Ol3, naujas mažai absorbuojamas tgr5 agonistas, turintis sumažintą šalutinį poveikį, dėl dvigubo veikimo tgr5 aktyvacijai ir dpp-4 slopinimui sumažino gliukozės kiekį kraujyje | acta pharmaologica sinica

Ol3, naujas mažai absorbuojamas tgr5 agonistas, turintis sumažintą šalutinį poveikį, dėl dvigubo veikimo tgr5 aktyvacijai ir dpp-4 slopinimui sumažino gliukozės kiekį kraujyje | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

TGR5 agonistai stimuliuoja į žarnyną panašų peptidą-1 (GLP-1), tačiau sisteminis poveikis sukelia nepageidaujamą šalutinį poveikį, pavyzdžiui, tulžies pūslės užpildymą. Šiame tyrime linagliptinas, didelio molekulinio svorio ir poliškumo DPP-4 inhibitorius, ir MN6, anksčiau aprašytas TGR5 agonistas, buvo susieti, kad būtų gautas naujas OL3 - naujas mažai absorbuojamas TGR5 agonistas, turintis mažesnį šalutinį poveikį ir dvigubą funkciją. mažinant gliukozės kiekį kraujyje, aktyvinant TGR5 ir slopinant DPP-4.

Metodai:

TGR5 aktyvacija buvo tiriama HEK293 ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose žmogaus ar pelės TGR5 ir CRE varomą liuciferazės geną. DPP-4 slopinimas buvo įvertintas remiantis surogatinio substrato hidrolizės greičiu. Buvo matuojamas GLP-1 sekrecija žmogaus enteroendokrininėse NCI-H716 ląstelėse. OL3 pralaidumas buvo patikrintas Caco-2 ląstelėse. Ūmus gliukozės kiekį mažinantis OL3 poveikis buvo įvertintas ICR ir diabetinėms ob / ob pelėms.

Rezultatai:

OL3 suaktyvino žmogaus ir pelės TGR5, kurių EC50 buvo atitinkamai 86, 24 ir 17, 36 nmol / L, ir stimuliavo GLP-1 sekreciją žmogaus enteroendokrininėse NCI-H716 ląstelėse (3–30 μmol / L). OL3 slopino žmogaus ir pelės DPP-4, kurių IC50 vertės buvo atitinkamai 18, 44 ir 69, 98 μmol / L. Caco-2 ląstelėse pastebėtas mažas OL3 pralaidumas. ICR pelėse, gydomose per burną OL3 (150 mg / kg), OL3 koncentracija serume buvo 101, 10 ng / ml per 1 h, o sumažėjo iki 13, 38 ng / ml 5, 5 valandos po dozės vartojimo, tai patvirtina mažą OL3 absorbciją in vivo . ICR pelėms ir ob / ob pelėms išgertas OL3 reikšmingai sumažino gliukozės kiekį kraujyje, o tai buvo sinerginis aktyvavimo TGR5, kuris stimuliavo GLP-1 sekreciją žarnyne, ir slopinantis DPP-4, kuris skaido GLP-1 plazmoje, poveikis. . ICR pelėms, išgėrus OL3, tulžies pūslė neužpildyta.

Išvada:

OL3 yra mažai absorbuojamas TGR5 agonistas, mažinantis gliukozės kiekį kraujyje, nesukeldamas tulžies pūslės užpildymo. Šis tyrimas pateikia naują strategiją, kaip sukurti stiprius TGR5 agonistus, gydančius 2 tipo diabetą, kurie nukreipti į žarnyną, kad būtų išvengta sisteminio šalutinio poveikio.

Įvadas

2002 m. 1, 2 TGR5 (GPR131) buvo identifikuotas kaip tulžies rūgščių (BA) baltymų sujungtas su ląstelių paviršiaus receptoriais Gaca, plačiai paplitęs daugelyje audinių, įskaitant tulžies pūslę, žarnyną, inkstus ir placentą 3, 4 . BA suaktyvinta TGR5 signalizacijos aktyvacija sukelia į gliukagoną panašaus peptido-1 (GLP-1) sekreciją enteroendokrininėse ląstelėse 5, 6, 7 . Žinoma, kad GLP-1 sekrecija padidina insulino sekreciją po valgio ir netiesiogiai reguliuoja gliukozės homeostazę, įskaitant sulėtėja skrandžio judrumas ir slopina apetitą. Be to, TGR5 vaidina svarbų vaidmenį didinant energijos sąnaudas skeleto raumenims ir rudajam riebaliniam audiniui, suaktyvinant nuo CAMP priklausomą 2 tipo jodtironindeiodinazę (D2) ir skydliaukės hormonų kelią 10, 11 . Nors šis poveikis rodo, kad TGR5 yra perspektyvus taikinys gydant medžiagų apykaitos sutrikimus, galimas šalutinis poveikis riboja TGR5 agonistų išsivystymą į vaistus. Naujausi Li ir Lavoie ir kt. 12, 13 tyrimai atskleidė, kad selektyvaus agonisto INT-777 stimuliacija TGR5 atpalaiduoja lygiuosius tulžies pūslės raumenis. Dėl to tulžies pūslė užpildoma ir plečiamas tūris, o tai yra pagrindinė kliūtis klinikiniam TGR5 agonistų taikymui. Be to, nustatyta, kad sutrikęs imuninis atsakas 14 ir širdies ritmo pokyčiai yra TGR5 aktyvacijos šalutinis poveikis 15, 16 . Naujausi tyrimai parodė, kad TGR5 aktyvacija ir vėlesnė GLP-1 sekrecija vyksta žarnos enteroendokrininių L ląstelių šoninėje dalyje, daugiausia gaubtinėje žarnoje. Taigi sisteminis TGR5 agonisto poveikis gliukozės homeostazės moduliavimui nėra būtinas 17, 18 . Gydant 2 tipo cukriniu diabetu, kritinis tikslas yra sukurti žemo lygio / nesisteminius TGR5 agonistus, kad būtų sumažintas šalutinis poveikis.

Ankstesniame mūsų tyrime nustatyta keletas stiprių ir selektyvių mažų molekulių TGR5 agonistų 19 . Tarp jų MN6 ([4- (2, 5-dichlorfenoksi) piridin-3-il] - (4-ciklopropil-3, 4-dihidro-2H-chinoksalin-l-il) metanonas (aprašytas kaip 22g junginys 19 nuorodoje) ) yra viena galingiausių molekulių, kurių EC50 yra atitinkamai 1, 5 nmol / L ir 18 nmol / L atitinkamai žmogaus ir pelės TGR5 (h / mTGR5), be aktyvavimo poveikio FXR 19. MN6 vartojimas per burną (apibūdinamas kaip junginys 2, nurodytas 20 nuorodoje, taip pat padidino pelių tulžies pūslės tūrį. 20. Didelės molekulinės masės (MW) ir didelio topologinio polinio paviršiaus ploto (tPSA) junginiai pasižymi mažu membranos pralaidumu ir sumažinta absorbcija žarnyne 21. Taigi, MN6, sujungtas su hidrofilinėmis medžiagomis. šoninės grandinės gali sumažinti sisteminį poveikį ir sumažinti šalutinį poveikį.

