Branduolio akumuliatorių krebinis aktyvumas yra būtinas norint pasirinkti vietą, kurioje yra kondicionuojamas nikotinas | neuropsichofarmakologija

Branduolio akumuliatorių krebinis aktyvumas yra būtinas norint pasirinkti vietą, kurioje yra kondicionuojamas nikotinas | neuropsichofarmakologija

Anonim

Anotacija

Nikotino gebėjimas pakeisti dopamino neuronų sudeginimą yra pirmas žingsnis, kuris suteikia atlygį už nikotiną, tačiau tarpląstelinių signalų perdavimo kelių, esančių paskui nikotino acetilcholino receptorius, aktyvinimas greičiausiai bus labai svarbus ilgalaikėms nikotino poveikio pasekmėms, įskaitant sąlygotą atlygį. Transkripcijos faktoriaus ciklinis AMP-atsaką elementas surišantis baltymas (CREB) yra svarbus naujo geno transkripcijai ir jo fosforilinta forma (pCREB) skatina ilgalaikius sinapsių stiprumo pokyčius. Ankstesni tyrimai parodė, kad CREB branduolio akumuliatoriai (NAc) moduliuoja kokaino ir morfino kiekį, ir jie parodė, kad nikotino sąlygota vieta (CPP) yra susijusi su NAc CREB aktyvacija. Neaišku, ar CPP sukelia CREB fosforilinimą, ar pCREB padidėjimas palaiko nikotino CPP. Dabartiniame tyrime mes ištyrėme CREB ir pCREB lygius, kai Pavlovianas kondicionavo nikotinu naujoje aplinkoje, kai nebuvo pasirinkta kamera. Dėl nikotino konteksto padidėjimo pelių NAc apvalkale padidėjo pCREB lygis, bet nebuvo pelenų NAc branduolio, kai jie buvo patalpinti į nikotino suporuotą kamerą be nikotino. Norėdami patikrinti, ar CREB aktyvumas NAc apvalkale prisideda prie užuominų sukeltų atsakų, kurie gali sukelti nikotino paieškas, mes panaudojome viruso tarpininkaujantį dominuojančio neigiamo CREB konstrukto genų pernešimą C57BL / 6J pelių NAc apvalkale ir nustatėme, kad CREB suaktyvinimas prieš treniruotę blokuoja nikotino dozę. Apibendrinant, šie tyrimai identifikuoja NAc apvalkalą kaip smegenų sritį, kurioje CREB veikla yra būtina nikotino CPP.

ĮVADAS

Nepaisant mažėjimo per pastaruosius 25 metus, daugiau nei penktadalis JAV gyventojų ir toliau rūko, ir vis daugiau tabako vartotojų yra nepertraukiamai rūkantys socialinėje aplinkoje („skaldikliai“). Tikėtina, kad aplinkos patarimai prisideda prie socialinio ir įprasto tabako vartojimo. Nikotinas, pagrindinė priklausomybę sukelianti medžiaga, esanti tabako dūmuose, stimuliuoja neuronų aktyvumą ventralinėje pagrindinėje srityje ir paskesniuose dopamino (DA) projekcijos regionuose, palaikančiuose priklausomybę (Due et al, 2002; Brody et al, 2004). Manoma, kad mezolimbinio DA išsiskyrimas yra pagrindinis narkotikų, įskaitant nikotiną, sustiprinantį poveikį (Roberts ir kt., 1980; Di Chiara ir Imperato, 1988; Corrigall ir kt., 1992; Picciotto ir kt., 1998). Visų pirma, manoma, kad DA išsiskyrimas akumuliacinių branduolių branduolyje (NAc) reguliuoja motyvaciją vartoti vaistus ir natūralų naudą (Di Chiara ir kt., 2004). Graužikų ir nežmoginių primatų tyrimai rodo, kad pakartotinai susiejus pirminį atlygį su sąlygoto stimulo (CS) žymeniu, CS funkciškai pakeičia pirminį stiprintuvą, reguliuodamas DA neuronų šaudymą (Schultz et al, 1997; Day et al, 2007). Manoma, kad priklausomiems asmenims užuominų, susijusių su pagrindiniu armatūra, pavyzdžiui, nikotinu, teikiamos naudingos savybės yra svarbesnės nei pirminio armatūros, susijusios su kompulsyviu narkotikų vartojimu (Robinson ir Berridge, 1993). Asociacinis mokymasis tarp narkotikų ir sąlygotos naudos apima amygdalą, cinguliarinę žievę, hipokampą ir NAc šerdį bei apvalkalą (Robbins ir Everitt, 2002; Robinson ir Berridge, 2003), DA projekcijos sritis, kurias rūkaliai suaktyvina nikotinu ir cigaretėmis (Due et. aldy, 2002; Brody ir kt., 2004) ir striatum, įskaitant NAc, regis, reguliuoja potraukio sukeltą potraukį (David et al, 2007; Franklin et al, 2007; McClernon et al, 2008; Volkow et al, 2008). . Graužikų tyrimai rodo, kad su nikotinu susijęs kontekstas stimuliuoja greitą ankstyvą genų aktyvaciją keliose mezolimblinėse DA projekcijos vietose (Schroeder ir kt., 2001; Schiltz ir kt., 2005), leidžia daryti prielaidą, kad neuroplastiškumas, susijęs su priklausomybe nuo nikotino, atsiranda DA molekuliniame lygmenyje. .

