosomas. Sumaišius autofagosomas su lizosomomis, LC3, esančius vidinėje autofagosominėje membranoje, greitai skyla lizosomų proteazės, todėl LC3-I ir LC3-II kiekis tam tikrais laiko momentais po badavimo gali būti padidintas arba sumažintas, atsižvelgiant į skirtingas ląsteles. kontekstai ir badavimo trukmė. 8, 9 Dėl dinamiškų LC3 pokyčių autofagijos metu LC3 buvo naudojamas kaip autofagijos pakaitalas. Todėl mes taip pat ištyrėme endogeninio LC3 pokyčius po badavimo šiose ląstelėse. Kaip parodyta 7a paveiksle, per 30 minučių nuo bado tiek EIG121, tiek LC3 lygis sumažėjo 70%. Po 2 valandų bado, LC3-I (nekonjuguota forma) ir LC3-II (PE konjuguota forma) beveik visiškai išnyko, tuo tarpu EIG121 redukcija sulėtėjo po pirmųjų 30 bado minučių ir niekada nebuvo tokia išsami kaip LC3 nuostoliai. Kadangi EIG121 ir LC3 baltymai mažėjo greitai po bado, jų sumažėjimą greičiausiai lėmė baltymų skaidymas. Norėdami atskirti du pagrindinius baltymų skilimo mechanizmus, mes badavome MCF-7 ląsteles ir apdorojome jas bafilomicinu A1 (BafA1) - agentu, kuris padidina lizosomų pH ir slopina lizosomų susiliejimą, ir proteosominiu inhibitoriumi MG132. „BafA1“ visiškai blokavo bado sukeltą EIG121 ir LC3 skilimą, tuo tarpu MG132 neturėjo jokio poveikio, o tai rodo, kad abu EIG121 ir LC3 badavimo metu skaidė lizosominiu mechanizmu (7b pav.).

Image

Po badavimo EIG121 ir LC3 kolokalizuojasi ir abu skaidomi lizosominiu mechanizmu. ( a ) MCF-7 ląstelės badavo HBSS 0, 0, 5, 1, 2 ir 4 valandas. Atkreipkite dėmesį į greitą EIG121 ir LC3-I, ir LC3-II skilimą badaujant. Šis eksperimentas buvo atliktas du kartus ir kiekvieną kartą su visomis gydymo grupėmis dviem egzemplioriais. ( b ) Badavimo sukeltą EIG121 ir LC3 skaidymą blokuoja lizosomų inhibitorius BafA1. MCF-7 ląstelės buvo iš anksto apdorotos arba BafA1 (100 nM), arba MG132 (10 μM ) 30 min., Po to 2 valandas badaujamos HBSS, nepertraukiamai dalyvaujant BafA1 arba MG132. 50 arba 150 μg ląstelių lizatų buvo išskaidyta SDS-PAGE geliu ir patikrinta atitinkamai EIG121 arba LC3 antikūnais. c ) EIG121 ir LC3 imunofluorescencinis dažymas skirtingais laikotarpiais po bado. Buvo naudojamas triušio polikloninis antikūnas prieš LC3. Po badavimo atkreipkite dėmesį į išsisklaidžiusį vezikulinį EIG121 dažymą. ( d ) EIG121 ir LC3 dvigubas MCF-7 ląstelių, pažemintų 10% FBS arba badaujamų HBSS, žymėjimas 20 min. Šiame eksperimente buvo naudojamas pelių monokloninis antikūnas prieš LC3. Rodyklės rodo kolokalizuotas LC3 ir EIG121 teigiamas pūsleles

Visas dydis

Nepatyrusiose MCF-7 ląstelėse EIG121 daugiausia lokalizuojasi plazmos membranoje ir citoplazmoje perinuklearinėje srityje, poliarizuojasi vienoje branduolio pusėje (7c paveikslas). Priešingai, praėjus 30 minučių po ląstelių bado, ląstelių citoplazmoje pradėjo išsisklaidyti ryškios EIG121 teigiamos vezikulinės struktūros. Po 1 valandos bado išryškėjo didesnės EIG121 teigiamos pūslelės, tuo tarpu perinuklearinio EIG121 dažymo intensyvumas pastebimai sumažėjo. Neatmestose MCF-7 ląstelėse LC3 buvo tolygiai pasiskirstęs citoplazmoje, kartais perinuklearinėje srityje dažant didelius punkcinius dažus (7c paveikslas). Po badavimo citoplazminė LC3 dramatiškai sumažėjo, tuo tarpu didelis punkcijos dažymas neturėjo įtakos.

