Naujas il-22 vaidmuo apsaugant lėtinę mikobakterijų tuberkuliozės hn878 infekciją | gleivinės imunologija

Naujas il-22 vaidmuo apsaugant lėtinę mikobakterijų tuberkuliozės hn878 infekciją | gleivinės imunologija

Anonim

Dalykai

  • Interleukinai
  • Gleivinės imunologija
  • Signalo perdavimas
  • Tuberkuliozė

Anotacija

Maždaug 2 milijardai žmonių yra užkrėsti Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ), kasmet miršta 1, 4 milijono žmonių. Tarp Mtb infekuotų asmenų vis labiau paplitę klinikiniai izoliatai, priklausantys W-Pekino linijai, susiję su atsparumu vaistams ir sukeliantys sunkią ligos imunopatologiją gyvūnų modeliuose. Todėl nepaprastai svarbu nustatyti imuninius mechanizmus, kurie tarpininkauja apsaugai nuo greitai atsirandančių Mtb padermių, tokių kaip W-Pekino kilmė. IL-22 yra IL-10 citokinų šeimos narys, turintis ir apsauginių, ir patologinių funkcijų gleivinės paviršiuje. Kol kas bendri duomenys rodo, kad pelės, turinčios IL-22 trūkumą, nėra jautresnės aerozolinėms infekcijoms su mažiau virulentiškomis Mtb padermėmis. Taigi šiame tyrime nagrinėtas funkcinis IL-22 kelio imuniteto vaidmuo atsirandantiems Mtb izoliatams, naudojant prototipą W-Pekino giminės narį Mtb HN878. Mes parodėme, kad Mtb HN878 stimuliuoja IL-22 gamybą priklausomai nuo TLR2, o IL-22 tarpininkauja apsauginiame imunitete pelių lėtinėse Mtb HN878 infekcijos stadijose. Įdomu tai, kad epitelio ląstelėse ir makrofaguose nuo IL-22 priklausomi keliai tarpina Mtb HN878 kontrolės apsauginius mechanizmus. Taigi, mūsų rezultatai rodo naują apsauginį IL-22 vaidmenį kylančiose Mtb infekcijose.

Įvadas

Maždaug 2 milijardai žmonių yra užkrėsti Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ), kasmet miršta 1, 4 milijono žmonių. 1 Daugumai užsikrėtusiųjų išsivysto latentinė tuberkuliozė ir jie išlieka besimptomiai, nors 10% jų rizika visą gyvenimą gali virsti aktyvia plaučių TB (ATB). Tarp Mtb infekuotų asmenų vis labiau paplitusios klinikinės Mtb padermės, priklausančios W-Pekino linijai, 2, 3 yra per daug atstovaujamos vaistams atsparių izoliatų, 4, 5 ir susijusios su žmogaus imunodeficito viruso (ŽIV) infekcija žmonėms. 6 Gyvūnų modeliuose užkrėtimas Mtb HN878, W-Pekino kilmės prototipu, laikomas padidėjusio virulentiškumo laipsniu dėl padidėjusio mirtingumo ir sunkios ligos imunopatologijos. 7, 8 Todėl svarbu nustatyti imuninius mechanizmus, kurie tarpininkauja apsaugai nuo greitai atsirandančių Mtb padermių, tokių kaip tie, kurie priklauso W-Pekino Mtb linijai.

Manoma, kad imuniniai atsakai, tarpininkaujantys apsauginiame imunitete nuo Mtb infekcijų, yra gaminant proinflammatinius citokinus, tokius kaip gama interferonas (IFNγ) ir naviko nekrozės faktorius alfa (TNFα), citokinai, kurie aktyvina makrofagus, kad būtų tarpininkaujant Mtb kontrolei. 9 Tai atitinka išvadą, kad Mtb HN878 infekcija sukelia I tipo interferono atsaką 10 ir T reguliuojančias ląsteles, kurios 8 riboja apsauginius 1-ojo tipo pagalbinio T (pagal Th1) atsakus. 8 Interleukinas-17 (IL-17) yra dar vienas priešuždegiminis citokinas, turintis gerai aprašytą vaidmenį skatinant citokinus ir chemokinus, kad būtų tarpininkaujant imuninėms ląstelėms, siekiant kontroliuoti plaučių tarpląstelinius patogenus. 11 Įdomu tai, kad nors IL-17 nėra reikalingas apsauginiam imunitetui nuo mažiau virulenčių Mtb padermių, tokių kaip H37Rv, 12, 13, mes neseniai pademonstravome, kad IL-17 reikalingas apsauginiam imunitetui nuo Mtb HN878 užkrėsti. Šie rezultatai verčia abejoti, ar imuniniai parametrai, reikalingi apsaugoti imunitetą nuo atsirandančių Mtb padermių, skiriasi nuo imuninių parametrų, reikalingų apsaugai nuo mažiau virulenčių Mtb padermių.

IL-22 yra IL-10 citokinų šeimos narys, jį daugiausia gamina T ląstelės, γδ T ląstelės ir natūralios žudikės (NK) ląstelės. 15 IL-22 veikia per savo heterodimerinį receptorių kompleksą, susidedantį iš IL-22R1 ir IL-10R2 subvienetų, ir aktyvuoja signalo keitiklį ir 3 transkripcijos (STAT3) aktyvatorių. 15 Nors IL-22 receptoriai (IL-22R) pirmiausia yra ekspresuojami epitelio ląstelėse gleivinės vietose, iš 16, 17 naujų duomenų matyti, kad mieloidinės ląstelės taip pat gali reaguoti į IL-22. 18, 19 IL-22 turi dvigubą vaidmenį ir atlieka apsaugines bei patologines funkcijas gleivinėje. Pavyzdžiui, IL-22 per didelis ekspresija gali atlikti patologinį vaidmenį esant kelioms uždegiminėms ligoms ir sukelti hiperplitimą, sustiprinti uždegimo mediatorių gamybą ir patologinių efektorinių ląstelių pritraukimą. 15 Priešingai, IL-22 vaidina teigiamą vaidmenį pašalinant žalą, nes skatina epitelio atstatymą ir pagreitina ląstelių apykaitą, 20, 21, 22 ir apsaugo nuo apoptozės, sukeldamas proapoptotinius veiksnius, tokius kaip BclIII. 20 IL-22 taip pat skatina antimikrobinius baltymus, tokius kaip β-defensinas, S100A8 / A9 baltymai, lipokalinas (Lcn) ir regeneruojanti salelė-3-gama (Reg3γ), kad būtų tarpininkauja apsaugai nuo tarpląstelinių patogenų. Nepaisant gausios literatūros apie IL-22 vaidmenį gleivinės vietose 15, neaišku ir ginčytina, ar IL-22 turi apsauginį ar patologinį vaidmenį imunitete nuo Mtb . Kai kurie tyrimai rodo padidėjusią IL-22 ekspresiją ligos vietose 23 ir 24 ATB sergantiems pacientams bei TB sergantiems pacientams, kuriems atliekama imuninės rekonstitucijos uždegiminis sindromas 25, ir tai rodo patologinį IL-22 vaidmenį TB. Atvirkščiai, kiti tyrimai rodo padidėjusį IL-22 kiekį latentinės TB sergančių pacientų serume 26, o gydymas nuo tuberkuliozės sustiprina IL-22 antigenui specifinių T ląstelių atsaką pacientams, sergantiems plaučių aktyvia TB. Visai neseniai IL-22 geno ( rs2227473 ) promotoriaus regione pavienio nukleotido polimorfizmas, sukeliantis padidėjusį IL-22 gamybą ir susijęs su sumažėjusiu jautrumu TB, 28 rodo, kad IL-22 turi apsauginį vaidmenį TB. Įdomu tai, kad IL-22 gydymas Mtb užkrėstais žmogaus makrofagais in vitro sustiprino Mtb žudymą 18, 29, 30 ir koreliavo su S100A8 / 9 baltymų, Rab baltymų indukcija ir skatino fagolizosomų aktyvaciją. Taigi IL-22 vaidmuo žmogaus tuberkulioze yra ginčytinas. Kai kurie tyrimai su žmonėmis rodo patologinį vaidmenį, o kiti tyrimai rodo apsauginį IL-22 vaidmenį TB metu. Iki šiol paskelbti pelių modelio tyrimai nebuvo ypač informatyvūs, nes pelės, turinčios IL-22 trūkumą, nėra jautresnės aerozolizuotai infekcijai su mažiau virulentiškomis Mtb padermėmis, tokiomis kaip H37Rv ir Erdman. 31, 32 Taigi, šiame tyrime, kaip pavyzdį naudojant Mtb HN878, buvo nagrinėjamas IL-22 kelio funkcinis vaidmuo imunitete atsirandančioms Mtb padermėms. Mūsų duomenys rodo, kad W-Pekino izoliatas Mtb HN878 įtraukia į Toll-2 receptorių (TLR2), kad padidintų IL-22 gamybą ir tarpininkauja apsauginiame imunitete lėtinėmis Mtb HN878 infekcijos stadijomis. Įdomu tai, kad nuo IL-22 priklausomų kelių suaktyvinimas epitelio ląstelėse ir makrofaguose kartu tarpininkauja apsauginiuose mechanizmuose nuo Mtb HN878 infekcijos. IL-22 funkcijos indukuoja antimikrobinius baltymus epitelio ląstelėse, kartu sukeldamos C – C motyvo ligandą 2 (CCL2), tarpininkaujant makrofagų pritraukimui į užkrėstą plaučius lėtinės ligos metu. Be to, IL-22 taip pat gali tiesiogiai suaktyvinti makrofagus, sukeldamas TNFα gamybą ir tarpininkaudamas Mtb kontrolei. Šie rezultatai kartu parodo naują apsauginį IL-22 vaidmenį imunitete nuo kylančių Mtb infekcijų, ypač lėtinės infekcijos metu.