Genetas kandidatas, kurį NAc reguliuoja nikotino poveikis in vivo DA, yra transkripcijos faktoriaus ciklinis AMP-atsaką elementas jungiantis baltymas (CREB) (Pandey ir kt., 2001; Brunzell ir kt., 2003; Pluzarev ir Pandey, 2004; Walters ir kt.)., 2005). D1 ir D2 tipo DA receptoriai išsiskiria pagal jų atitinkamą stimuliuojantį ir slopinantį poveikį adenilil ciklazei ir vėlesniam CREB aktyvavimui fosforilinant baltymą Ser-133 (Gomperts ir kt., 2002). Nikotino vietos kondicionavimo paradigmoje, kai gyvūnams suteikiama galimybė pasirinkti vieną iš dviejų kamerų, anksčiau suporuotų su nikotinu ar fiziologiniu tirpalu, pelėms parodyta padidėjusi CREB fosforilintos formos (pCREB) išraiška NAc, kuri atitinka padidėjusį nikotino porų pasirinkimą. kamera (Walters ir kt., 2005). Šis nikotino sąlygotas vietos pasirinkimas (CPP) taip pat yra susijęs su padidėjusiu pCREB lygiu hipokampyje (Walters ir kt., 2005) - smegenų srityje, kuri yra svarbi konteksto nustatymui (Kim ir Fanselow, 1992; Phillips ir LeDoux, 1992) ir jautrus nikotino poveikiui (Levin ir kt., 2006; Kenney ir Gould, 2008). Vis dėlto nėra aišku, ar CREB fosforilinimas lemia nikotino kameros pasirinkimą CPP metu, ar gyvūnų elgesys ieškant nikotino sukelia CREB fosforilinimą. Signalizacijos pokyčiai, vykstantys prieš CPP, gali būti susiję su elgesio reakcijomis, nukreipiančiomis į atlygį. Įdomu tai, kad dėl lėtinio nikotino poveikio sumažėja NAC pCREB (Brunzell ir kt., 2003) ir kad atlygintini iškviečiamų narkotikų, tokių kaip morfinas ir kokainas, poveikį sustiprina sutrikę CREB aktyvacija NAc apvalkale. (Carlezon ir kt., 1998; Barrot ir kt., 2002). Konstitutinis, visuotinis CREB α / δ izoformų išstūmimas apsaugo nuo nikotino CPP (Walters ir kt., 2005), teigdamas, kad CREB aktyvinimas yra kritinis šiam su atlygiu susijusiam elgesiui; tačiau NAc CREB aktyvavimo funkcija nikotino CPP dar nėra nustatyta.

Norėdami išsiaiškinti CREB funkciją kondicionuojant nikotiną, pirmiausia išbandėme, ar nikotinas, ar nikotinu suporuota kamera sureguliuos bendrą CREB ar pCREB lygį hipokampo ir NAc lygyje gyvūnams, izoliuotiems nuo treniruočių kameros treniruotės metu ar 24 valandas po 3 dienų. nikotino konteksto kondicionavimas nesant nikotino. Norėdami išplėsti ankstesnius tyrimus (Brunzell ir kt., 2003; Pluzarev ir Pandey, 2004; Walters ir kt., 2005), mes suskirstėme NAc į branduolio ir apvalkalo regionus. Nikotino suplanuota kamera padidino pCREB lygį NAc apvalkale, bet ne šerdį ar hipokampą. Mes iškėlėme hipotezę, kad CREB signalizacijos pokyčiai, atsirandantys gyvūnui izoliuojant nikotino suporuotoje kameroje, priklauso nuo CS ir yra būtini nikotino CPP. Norėdami patikrinti šią hipotezę, mes panaudojome herpes simplex virusinį vektorių, norėdami išreikšti dominuojančią-neigiamą CREB formą su mutacija Ser-133 fosforilinimo vietoje (mCREB) (Carlezon ir kt., 1998) arba kontrolinį vektorių (LacZ) į NAc. apvalkalas. Pelėms buvo parodytas normalus nikotino CPP, kai buvo infuzuotas su LacZ kontroliniu vektoriu, bet mCREB apvalkalo infuzijos blokavo nikotino CPP įvairiomis dozėmis. Šie duomenys kartu rodo, kad nikotino CPP būtini su kontekstu susiję pokyčiai, susiję su CREB aktyvacija NAc apvalkale.

MEDŽIAGOS IR METODAI

Gyvūnai

Patinėliai C57BL / 6J (8–12 savaičių amžiaus) pelės buvo įsigytos iš „Jackson Laboratories“ arba išaugintos mūsų laboratorijoje. Pelės buvo laikomos kontroliuojamame vivariume (21 ± 2 ° C) 12: 12 val. Šviesos-tamsos cikle ir laikomos keturios viename narve. Maistas ir skystis buvo prieinami ad libitum . Pelės buvo įpratusios jas apdoroti mažiausiai 3 dienas prieš elgesio testus ar biocheminius tyrimus. Visus tyrimus patvirtino Jeilio universiteto gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas ir jie vadovavosi NIH laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovu .

Vaistų dozavimas ir administravimas

Pelėms, kuriose atliekamas kondicionierius, prieš pat treniruotę buvo injekuotos ip nikotino 0, 9% fiziologinio tirpalo (0, 04, 0, 065, 0, 09, 0, 175, 1, 75 mg / kg (pagal laisvosios bazės masę)) arba nešiklio.