Aktyvios formos GLP-1 lygį galima padidinti ne tik skatinant GLP-1 sekreciją žarnyne, bet ir sulėtinant jo skilimą. Cirkuliacinės GLP-1 pusinės eliminacijos laikas yra trumpas (maždaug 1–2 min.), Nes dipeptidilpeptidazė-4 (DPP-4) greitai N-galo dipeptidą skaido į neaktyvius metabolitus - 22, 23, 24 . DPP-4 inhibitoriai gali užkirsti kelią šiam GLP-1 inaktyvavimo procesui, todėl atsiranda įvairių DPP-4 inhibitorių, kurie jau naudojami klinikiniuose tyrimuose kaip monoterapija ar derinio terapija su kitais hipoglikemijos sukėlėjais 25 . Linagliptinas yra vienas iš selektyviausių ir stipriausių DPP-4 inhibitorių, kurio IC50 yra maždaug 1 nmol / L, ir kurį FDA patvirtino 2011 m. Be to, linagliptino struktūra pagrįsta ksantino pastoliais su didelis MW - 472, 5 ir aukštas tPSA 26 . Norėdami sumažinti MN6 absorbciją žarnyne, linagliptinas buvo įterptas kaip hidrofilinė šoninė grandinė, kad būtų gaunamas mažai sisteminis agentas OL3. Buvo tikimasi, kad šis junginys sukels sinergetinį poveikį padidinant aktyvios formos GLP-1 lygį nukreipdamas TGR5 aktyvaciją žarnyne ir DPP-4 slopinimą plazmoje, kad padidėtų GLP-1 (1 paveikslas).

Image

OL3 buvo kuriamas ir sintetinamas remiantis MN6 struktūra.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Šiame tyrime mes sukūrėme ir susintetinome naują junginį - OL3, turintį mažai sisteminį poveikį ir dvigubą funkcinį taikymą - TGR5 aktyvaciją ir DPP-4 slopinimą. OL3 gebėjimas suaktyvinti TGR5 ir slopinti DPP-4 buvo vertinamas tiek in vitro, tiek in vivo . Be to, mes apibūdinome ūmų OL3 poveikį reguliuodami gliukozės homeostazę normalioms ir diabetinėms pelėms. OL3 poveikis tulžies pūslės užpildymui buvo stebimas ICR pelėms.

medžiagos ir metodai

Chemikalai

OL3 sintezė parodyta 1 schemoje.

Image

OL3 sintezė. Reagentai ir sąlygos: a) etilakrilatas, Pd (OAc) 2, P (O-MePh) 3, LiCl, MeCN, mikrobangų krosnelė 140 ° C; b) NaBH4, CuCl, THF, MeOH, 0 ° C; c) NaOH, dioksanas, H2O, kambario temperatūra; d) tret-butil-5, 8, 11, 14, 17, 20-heksaksa-2-azatricosan-23-oato, HATU, Et3N, DCM, kambario temperatūra; e) CH3COCl, H2O, DCM, kambario temperatūra; f) linagliptinas, HATU, Et3N, DCM, kambario temperatūra.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Etilo (E) -3- (2, 5-dichlor-4 - ((3- (4-ciklopropil-1, 2, 3, 4-tetrahidrochinoksalin-1-karbonil) piridin-4-il) oksi) fenil) akrilato (2)

Į 1 junginio (5, 20 g, 10 mmol) tirpalą MeCN pridėta etilo akrilato (2, 17 ml, 20 mmol), po to paladžio diacetato (225 mg, 1, 0 mmol), Tris (2-metilfenil) fosfino (400 mg)., 2, 0 mmol), Et3N (3, 5 ml, 50 mmol) ir ličio chlorido (430 mg, 10 mmol). Gautas mišinys 1 valandą kaitinamas mikrobangų reaktoriuje 140 ° C temperatūroje. Atšaldžius iki kambario temperatūros, reakcijos mišinys supilamas į vandenį ir ekstrahuojamas etilo acetatu. Organiniai sluoksniai sujungiami, plaunami sočiu druskos tirpalu, džiovinami bevandeniu magnio sulfatu ir sukoncentruojami sumažintame slėgyje. Likutis buvo išgrynintas greitosios kolonėlės chromatografijos metodu, kad būtų gautas 4, 05 g norimo junginio (75%). ' H NMR (300 MHz, CDCI3): 8 8, 88 (s, 1H), 8, 46 (d, 1H), 7, 91 (d, 1H), 7, 65 (s, 1H), 7, 04–6, 99 (m, 1H), 6, 89 (d, 1H), 6, 48 (d, 1H), 6, 42–6, 37 (m, 3H), 5, 73 (s, 1H), 4, 89 (m, 1H), 4, 28 (q, 2H), 3, 49 (m, 2H), 3, 17 (m, 1H), 2, 22 (m, 1H), 1, 35 (t, 3H), 0, 65 (m, 3H), 0, 27 (m, 1H).

Etilo 3- (2, 5-dichlor-4 - ((3- (4-ciklopropil-1, 2, 3, 4-tetrahidrochinoksalin-1-karbonil) piridin-4-il) oksi) fenil) propanoato (3)

Į 2 (3, 5 g, 6, 5 mmol) ir vario chlorido (965 mg, 9, 75 mmol) mišinį metanolyje ir tetrahidrofuraną 0 ° C temperatūroje partijomis pridėta NaBH4 (1, 24 g, 32, 5 mmol) ir gautas mišinys maišomas 8 ° C 2 val. Po to reakcija buvo užgesinta pridedant vandens. Gauta kieta medžiaga filtruojama, o filtratas sukoncentruojamas sumažintame slėgyje. Likutis praskiedžiamas vandeniu ir ekstrahuojamas dichlormetanu. Organiniai sluoksniai buvo sujungti, išdžiovinti bevandeniu magnio sulfatu ir išgarinti sumažintame slėgyje. Likutis išvalytas greitosios kolonėlės chromatografijos metodu su petroleterio / etilo acetatu. Gauta 2, 84 g (81%) 3 kaip geltonos alyvos. ' H NMR (300 MHz, DMSO): 8 8, 82 (s, 1H), 8, 40 (d, 1H), 7, 30 (s, 1H), 7, 03 (m, 1H), 6, 93 (d, 1H), 6, 48 (d, 1H), 6, 37 (m, 1H), 6, 29 (d, 1H), 5, 69 (s, 1H), 4, 89 (m, 1H), 4, 15 (q, 2H), 3, 49 (m, 2H), 3, 17 (m, 1H) ), 2, 99 (t, 2H), 2, 61 (t, 2H), 2, 25 (m, 1H), 1, 26 (t, 3H), 0, 62 (m, 3H), 0, 34 (m, 1H).