Rezultatai, pateikti 7a ir b paveiksluose, rodo, kad EIG121 ir LC3 po bado išgyvena tą patį likimą, būtent, lizosomų sukeltą baltymų skaidymą. Toliau nustatėme, ar šie du baltymai badaujant juda į tas pačias pūsleles. Tuo tikslu buvo gautas skirtingas pelių sugeneruotas LC3 antikūnas (MBL International Corporation, Woburn, MA, JAV). Kadangi tiek EIG121, tiek LC3 buvo suirę po bado 30 min., Mes ištyrėme galimą šių dviejų kolokalalizaciją prieš 30 min. Kaip parodyta 7d paveiksle, MCF-7 neturinčiose ląstelėse EIG121 yra tankiai lokalizuotas perinukleariniame regione, tuo tarpu LC3 buvo tolygiai pasiskirstęs citoplazmoje. Po 20 minučių badavimo išsklaidytos EIG121 teigiamos pūslelės buvo stipriai kolokalizuotos su didelėmis LC3 puoštomis pūslelėmis.

EIG121 sunaikinimas pakenkia bado sukeltai autofagijai ir jautrina ląsteles ląstelių mirčiai, kurią sukelia maistinių medžiagų nepriteklius ir veikimas citotoksinėmis medžiagomis.

Norėdami nustatyti, ar EIG121 reikalingas autofagijai, mes ištyrėme EIG121 numušimo poveikį badavimo sukeltam LC3 skilimui. Dėl EIG121 numušimo EIG121 baltymo ekspresija sumažėjo maždaug 70%, ir tai buvo susijusi su badavimo sukeltu LC3 skilimu, nustatytu imunofluorescencijos (IF) (8a pav.) Ir Western blot (8b paveikslas).

Image

EIG121 numušimas kompromituoja bado sukeltą autofagiją. ( a ) EIG121 siRNR blokavo badavimo sukeltą LC3 skilimą. MCF-7 ląstelės buvo transfekuotos kontroliuojančiąja neatitinkančia siRNR arba EIG121 siRNR 72 valandas, o po to 2 valandas badaujamos HBSS. Tada ląstelės buvo fiksuotos ir nudažytos LC3. ( b ) MCF-7 ląstelės buvo transfekuotos siRNR dviem egzemplioriais ir badaujamos kaip ir A, bet ląstelių lizatai buvo surinkti ir zonduoti LC3 arba EIG121 antikūnais, naudojant Western blot. Parodytas vieno iš trijų nepriklausomų eksperimentų atstovas. Juostų tankis, palyginti su pirmąja neradusių ląstelių juosta, parodytas po blotomis. Santrumpos: ne, neperkeltos ląstelės (be siRNR); EIG, EIG121 siRNR; con, kontroliuoti netaikymą siRNR

Visas dydis

Autofagija skatina ląstelių išgyvenimą maistingųjų medžiagų trūkumo ir kitomis stresinėmis sąlygomis. 4, 10 Mes hipoteze, kad EIG121 prisideda prie tokių autofaginių apsauginių mechanizmų. Pats EIG121 sunaikinimas neturėjo įtakos ląstelių išgyvenimui (9a pav., Pirmoji eilutė), tai patvirtina panašūs TUNEL tyrimo metodai tarp kontrolinių ir EIG121 siRNR transfekuotų ląstelių. Po bado serume (9a paveikslas, vidurinė eilutė) arba paklitakseliu (9a paveikslas, apatinė eilutė), EIG121 numušimas smarkiai padidino ląstelių, kurioms atliekama apoptozė, procentą. MCF-7 ląstelėse nebuvo galima aptikti išpjaustytos kaspazės 3, tačiau suskaidytos kaspazės 7 žymiai padidėjo EIG121 siRNR transfekuotose ląstelėse. EIG121 numušimas padidino suskaidytos kaspazės 7 bazinius lygius, palyginus su netransfekuota kontrole ir nedetalizuojančia siRNR kontrole (9b paveikslas). Serumo trūkumas (48 val., 4–6 juostos), maistingų medžiagų badas (7–9 juostos) ir gydymas doksorubicinu (10–15 juostos) padidino suskaidytą kaspazę 7, tačiau EIG121 numušimas padidino šį padidėjimą. Šie rezultatai rodo, kad EIG121 išeikvojimas pakenkė ląstelių išgyvenimui esant įvairiems ląstelių stresams.