CREB ir pCREB indukcijos tyrimai Pavlovijos konteksto kondicionavimo metu

Tiriant CREB signalizaciją Pavlovijos sąlygomis, atskiroms pelių grupėms buvo skiriamos nikotino (NIC; 0, 09 mg / kg, ip) arba fiziologinio tirpalo injekcijos (SAL) vieną kartą per parą 3 dienas prieš pat pradedant į (48 × 22 × 18 cm) treniruotę. kamera 30 min. Visų SAL gyvūnų smegenys ir dalis NIC pelių buvo surinktos 15 min. Iki trečiosios treniruotės. Praėjus maždaug 22 valandoms po trečiosios NIC treniruotės, likusių pelių (NIC rūmai) smegenys buvo surinktos 15 minučių po fiziologinio tirpalo injekcijos ir įdėjimo į nikotino suporuotą kamerą. „Med Associates“ lokomotorinis aparatas išmatavo spindulių pertraukas, kad apskaičiuotų nuvažiuotą atstumą veikdamas treniruočių kameras gyvūnų pogrupiams kiekviena iš trijų sąlygų.

Vakarų bloto analizė

Pelės smegenys buvo surinktos greitai nukenksminant, supilstytos į ledinį PBS, supjaustytos į atšaldytą matricą ir sudedamos į šviežią, atšaldytą PBS. Dorsalinis hipokampas buvo išpjaustytas, o 16c dydžio NAc šerdies ir apvalkalo štampai buvo paimti iš 1 mm smegenų sekcijų ir greitai užšaldyti sausame lede. Audiniai ir blotai buvo apdoroti, kaip aprašyta anksčiau (Brunzell ir kt., 2003). Baltymai (10 μg) buvo supilti į poliakrilamido gradiento gelį (4–20%) ir perkelti į nitroceliuliozę imuniniam nustatymui naudojant polikloninius antiserumus (Cell Signaling, JAV) į CREB (1: 1000) ir pCREB (Ser-133; 1: 500). ). Blotai buvo nuplauti ir inkubuoti 1: 1000 peroksidaze pažymėtame anti-triušio antiserume (Vektorius, JAV). NAc šerdims ir apvalkalams ECL aptikimo reagentai buvo naudojami 1 minutę, blotai buvo paveikti rentgeno plėvele ir sukurti. Lygus krovimas buvo užtikrintas dažant Ponceau, o blotai vėliau buvo inkubuojami 1: 10 000 GAPDH monokloniniame antiserume (Upstate Biotechnology) ir 1: 5000 antivirusiniame antiserume kaip apkrovos kontrolėje. Hipokampyje viename tirpale buvo inkubuojami monokloniniai pCREB (1: 500 pelėms) ir CREB (1: 1000 triušiui) (ląstelių signalizacijos) antiserumai. Buvo naudojami skirtingo bangos ilgio antriniai antikūnai su pelėmis, pažymėtais fluorescencija ir triušiais (Licor), ir buvo nuskaityti naudojant Odisėjos skenavimo sistemą ir programinę įrangą.

Nešališkas vietos kondicionavimas

Dvi kondicionavimo kameros su ištraukiamomis durimis buvo atskirtos neutralia kamera. Kambarių sienos ir grindys skyrėsi, tačiau apšvietimas buvo subalansuotas taip, kad nė vienai kamerai nebuvo suteikta pirmenybė. Laikas, praleistas kiekvienoje kameroje, buvo užfiksuotas pluošto pertraukomis ir apskaičiuotas naudojant „Med-PC IV“ programinę įrangą.

0 dieną, pradinėje pelėje, pelėms buvo įnešta nešiklio injekcija, jos buvo įdėtos į neutralią kamerą ir 15 minučių jiems buvo leista tyrinėti aparatą. Pelės, kurių kameros pakreipimas didesnis nei 75%, buvo išmestos iš tyrimų. 1–3 dienomis pelės buvo įdėtos į vieną kondicionavimo kamerą 30 minučių po transporto priemonės sušvirkštimo ryte, o po pietų buvo suleistos į priešingą kondicionavimo kamerą suleidus vaisto; tirpikliams, įšvirkštusiems į tirpiklį, buvo įšvirkštas fiziologinis tirpalas prieš dedant į bet kurią kamerą. Pelėms buvo subalansuota narkotikų poros kamera atsižvelgiant į gydymo dozę, genotipą ir pradinį pasirinkimą. 4 dieną bandymai pelėms buvo suleistos transporto priemonės, įdėtos į centrinį skyrių ir leista 15 min. Patekti į abi kondicionavimo kameras. Pradinės ir testavimo sesijos vyko tarpiniu metu tarp AM ir PM treniruočių. Buvo išmatuotas bendras laikas, praleistas kiekvienoje kameroje, ir apskaičiuoti pokyčiai, palyginti su pradiniu pasirinkimu.