Rezultatai

Mtb HN878 infekcija skatina IL-22 gamybą per TLR2 priklausomą IL-1β kelią

Pelės, turinčios IL-22 trūkumą, ar IL-22 neutralizacija neturi įtakos pelių, užkrėstų mažiau virulentišku Mtb kamienu Mtb H37Rv, TB ligos patogenezei. 13 Vis dėlto neseniai nustatėme, kad imuninės apsaugos nuo Mtb HN878 reikalavimai nėra tas pats, kas po infekcijos su mažiau virulentišku Mtb H37Rv. Taigi pirmiausia mes išbandėme, ar plaučių ląstelių IL-22 gamyba po Mtb infekcijos priklauso nuo užkrėstos Mtb padermės. Kaip neseniai parodyta, 14 infekcija Mtb HN878 padidino IL-1β gamybą išaugintose pelių plaučių ląstelėse, palyginti su infekcija Mtb H37Rv (1a pav.). Mes nustatėme, kad IL-1β indukcija priklauso nuo TLR2, 14 kadangi Tlr2 - / - užkrėstos plaučių ląstelės Mtb H37Rv arba Mtb HN878 užkrečiant Tlr2 - / - in vitro nesukėlė IL-1β gamybos indukcijos (1a pav.). Kartu su padidėjusia IL-1β gamyba nustatėme, kad plaučių ląstelės, užkrėstos Mtb HN878, sąlygojo žymiai padidėjusį IL-22 baltymo kiekį, palyginti su infekcija Mtb H37Rv (1b paveikslas). Be to, Mtb infekcijos sukeltas IL-22 gamyba priklausė nuo IL-1R signalizacijos ir TLR2 kelio (1b pav.). Taigi, mūsų duomenys rodo, kad hipervirulentiška Mtb HN878 infekcija sukelia padidintą IL-1β gamybą per TLR2 mechanizmą, todėl padidėja IL-22 gamyba.

Image

Infekcija Mtb HN878 sukelia padidėjusią IL-17 gamybą per TLR2 priklausomą kelią. Plaučių ląstelės, išskirtos iš B6, Il1r - / - ir Tlr2 - / - pelių, buvo užkrėstos Mtb H37Rv (Rv) arba Mtb HN878 (HN), kai infekcijos dauginimasis (MOI) buvo 0, 1 7 dienas, o baltymų lygis ( a ) IL-1β ir ( b ) IL-22 buvo įvertinti kultūros supernatantuose atitinkamai ELISA ir luminex tyrimais. Plaučių ląstelės, išskirtos iš B6 pelių, buvo apdorotos ląstelių sienelėmis, ištrauktomis iš Mtb H37Rv (Rv) arba Mtb HN878 (HN) (kiekviena po 10 μg ml –1 ). ( C ) IL-1β ir ( d ) IL-22 baltymų lygis buvo įvertintas atitinkamai ELISA ir luminex tyrimais. Iš ATB sergančių pacientų PBMC buvo išskirti ir stimuliuoti Mtb H37Rv (Rv) arba Mtb HN878 (HN) ląstelių sienelių ekstraktais (kiekviename po 20 μg ml −1 ), o ( e ) IL-22 baltymų lygis buvo matuojamas luminex tyrimais. Klaidų juostos reiškia vidurkį ± sem n = 3–5 ( ad ). n = 17 žmonių ATB pacientams ( e ). * P 0, 05, ** P 0, 01, *** P 0.001 pagal ( a, b ) vienpusę ANOVA, ( c ir d ) Studento t testą ( e ) dvipusę dispersijos analizę. ŠD, neaptikta; IL-17, interleukinas-17; TLR, į rinkliavą panašus receptorius; UI, neužkrėsta; JT, neapdorotas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Mtb padermėms būdinga skirtinga virulentiškumo faktorių išraiška, ypač kompleksiniai lipidų komponentai bakterijų ląstelių sienelėje, kurie vaidina lemiamą vaidmenį šeimininko ir patogeno sąveikoje, prisidedant prie uždegiminių reakcijų. 7 Mtb HN878, bet ne Mtb H37Rv, turi nepažeistą pks 1–15 geną, reikalingą fenolio glikolipido (PGL), sudėtinio šakoto lipido, dalyvaujančio priimančiosios imunogeniškumo moduliavimui ir bakterijų virulentizei, sintezei. 7 Sutikdami su unikalia mikobakterijų ląstelių sienelės sudėtimi, mes nustatėme, kad pelių plaučių ląstelių gydymas Mtb HN878 ląstelių sienelių ekstraktais sąlygojo didesnį IL-1β ir IL-22 gamybą, palyginti su plaučių ląstelėmis, apdorotomis ląstelių sienelių ekstraktais, išgrynintomis iš Mtb H37Rv (1c ir d paveikslai). Svarbu tai, kad išsiaiškinome, kad iš ATB pacientų išskirti PBMC reagavo į Mtb HN878 ląstelių sienelių ekstraktų poveikį, sukeldami žymiai padidėjusį IL-22 produkcijos lygį (1e pav.), Palyginti su PBMC, stimuliuojamais iš Mtb H37Rv paruoštų ląstelių sienelių. Taigi, mūsų duomenys rodo, kad padidėjęs IL-22 indukcija pelių ląstelėse ir žmogaus PBMC iš ATB sergančių pacientų priklauso nuo poveikio Mtb HN878 ląstelių sienelėms.