3- (2, 5-dichlor-4 - ((3- (4-ciklopropil-1, 2, 3, 4-tetrahidrochinoksalin-1-karbonil) piridin-4-il) oksi) fenil) propano rūgštis (4)

Į 3 (2, 7 g, 5, 0 mmol) tirpalą 1, 4-dioksane ir vandenyje pridedama natrio hidroksido (0, 40 g, 10 mmol) ir reakcijos mišinys maišomas kambario temperatūroje 3 valandas. Reakcija išgarinta iki sausumo, o liekana ištirpinta vandenyje. Tirpalo pH buvo sureguliuotas iki 3 2 mol / l HCl. Susidariusios nuosėdos filtruojamos, plaunamos šaltu vandeniu ir džiovinamos vakuume. Gaunamas 2, 36 g antraštės junginio (92%). ' H NMR (300 MHz, DMSO): 8 12, 29 (s, 1H), 8, 77 (s, 1H), 8, 41 (d, 1H), 7, 59 (s, 1H), 6, 97 (m, 1H), 6, 84 (m, 1H), 6, 53 (m, 1H), 6, 48 (m, 1H), 6, 33 (m, 1H), 5, 54 (s, 1H), 4, 71 (m, 1H), 3, 36 (m, 2H), 3, 07 (m, 1H) ), 2, 86 (m, 2H), 2, 51 (m, 1H), 2, 16 (m, 1H), 0, 60 (m, 2H), 0, 47 (m, 1H), 0, 44 (m, 1H).

Tret-butil 1- (2, 5-dichlor-4 - ((3- (4-ciklopropil-1, 2, 3, 4-tetrahidrochinoksalin-1-karbonil) piridin-4-il) oksi) fenil) -4- metil-3-okso-7, 10, 13, 16, 19, 22-heksaksa-4-azapentakozano-25-oato (5)

Į 4 (1 mmol) tirpalą dichlormetane pridedama HATU (1, 5 mmol), po to Et3N (3 mmol) ir tret-butilo 5, 8, 11, 14, 17, 20-heksaksa-2-azatricosan- 23-avižos (1, 5 mmol). Gautas mišinys maišomas kambario temperatūroje per naktį. Reakcijos mišinys praskiedžiamas vandeniu ir ekstrahuojamas dichlormetanu. Organinis sluoksnis plaunamas sočiu druskos tirpalu, išdžiovinamas bevandeniu magnio sulfatu ir sukoncentruojamas sumažintame slėgyje. Likutis išvalytas greitosios chromatografijos būdu, kad gautų norimą junginį. ' H NMR (300 MHz, CDCI3): 8 8, 80 (s, 1H), 8, 40 (d, 1H), 7, 34 (s, 1H), 7, 03 (m, 1H), 6, 96 (m, 1H), 6, 48 (m), 1H), 6, 36 (m, 1H), 6, 29 (d, 1H), 5, 73 (m, 1H), 4, 86 ​​(m, 1H), 3, 63–3, 46 (m, 30H), 3, 20 (m, 1H), 3, 05–3. 2, 96 (m, 5H), 2, 65 (m, 1H), 2, 56 (m, 1H), 2, 26 (m, 1H), 1, 43 (s, 9H), 0, 64 (m, 3H), 0, 24 (m, 1H).

1- (2, 5-dichlor-4 - ((3- (4-ciklopropil-1, 2, 3, 4-tetrahidrochinoksalin-1-karbonil) piridin-4-il) oksi) fenil) -4-metil-3 -okso-7, 10, 13, 16, 19, 22-heksaksa-4-azapentakozano-25-riebiosios rūgšties (6)

Į 5 (1 mmol) tirpalą dichlormetane pridedama acetilchlorido (470 μL, 6, 6 mmol) ir H2O (118 μL, 6, 6 mmol). Gautas mišinys maišomas kambario temperatūroje 3 valandas. Reakcijos tirpalas tiesiogiai išgarinamas sumažintame slėgyje, išgryninamas pusiau preparatyvia HPLC, kad gautų 105 mg produktą. ' H NMR (300 MHz, CDCI3): 8 8, 95 (s, 1H), 8, 74 (m, 1H), 7, 43 (s, 1H), 7, 11 (m, 2H), 6, 68 (m, 1H), 6, 46 (m., 2H), 5, 92 (s, 1H), 4, 80 (m, 1H), 3, 76–3, 51 (m, 29H), 3, 09–2, 98 (m, 5H), 2, 75–2, 58 (m, 4H), 2, 32 (m, 1H) ), 0, 74 (m, 3H), 0, 17 (m, 1H).

( R ) -N- (1- (7- (but-2-in-1-il) -3-metil-1 - ((4-metilchinazolin-2-il) metil) -2, 6-diokso-2, 3, 6, 7-tetrahidro-1H-purin-8-il) piperidin-3-il) -1- (3- (2, 5-dichlor-4 - ((3- (4-ciklopropil-1, 2), 3, 4-tetrahidrochinoksalin-1-karbonil) piridin-4-il) oksi) fenil) -N-metilpropanamido) -3, 6, 9, 12, 15, 18-heksaoksahenikozano-21-amido (OL3)

OL3 buvo susintetintas iš 6 tuo pačiu metodu, kaip ir paruošiant 4, išskyrus 5, 8, 11, 14, 17, 20-heksaksa-2-azatricosan-23-oato pakeitimą linagliptinu. ' H NMR (300 MHz, CDCI3): 8 8, 80 (s, 1H), 8, 40 (d, 1H), 8, 01 (d, 1H), 7, 87 (d, 1H), 7, 75 (d, 1H), 7, 52 (d), 1H), 7, 33 (s, 1H), 7, 03 (m, 2H), 6, 97 (m, 1H), 6, 48 (m, 1H), 6, 37 (m, 1H), 6, 29 (m, 1H), 5, 74 (m, 1H), 5, 55 (s, 2H), 4, 90 (m, 3H), 4, 17 (m, 1H), 3, 74 (t, 2H), 3, 62–3, 15 (m, 30H), 3, 04–2, 96 (m, 5H), 2, 88 (s, 3H), 2, 66 (m, 1H), 2, 58 (m, 1H), 2, 48 (t, 2H), 2, 26 (m, 1H), 1, 91–1, 65 (m, 11H), 0, 64 (m, 3H), 0, 24 (m, 1H).

Gyvūnai

Patinai patinai ICR buvo įsigyti iš SLAC laboratorinių gyvūnų (Šanchajus, Kinija). B6.V- Lep ob / Lep ob pelės (Jackson laboratorija, Bar Harbor, ME, JAV) buvo veisiamos Šanchajaus Materia Medica institute, Kinijos mokslų akademijoje (Šanchajus, Kinija). Visi gyvūnai buvo laikomi kontroliuojamomis aplinkos sąlygomis, naudojant 12 valandų šviesos-tamsos ciklą ir laisvą prieigą prie vandens ir maisto. Bandymus su gyvūnais patvirtino Šanchajaus „Materia Medica“ instituto Gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas.