HSV tarpininkaujamas genų perdavimas

HSV-mCREB arba HSV-LacZ buvo suleista į NAc apvalkalą 1 dieną po pradinio pasirinkimo įvertinimo ir 2 dienos prieš pradedant kondicionuoti vietą. Pelės buvo anestezuojamos ketamino (130 mg / kg, ip) ir ksilazino (13 mg / kg) mišiniu. Dvišalės infuzijos kaniulės buvo 1, 5 mm atstumu viena nuo kitos ir buvo 0, 5 mm ilgio, kad būtų nukreiptos į NAc apvalkalą, kai vienašališkai įstatomos 20 ° kampu, saugant viršutinę cingulinės žievės dalį ir priešingąsias struktūras. Stereotaksinis 10 mm kreipiamosios kanulės (od / id 0, 6 / 0, 45 mm) įdėjimas į NAc apvalkalą iki minimumo sumažindavo atgalinį srautą į viršutines struktūras (1, 5 mm A / P, 2, 5 mm L ir –4, 0 mm D / V, atsižvelgiant į bregmą). Anatominės kontrolės gyvūnams buvo gauta optimali nikotino dozė atlikus darnesnę HSV-mCREB infuziją (1, 5 mm A / P, 2, 25 mm L ir –3, 25 mm D / V iš dura), kad būtų galima dar labiau įsitikinti, kad mCREB elgesys sukelia infuzija į NAc apvalkalą, o ne į viršutinę struktūrą. HSV vektorius (0, 7 μl per 14 min.) Buvo infuzuotas mikroinfuzijos pompa. Kanulės buvo laikomos vietoje 5 minutes po infuzijos. Po operacijos pelės buvo laikomos po keturis narvus. Kai kurių pelių prevencinis nuskausminimas buvo naudojamas nesteroidiniu vaistu nuo uždegimo (5 mg / kg, Rimadyl); visos pelės gaudavo 64 mg vaikų acetaminofeno, drėgnam čiulpui ad libitum panaudojant sveikimą. Dauguma pelių po operacijos pasveiko per 48 valandas, be diskomforto, infekcijos ar kraujavimo požymių. Po 2 dienų pasveikimo pelėms buvo atliktas CPP mokymas tomis dienomis, kai HSV tarpininkaujama mCREB ekspresija buvo didžiausia (2–4 dienos po infuzijos), o vėliau buvo atlikti tyrimai 5 dieną (Carlezon et al, 1998; Barrot et al, 2002). ). Po elgesio procedūrų pelėms buvo sušvirkščiamos mirtinos chloralinio hidrato dozės, jos intrakardialiai perfuzuojamos su atšaldytu 4% paraformaldehidu (PFA), o smegenys buvo surenkamos ir pjaustomos, kad būtų galima patikrinti kaniulės vietą. Atskiros grupės HSV-LacZ pelių smegenys buvo surinktos praėjus 3 dienoms po infuzijos X-gal fermentiniam tyrimui.

X-Gal imunohistochemija

Pelės buvo perfuzuotos transkardialiai su šaltu PBS, po to 4% PFA 0, 1 mol / l fosfato buferiu. Smegenys buvo pašalintos, užfiksuotos 4% PFA, o po to dehidratuojamos į 30% sacharozės į PBS. Sekcijos (40 μm) buvo surinktos ant užšąlančio mikrotomo ir laikomos krioprotektoriuje –20 ° C temperatūroje. X-gal histochemijai pjūviai buvo plaunami 3x PBS, 4 valandas inkubuojami 37 ° C temperatūroje PBS tirpale, kuriame yra 3, 1 mmol / l kalio ferocianido, 1 mmol / l MgCl, 0, 01% natrio deoksicholato, 0, 02% nonideto P-40. ir 0, 2 mg / ml X-gal. β- galaktozidazės fermentinis aktyvumas buvo nutrauktas 5 minutes plaunant PBS. Skyriai buvo sudedami, nudažyti neutralia raudona spalva, dehidratuoti didinant etanolio koncentraciją ir uždengti Permount.

Statistinė analizė

Vietoje kondicionavimo buvo nustatytas reikšmingas gydymo poveikis ir genotipas, analizuojant kondicionavimo kamerą kaip tiriamojo asmens vertę (vaistas suporuotas prieš fiziologinį tirpalą suporuotas), tarp viruso tarpininkaujant transfekcijai (HSV-mCREB arba HSV-LacZ) ir vaistą nustatant tarp tiriamųjų. (pvz., NIC / VEH). Post hoc dviejų krypčių bandymai buvo atlikti visai statistikai, išskyrus tuos atvejus, kai ankstesni tyrimai numatė kryptinį atradimą, pagrindžiantį vienpusį bandymą. „Western blot“ optiniai tankiai buvo normalizuoti tirpiklio kontrolei, kad būtų galima palyginti visus blotus. Numatyti palyginimai buvo atlikti su gyvūnais, įpuršktais (SAL) ir nikotino sušvirkštais (NIC), bei tarp SAL tiriamųjų ir gyvūnų, paveiktų nikotino poroje, kurioje nėra nikotino (NIC kamera). Prieš pat smegenų surinkimą buvo įvertintas lokomotorinis aktyvumas tarp gydymo grupių (SAL, NIC ir NIC rūmai), naudojant kartotinę laiko juostą.

REZULTATAI

Nikotinu suderintas kontekstas lemia pCREB padidėjimą NAc apvalkale, nesant lokomotorinio aktyvumo pokyčių

Kad nikotino nebūtų akivaizdžiai ieškoma, NAc CREB aktyvumui aktyvuoti pakako nikotino suporuoto konteksto (1a pav.). Palyginus su fiziologiniu tirpalu sušvirkštais kontroliniais gyvūnais, kurie nebuvo veikiami nikotino, gyvūnams, fiziologiniu tirpalu sušvirkštusiems gyvūnams, paveiktiems kameroje, kur jie anksčiau buvo gavę nikotino, pastebimas reikšmingas pCREB ( p = 0, 05) lygio padidėjimas NAc apvalkalu. Nedidelis NAc apvalkalo pCREB lygio padidėjimas nikotino metu Pavloviano treniruotėse nepasiekė reikšmingumo ( p > 0, 1), o tai rodo, kad CS poveikis kontekste, o ne pirminės apdovanojimo nikotino savybės, reguliuoja šį poveikį po 3 dienų treniruočių. Nei nikotinas, nei su nikotinu susijęs kontekstas nepakeitė pCREB lygio hipokampo ar NAc šerdyje (1b ir c pav.), O gydymo sąlygos neturėjo įtakos bendram CREB lygiui NAc apvalkalo, šerdies ar hipokampo srityje ( p ' s> 0, 1).