IL-22 vaidina apsauginį vaidmenį lėtinėmis Mtb infekcijos stadijomis

Kadangi Mtb HN878 infekcija in vitro sukėlė daug didesnį IL-22 susidarymo lygį, tada mes įvertinome, ar reikalingas IL-22 apsaugai nuo Mtb HN878 infekcijos, naudojant aerozolinį pelės infekcijos modelį. Nors Il22 - / - pelės nebuvo jautresnės ūmiomis infekcijos fazėmis, Il22 - / - pelėms lėtinė stadija buvo didesnė bakterijų našta plaučiuose, nesvarbu, ar pelės buvo užkrėstos mažomis (100 KSV), arba vidutinėmis (500 KSV) dozėmis. Mtb HN878 (2a, b paveikslas). Padidėjęs Mtb plaučių kolonijas sudarančių vienetų (CFU) lėtinės Mtb HN878 infekcijos metu pelėms Il22 - / - metu taip pat sutapo su padidėjusiu Mtb pasklidimu blužnyje tiek esant mažoms, tiek vidutinėms infekcijos dozėms (2a, b pav.). Šie duomenys kartu rodo, kad IL-22 nebuvimas lemia padidėjusį jautrumą Mtb infekcijai lėtinėmis infekcijos stadijomis, tačiau IL-22 yra būtinas Mtb HN878 infekcijos ūmiose stadijose.

Image

IL-22 reikalingas apsaugai lėtinėmis Mtb HN878 infekcijos stadijomis. Il22 - / - ir B6 pelės buvo aerozoliu užkrėstos ( a ) ∼ 100 KSV arba ( b ) ∼ 500 KSV Mtb HN878. Bakterijų našta plaučiuose ir blužnyje buvo įvertinta plakinant po ( a, b ) praėjus 30 ir 100 dienų po užsikrėtimo (pi). Klaidų juostos reiškia vidurkį ± sd n = 5–14 pelių kiekvienam laiko taškui. * P 0, 05, ** P 0, 01, *** P 0.001 pagal ( a, b ) Studento testą. CFU, kolonijas sudarantys vienetai; IL-22, interleukinas 22.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

IL-22 signalus perduoda per IL-22R receptorių, kurį sudaro du atskiri subvienetai - IL-22R1 ir IL-10R2. Manoma, kad IL-22R daugiausia ekspresuojamas ne hematopoetinėse ląstelėse, ypač epitelio ląstelėse. 16 Vis dėlto naujausi tyrimai rodo, kad makrofagai yra atsakai į IL-22. 18, 29 Norėdami išsiaiškinti pagrindinį ląstelių tipą, reaguojantį į IL-22, ūminės ir lėtinės Mtb HN878 infekcijos metu, išanalizavome IL-22R ekspresijos Mtb HN878 infekuotų pelių plaučiuose. IL-22R ekspresija daugiausia buvo ekspresuojama epitelio ląstelėse ūmiomis Mtb HN878 infekcijos stadijomis (3a pav.). Priešingai, lėtinėmis Mtb HN878 infekcijos stadijomis, IL-22R buvo ekspresuojamas abiejose epitelio ląstelėse, ekspresuojančiose E-kadheriną (3b paveikslas, bronchas), ir įdarbintose imuninėse ląstelėse TB granulomose (3a pav., Granuloma), konkrečiai F4 / 80, ekspresuojančiose F4 / 80. makrofagai, kaupiantys TB granulomose (3b paveikslas, granuloma). Svarbu tai, kad mes nustatėme, kad žmogaus tuberkuliozėse, gautose iš aktyvių TB pacientų, IL-22R ekspresuojančiose ląstelėse daugiausia buvo CD68 ekspresuojančių makrofagų (3c paveikslas), o IL-22R + E-kadheriną ekspresuojančių epitelio ląstelių buvo mažiau ir, pageidautina, lokalizuotos plaučių epitelyje. (3d pav.). Šie duomenys kartu rodo, kad nors į ūmią Mtb infekciją reaguojančios į IL-22 ląstelės pirmiausia yra epitelio ląstelės, tiek epiteliniai, tiek kaupiantys makrofagai TB granulomose išreiškia IL-22R lėtinės pelių ir žmogaus tuberkuliozės ligos metu.

Image

Epitelio ląstelės ir makrofagai ekspresuoja IL-22R per Mtb infekciją. B6 pelės buvo aerozoliu užkrėstos ∼ 500 CFU Mtb HN878, o plaučiai buvo surinkti po ūmios (20 ir 50 pi dienų) arba lėtinės (80 ir 100 pi dienos) infekcijos stadijų ir užfiksuoti formalinu ir įterpti į parafiną (FFPE). Serijinės sekcijos iš FFPE sekcijų buvo apdorotos imunofluorescencija, naudojant antikūnus, specifinius ( a ) CD3 (raudona) ir IL-22R (žalia), ( b ) E-kadherino (raudona) arba F4 / 80 (raudona) ir IL-22R (žalia) ). ( c ) FFPE plaučių sekcijose, gautose iš aktyvių TB pacientų, buvo apdorota imunofluorescencija, naudojant antikūnus, specifinius CD68 (žalia) ir IL-22R (raudona) ir ( d ) E-kadherino (raudona) ir IL-22R (žalia). Visi pjūviai buvo padengti DAPI (mėlyna) spalva. Baltos strėlės nurodo ląsteles, kurios lokalizuoja IL-22R raišką kartu su CD68 arba E-kadherinu. n = 4–6. Originalus padidinimas a ir b, 200; c ir d, palikta 4 × 4 × 200 mozaika; c ir d, dešinėn × 200. Parodytas vienas reprezentacinis vaizdas. IL-22, interleukinas 22.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami išsiaiškinti, ar IL-22R ekspresuojančių makrofagų kaupimasis yra susijęs su Mtb kontrole ar ligos progresavimu, įvertinome IL-22R raišką TB latencijos ir TB ligos metu nežmoginiams primatams (NHP), užkrėstiems CDC1551, klinikinio Mtb kamieno. nuo tuberkuliozės protrūkio JAV. Pagal NHP modelį TB, panašiai kaip žmogaus infekcija, Mtb infekcija gali sukelti imuninę kontrolę ir nustatyti latentinę TB arba progresuoti į TB ligą. Po užkrėtimo Mtb CDC1551, mes nustatėme, kad IL-22R ekspresuojantys makrofagai daugiausia yra latentiniu būdu užkrėstų NHP nekrotinėse granulomose (4a pav.). Priešingai, IL-22R ekspresuojantis makrofagų kaupimasis buvo sumažintas ir daugiausia lokalizuotas ant ATB liga sergančių NHP nekrozinių granulomų krašto (4b paveikslas). Taip pat mes nustatėme didesnę IL-22R1 pasiuntinio RNR (mRNR) ekspresiją TB granulomose iš latentiškai užkrėstų NHP, palyginti su IL-22R1 mRNR ekspresija TB granulomose iš NHP, turinčių ATB ligą (4c paveikslas). Įdomu tai, kad nei ATB, nei latentiškai užkrėstose TB granulomose iš NHP reikšmingo IL-10R2 mRNR indukcijos neaptikta (4c paveikslas). Kartu mūsų duomenys rodo, kad į IL-22 reaguojantys makrofagai kaupiasi užsikrėtus klinikinėmis Mtb padermėmis ir gali dalyvauti imuninėje apsauginėje kontrolėje TB metu.