In vitro TGR5 aktyvumo tyrimas

HEK293 ląstelės, stabiliai ekspresuojančios žmogaus ar pelės TGR5, ir CRE valdomas luciferazės genas buvo gautos ir palaikomos, kaip aprašyta 27 . Trumpai tariant, HEK293 ląstelės, stabiliai transfekuotos h / mTGR5 ekspresijos plazmidėmis (hTGR5-pcDNA3.1 arba mTGR5-pcDNA3.1) ir CRE varoma luciferazės reporterio plazmidė (pGL4.29, Promega, Madison, WI, JAV), buvo pasėtos į 96 šulinėlių plokštelės ir inkubuojamos per naktį 37 ° C temperatūroje DMEM, turinčioje 10% FBS 5% CO2. Tada ląstelės buvo inkubuojamos šviežioje terpėje, kurioje buvo skirtingos OL3 arba MN6 koncentracijos, 5, 5 valandos, o aktyvumas buvo įvertintas reporterio geno tyrimu. Remiantis gamintojo instrukcijomis, liuciferazės aktyvumas ląstelių lizate buvo nustatytas naudojant Steady-Glo ® Luciferase Assay System (Promega, Madisonas, WI, JAV).

In vitro DPP-4 aktyvumo tyrimas

Slopinamasis junginių poveikis žmonių ir pelių DPP-4 buvo nustatytas matuojant Gly-Pro-7-amido-4-metilkumarino hidrobromido (Gly-Pro-7-AMC, Sigma-Aldrich, MO, JAV) hidrolizės greitį, kaip ir anksčiau. aprašytas 28 . Trumpai tariant, rekombinantinis žmogaus DPP-4 (Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY, JAV), esantis 50 mmol / l Tris (pH 7, 5), buvo inkubuotas su skirtingomis junginių koncentracijomis 5 minutes. Tada Gly-Pro-7-AMC buvo pridėtas prie galutinės 10 μmol / L koncentracijos, o po to stebimas katalizės greitis, norint apskaičiuoti junginių slopinamąjį poveikį. In vitro pelių DPP-4 aktyvumo tyrimo procedūros buvo tokios pačios kaip žmogaus DPP-4 aktyvumo tyrimo, tačiau fermentą pakeitė ICR pelių serumas ir buferis buvo pakeistas į 25 mmol / L HEPES, 140 mmol / L. NaCl, 1% BSA (pH 7, 8).

GLP-1 sekrecijos tyrimas NCI-H716 ląstelėse

Žmogaus enteroendokrininės NCI-H716 ląstelės buvo palaikomos suspensijos kultūroje, kaip aprašyta Amerikos tipo kultūros kolekcijoje (ATCC, Manassas, VA, JAV). Trumpai tariant, ląstelės buvo sėjamos į 24 šulinėlių plokšteles, padengtas Matrigel (BD Biosciences, Oxford, UK) 48 valandas. Po plovimo KREBS ląstelės buvo inkubuotos su OL3, nešiklio kontrole arba PMA kaip teigiama kontrole, praskiestoje KREBS (su 0, 2% BSA ir 1% DPP-4 inhibitoriumi) 2 valandas 37 ° C temperatūroje. Tada mėginiai buvo surinkti ir centrifuguoti, kad būtų pašalintos plūduriuojančios ląstelės. Aktyvus GLP-1 lygis buvo tiriamas naudojant ELISA rinkinį iš „Merck-Millipore“ (Bostonas, MA, JAV).

Pralaidumo tyrimas Caco-2 ląstelėse

OL3 pralaidumas buvo patikrintas naudojant Caco-2 ląstelių monosluoksnio modelį, kuris buvo gautas iš ATCC. Junginiai, gabenami iš viršūnės pusės į bazolateralinę pusę (A – B) ir iš bazolateralinės pusės į viršūninę pusę (B – A), buvo nustatyti tomis pačiomis sąlygomis. Propranololis ir atenololis buvo naudojami atitinkamai kaip hipertoninė ir hipotoninė kontrolė. Digoksinas buvo naudojamas P-glikoproteinų (P-gp) tarpininkaujant vaisto ištekėjimui kaip teigiama kontrolė. Trumpai tariant, ląstelės buvo pasėtos į 24 šulinėlių plokšteles ir inkubuotos DMEM, turinčioje 10% FBS, 1% neesminių amino rūgščių, 1% glutamino, 100 mg / ml streptomicino ir 100 U / ml penicilino, 5% CO 2, esant 37 ° C. už 21 d. Tris kartus po plovimo HBSS, monosluoksnio vientisumas buvo patikrintas išmatuojant TEER (trans-epitelio elektrinę varžą). Po to ląstelių monosluoksnis buvo inkubuotas su kiekvienu nurodytu junginiu, praskiestu HBSS (400 μl / duobutėje viršūninėje pusėje ir 800 μL / duobutėje bazolaterinėje pusėje) 90 min., Esant 37 ° C. Mėginiai buvo imami iš donoro ir imtuvo pusės po inkubacijos. Junginių koncentracija buvo matuojama LC-MS / MS. P programos vertė buvo apskaičiuota pagal šią lygtį:

P app = ( V A / (A × T)) × ([Comp] akceptorius / [Comp] pradinis donoras )

kur V A yra akceptoriaus šulinio tūris; A - membranos paviršiaus plotas (cm 2 ); T yra viso pervežimo laikas; [Comp] akceptorius yra junginio koncentracija akceptoriaus pusėje, o [Comp] pradinis donoras yra pradinė junginio koncentracija donoro pusėje.

Mišinio paruošimas tyrimui in vivo

Kadangi OL3 tirpumas vandenyje dėl mažos molekulinės masės buvo mažas, junginys buvo paruoštas derinant su polivinilpirolidonu (PVP) K30 (Sinopharm Chemical Reagent Co, Ltd, Šanchajus, Kinija), kuris pagerino vaistų tirpumą vandenyje. Trumpai tariant, 1 g OL3 buvo ištirpinta 50 ml dichlormetano. Tada pridedama 5 g PVP K30 ir mišinys išgarinamas, vakuume gaunant baltus miltelius. In vivo eksperimentams milteliai, kurių sudėtyje yra tiriamojo junginio ir PVP K30 mišinio, buvo suspenduoti distiliuotame vandenyje, o kontrolinis tirpiklis buvo naudojamas toks pat PVP K30 kiekis.

Junginio lygio matavimas ICR pelių serume

Vienos nakties nevalgiusios ICR pelės buvo atsitiktinai paskirstytos į 4 grupes ( n = 4 kiekvienoje grupėje). Vienai grupei buvo peroduota nešiklis, o kraujo mėginiai buvo paimti kaip kontroliniai mėginiai (0 val.) Junginio matavimui. Kitoms trims grupėms buvo išgertas OL3 po 150 mg / kg, o kraujo mėginiai buvo paimti praėjus 1, 3, 5 ir 5, 5 val. Po vartojimo OL3 ir linagliptino matavimui. Trumpai tariant, baltymai serume buvo nusodinami acetonitrilu, o supernatantas buvo suleistas į LC-MS / MS sistemą tolimesniam kiekybiniam įvertinimui. Chromatografinis atskyrimas atliktas naudojant „Luna C 18“ kolonėlę (50 mm × 2, 1 mm ID OL3 ir 100 mm × 2, 1 mm ID linagliptinui, 1, 7 μm, Waters, MA, JAV), naudojant 5 mmol / l amonio acetato ir acetonitrilo (1: 1, tūris / tūris ), kuriame judančioji fazė yra 0, 1% skruzdžių rūgšties, kuri buvo tiekiama 0, 5 ml / min. Srautu. MS aptikimas buvo atliktas kelių reakcijų stebėjimo režimu, naudojant teigiamą elektros purškimo jonizacijos sąsają. OL3 kalibravimo kreivė buvo nustatyta nuo 3, 0 iki 1000 ng / ml, o linagliptino - nuo 0, 01 iki 3 ng / ml.