Image

Dėl nikotino konteksto padidinimo fosforilinti cikliniai AMP-atsaką sukeliantys elementai, jungiantys baltymus (pCREB), branduolio akumuliatorių (NAc) apvalkale, bet ne NAc šerdyje ar nugariniame hipokampe. a) Palyginti su gyvūnais, kuriems treniruotės kameroje buvo švirkščiamas fiziologinis tirpalas (SAL, S; n = 12), pelėms, gavusioms nikotino (0, 09 mg / kg, ip pagal laisvosios bazės masę), nebuvo jokio gydymo poveikio pCREB lygiui. trečiąją Pavloviano treniruočių dieną (NIC, N; n = 13), tačiau po kameros, prieš tai suplanuotos su nikotinu, ekspozicija parodė NAc apvalkalui būdingą pCREB padidėjimą (NIC rūmai, NC; n = 4; p <0, 05). Bendras CREB lygis NAc apvalkale nebuvo reguliuojamas nei NIC, nei NIC suporuotų rūmų poveikio. (b, c) NIC ir NIC rūmų poveikis nei NAc šerdies, nei hipokampo CREB ar pCREB lygiui nebuvo ( p 's> 0, 1). (d) SAL, NIC ir NIC rūmų pelių grupėse lokomotorinis aktyvumas nesiskyrė per 15 minučių po injekcijos prieš pat smegenų surinkimą ( p > 0, 1). Veiklos duomenys pateikiami kaip nuvažiuotas atstumas cm per 5 minučių laiko dėžes. Visos smegenys buvo surinktos po 15 minučių po injekcijos ir įdėjimo į kamerą. Western blotting duomenys pateikiami procentais nuo SAL kontrolės duomenų. Klaidų juostos žymi SEM; * p 0, 05, palyginti su SAL gyvūnais.

Visas dydis

1d paveiksle pavaizduotas su nikotinu susijęs lokomotorinis aktyvumas trečiąją treniruočių dieną ir veikiant nikotino suporuotoje kameroje, kai nikotino nėra. Smegenų derliaus nuėmimo dieną eksperimentinių sąlygų lokomotorinis aktyvumas nesiskyrė (F 2, 11 = 0, 448, p = 0, 65), o Pavloviano būklės sąveika su laiko juostos nuvažiuotu atstumu nebuvo nustatyta (F 2, 11 = 1, 662, p = 0, 23). Šie duomenys taip pat rodo, kad su nikotinu susijęs kontekstas, o ne dėl atviro gyvūno elgesio lėmė pastebėtą pCREB indukciją NAc apvalkale.

Nešališkas nikotino CPP priklauso nuo dozės

Nikotino CPP C57BL / 6J pelėse buvo griežtai kontroliuojamas pagal dozę (F 3, 39 = 2, 87, p = 0, 05). Kaip anksčiau buvo pranešta žiurkėms (Le Foll ir Goldberg, 2005) ir pelėms (McGeehan and Olive, 2003), C57BL / 6J pelėms nustatyta nikotino CPP, kai 0, 09 mg / kg, ip nikotino dozė, matuojama atsižvelgiant į vaisto suporuota kamera, palyginti su fiziologinio tirpalo kontrolėmis ( p = 0, 05; 2a pav.). Didžiausia nikotino dozė (0, 175 mg / kg) nesukėlė pirmenybės nikotinui suplanuotoje kameroje, greičiausiai dėl galimo neigiamo nikotino poveikio. Kitaip nei vartojant vaistą sc panašiomis sąlygomis (Walters ir kt., 2006), tačiau ip nikotinas nesudarė sąlygotos vietos noro į nikotino porą, net jei nikotino dozė buvo viena log didesnė nei didžiausia dozė (1, 75 mg / kg, ip; duomenys nepateikti), galbūt dėl ​​spartesnės ip vartojimo būdo kinetikos.

Image

Neobjektyvus nikotino sąlygotas vietos pasirinkimas (CPP) yra griežtai reguliuojamas pagal dozę. (a) C57BL / 6J pelėms nustatyta nikotino CPP tendencija vartojant 0, 04 mg / kg dozę ( n = 12), žymiai padidėjus pirmenybei nikotino poroje, naudojant 0, 09 mg / kg dozę ( n = 8; p). = 0, 05), o pirmenybė netaikoma didžiausiai ip nikotino dozei, 0, 175 mg / kg ( n = 8), palyginti su fiziologinio tirpalo sušvirkštais gyvūnais ( n = 9). Visos nikotino dozės apskaičiuojamos pagal laisvosios bazės svorį. Duomenys pateikiami sekundėmis kaip vidutinis procentinis pokytis, palyginti su pradiniu pasirinkimu; klaidų juostos atspindi SEM; * p <0, 05, palyginti su kontroliniais gyvūnais. b) Pradinio kondicionavimo kameroje praleisto laiko skirtumas nesiskyrė, rodantis, kad gyvūnai prieš treniruotę neparodė jokios abiejų kamerų paklaidos ( p '> 0, 1), o tai rodo, kad pirmenybės pokytis atsirado dėl atlygio už nikotiną, o ne dėl anksiolitinio poveikio. gydymo nikotinu.