Image

Preferencinis IL-22 + makrofagų kaupimasis latentinės tuberkuliozės (TB) granulomose. Nežmoginiai primatai (NHP) buvo aerozoliu užkrėsti Mtb CDC1551, o plaučiai buvo surinkti iš NHP, turinčių ( a ) latentinę ir ( b ) ūmią TB. Formalinu fiksuotos ir į parafiną įterptos (FFPE) plaučių sekcijos buvo paruoštos ir nudažytos (kairėje) H&E arba imunofluorescencija, naudojant antikūnus, būdingus (viduriniajam) E-kadherinui (raudonai) ir IL-22R (žaliam) arba (dešiniajam) makrofagui ( žalia) ir IL-22R (raudona). Visi pjūviai buvo padengti DAPI (mėlyna) spalva. Baltos rodyklės rodo IL-22R lokalizaciją kartu su makrofagų ar epitelio žymenimis. Originalus padidinimas (kairiajame) H&E skydelyje yra × 100, (viduryje ir dešinėje) imunofluorescencinės plokštės × 200. ( c ) IL-22RA1 ir IL-10RA indukcija buvo matuojama realaus laiko PGR ir raukšlės indukcija latentiniu arba aktyviu būdu. parodyti užkrėsti NHP plaučiai, viršijantys kontroliniuose plaučiuose nurodytą lygį. n = 4–6. Klaidų juostos reiškia vidurkius ± sem IL, interleukiną; ND, neaptikta.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

IL-22 reikalingas Reg3γ indukcijai ir antimikobakterijų kontrolei epitelio ląstelėse

Mes nustatėme, kad tiek makrofagai, tiek epitelio ląstelės ekspresuoja IL-22R per Mtb infekciją gyvūnų modeliuose ir žmogaus TB granulomose. Taigi pirmiausia įvertinome, ar epitelio barjeras buvo sureguliuotas, nesant IL-22, lėtinės Mtb HN878 infekcijos metu. Mes pastebėjome, kad nors B6 pelių, užkrėstų mažomis ar vidutinėmis Mtb HN878 dozėmis, plaučiai lėtinėje stadijoje demonstravo gerai prižiūrimą epitelio barjerą, epitelio barjeras Il22 - / - Mtb HN878 infekuotų pelių plaučiuose buvo nekintamas ir nenutrūkstamas. (5a ir b paveikslai). Be to, mes nustatėme, kad nuo IL-22 priklausomų antimikrobinių genų, tokių kaip S100A8 ir Reg3γ, mRNR indukcija sumažėjo vidutinės dozės Il22 - / - Mtb HN878 infekuotų pelių plaučiuose, palyginti su B6 Mtb HN878 infekuotomis pelėmis. pelių, o Lcn2 mRNR raiška reikšmingai nesiskyrė (5c paveikslas). Įdomu tai, kad šie epitelio barjero vientisumo skirtumai ar sumažėjęs nuo IL-22 priklausomų antimikrobinių genų indukcija neturėjo įtakos bendram uždegimui, susijusiam su lėtiniu infekcijos reiškiniu, vartojant vidutinėmis dozėmis Il22 - / - Mtb HN878 užkrėstas peles, palyginti su uždegiminiais pokyčiais plaučiuose. B6 Mtb HN878 infekuotos pelės (5d paveikslas). Norėdami išsiaiškinti, ar IL-22 turi tiesioginį anti-mikobakterinį poveikį epitelio barjerui, ne tumorigeninę plaučių epitelio ląstelių liniją C10 apdorojome rekombinantiniu (r) IL-22 ir nustatėme, kad dėl to mRNR indukuoja antimikrobinius baltymus įskaitant Reg3γ, S100A8 baltymus ir Lcn2 (5e pav.). Be to, mes nustatėme, kad pirminis C10 ląstelių apdorojimas rIL-22 leido pagerinti Mtb HN878 kontrolę epitelio ląstelėmis (5f pav.). Atsižvelgiant į pagerintą Mtb kontrolę apdorojant rIL-22, išankstinis apdorojimas rIL-22 taip pat sumažino Mtb HN878 įsisavinimą C10 ląstelėse (5g paveikslas). Be to, mes nustatėme, kad gydymas Mtb HN878 užkrėstomis C10 ląstelėmis rReg3γ taip pat pagerino Mtb HN878 kontrolę, nors ir ne tokiu mastu kaip gydant rIL-22 (5h pav.). Šie duomenys kartu rodo, kad esant lėtinėms Mtb HN878 infekcijos stadijoms, IL-22 vaidina svarbų vaidmenį epitelio barjero struktūroje ir veikime, greičiausiai sukeldamas antimikrobines medžiagas.

Image

IL-22 reguliuoja epitelio ląstelių funkciją po užsikrėtimo Mtb HN878. Il22 - / - ir B6 pelės buvo aerozoliu užkrėstos 100 arba 500 CFU Mtb HN878, o 100 dieną pi buvo surinktos. FFPE plaučių sekcijos buvo apdorotos, kad būtų galima a ) dažyti H&E ir imunofluorescenciškai dažyti antikūnus, būdingus E-kadherinui (raudona spalva). Visi pjūviai buvo padengti DAPI (mėlyna) spalva. Apskritimai nurodo sritis, kuriose parodyti imunofluorescenciniai vaizdai. ( b ) E-kadherino kiekybinis įvertinimas iš plaučių FFPE sekcijų buvo nustatytas išmatuojant E-kadherino fluorescencijos plotą vidutinio dydžio bronchuose (<150 μm skersmens). ( c ) Reg3γ ir S100A8 mRNR indukcija buvo išmatuota RT-PGR metodu ir parodyta mRNR kartų indukcija. ( d ) Granulomatinio plaučių uždegimo procentas buvo įvertintas naudojant automatinį Zeiss mikroskopo įrankį. ( e ) C10 ląstelės buvo inkubuotos su rIL-22 (100 ng ml −1 ), o Reg3γ, S100A8 ir Lcn2 mRNR indukcija buvo išmatuota realiojo laiko PGR, parodyta raukšlės indukcija per neapdorotas ląsteles. C10 ląstelės (6 × 10 5 –9 × 10 5 ) buvo užkrėstos Mtb HN878 (infekcijos dauginimosi (MOI) iš 1) ir apdorotos f ) rIL-22 (100 ng ml −1 ) arba g ) rekombinantiniu suskaidytas Reg3γ (25 μg ml −1 ) ir bakterijų našta įvertinta praėjus 6 dienoms po užkrėtimo. n = 4–6. Klaidų juostos žymi ± sd ( h ) C10 ląstelės 48 valandas buvo iš anksto apdorotos rIL-22 (100 ng / ml) ir po to užkrėstos HN878: GFP, esant MOI 1 (5 × 105 C10 ląstelių), dar 4 valandas, ir įvertintas procentinis Mtb : GFP + įsisavinimas. * P 0, 05, ** P 0, 01, *** P 0.001 pagal ( c, d, f - h ) studento t testą. GFP, žali fluorescenciniai baltymai; NS, nereikšmingas; ŠD, neaptikta; JT, neapdorotas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