Image

EIG121 numušimas sumažina ląstelių gyvybingumą serumo trūkumo ar gydymo citotoksiniais vaistais sąlygomis. ( a ) MCF-7 ląstelės buvo transfekuotos 48 valandas nekontroliuojančia netirpstančia siRNR arba EIG121 siRNR ir 48 valandas inkubuojamos terpėje su 10% FBS arba terpe, kurioje nėra serumo, arba 16 val. apdorotos 20 nM paklitakselio (taksolio). Tada ląstelės buvo fiksuotos TUNEL dažymui. Kiekviename eksperimente apoptozinės ląstelės (tamsiai žalios spalvos) buvo išmatuotos tarp 2000 ląstelių (mėlynos spalvos), o apoptozinis indeksas buvo apskaičiuotas dalijant apoptozinių ląstelių skaičių iš visų ląstelių skaičiaus. ** rodo reikšmingumą esant P <0, 01 lygiui, palyginti su kontrolinėmis nenustatančiomis siRNR grupėmis. ( b ) MCF-7 ląstelės buvo transfekuotos kontroline netaikančia siRNR arba EIG121 siRNR 48 valandas ir po to apdorotos taip, kaip nurodyta. Ląstelės buvo sulaužytos, o EIG121, suskaidyta kaspazė 7 ir β- aktinas buvo tirti naudojant specifinius antikūnus. N, netransfekuotos ląstelės (nėra siRNR); E, EIG121 siRNR; C, kontroliuoja netaikomą siRNR

Visas dydis

Diskusija

Šiame tyrime mes parodėme, kad naujas estrogeno sukeltas genas EIG121 vaidina autofagiją ir kad ši funkcija gali skatinti ląstelių išgyvenimą, kai trūksta maistinių medžiagų ir atsiranda kitų ląstelių stresų. Po ląstelių frakcionavimas (2 paveikslas) ir konfokalinė mikroskopija (3 paveikslas) parodė, kad EIG121 yra transmembraninis baltymas, susijęs su plazmos membranos, trans- Golgi tinklo (TGN), vėlyvųjų endosomų ir lizososomų dalimis. Todėl mes labai įtarėme, kad EIG121 gali turėti įtakos ląstelių membranų prekybos procesams, kuriuose dalyvauja šie organeliai. Vienas tokių prekybos žmonėmis procesų yra autofagija. Autofagijos metu perteklinės, senos ir nereikalingos makromolekulės, įskaitant ilgaamžius baltymus ir organoles, pirmiausia apvyniojamos dvigubo sluoksnio membrana, kad susidarytų autofagosomos. Vėliau autofagosomos gauna lizosomų fermentus, susiliedamos su gabenančiomis pūslelėmis, gautomis iš TGN, arba lizosomomis. Galiausiai įsisavintos medžiagos skaidomos lizosomų fermentais, o aminorūgštys ir kitos mažos molekulės yra perdirbamos. 3, 11 Daugybė tyrimų parodė, kad TGN baltymai vaidina svarbų vaidmenį autofagijoje. Beclin-1, PtdIns 3-kinazė ir ATG9 - trys baltymai, reikalingi autofagijai, lokalizuojasi TGN pakankamai maistinių medžiagų sąlygose, tačiau badavimo sukeltos autofagijos metu jie yra perskirstomi į autofagosomas ir lizosomas. 12, 13, 14 Rab7, vėlyvasis endosomų baltymas, yra būtinas vėlyvųjų autofagosominių vakuolių brendimui. 15 Kadangi paskutinis autofagijos etapas apima autofagosomų susiliejimą su lizosomomis ir įsisavintų medžiagų skaidymą lizosomų fermentais, nėra abejonės, kad lizosomų baltymai yra svarbūs autofagijai. Tai rodo autofagijos blokada, naudojant lizosomų inhibitorius 16, 17, ir nepakankami autofaginiai atsakai į lizosomų kaupimo ligas ar lizosomų baltymų išmušimo modeliai gyvūnams. 18, 19