Visas dydis

„NAc Shell“ CREB aktyvumo sumažėjimas prieštarauja mokymui už nikotiną

NAc apvalkale mes panaudojome modifikuotą herpes simplex viruso vektorių (HSV), norėdami išreikšti mCREB, dominuojančią neigiamą CREB formą su Ser-133 mutacija alaninu, NAc apvalkale, norėdami tiesiogiai patikrinti, ar CREB aktyvumas yra susijęs su vietos nustatymu. reikalingi nikotino CPP. Serino ir alanino mutacija šiame HSV-mCREB konstrukte sumažina ciklinę AMP-atsako elemento (CRE) tarpininkaujamą transkripciją pelėse CRE-LacZ reporteriuose (Barrot ir kt., 2002); taigi mCREB ekspresija sutrikdo NAc CREB aktyvumą ir priešinsis NAc CREB aktyvumo padidėjimui, kuris gali atsirasti kondicionuojant vietą ir po nikotino CPP (papildomas paveikslas S1). Pakitus kameros preferencijai, reikšminga HSV infuzijos sąveika su nikotino doze (F 3, 148 = 2, 836, p = 0, 04). Pelėms, infuzuotoms naudojant HSV-LacZ kontrolinį vektorių, kaip ir negydytiems gyvūnams, pasireiškė nuo dozės priklausomas nikotino CPP (3a pav.), Tačiau parenkant NAV apvalkalo HSV-mCREB infuziją buvo blokuojama pirmenybė nikotino suporuotai kamerai per įvairias dozes (3a ir 3 pav.). b). Infuzija HSV-mCREB į NAc apvalkalą taip pat lėmė, kad fiziologinio tirpalo kameroje buvo teikiama pirmenybė optimaliai nikotino CPP dozei negydytoms pelėms (0, 09 mg / kg; p = 0, 036), kuri atsirado dėl centre praleisto laiko kitimo. skyrių ir neatspindėjo reikšmingo pirmenybės narkotikų poroje sumažėjimo. Gyvūnų, kuriems bandymo dieną buvo atliktas lokomotorinis aktyvumas, pogrupis parodė, kad HSV infuzija ar ankstesnis gydymas nikotinu neturi įtakos lokomotoriniam aktyvumui (papildomas S2 paveikslas). Infuzinės kaniulės išdėstymo rekonstrukcija ir fermento fermento aktyvumo tyrimas HSV-LacZ X-gal rodo, kad HSV vektoriaus ekspresija buvo lokali infuzijos vietoje (4 paveikslas). Kontroliniams gyvūnams, gavusiems 0, 75 mm užpakalinę NAc apvalkalo infuziją, nikotino CPP buvo panašus į gyvūnams, kuriems buvo sušvirkšta HSV-LaZ, sušvirkštus 0, 09 mg / kg ip nikotino, matuojant padidėjusia pirmenybe vaistams suplanuotoje kameroje, o ne fiziologiniame tirpale porinė kamera ( p = 0, 05). Preparatai, suporuoti su vaistais, buvo žymiai didesni fiziologiniu tirpalu injekuotose kontrolinėse medžiagose ( t 54 = 1, 675, p = 0, 05), kas rodo, kad nikotino CPP blokavimas šiuose eksperimentuose daugiausia buvo susijęs su CREB slopinimu NAc apvalkale, o ne su kažkokia pagrindine struktūra ( 5 pav.).

Image

Ciklinio AMP-atsaką palaikančio baltymo (CREB) aktyvacijos blokada branduolio akumuliatorių (Nac) apvalkale su HSV-mCREB panaikina nikotino sąlygotos vietos pasirinkimą (CPP) įvairiose dozėse. (a) HSV-LacZ gydytos pelės parodė, kad nikotinu suporuotoje kameroje pirmenybė teikiama nikotino 0, 065 ( n = 18) ir 0, 09 ( n = 20) mg / kg, bet ne 0, 04 mg / kg dozėje. ( n = 22), palyginti su fiziologiniu tirpalu apdorotų kontrolinių grupių ( n = 18). (b) HSV-mCREB infuzija į NAc apvalkalą užblokavo nikotino CPP visomis ip nikotino dozėmis, tai parodo, kad nėra teikiama pirmenybė vaisto poroms (visi p ’> 0, 2; n = 15–23). Pelės, į kurias įšvirkšta HSV-mCREB, parodė, kad druskos tirpalo poroje pirmenybė teikiama nikotino 0, 09 mg / kg ip. (c, d) Pelėms nebuvo teikiama pirmenybė vaistų ar fiziologinio tirpalo poromis. Duomenys pateikiami kaip pokyčiai, palyginti su pradiniu pasirinkimu ± SEM; * p = 0, 05, palyginti su kontrolinėmis pelėmis.

Visas dydis

Image

HSV infuzijos į branduolio akumuliatorių (NAc) apvalkalą. a) Kanulų, skirtų HSV-mCREB- (uždari apskritimai) ir HSV-LacZ-infuziniams gyvūnams (atviri apskritimai), rekonstravimas. (b) Reprezentatyvus pelių NAc skyrius, kuris buvo nuimtas praėjus 3 dienoms po HSV-LacZ infuzijos. Fermentinė X-gal reakcija rodo, kad HSV infuzijos buvo lokalios NAc apvalkalo infuzijos vietoje. Naudojant kreipiamąsias kaniles, buvo galima įsitikinti, kad virusinis vektorius, kuris galėjo nukeliauti iki infuzijos kaniulės, neužkrėtė viršutinių audinių. Vainikinė striatumo dalis, naudojama gavus leidimą: „Rosen GD“, „Williams AG“, „Capra JA“, „Connolly MT“, „Cruz B“, „Lu L“ ir kt. (2000). Pelės smegenys [apsaugotas el. Paštas ] www.mbl.org. „Pelių genomo“ konferencija 14: 166.