Burnos gliukozės toleravimo testas (OGTT) ir tulžies pūslės tūrio matavimas ICR pelėms

ICR pelės buvo suskirstytos į 5 grupes ( n = 8 kiekvienoje grupėje) pagal nevalgiusio gliukozės kiekį kraujyje ir kūno svorį. Vieną naktį nevalgiusiems ICR pelėms peroraliai buvo sušvirkščiama 75, 150 arba 300 mg / kg OL3, 50 mg / kg MN6 arba nešiklio, po to po 90 min. - peroralinė 4 g / kg gliukozės dozė. Kraujas buvo gautas iškarpant uodegą, o gliukozės lygis buvo išmatuotas naudojant ACCU-CHEK Advantage II gliukozės monitorių (Roche, IN, JAV) 15 minučių prieš junginio dozę ir 0, 15, 30, 60 ir 120 min. po gliukozės dozės. Plotas po koncentracijos ir laiko kreivės nuo 0 iki 120 min (AUC 0–120 min ) gliukozės kiekiui kraujyje pakėlus gliukozę buvo nustatytas pagal trapecijos taisyklę (naudojant 0 laiko gliukozės lygį kiekvienam gyvūnui kaip to gyvūno pradinę vertę). Po OGTT pelėms buvo suteiktas maistas 2 valandas. Po to pelės buvo paaukotos ir išpjaustytos, o tulžies pūslės tūris buvo matuojamas vernieriniu apkaba. Santykinis tulžies pūslės tūris buvo apskaičiuotas iš ilgio, padauginto iš tulžies pūslės pločio.

Gliukozės kiekio kraujyje nevalgius nustatymas pelėms, sergančioms diabetinėmis ob / ob ligomis

Moteriškos ob / ob pelės buvo suskirstytos į 3 grupes ( n = 7–8 kiekvienoje grupėje), atsižvelgiant į gliukozės kiekį kraujyje ir kūno svorį. Dviejų valandų nevalgiusioms ob / ob pelėms buvo geriama nešiklio arba OL3 po 200 arba 400 mg / kg. Kraujas buvo gautas iškarpant uodegą, o gliukozės lygis buvo matuojamas 0, 2, 4 val. Po junginio dozės naudojant ACCU-CHEK Advantage II gliukozės monitorių.

Oralinis gliukozės toleravimo testas (OGTT) sergantiems diabetinėmis ob / ob pelėmis

Moteriškos ob / ob pelės buvo padalintos į 3 grupes ( n = 7–8 kiekvienoje grupėje), atsižvelgiant į nevalgiusio gliukozės kiekį kraujyje ir kūno svorį. Penkių valandų nevalgiusioms ob / ob pelėms buvo peroraliai nešiklis arba OL3 po 200 arba 400 mg / kg, o po to peroralinė 1, 5 g / kg gliukozės dozė po 90 min. Po junginio dozės. Po 0, 15, 30, 60 ir 120 minučių po gliukozės įkrovimo buvo paimti kraujo mėginiai iš retroorbitalinio sinuso, o gliukozės kiekis serume buvo nustatytas gliukozės oksidazės-peroksidazės metodu, naudojant Gliukozės analizės rinkinį (Rongsheng Biotech, Šanchajus, Kinija).

In vivo DPP-4 slopinimas ICR pelėse

Šis eksperimentas buvo atliktas kartu su OGTT ICR pelėse. Trumpai tariant, nevalgiusiems ICR pelėms peroraliai buvo sušvirkšta OL3, MN6 arba nešiklis, o kraujo mėginiai buvo paimti po 0, 1, 3, 5, 5, 5 val. Serumo DPP-4 aktyvumas buvo matuojamas tuo pačiu metu, kai buvo nustatytas in vitro pelių DPP-4 slopinimo testas, tačiau junginių pridėjimo nebuvo praleista.

OL3 poveikis aktyviajai GLP-1 formai ICR pelių plazmoje

ICR pelės buvo suskirstytos į 2 grupes ( n = 30 kiekvienoje grupėje) pagal kūno svorį. OL3 poveikis aktyviajai GLP-1 formai plazmoje buvo įvertintas bazinėmis ir gliukozės stimuliuojamomis sąlygomis. Bazinei grupei pelės nevalgytos 6 valandas, po to išgėrus OL3 (150 mg / kg), linagliptino (0, 1 mg / kg) arba nešiklio ( n = 10). Kraujo mėginiai buvo paimti po 1, 5 valandos po junginio dozės. Gliukozės stimuliuotoje grupėje pelės buvo nevalgomos per naktį, po to jos buvo geriamos OL3 (150 mg / kg), linagliptino (0, 1 mg / kg) arba nešiklio ( n = 10). Po 1, 5 val. Po junginio dozės gavimo visos pelės buvo tiriamos su 4 g / kg geriamosios gliukozės, o kraujo mėginiai buvo paimti praėjus 5 minutėms po gliukozės įkrovimo. Visi kraujo mėginiai buvo dedami į Eppendorfo mėgintuvėlius, kuriuose buvo DPP-IV inhibitorius (Merck-Millipore, Bostonas, MA, JAV), o galutinė kraujo mėginių koncentracija buvo 1% ir 25 mg / ml EDTA. Aktyvioji GLP-1 forma plazmoje buvo kiekybiškai įvertinta naudojant ELISA rinkinį (Merck-Millipore, Bostonas, MA, JAV). Taip pat buvo nustatytas serumo DPP-4 aktyvumas pelėms, kurias stimuliuoja gliukozė.

Statistinė analizė

Statistiniai skaičiavimai buvo atlikti naudojant „GraphPad Prism 5“ programą („GraphPad Software“, San Diegas, CA, JAV). Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SEM. Visos statistinės analizės buvo atliktos naudojant dvipusį neporinį t testą. Skirtumas buvo laikomas reikšmingu, kai P <0, 05.