Badavimo metu LC3-I (citoplazminė) virsta LC3-II (sujungta su membranomis), o susiliejus autofagosomoms su lizosomomis, intraautofagosominį LC3-II greitai skaido lizosomų proteazės. Laikydamiesi šios idėjos, mes pastebėjome, kad badaujant, EIG121 buvo perskirstytas į LC3 teigiamas pūsleles ir tada LC3 ir EIG121 buvo suskaidytos (7 paveikslas). Ląstelinių LC3-I ir LC3-II kiekis tam tikru laiko momentu tam tikroje ląstelėje yra labai dinamiškas ir priklauso nuo ląstelės konteksto. Pavyzdžiui, LC3-II padidėja HEK293 ląstelėse po 2 valandų inkubacijos KRB badavimo buferyje, tuo tarpu tas pats gydymas lemia tiek LC3-I, tiek LC3-II sumažėjimą HeLa ląstelėse. 8 Dėl storosios žarnos vėžio ląstelių linijų aminorūgščių padidėja LC3 SW620 ir WiDr ląstelėse, tačiau sumažėjo LC3 SW480 ir LoVo ląstelėse. 9 Savo tyrime mes nustatėme, kad MCF-7 ląstelėse LC3-II yra dominuojanti LC3 forma ir kad badaujant, LC3 ir EIG121 greitai suyra (7a ir b paveikslai). Tačiau MDA-MB-231 ląstelėse LC3-I yra dominuojanti forma ir kad ankstyvaisiais badavimo taškais (nuo 5 iki 30 min.) LC3-II padidėja, o užsitęsęs badas (nuo 30 min. Iki 2 val.) Lemia gilų irimą. LC3 (duomenys nepateikti). Manome, kad LC3 ir EIG121 skilimas įvyko lizosomose, nes BafA1, agentas, kuris padidina lizosomų pH ir slopina susiliejimą su lizosomomis, 16 visiškai panaikino bado sukeltą EIG121 ir LC3 skilimą (7b pav.). Kadangi LC3 yra pripažintas autofagijos biologiniu žymeniu, čia pateikti rezultatai rodo, kad EIG121 turi reikšmės autofagijai, kurią sukelia badas ir gydymas citotoksiniais vaistais. Tačiau tiksli EIG121 funkcija autofagijoje ir mechanizmas, kuriuo grindžiama ši funkcija, vis dar nėra aiškūs ir turėtų būti pagrindinis dėmesys ateityje.

Pirmiausia EIG121 apibūdinome kaip estrogeno sukeltą geną, kuris buvo per daug ekspresuojamas esant nuo estrogenų priklausomai endometriumo endometrioidinei adenokarcinomai, bet ne nuo estrogenų nepriklausomai nonendometrioidinei endometriumo karcinomai. 1 Autofagijos vaidmuo vėžyje išlieka ginčytinas. Viena vertus, įvairių vėžio formų atvejais nustatytas autofaginių genų, tokių kaip beclin-1, trūkumas, o pelėms, turinčioms beclin-1 haploinfektyvumą, labiau būdinga navikogenezė. Naviko slopintuvai, tokie kaip p53, gali teigiamai reguliuoti autofagiją, o onkogeninės molekulės, tokios kaip mTOR, yra neigiamos autofagijos reguliatoriai. Šie stebėjimai rodo, kad autofagija slopina navikogenezę. Kita vertus, gerai žinoma, kad autofagija skatina normalių ir navikinių ląstelių išgyvenimą tokiomis stresinėmis sąlygomis, kaip maistinių medžiagų trūkumas ir gydymas citotoksiniais vaistais, ir tokiu būdu gali palengvinti naviko vystymąsi ir atsparumą terapijai. 24, 25 Šie prieštaringi pastebėjimai rodo, kad autofagijos vaidmuo navikogenezėje gali priklausyti nuo baltymų, reguliuojančių autofagiją, ląstelių tipo ir mikroaplinkos. Kai kurie naujausi tyrimai parodė, kad normaliam ląstelių augimui reikalinga pusiausvyra autofaginiame kelyje ir kad nepakankamas ir per didelis autofagijos lygis gali slopinti išgyvenimą ir sukelti ląstelių žūtį. 4, 26 Šiame tyrime mes pastebėjome, kad per didelis EIG121 ekspresija paskatino augimą ir apoptozę (1a pav.). Vien tik EIG121 numušimas neturėjo įtakos ląstelių išgyvenimui, tačiau kartu su maistinių medžiagų trūkumu ar gydymu citotoksiniais vaistais lėmė didžiulę ląstelių mirtį (9 pav.). Šie rezultatai rodo, kad naviko ląstelės gali nepriklausyti nuo EIG121, kai yra pakankamai maistinių medžiagų, tačiau EIG121 sukelta autofagija gali skatinti laikiną ląstelių išgyvenimą stresinėmis sąlygomis. Autofaginis aktyvumas labiausiai išryškėja ankstyvų pieno liaukų navikų, kuriuose trūksta maistinių medžiagų ir deguonies, centre, nes trūksta naviko sukeltos angiogenezės. 27 Todėl gali būti, kad aukštas EIG121 lygis, kurį anksčiau stebėjome esant endometriumo hiperplazijai ir 1 laipsnio endometriumo karcinomai, prisideda prie šių ankstyvų nenormalių proliferacijų išgyvenimo, kai egzogeninių maistinių medžiagų tiekimas yra labai ribotas, sukeldamas autofagiją. Sudėtingesnių endometrioidinių ir neendometrioidinių karcinomų atvejais, kadangi masinė angiogenezė ir padidėjęs augimo faktoriaus signalas gali palaikyti naviko augimą, EIG121 nebūtina naviko išgyvenimui. Tiesą sakant, nuolatinis aukšto lygio EIG121 buvimas šiuose navikuose gali sukelti augimo sustojimą ir ląstelių mirtį, nes užsitęsusi ir per didelė autofagija prisideda prie ląstelių mirties. 28, 29 Spėjame, kad dėl per didelės autofagijos sukeltos metabolinės katastrofos EIG121 pasišalina iš pažengusių karcinomų. Dėl tos pačios priežasties mes negalėjome sukurti stabilių ląstelių, kurios konstituciškai išreikštų EIG121 aukštu lygiu.