Visas dydis

Image

HSV-mCREB infuzijos į struktūras virš branduolio akumuliatorių (NAc) apvalkalo nesutrikdė nikotino sąlygojamos vietos pasirinkimo. a) Kontroliuojamiems chirurgijos gyvūnams ( n = 18) nustatyta sąlyginė 0, 09 mg / kg ip nikotino, matuojant žymiai padidėjusia pirmenybe kamerai, kurioje yra nikotinas, palyginti su gyvūnais, kuriems buvo sušvirkšta HSV, nikotino ( n = 38). . (b) Pelėms nebuvo suteikta pirmenybė nė vienai kamerai pradiniame taške. c) HSV-mCREB (uždarų ratų) kaniulės padėties rekonstravimas gyvūnams, kuriems buvo užpilta 0, 75 mm nugaros dalis pagal NAc apvalkalo tikslinę struktūrą. Duomenys pateikiami kaip vidutiniai pokyčiai, palyginti su pradiniu pasirinkimu, ir vidutinis laikas, praleistas bet kurioje kameroje, esant pradinei vertei ± SEM; * p <0, 05, palyginti su fiziologinio tirpalo injekcijomis.

Visas dydis

DISKUSIJA

Šie tyrimai rodo, kad CREB suaktyvinimas NAc apvalkale yra labai svarbus nikotino CPP, kuris yra apetitinio konteksto formavimo forma. Mes taip pat parodome, kad nikotinu suporuotas kontekstas padidina pCREB lygį NAc apvalkale, jei nėra akivaizdžios nikotino siekiančios ar lokomotorinės aktyvacijos, ir tai rodo, kad veikimas aplinkoje, susijusioje su nikotinu, gali suaktyvinti transkripcijos faktorių CREB. Su kontekstu susijęs pCREB padidėjimas buvo būdingas NAc apvalkalui ir nebuvo stebimas NAc šerdyje ar hipokampyje naudojant šiuos parametrus. Kondicionavimo mokymo sąlygomis, kai gyvūnams buvo suteikta pasirinkimo kamera, CREB aktyvacijos sutrikimas NAc apvalkale užblokavo nikotino CPP, o tai rodo, kad pCREB indukcija veikiant kontekstinėms nuorodoms gali padėti išmokti nikotino.

Šie duomenys papildomi ankstesniais CREB αδ nokauto pelių tyrimais (Walters ir kt., 2005), teigdami , kad CREB reguliavimas yra kritinis nikotino CPP. Mes parodėme, kad gyvūnams, kurie vystosi normaliai veikdami CREB funkcijai, pakanka inaktyvuoti CREB NAc apvalkale, kad būtų sutrikdytas nikotino CPP. Ankstesnės ataskaitos parodė, kad HSV-mCREB infuzija į NAc apvalkalą sustiprina kokaino ir morfino CPP (Carlezon ir kt., 1998; Walters ir Blendy, 2001; Barrot ir kt., 2002). Atvirkščiai, dabartinis tyrimas rodo, kad nikotino CPP negali atsirasti be CREB aktyvumo NAc apvalkale. Tai rodo, kad, nors įvairūs piktnaudžiavimo narkotikai yra panašūs į NAc, kalbant apie DA išsiskyrimą (Di Chiara ir Imperato, 1988), grandinės lygio adaptacijos, kuriomis grindžiamas atlygis už nikotiną, skiriasi nuo kitų piktnaudžiavimo narkotikais (Nestler, 2005). Įdomu tai, kad dėl lėtinio nikotino sumažėja NAC pCREB (Brunzell ir kt., 2003), todėl tai gali prisidėti prie cigarečių rūkymo gebėjimo skatinti perėjimą prie kitų narkotikų vartojimo (Lai et al., 2000). Tačiau kiti tyrimai rodo, kad padidėjęs pCREB yra susijęs su kokaino CPP NAc (Miller ir Marshall, 2005; Walters ir kt., 2005), o antisense sukeltas NAc CREB sumažėjimas apvalkale ar šerdyje silpnina pirminį sustiprinantį kokaino efektyvumą, nes taip pat jo gebėjimas veikti kaip gruntas atkuriant vaistą (Choi ir kt., 2006), galbūt dėl ​​lėtesnio kokaino vartojimo savaiminio vartojimo režimų (McClung ir Nestler, 2003). Rezultatai, gauti naudojant CPP, ne visada paverčiami į veną įvedamų savikontrolės duomenimis, tačiau, deja, pelėms sunku nustatyti patikimą nikotino savaiminį vartojimą.

Vietos kondicionavimas yra vertinga priemonė, padedanti įvertinti Pavloviano indėlį į signalizacijos pokyčius ir iš to kylantį atlygį. Šie tyrimai apima ankstesnius duomenis, kurie neišskiria NAc padalinių (Pandey ir kt., 2001; Brunzell ir kt., 2003; Walters ir kt., 2005), kad būtų parodyta NAc šerdies ir apvalkalo dichotomija nikotino- susijęs pCREB reguliavimas. Ankstesni duomenys rodo, kad CPP tyrimai, tačiau ne panašus nikotino ekspozicijos ir pašalinimo iš namų režimas, padidina NAc pCREB (Walters ir kt., 2005). Dabartiniame tyrime pelėms buvo nustatytas pCREB NAc apvalkalo lygio padidėjimas, kai jos buvo izoliuotos į nikotino suporuotą kamerą 22 val. Po paskutinės 3 dienos nikotino porų su ta kamera. Taigi, dėl Pavlovian nikotino vietos nustatymo padidėjo pCREB, jei nebuvo akivaizdžių nikotino siekių. Mikrodializės tyrimai parodė, kad padidėjęs DA išsiskyrimas, kuris turėtų sukelti su D1 susijusį CREB aktyvavimą, įvyksta NAc apvalkale, bet ne šerdyje per ankstyvas įsigijimo sesijas (mažiau nei septynias), tai rodo, kad NAc apvalkalo CREB gali prisidėti prie nikotino vartojimo pradžia (Spina ir kt., 2006). Šie Pavlovijos kondicionavimo duomenys patvirtina hipotezę, kad CS konteksto savybės yra pakankamos, kad NAc apvalkale suaktyvintų CREB.