IL-22 reikalingas makrofagų įdarbinimui lėtinės Mtb HN878 infekcijos metu

Mūsų nauji duomenys rodo, kad makrofagai yra vienas iš vyraujančių verbuotų ląstelių tipų, ekspresuojančių IL-22R, lėtinės Mtb infekcijos metu gyvūnų modeliuose ir žmogaus TB granulomose. Taigi toliau nagrinėjome, ar pasikartojančių makrofagų kaupimasis paveiktas Il22 - / - Mtb HN878 infekuotomis pelėmis ūmiomis ar lėtinėmis Mtb infekcijos stadijomis. Mes nustatėme, kad po nedidelės (papildomos 1a – c paveikslo internete) arba vidutinės dozės (6a – c pav.) Mtb HN878 infekcijos, alveolinių makrofagų, monocitų ir įdarbintų makrofagų skaičius plaučiuose buvo panašus tarp pelių B6 ir Il22 - / -. esant ūmioms Mtb HN878 infekcijos stadijoms. Priešingai, atlikdami tiek mažas, tiek vidutines Mtb HN878 infekcijos dozes, mes pastebėjome sumažėjusį įdarbintų makrofagų, besikaupiančių per Il22 - / - Mtb HN878 infekuotus plaučius, skaičių, palyginti su laukinio tipo infekuotais plaučiais. Be to, lėtinėmis stadijomis alveolinių makrofagų skaičius sumažėjo užkrėstose Il22 - / - pelėse po mažos Mtb HN878 dozės infekcijos (papildomas 1a paveikslas), o monocitų sumažėjo vidutinėmis Mtb HN878 infekuotomis pelėmis (6b paveikslas). ). Neutrofilinis kaupimasis esant mažoms ar vidutinėms Mtb HN878 dozėms ūmios ir lėtinės infekcijos stadijose statistiškai nesiskyrė tarp laukinio tipo ir Il22 - / - infekuotų plaučių (6d paveikslas ir papildomas 1d paveikslas). Šie rezultatai buvo papildomai patvirtinti histologiškai, nes lėtiniu būdu užkrėstose Il22 - / - pelėse TB granulomose buvo pastebėtas sumažėjęs IL-22R + ir F4 / 80 makrofagų kaupimasis, nepriklausomai nuo to, ar pelės buvo užkrėstos mažos ar vidutinės Mtb HN878 dozės (6e paveikslas)., f). IFNy gaminančių aktyvuotų CD4 + ir CD8 + T ląstelių skaičius Il22 - / - pelėse, užkrėstose vidutinėmis Mtb HN878 dozėmis, ūminės infekcijos metu padidėja, tačiau reikšmingo skirtumo, palyginti su B6, lėtinių infekcijos stadijų metu nėra (2 papildomas paveikslas). . IL22 - / - pelių IL-17 + aktyvintų CD8 T ląstelių skaičius, priešingai, padidėjo ūminės ir lėtinės infekcijos stadijose (2 papildomas paveikslas). Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant mažas Mtb HN878 dozes, užsikrėtusias Il22 - / - pelėmis (duomenys nepateikti). Kartu mūsų duomenys rodo, kad Il22 - / - pelės, užkrėstos Mtb HN878, turi lėtinių Mtb infekcijų, įkrisdamos ir kaupdamos IL-22R ekspresuojančius makrofagus TB granulomose.

Image

IL-22 reikalingas makrofagų ir monocitų įsisavinimui lėtinėmis Mtb HN878 infekcijos stadijomis. Il22 - / - ir B6 pelės buvo aerozoliu užkrėstos ∼ 500 CFU Mtb HN878 ir plaučiai surinkti skirtingais laiko momentais. Pi Bendras ( a ) alveolinių makrofagų (AMs), b ) monocitų (Mn), c ) pasiskirstymas makrofagai (RM), ( d ) neutrofilai (Neu) buvo nustatyti srauto citometrija. e ) FFPE plaučių sekcijos buvo apdorotos siekiant nustatyti plaučių patologiją ir imunofluorescenciją, naudojant antikūnus, būdingus F4 / 80 (raudona) ir IL-22R (žalia). Visi pjūviai buvo padengti DAPI (mėlyna) spalva. Apskritimai rodo dominančią F4 / 80 + ir IL-22R + sritį granulomose. ( f ) IL22R + ląstelių kiekybinis įvertinimas plaučių sekcijose iš ( e ) buvo suskaičiuotas / 200x lauke. Klaidų juostos žymi (± sd n = penkios pelės. Atskiri reprezentatyvūs eksperimentai parodomi bent iš dviejų eksperimentų. ** P <0, 01, *** P <0, 001 pagal Studento t testą. CFU, kolonijas sudarantys vienetai; IL, interleukinas.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami nustatyti ląstelių IL-22 šaltinį po Mtb HN878 infekcijos, in vitro užkrėtėme visas plaučių ląsteles Mtb HN878 ir nustatėme, kad nors CD4 + ir CD8 + ląstelės yra pagrindiniai IL22 gamintojai (papildomas 3a paveikslas), tokios įgimtos ląstelės yra tokios. kaip natūralios žudikės (NK) ląstelės, NK T ląstelės ir TCRγδ ląstelės taip pat gamina IL-22 (papildomas 3b paveikslas). Taigi, mūsų duomenys rodo, kad tiek įgimtos, tiek adaptyvios ląstelės gali gaminti IL-22, reaguodamos į Mtb HN878 infekciją.

Toliau aptarėme, ar IL-22 gali veikti epitelio ląsteles, norėdamas sukelti chemokinus, kurie tarpininkauja makrofagų įdarbinimui į granulomas. Mes apdorojome C10 epitelio ląsteles rIL-22 ir pastebėjome, kad kartu su antimikrobinių baltymų indukcija (5e paveikslas), gydymas rIL-22 sąlygojo kelių chemokinų, įskaitant neutrofilus pritraukiančius chemokinus, tokius kaip CXCL1, CXCL5, mRNR ir baltymų lygio indukciją. ir G-CSF epitelio ląstelėse (7a, b pav.). Svarbu ir tai, kad mes nustatėme, kad gydymas C10 ląstelėmis rIL-22 sukėlė CCL2 - makrofagus, verbuojančius chemokiną TB 34 (7a, b pav.). Kartu su rIL-22 gebėjimu sukelti CCL2, mes taip pat nustatėme sumažėjusią CCL2 mRNR lokalizaciją Il22 - / - Mtb HN878 užkrėstų pelių plaučiuose, palyginti su B6 Mtb HN878 infekuotų pelių plaučiais lėtinių infekcijos stadijų metu (7c paveikslas). . Šie duomenys rodo, kad IL-22 gali veikti epitelio ląsteles, norėdamas sukelti neutrofilus ir makrofagus, pritraukiančius chemokinus. Šie radiniai atitinka sumažėjusį makrofagų įdarbinimą lėtinės infekcijos metu Mtb HN878 užkrėstomis pelėmis Il22 - / -. Tai rodo, kad IL-22 vaidmuo yra svarbus mieloidinių ląstelių įsisavinimui lėtinės tuberkuliozės metu.