Rezultatai

Chemija

OL3 sintezė aprašyta 1 schemoje. Pradinė medžiaga 1, sintezuota taip, kaip aprašyta anksčiau 19, buvo sujungta su etilakrilinatu, naudojant mikrobangų krosnelės pagalba Pd katalizuojamą Hecko reakciją, po kurios atlikta redukcija ir hidrolizė, gaunant pagrindinę tarpinę medžiagą. rūgštis 4 su tret.-butil-5, 8, 11, 14, 17, 20-heksaksa-2-azatricosan-23-oatu, esteriui 5, naudojant kondensacijos agentą HATU. Esterių 5 hidrolizė suteikia 6 junginį, kuris buvo kondensuotas su linagliptinu tokiomis pačiomis sąlygomis, kad būtų gautas tikslinis junginys OL3 (1 schema).

OL3 yra stiprus TGR5 agonistas, silpnai slopinantis DPP-4 in vitro

Kaip parodyta 2A ir 2B paveiksluose, OL3 pasižymėjo stipriu aktyvumu, kai EC50 vertės buvo 86, 24 nmol / L hTGR5 ir 17, 36 nmol / L ant mTGR5. INT-777, kuris buvo plačiai naudojamas kaip TGR5 agonistas tiriant TGR5 fiziologines funkcijas, parodė hTGR5 ir mTGR5 atitinkamai 50 1, 08 μmol / L ir 0, 35 μmol / L, kurios atitiko ankstesnes ataskaitas 29 . Kadangi OL3 buvo DPP-4 inhibitorių grupės linagliptinas, mes ištyrėme slopinantį OL3 poveikį DPP-4. Didelės koncentracijos, kai IC50 vertė buvo maždaug 18, 44 ir 69, 98 μmol / L, žmogaus organizme ir pelių DPP-4 (h / mDPP-4) atitinkamai buvo stebimas silpnas OL3 slopinamasis poveikis. Kaip teigiama kontrolė, linagliptino IC50 buvo atitinkamai 1, 00 nmol / L ir 2, 91 nmol / L, palyginti su hDPP-4 ir mDPP-4 (3 pav.), Kaip anksčiau pranešta 30 . Šie rezultatai parodė, kad OL3 atliko dvigubas funkcijas galimai suaktyvindamas TGR5 ir silpnai slopindamas DPP-4 in vitro .

Image

OL3 aktyvavimo poveikis žmogaus ir pelių TGR5 in vitro . Buvo tiriama, ar junginiai stiprina TGR5 aktyvaciją HEK293 ląstelėse, transfekuotose hTGR5 (A) arba mTGR5 (B) ekspresijos plazmidėmis ir CRE-Luc reporterio geno plazmidėmis. Kiekvieno junginio EC50 verčių 95% pasikliovimo ribos buvo apskaičiuotos remiantis trijų nepriklausomų eksperimentų duomenimis.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę
Image

Slopinamasis OL3 ir linagliptino poveikis žmonių ir pelių DPP-4 aktyvumui in vitro . Junginių slopinamasis poveikis žmogaus rekombinantiniam DPP-4 (A) arba pelės serumui DPP-4 (B) buvo apskaičiuotas pagal nešiklio kontrolę. Kiekvieno junginio IC50 verčių 95% pasikliovimo ribos buvo apskaičiuotos remiantis trijų nepriklausomų eksperimentų duomenimis.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

OL3 priklausomai nuo dozės, stimuliavo GLP-1 sekreciją NCI-H716 ląstelėse

Norint nustatyti OL3 stiprumą stimuliuojant GLP-1 sekreciją in vitro , buvo naudojamos NCI-H716 ląstelės (žmogaus enteroendokrininė L ląstelių linija), endogeniškai ekspresuojančios TGR5 7, 31, 32 . Forbolas 12-miristatas 13-acetatas (PMA) buvo teigiama kontrolė. Rezultatai parodė, kad OL3 stipriai padidino GLP-1 sekreciją priklausomai nuo dozės. 2 valandas trukusioje OL3 inkubacijoje esant 3 μmol / L, padidėjo GLP-1 sekrecija 1, 5 karto. Po 30 μmol / L OL3 ekspozicijos buvo pasiektas maksimalus 2, 4 karto padidėjimas (4 paveikslas), patvirtinantis, kad OL3 in vitro sukėlė GLP-1 sekreciją enteroendokrininėse ląstelėse.

Image

OL3 priklausomai nuo dozės, stimuliavo GLP-1 sekreciją NCI-H716 ląstelėse. NCI-H716 ląstelės buvo apdorotos 1 μmol / L PMA arba OL3 nurodytomis koncentracijomis 2 valandas, buvo išmatuota aktyvios formos GLP-1 lygio ekspresija ( n = 3). Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01 palyginti su kontroliniu gydymu.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

OL3 parodė silpną Caco-2 ląstelių pralaidumą

Žmogaus storosios žarnos karcinomos (Caco-2) ląstelė plačiai naudojama apibūdinti absorbciją žarnyne ir vaistų sekreciją in vitro 33 . Ankstesniame pranešime MN6 parodė aukštą „Caco-2“ ląstelių pralaidumą ( P app = 6, 75 × 10 –6 cm / s) 20 . Dabartiniame tyrime Caco-2 ląstelės buvo naudojamos įvertinti OL3 pralaidumą in vitro . Kaip ir tikėtasi, OL3 „Caco-2“ pralaidumas ( P app = 0, 03 × 10 –6 cm / s) buvo daug mažesnis nei MN6 ir kitos teigiamos kontrolės, propranololio ( P app = 19, 20 × 10 –6 cm / s), reiškia, kad OL3 yra hipoosmozės sukėlėjas, palyginti su MN6 (1 lentelė).

Pilno dydžio lentelė

Farmakokinetiniai tyrimai su ICR pelėmis

Kadangi OL3 Caco-2 modelyje buvo pralaidus, mes atlikome farmakokinetinius tyrimus su ICR pelėmis, norėdami toliau tirti jo absorbciją in vivo . Išgėrus OL3 150 mg / kg kūno svorio pelėms, OL3 koncentracija serume buvo tiriama po 1, 0, 3, 5, 5, 5 valandos po dozės išgėrimo. Kaip parodyta 2 lentelėje, OL3 koncentracija per 1 h pasiekė 101, 10 ng / ml, o po 5, 5 val. Po dozės sumažėjo iki 13, 38 ng / ml, ir tai patvirtina mažą OL3 absorbciją in vivo . Linagliptino koncentracija serume buvo atitinkamai 0, 19, 0, 16, 0, 06 ng / ml, vartojant atitinkamai 1, 0, 3, 5, 5, 5 valandos. Šie duomenys parodė, kad OL3 buvo blogai absorbuojamas, todėl jo in vivo sisteminė ekspozicija buvo maža; kaip vienas iš OL3 metabolitų, serume taip pat buvo aptinkamas linagliptinas.