Molekuliniame lygmenyje pCREB aktyvacija NAc vyksta pagal panašų modelį, kuris pastebimas DA neuronų aktyvumui mokantis stimulo atlygio. Primatų ir graužikų tyrimai rodo, kad po pakartotinio atlygintino dirgiklio susiejimo su lazda DA neuronas suaktyvėja, reaguodamas į pirminį atlygintiną dirgiklį, ir tampa priklausomas nuo sąlygoto lazda (Schultz et al, 1997; Day et al, 2007). . Panašiai, pCREB padidėjimas stebėtas NAc, reaguojant į ūmų nikotino poveikį, tačiau po 4 dienų nikotino ekspozicijos namų namuose (Walters ir kt., 2005) ar per Pavlovian treniruotes trečią nikotino ekspozicijos dieną šiuose tyrimuose. . Vietoj to, NAc pCREB lygis buvo padidintas reaguojant į nikotino suporuotą kamerą, o tai rodo, kad CSC konteksto savybės, o ne malonios nikotino savybės, reguliuoja pCREB NAc apvalkale po treniruotės, kurios pakanka nikotino CPP pasiekti.

CREB signalizavimas yra būtinas dėl nervinio plastiškumo, susijusio su mokymu ir priklausomybe (Silva ir kt., 1998; Carlezon ir kt., 2005). Genai, tokie kaip fos ir BDNF , kuriuos reguliuoja nikotinas ir kurie, kaip manoma, yra svarbūs priklausomybei nuo tabako (Schroeder ir kt., 2001; Li ir kt., 2008), yra perreguliuoti dėl CREB per didelės ekspresijos ir juos slopina mCREB raiška NAc. transgeninių pelių (McClung ir Nestler, 2003). CREB veiklos sutrikimas gali sutrikdyti daugelio genų, kurių promotoriuose yra CRE seka, ekspresiją. Pvz., CREB aktyvumas yra būtinas norint reguliuoti μ- opiatų receptorius reaguojant į nikotino skyrimą, o šis padidėjimas prisideda prie nikotino CPP (Walters ir kt., 2005). Taigi CRE tarpininkaujantys neuroadaptacijos, paprastai atsirandančios reaguojant į nikotiną, gali sukelti ilgalaikius pokyčius sistemose, kurios reguliuoja skatinamąjį patrauklumą ir atlygį už vaistus.

Dabartiniame tyrime nikotinas ar nikotinu sujungtos kameros neturėjo įtakos pCREB reguliavimui hipokampo srityje, kaip buvo pastebėta ankstesnių tyrimų metu naudojant 4 dienų CPP mokymo schemą (Walters ir kt., 2005). One potential reason for this difference may be that animals were not actively seeking the nicotine-paired chamber in the current study, but were rather confined to that chamber by the experimenter. Some evidence suggests that regulation of CREB in the dorsal hippocampus is more critical for spatial navigation than context conditioning (Pittenger et al, 2002). Although CREB was not regulated in the NAc core or hippocampus during exposure to a nicotine-paired chamber on the third day of training, we cannot conclude that CREB in these brain areas is not critical for learning during earlier trials or for consolidation processes related to nicotine CPP (Josselyn and Nguyen, 2005). Human studies show that the dorsal striatum and orbitofrontal cortex may also be involved in cue reward for drugs of abuse (David et al, 2007; Franklin et al, 2007; McClernon et al, 2008; Volkow et al, 2008). Whereas guide canulae prevented expression of mCREB along the canulae tracks, damage to these overlying structures could have impaired cue reward. LacZ control animals showed levels of nicotine CPP similar to untreated controls, however, suggesting that potential unilateral damage during infusion did not affect nicotine CPP.

In summary, these studies show that activation of CREB in the NAc shell is critical for nicotine CPP. The phosphorylation state of CREB may therefore regulate the motivational valence for nicotine or the conditioned rewarding effects of nicotine-associated cues, such as a context associated with nicotine. A nicotine-paired environment can elicit CREB phosphorylation in the NAc shell, suggesting that contextual cues may drive changes in CREB that promotes nicotine reward learning. We conclude from the current study that pharmacological agents that decrease CREB phosphorylation might be novel targets for smoking cessation.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi S1 ir S2 paveikslai

    ATSKLEIDIMAS / INTERESŲ KONFLIKTAS

    The authors have no financial conflicts of interest with any data or original ideas presented in this paper. DH Brunzell and RL Neve are supported by the National Institute of Health (NIH) for projects unrelated to the work presented in this paper. YS Mineur is supported by the National Institute of Health and by a Pfizer contract for an unrelated project. In addition to the NIH support of this work and other projects, MR Picciotto has received funding from Pfizer for unrelated research endeavors. YS Mineur and MR Picciotto have a patent on cytisine derivatives as novel treatments for depression.

    Neuropsichofarmakologijos tinklalapyje (//www.nature.com/npp) pridedama papildoma informacija