Image

IL-22 aktyvina makrofagus Mtb kontrolei. Ne tumorigeninė plaučių epitelio ląstelių linija C10 buvo apdorota rIL-22 ir ( a ) chemokinų mRNR buvo nustatyta realaus laiko PGR, nustatyta raukšlių indukcija per neapdorotas ląsteles arba ( b ) baltymų lygis kultūros supernatantuose nustatytas luminex tyrimais . ( c ) Il22 - / - ir B6 pelės buvo aerozoliu užkrėstos ∼ 500 CFU Mtb HN878, o 100 dieną pi, formalinu fiksuotos, parafinu įterptos plaučių sekcijos buvo analizuojamos ISH, siekiant nustatyti CCL2 mRNR ekspresijos plaučiuose lokalizaciją. Juodos rodyklės rodo CCL2 mRNR lokalizaciją granulomose. Pradinis padidinimas, × 10. BMDM, gauti iš B6 pelių, buvo gydomi rIL-22 ir užkrėsti Mtb HN878 (infekcijos kartotinis (MOI) iš 1) ir ( d ) tarpląstelinė Mtb našta buvo nustatyta plakinant ir ( e ) baltymų lygius TNFα gamybos procentas buvo nustatytas kultūros supernatantuose ELISA metodu. n = 4–6. ( f ) B6 makrofagai buvo 48 valandas iš anksto apdoroti rIL-22 (100 ng ml −1 ) ir po to užkrėsti HN878: GFP esant 1 MOI dar 4 h, įvertintas Mtb : GFP įsisavinimo procentas. * P 0, 05, ** P 0, 01, *** P 0.001 pagal ( d, e ) dispersijos analizę į vieną pusę arba ( b, f ) studentų testą. Klaidų juostos žymi sd. Atskiri reprezentaciniai eksperimentai rodomi bent iš dviejų eksperimentų. ŠD, neaptikta; UI, neužkrėsta; JT, neapdorotas; NS, nereikšminga.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Norėdami dar labiau suprasti, ar IL-22 gali tiesiogiai modifikuoti makrofagų funkciją Mtb infekcijos metu, 18 mes tada apdorojome Mtb užkrėstus makrofagus rIL-22 ir įvertinome tarpląstelinę Mtb kontrolę. Panašiai kaip makrofagų gydymas rIFNγ, mes nustatėme, kad gydymas rIL-22 taip pat sumažino tarpląstelinę Mtb naštą makrofaguose (7d pav.). Panašiai kaip BMDM gydymas rIFNγ, pagerėjusi Mtb kontrolė rIL-22 gydytais Mtb infekuotais makrofagais sutapo su padidėjusia TNFα gamyba (7e pav.). Priešingai, gydymas rIL-22 nepadarė įtakos Mtb HN878 įsisavinimui makrofaguose (7f pav.). Šie duomenys rodo, kad IL-22 tiesiogiai skatina TNFα aktyvinti makrofagus, sustiprindamas tarpląstelinius žudymo mechanizmus, kad būtų kontroliuojamas Mtb augimas. Taigi, mūsų nauji duomenys rodo, kad IL-22 skatina chemokino gamybą epitelio ląstelėse, kad įdarbintų monocitus ir makrofagus, ir stimuliuoja į IL-22 reaguojančius makrofagus, kad tiesiogiai sukeltų TNFα makrofagų aktyvacijai ir Mtb kontrolei.

Diskusija

Šiame tyrime mes ištyrėme funkcinį IL-22 vaidmenį organizmo imuniniame atsake į infekciją, atsirandančią dėl besiformuojančio „hipervirusinio“ Mtb HN878. Skirtingai nuo infekcijos su mažiau virulentiška Mtb H37Rv infekcija, 13 mes pranešame, kad IL-22 skatina apsauginį imunitetą lėtinėmis Mtb HN878 infekcijos stadijomis. Mes parodome, kad IL-22 veikia plaučių epitelio ląsteles, kad sukeltų antimikrobinius baltymus, taip pat monocitus ir makrofagus įdarbinančius chemokinus, pavyzdžiui, CCL2, tarpininkaudamas Mtb HN878 kontrolei. Be to, mes parodome, kad IL-22R yra ekspresuojamas ant makrofagų, kurie kaupiasi plaučių TB granulomose, ir kad IL-22 gali tiesiogiai sukelti TNFα gamybą ir suaktyvinti makrofagus, kad būtų tarpininkaujama mikobakterijų kontrolei. Kartu mūsų rezultatai apibūdina funkcinį IL-22 vaidmenį tarpininkaujant apsauginiam imunitetui nuo TB, dalyvaujant epitelio ląstelėms ir makrofagams, tarpininkaujant nuo IL-22 priklausomiems apsauginiams mechanizmams TB. Taigi, mūsų rezultatai rodo, kad imuniteto poreikis kylančioms kliniškai svarbioms Mtb padermėms, tokioms kaip HN878, gali skirtis nuo tų, kurios reikalingos laboratorijoms pritaikytų Mtb padermių, tokių kaip H37Rv, kontrolei.

Palyginti su infekcija Mtb H37Rv, mūsų duomenys rodo, kad pelių plaučių ląstelių Mtb HN878 infekcija yra stipresnė sukeldama IL-1β ir IL-22 gamybą. Be to, IL-22 indukcija plaučių ląstelėse, reaguojant į Mtb HN878 infekciją, priklauso nuo IL-1R kelio, numatant Mtb HN878 padidintą IL-1β indukciją kaip kritinį žingsnį didinant abiejų IL-17 14, kaip parodyta anksčiau, ir IL-22, kaip parodyta čia. Mtb HN878 vienareikšmiškai ekspresuoja fenolinius glikolipidus (PGL), pagrindinį mikobakterijų ląstelių sienos lipidų komponentą. 7, 10, 35 Padidėjęs IL-1β ir IL-22 gamybos indukcija veikiant Mtb HN878 ląstelių sienelės komponentams pelių ir žmogaus ląstelėse, rodo, kad Mtb HN878 PGL gamyba gali būti būdas aukšto lygio indukcijai. IL-22. Taigi būsimi tyrimai, apibūdinantys molekulinę šeimininko ir patogeno sąveiką, tarpininkaujančią diferencinei IL-22 indukcijai po infekcijos su skirtingomis Mtb linijomis, bus kritiški, norint visiškai suprasti IL-22 vaidmenį TB.

The low induction of IL-22 in response to Mtb H37Rv infection in vitro , coincides with a redundant role for IL-22 in mediating protective immunity against less virulent Mtb strains. 13, 31 Accordingly, following induction of high levels of IL-22 in response to Mtb HN878 infection in vitro , we show that IL-22 plays an important role in mediating protective immunity to Mtb HN878 infection during chronic infection in mice. Interestingly, Il22 −/− mice are not more susceptible to Mtb HN878 during acute stages of Mtb HN878 infection, but show increased susceptibility during the chronic stages of infection. This is in contrast to Il17 −/− mice that show increased susceptibility during acute stages of Mtb HN878 infection. 14 Our published studies show that Il17 −/− mice have reduced CXCL13 mRNA localization in the lung, decreased formation of lymphoid containing granulomas and decreased activation of macrophages in Il17 −/− Mtb HN878 infected mice. 14 Thus, it is possible that early increased IL-17 induced in the lung is sufficient to maintain protective immunity during acute stages of Mtb HN878 infection in Il22 −/− mice. Interestingly, and in contrast to a protective role for IL-17 during early stages of Mtb HN878 infection, 14 IL-17 production in T cells during chronic infection in Il22 −/− mice does not appear to be sufficient for protective immunity. Furthermore, while we did not observe differences in overall lung inflammation in B6 and Il22 −/− Mtb -HN878 infected mice, we observed both dysregulated epithelial barrier function and decreased macrophage recruitment in chronically infected Il22 −/− mice. Interestingly, infection of epithelial cells with Mtb HN878 results in greater uptake and infection of epithelial cells, 36 suggesting that the epithelial barrier may have an important role to play in protective immunity to emerging Mtb strains. It is interesting that treatment of epithelial cells with rIL-22 can reduce uptake and control Mtb HN878 growth in epithelial cells. Similarly, treatment with Reg3γ can also reduce Mtb HN878 growth in epithelial cells, albeit not to levels induced by rIL-22 treatment. These results suggest that IL-22 dependent induction of antimicrobial peptides including Reg3γ, Lcn2 and S100A8 proteins can likely mediate direct anti-mycobacterial control at the epithelial barrier. A role for IL-22 during chronic stages of Mtb infection coincides with decreased induction of CCL2 mRNA within TB granulomas and associated reduction in recruitment of macrophages within TB granulomas. IL-22 treatment of epithelial cells also drives induction of G-CSF and chemokines associated with neutrophil responses. However, as differences in neutrophilic accumulation during chronic stages of Mtb HN878 infection in Il22 −/− and B6 mice were not dramatic, we predict that IL-17 may be playing a compensatory role in driving neutrophil responses in the Il22 −/− infected mice. It is thus likely that the major protective effects of IL-22 in vivo during chronic infection are mediated through the accumulation of newly recruited macrophages, rather than through direct anti-mycobacterial mechanisms at the epithelial barrier or neutrophil mediated control. The future availability of IL-22R deficient floxed mice that specifically lack IL-22R expression either on epithelial cells or macrophages and neutrophils will allow us to define the role of epithelial cell versus myeloid cells in IL-22-dependent immunity to TB.