Pilno dydžio lentelė

Ūmus OL3 įvedimas ICR pelėms pagerino gliukozės toleranciją, nesukeldamas tulžies pūslės užpildymo

Norint įvertinti in vivo OL3 poveikį gliukozės homeostazei, OGTT buvo atliktas ICR pelėms. Kaip parodyta 5A paveiksle, gliukozės kiekis kraujyje padidėjo ir pasiekė aukščiausią vertę per 30 min. Po gliukozės vartojimo. Vartojant OL3 75, 150, 300 mg / kg dozėmis, smarkiai sumažėjo gliukozės kiekis kraujyje 21, 72%, 27, 54% ir 30, 76% (13, 96 ± 0, 70 mmol / L, 12, 93 ± 0, 89 mmol / L, 12, 35 ± 0, 85 mmol / kg). L atitinkamai 75, 150, 300 mg / kg OL3 grupėse, palyginti su 17, 84 ± 2, 00 mmol / L kontrolinėje grupėje), palyginti su 32, 31% 50 mg / kg MN6 (12, 08 ± 0, 90 mmol / L MN6). grupė palyginti su 17, 84 ± 2, 00 mmol / L kontrolinėje grupėje). Pastebėtas nuo dozės priklausomas gliukozės kiekio kraujyje (AUC) 0–120 min sumažėjimas, o 300 mg / kg OL3 sumažėjo maksimaliai 31, 43%, palyginti su kontroline grupe. MN6, esant 50 mg / kg koncentracijai, sumažėjo 36, 52% (17, 17 ± 0, 98 mmol / L · h 300 mg / kg OL3 grupėje, 15, 89 ± 0, 76 mmol / L · h MN6 grupėje, palyginti su 25, 03 ± 2, 33 mmol). / L · h kontrolinėje grupėje, 5B paveikslas). Pasibaigus OGTT, pelėms buvo suteiktas maistas 2 valandas, o tulžies pūslės užpildymas buvo įvertintas išmatuojant jos tūrį. Pelėms, gydomoms MN6, vartojant 50 mg / kg dozę, stebėtas tulžies pūslės tūrio padidėjimas 2, 09 karto, o OL3 nepadidino jokio žymaus tūrio padidėjimo, palyginti su kontroline grupe (5C pav.). Šie rezultatai rodo, kad OL3 pagerino gliukozės toleranciją, tačiau žymiai nepakėlė tulžies pūslės užpildymo ICR pelėse.

Image

OL3 pagerino burnos gliukozės toleranciją be akivaizdaus tulžies pūslės užpildymo ICR pelėms. Patinėliai ICR pelės ( n = 8) buvo išgerti OL3 arba MN6 nurodytomis koncentracijomis arba tirpiklio kontrole 90 min. Prieš OGTT eksperimentą įkėlus per burną 4 g / kg gliukozės. (A) Nurodytais laiko momentais buvo ištirtas gliukozės kiekis kraujyje, ir (B) apskaičiuotas plotas po kreive (AUC). Po OGTT eksperimento nevalgiusioms pelėms buvo patiektas maistas 2 valandas ir išmatuotas tulžies pūslės tūris (C). Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, palyginti su kontroline grupe.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

OL3 sumažino gliukozės kiekį nevalgius kraujyje ir pagerino burnos gliukozės toleranciją diabetinėms ob / ob pelėms

Kaip vienas iš plačiausiai naudojamų metabolinių nenormalių gyvūnų modelių, 2 tipo diabetinės ob / ob pelės turi hiperglikemiją ir sutrikusią gliukozės toleranciją reaguodamos į geriamąjį gliukozės poveikį. Vieną kartą per burną sušvirkštus 200 mg / kg OL3, gliukozės kiekis nevalgius kraujyje reikšmingai sumažėjo 24, 65% (13, 27 ± 1, 19 mmol / L 200 mg / kg OL3 grupėje, palyginti su 17, 61 ± 1, 44 mmol / L kontrolinėje grupėje). grupė) 2 val. po dozės; 400 mg / kg OL3 dar labiau sumažino gliukozės kiekį nevalgius kraujyje 24, 73% ir 22, 98% atitinkamai po 2 ir 4 val. (13, 26 ± 1, 10 mmol / L ir 15, 53 ± 1, 59 mmol / L per 2 ir 4 valandas). atitinkamai 400 mg / kg OL3 grupės valanda, palyginti su 17, 61 ± 1, 44 mmol / L ir 20, 16 ± 1, 25 mmol / L kontrolinės grupės atitinkamai per 2 ir 4 valandas (6A pav.). Vienkartinis OL3 gydymas 400 mg / kg dozėmis taip pat pagerino ob / ob pelių gliukozės toleranciją, todėl 15 ir 30 min. Po gliukozės injekcijos žymiai sumažėjo gliukozės kiekis kraujyje - 14, 11% ir 12, 64% (35, 65 ±). 1, 56 mmol / L ir 40, 69 ± 2, 17 mmol / L atitinkamai per 15 ir 30 minučių 400 mg / kg OL3 grupės, palyginti su 41, 50 ± 0, 95 mmol / L ir 46, 58 ± 1, 33 mmol / L per 15 ir 30 minučių kontrolinėje grupėje., atitinkamai, 6B pav.) ir parodė tendenciją sumažinti (AUC) 0–120 min gliukozės kiekį kraujyje (6C paveikslas). Šie rezultatai parodė, kad OL3 gali pagerinti gliukozės homeostazę diabetinėms ob / ob pelėms.

Image

OL3 sumažino gliukozės kiekį kraujyje ir pagerino burnos gliukozės toleranciją diabetinėms ob / ob pelėms. (A) Gliukozės kiekis kraujyje buvo nustatytas po vienkartinio peroralinio OL3 200 ir 400 mg / kg gydymo arba nešiklio kontrolės 2 val. Nevalgiusioms ob / ob pelėms ( n = 7–8) nurodytais laiko momentais. Moteriškos ob / ob pelės ( n = 7–8) buvo sušvirkštos OL3 esant nurodytai koncentracijai arba kontrolinei medžiagai kontroliuoti 90 min., Po 1, 5 g / kg gliukozės įkrovimo OGTT eksperimentui. (B) Buvo ištirtas gliukozės kiekis kraujyje ir (C) apskaičiuotas plotas po kreive (AUC). Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM. * P <0, 05, palyginti su kontroliniu gydymu.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Gliukozės homeostazės pagerėjimas OL3 buvo sinergetinis poveikis, skatinantis GLP-1 sekreciją žarnyne ir slopinantis GLP-1 skilimą plazmoje.