Priežastis, kodėl MCF-7 ląstelės in vitro ir žemo laipsnio endometroidinės endometriumo karcinomos gali toleruoti palyginti aukštą EIG121 lygį, šiuo metu nėra aiški. Gali būti, kad MCF-7 ląstelės ir žemo laipsnio endometriumo navikai turi papildomų genetinių ar epigenetinių pakitimų, kurie gali antagonizuoti augimą slopinantį ir mirti sukeliantį poveikį, kurį sukelia užsitęsusi ir per didelė EIG121 ekspresija. Be to, EIG121 vaidmuo vėžyje greičiausiai priklauso nuo naviko vystymosi stadijos ir ląstelių konteksto. Pavyzdžiui, TGF- β yra naviko slopintuvas ankstyvose navikogenezės fazėse, tačiau skatina jo progresavimą vėlesnėse stadijose. 30 Net klasikinis naviko slopintuvas PTEN gali turėti naviką skatinančių savybių nustatant funkcijų padidėjimo mutacijas. 31 Todėl nenuostabu, kad EIG121 vaidmuo ankstyvojo endometrioidinio tipo endometriumo karcinomose gali būti labai skirtingas, palyginti su pažengusiais navikais ir neendometrioidinio tipo navikais.

Tai, kad EIG121 teigiamai reguliuoja estrogenai, kelia klausimą dėl estrogeno vaidmens autofagijos reguliavime ir autofagijos funkcijos audiniuose, reaguojančiuose į estrogenus. Įrodyta, kad steroidiniai hormonai, tokie kaip ekdizonas, vitaminas D ir gliukokortikoidai, stipriai sukelia autofagiją. 32, 33, 34 Iš tikrųjų, norint sunaikinti seilių liaukas, kūno riebalus ir vidurines žarnas, reikalinga ekdizono sukelta autofagija, kad būtų galima atlikti audinių pertvarkymą ir morfogenezę, kad į kirminus panašios lervos virstų suaugusiomis musėmis. 35 Taip pat nustatyta, kad selektyvūs estrogeno receptorių moduliatoriai, įskaitant tamoksifeną ir resveratrolį, sukelia autofagiją, 36, 37, o estrogeno receptorių koaktyvatorius PELP1 po gydymo resveratroliu virsta autofagosomomis. 38 Gali būti, kad estrogenai per PELP1 arba EIG121 tarpininkaujamus būdus moduliuoja gimdos endometriumo ir pieno liaukų audinių virškinamąjį aktyvumą, kad būtų galima pertvarkyti endometriumo audinius mėnesinių ciklo metu ir pieno liaukų laktaciją bei įsitraukimą.

Žodynas

UPSC

gimdos papiliarinė serozinė karcinoma

MMMT

piktybinis mišrus mullerijos navikas

TGN

trans- Golgi tinklas