IL-22R is thought to be expressed primarily on epithelial cells at mucosal sites. 16, 17 However, emerging evidence projects myeloid cells as novel responders to IL-22. 18, 19 We found that during the acute stages of Mtb HN878 infection in mice, IL-22R was primarily expressed on epithelial cells. However, during progression into chronic stages of Mtb HN878 infection in mice, we observed localization of F4/80-expressing macrophages that also expressed IL-22R within TB granulomas. Importantly, we also observed that the predominant cells expressing IL-22R within human TB granulomas and latently infected NHPs was also CD68-expressing macrophages. As NHPs infected with Mtb CDC1551, and mice infected with Mtb HN878, both exhibited accumulation of IL-22R-expressing macrophages within TB granulomas, suggesting that the IL-22R-expressing macrophage accumulation with TB granulomas is a more general response to Mtb infection with clinical strains. These data are consistent with direct IL-22-dependent induction of TNFα in macrophages, and improved intracellular Mtb control. Previous studies have also shown that IL-22 can act on Mtb -infected human macrophages to induce S100A8/A9 proteins, enhance phagolysosomal fusion and improve Mtb killing. 18, 30 Thus, IL-22 has an emerging role in activating macrophages to mediate anti-mycobacterial killing mechanisms to mediate protective immunity to TB.

Increased IL-22 expression is observed at disease sites in ATB patients, 23, 24 and accumulation of IL-22-producing T cells have been documented within TB granulomas in NHPs. 37 In addition, both innate and adaptive immune cells produce IL-22, as NK 1.1+ cells, 29, 38 CD4 + T cells 23, 26 and granulocytes 26 have all been reported to produce IL-22 during TB. This is consistent with our studies which show that both innate and adaptive cells in the lung produce IL-22 upon Mtb HN878 infection. On the basis of our results, we thus speculate that increased level of IL-22 observed in serum of latent TB patients 26 functions protectively and is able to limit disease progression. However, overexpression of IL-22 in pulmonary disease sites 23, 24 may mediate exacerbated pathology during active TB. Considering that anti-tuberculosis treatment enhances IL-22 antigen-specific T-cell responses in ATB patients, 27 it is possible that enhancing IL-22 T cell responses by vaccine strategies will benefit host immunity to control Mtb . Furthermore, as identification of a single-nucleotide polymorphism that drives increased IL-22 production in humans is associated with reduced susceptibility to TB, 28 our results together project a protective role for IL-22 in TB.

In conclusion, in the current study we demonstrate a novel role for IL-22 in mediating protective immunity to TB, especially following infection with emerging Mtb strains, specifically at the chronic stages of infection. Interestingly, IL-22-dependent pathways in both epithelial cells and macrophages together mediate protective mechanisms against Mtb HN878 infection. Together, these results project a novel protective role for IL-22 in emerging Mtb infections.

Metodai

Human tissue samples and patient diagnosis. Archival paraffin samples of human lung biopsies with diagnosis of TB were collected under a protocol approved by the Ethics Committee of the National Institute for Respiratory Diseases (INER), Mexico. Subjects were of similar socioeconomic status and unrelated to the third generation as determined by a questionnaire. TB patients had evident symptoms (weight loss >10 kg, cough, fever, night sweats for >1 month, or cervical or axillary lymphadenopathy) and chest radiographic findings consistent with recent pulmonary TB. TB was confirmed with a positive sputum acid-fast smear and culture. Fresh blood samples from ATB patients were obtained from patients recruited to the Tuberculosis Outpatient Clinic, INER, Mexico prior to anti- Mtb treatment and did not present co-morbidities such as diabetes, HIV, cancer and Chronic Obstructive Pulmonary Disease. Human peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from ATB patients were isolated by Ficoll Hypaque gradient (Lymphoprep ; Axis-Shield POC AS, Oslo, Norway ). PBMCs (2.5 × 10 6 cells per ml) were plated in 24-well plates and incubated at 37 °C in presence of cell wall extract (20 μg ml −1 ) from Mtb H37Rv or Mtb HN878. After a 4-day incubation period, cells were collected and culture supernatants were used to determinate the levels of IL-22 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Mtb infection in non-human primates (NHPs). Groups of NHPs (Indian rhesus macaques) were used in this study at the Tulane National Primate Research Centre as previously described following the recommendations of the Institutional Animal Care and Use Committee. For latently infected NHPs, NHPs were infected with a low dose of Mtb CDC1551 (200–500 CFU) by the aerosol route. 39 Mtb CDC1551 exposure was confirmed in NHPs by positive tuberculin skin test and PRIMAGAM (Prionics), a quantiferon-type IFNγ release assay specifically designed to confirm Mtb infection in NHPs. The NHPs with latency did not exhibit any clinical signs of TB, as evident from normal body temperatures and weights, chest X-rays and serum levels of acute phase proteins. 40 For pulmonary TB in NHPs, NHPs were infected with a high dose of Mtb CDC1551 via aerosol infection ( ∼ 5, 000 CFU). Mtb exposure was confirmed by positive tuberculin skin test and PRIMAGAM and the NHPs exhibited clinical signs of TB, as evident from body temperatures, weights and chest x-rays. 40 Depending on disease severity, NHPs with ATB were necropsied at different time points with the average time to euthanasia being 37 days. Latently infected NHPs were necropsied at varying time points due to experimental and ethical considerations rather than disease severity (as latently infected NHPs are otherwise normal), and the average time to necropsy was 141 days.

Pelės. C57BL/6 (B6), Il1r −/− , Tlr2 −/− on the B6 background were purchased from the Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME) and bred at Washington University in St Louis animal facility. Il22 −/− mice 16 were obtained from Dr Wenjun Ouyang and bred in-house. Experimental mice were age- and sex-matched and used between the ages of 6–8 weeks. All mice were maintained and used in accordance with the approved Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) guidelines at Washington University in St Louis.

Bacterial strains and cell wall preparations. Mtb strains H37Rv (Trudeau Institute) and HN878 (BEI Resources, and a kind gift from Dr Gilla Kaplan, PHRI) were cultured in Proskauer Beck medium containing 0.05% Tween 80 to mid-log phase and frozen in 2 ml aliquots at −80 °C. Mice were aerosol infected with approximately 100 or 500 Mtb CFU as before. 14 At given time points, organs were collected, homogenized and serial dilutions of tissue homogenates plated on 7H11 agar plates and CFU determined.

H37Rv (NR14828) or HN878 (NR14830) cell wall preparations were commercially obtained from BEI Resources, under National Institutes of Health (NIH) contract AI-75320. Mtb cultures were collected at late-log phase in glycerol-alanine-salts medium, washed with PBS pH 7.4, and subsequently inactivated by gamma irradiation. The bacilli were broken in a French Press pressure cell at 4 °C. The cell wall was isolated by centrifugation at 27, 000 × g for one hour and washed two times in PBS. The final cell wall pellet was suspended and dialyzed in 10 m M ammonium bicarbonate, quantified by BCA protein assay for protein content.

Preparation of bone marrow-derived macrophages. BMDMs were generated from the bone marrow of B6 or gene-deficient mice as described previously. 14 On day 7, adherent cells were collected and used as BMDMs which were used to perform either in vitro infection or treatment with bacterial cell wall preparations (10 μg ml −1 each, BEI Resources, obtained under National Institutes of Health (NIH) contract AI-75320).

Preparation of lung cell suspensions. Lung cell suspension was prepared from the lungs of B6 and gene deficient mice as described previously. 14 Briefly, lungs were taken and perfused with cold saline containing heparin prior to sectioning in chilled DMEM using sterile razor blades. Dissected lung tissue was then incubated in DMEM containing collagenase (0.7 mg ml −1 ; Sigma-Aldrich) and DNase (30 μg ml −1 ; Sigma-Aldrich) at 37 °C, 7.5% CO 2 for 30 min. Digested lung tissue was dispersed by passage through a 70 μm pore size nylon tissue strainer (Falcon; BD Biosciences, San Jose, CA). Single cell suspension was treated with Gey's solution to lyse any residual red blood cells and washed twice before counting.

In vitro Mtb infection. BMDMs and total lung cells were prepared as described above and plated at a density of 1 × 10 6 cells per ml and rested at 37 °C, 7.5% CO 2 overnight. Non-tumorigenic lung epithelial cell line, C10 was cultured to 100% confluence prior to infection or pretreatment with recombinant IL-22 (R&D Biosystems, Minneapolis, MN), or the cleaved form of Reg3γ. 41 A representative well was taken for counting using a haemocytometer and to calculate the multiplicity of infection (MOI). Cells were subsequently infected with Mtb HN878 at a MOI of 1 for BMDMs and C10 cells, and MOI of 0.1 for lung cells. Infected cells were cultured in antibiotic-free DMEM (with 10% fetal bovine serum) at 37 °C, 7.5% CO 2 for 6 days. Plates were then centrifuged, and culture supernatant stored at −80 °C for further analysis. The infected BMDMs were washed once with sterile PBS and lysed with 0.05% SDS, following which serial dilutions were plated on 7H11 plates and CFU determined. 14

Following a 48 h pretreatment with rIL-22 (100 ng ml −1 ), BMDMs or C10 cells were assessed for mycobacterial uptake using Mtb HN878:GFP for infection at a MOI of 1 for 4 h. After removal of the supernatants by centrifugation, single cell suspensions of infected cells were generated using.25% trypsin (Gibco) treatment for 4 min followed by equal volume of DMEM (with 10% fetal bovine serum). Suspensions were analyzed for GFP + cells against uninfected controls using the BD FACs Jazz cell sorter and post run analysis using FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Data are reported as %Mtb-GFP uptake.

Srauto citometrija. Lung cell suspensions were prepared, stained, collected and analyzed for flow cytometry as described earlier. 12 Fluorochrome-labeled antibodies specific for CD3 (500A2), CD4 (RM4–5), CB8α (53-6.7), CD44 (IM7), IFNγ (XMG1.2), IL-17 (TC11-18H10), IL-22 (1H8PWSR), CD11b (M1/70), CD11c (HL3), NK1.1 (PK136), TCRγδ (GL3) and Gr-1 (RB6-8C5), or isotype control antibodies were used in this study. Cells were collected using a Fortessa X20 Cytometer with FACS Diva software. Cell populations were gated based on their forward by side scatter characteristics and the frequency of specific cell types was calculated using FlowJo (Tree Star). Lung alveolar macrophages were gated as CD11c + CD11b , lung myeloid dendritic cells were gated on CD11c + CD11b +, neutrophils as CD11b + Gr-1 hi, recruited macrophages were annotated as CD11b + Gr-1 lo, and monocytes were gated on CD11b+ Gr1 int cells as before. 42

Lung morphometric analysis and immunofluorescence. Mouse lung lobes were processed as described previously. 12 Lung sections were stained with hematoxylin and eosin (H&E) and inflammatory features were blinded and evaluated by light microscopy. Formalin-fixed lung sections were cut, stained and performed immunofluorescence analysis was performed as described previously. 14 Regions of inflammatory accumulation were delineated with the automated tool of the Zeiss Axioplan 2 microscope (Carl Zeiss, Thornwood, NY) and average size in squared microns calculated. Sections were probed with F4/80 (MCA497GA, Serotec, Hercules, CA) to detect activated macrophages within inflammatory lesions, and goat anti-mouse E-cadherin (AF748, R&D Systems, Minneapolis, MN) to detect epithelial cells. Quantification of E-cadherin from lung FFPE sections was determined measuring the area covered by E-cadherin fluorescence in medium size bronchi (<150 μm in diameter) using the automated tool of the Zeiss Axioplan 2 microscope (Carl Zeiss). Rabbit anti-mouse IL-22Rα (ab5984, Abcam, Cambridge, MA) or rat anti-mouse IL-22Rα1 (clone 496514, R&D systems) was used to visualize IL-22R expression. Non-human primate (NHP) and human sections were probed with mouse anti-human macrophages (clone MAC387, AbD Serotec) to detect activated macrophages within inflammatory lesions, anti-human cadherin (AF648, R&D systems) to stain for epithelial cells, mouse monoclonal anti-human IL22R alpha 1 (MAB2770, R&D systems) to observe IL-22R expression or mouse monoclonal anti-human CD68/Macrosialin (clone PG-M1, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) for evaluating macrophage accumulation in infected lungs.

Real-time PCR. RNA was extracted and cDNA was generated as previously described. 12 cDNA was then amplified using TaqMan reagents on the Applied Biosystems ViiA 7 Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Foster City, CA). The log 10 fold induction of mRNA in experimental samples was calculated over expression levels in uninfected samples was determined using the ΔΔct calculation recommended by manufacturer. The primer and probe sequences for murine glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) were previously published. 14 The primer and probes for murine Reg3γ, S100A8, Lcn2, CCL2, chemokine (CXC motif) ligand 1 (CXCL1), granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) and IL-22R were purchased from Applied Biosystems.

Quantification of protein production. Mouse IL-1β ELISA set (BD Biosciences, San Jose, CA) and mouse TNFα ELISPOT pair (BD Biosciences) was used to detect IL-1β and TNFα protein levels in the supernatant samples according to the manufacturer's protocol. IL-22, G-CSF and chemokine protein levels were measured using a mouse Luminex assay (Linco/Millipore, Bedford, MA).

In situ hybridization (ISH). Paraffin embedded tissue sections were deparaffinized and prepared for performing in situ hybridization as previously described. 43 In brief, stringent in situ hybridization (50 °C with 0.1 M DTT in the hybridization mix) was performed with 35S-labeled riboprobes as previously described. 43 Tissue sections were coated with NTB emulsion (Carestream/Kodak, Rochester, NY), exposed at 10 °C for 14 days, counterstained with hematoxylin (Vector Laboratories, Burlingame, CA) and mounted with Permount (Fisher, Waltham, MA). Images were visualized using Leica DMC2900 and captured using LAS V4.5 program (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI).

Statistinė analizė. Differences between the means of two groups were analyzed using the two tailed Student's t test or between multiple groups using one- or two-way ANOVA in GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA). Differences with a P 0.05 were considered significant.

Papildoma informacija

Vaizdo failai

  1. 1.

    1 papildomas paveikslas

  2. 2.

    2 papildomas paveikslas

  3. 3.

    3 papildomas paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildomos figūros legendos

    Autoriaus įmokos

    PT, OP, JR-M., JKK and SAK designed the experiments; PT, OP, AC-L., MM-T., MAS-L., BF-J, DK and JR-M did the experiments; MS and JZ, provided human samples; PT, OP and SAK, wrote the paper; DK, TR, JZ, JKK, JFA and SAK edited the paper, and SAK, and DK provided the funding.

    PAPILDOMA MEDŽIAGA susieta su internetine šio leidinio versija adresu //www.nature.com/mi