Atsižvelgiant į tai, kad OL3 turėjo dvigubas funkcijas, aktyvuodamas TGR5 ir slopindamas DPP-4 in vitro , mes toliau tyrėme, ar OL3 turėjo tuos pačius sinergetinius mechanizmus, mažindami gliukozės kiekį in vivo . Kaip parodyta 7A paveiksle, praėjus 1 valandai po dozės, 75 mg / kg, 150 mg / kg ir 300 mg / kg OL3 sumažino DPP-4 aktyvumą serume atitinkamai 25, 34%, 26, 17% ir 26, 24%. OL3, esant 150 mg / kg ir 300 mg / kg, palaikė slopinimo intensyvumą viso eksperimento metu, tuo tarpu vienkartinė MN6 dozė (50 mg / kg) neparodė jokio DPP-4 slopinančio efektyvumo. Mes toliau tyrėme OL3 poveikį TGR5 aktyvacijai in vivo . Kaip parodyta 7B paveiksle, 0, 1 mg / kg linagliptino sumažino DPP-4 aktyvumą 38, 72%, o tai buvo panašu į 150 mg / kg OL3 poveikį (sumažėjimas 35, 15%). Taigi 0, 1 mg / kg linagliptino buvo naudojama kaip kontrolė, kad būtų imituojamas slopinamasis 150 mg / kg OL3 poveikis DPP-4. Įvertinę aktyviąją GLP-1 formą plazmoje, mes suleidome 150 mg / kg OL3 arba 0, 1 mg / kg linagliptino bazinėmis ar gliukozės stimuliuotomis sąlygomis. Rezultatai atskleidė, kad esant pagrindinėms sąlygoms, OL3 reikšmingai padidėjo 26, 44%, palyginti su kontroline grupe, ir parodė tendenciją padidinti aktyviąją GLP-1 formą plazmoje, palyginti su linagliptinu. Gliukozės stimuliuojamomis sąlygomis OL3 buvo susijęs su padidėjusia aktyvia GLP-1 forma 44, 89%, palyginti su linagliptinu (7C pav.), Rodantis, kad OL3 ne tik slopina DPP-4 aktyvumą, bet ir padidino GLP-1 sekreciją. aktyvinant TGR5. Šie duomenys rodo, kad padidėjusi aktyvioji GLP-1 forma plazmoje, stimuliuojama OL3, atsirado dėl sinergetinio stimuliuojančio sekreciją ir slopinančio skaidymąsi.

Image

OL3 įtaką gliukozės homeostazei sukėlė sinergetinis poveikis, skatinantis GLP-1 sekreciją žarnyne ir slopinantis GLP-1 skilimą plazmoje. (A) Serumo DPP-4 aktyvumas buvo matuojamas nurodytais laiko momentais išgėrus OL3 75, 150 ir 300 mg / kg dozėmis, MN6 50 mg / kg dozėmis arba nešikliu ICR pelėms ( n = 8). . (B) 6 valandos nevalgius (pagrindinė grupė) arba nevalgius (gliukozės stimuliuota grupė) ICR pelėms ( n = 10) buvo sušvirkšta OL3 150 mg / kg, linagliptino 0, 1 mg / kg arba kontrolinė medžiaga ir nakties nevalgiusioms pelėms. po 1, 5 valandos po dozės buvo užkrėstos 4 g / kg gliukozės. DPP-4 aktyvumas serume buvo įvertintas pelėms, kurioms buvo sukelta gliukozės koncentracija. (C) Aktyviosios GLP-1 formos ekspresija plazmoje buvo nustatyta tiek bazine, tiek gliukozės stimuliuotomis sąlygomis. Rezultatai pateikiami kaip vidurkis ± SEM. * P <0, 05, ** P <0, 01, palyginti su kontroliniu gydymu, kaip nurodyta.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Nustatyta, kad TGR5 yra perspektyvus II tipo cukrinio diabeto gydymo tikslas, nes skatina GLP-1 sekreciją L žarnyno ląstelėse ir reguliuoja energijos sąnaudas raumenyse ir rudajame riebaliniame audinyje 34 . Tačiau TGR5 agonistų raida buvo sustabdyta dėl nepageidaujamo sisteminio šalutinio poveikio 35 . Dabartiniame tyrime pirmą kartą mes sujungėme linagliptiną, didelio poliškumo 36 DPP-4 inhibitorių, su MN6, nauju TGR5 agonistu, kad gautume naują mažai sisteminio poveikio agentą OL3. Be to, mes apibūdinome OL3 kaip naują galingą TGR5 agonistą, kuris žymiai padidino aktyviąją GLP-1 formą plazmoje ir sumažino gliukozės kiekį kraujyje, nesukeldamas pelių tulžies pūslės užpildymo.

Ankstesniame mūsų tyrime MN6 buvo apibūdinamas kaip stiprus TGR5 agonistas, kurio EC50 yra atitinkamai 1, 5 nmol / L ir 18 nmol / L, atitinkamai žmogaus ir pelių TGR5 19 . OL3 buvo gautas derinant linagliptiną su MN6. In vitro tyrimas patvirtino, kad OL3 palaikė patenkinamą aktyvacijos potencialą - atitinkamai žmogaus ir pelės TGR5 buvo EC 50 vertės 86, 24 nmol / L ir 17, 36 nmol / L. Be to, nuo dozės priklausomas OL3 stimuliavo GLP-1 sekreciją NCI-H716 ląstelėse, endogeniškai išreiškiančiose TGR5, dar kartą patvirtindamas, kad OL3 aktyvuoja TGR5 in vitro . Tuo tarpu OL3 taip pat parodė silpną žmogaus ir pelių DPP-4 slopinimą in vitro , kuris gali būti susijęs su linagliptino įdėjimu. Norint įvertinti OL3 absorbciją žarnyne, buvo atliktas vienkartinio „Caco-2“ sluoksnio pralaidumo tyrimas, kuris yra plačiai priimtas ląstelių modelis tiriant vaistų absorbciją ir sekreciją žarnyne. Kaip ir tikėtasi, linagliptino grupės pridėjimas buvo susijęs su daug mažesniu OL3 pralaidumu, palyginti su MN6. In vivo OL3 farmakokinetikos tyrimas taip pat buvo atliktas su ICR pelėmis. Išgėrus 150 mg / kg OL3 dozę, OL3 koncentracija serume buvo 101, 10, 43, 10 ir 13, 38 ng / ml 1, 0, 3, 5 ir 5, 5 val. Ankstesniame tyrime mes pranešėme apie MN6 analogo, apibūdinamo kaip 23g junginys, absorbciją in vivo . 50 mg / kg 23 g ICR pelėms buvo gauta atitinkamai 1243 ng / ml ir 936 ng / ml koncentracija serume, praėjus atitinkamai 0, 5 val. Ir 1 val. Po dozės 19, o tai dar labiau rodo, kad OL3 yra mažai sisteminė ekspozicija. Todėl įvesdami linagliptiną į MN6, mes sukūrėme naują junginį, pasižymintį stipriu TGR5 agonistiniu ir silpnu DPP-4 slopinančiu aktyvumu, tačiau mažu pralaidumu in vitro ir žemu sisteminiu poveikiu in vivo .

Ūminis OL3 poveikis mažinant gliukozės kiekį buvo tiriamas normalių ir 2 tipo diabetu sergančių gyvūnų modeliuose. Vienkartinė išgerta OL3 dozė 75, 150 arba 300 mg / kg padidino gliukozės toleranciją ICR pelėms, kurių jautrumas insulinui yra normalus. Dar svarbiau, kad, priešingai nei kiti TGR5 agonistai, sukeliantys tulžies pūslės užpildymą kaip pagrindinį šalutinį poveikį 12, OL3 neparodė jokio poveikio tulžies pūslės tūriui ICR pelėms, net ir vartojant didelę 300 mg / kg dozę; 50 mg / kg MN6 dozė reikšmingai padidino tulžies pūslės tūrį. OL3 sumažino nevalgiusio gliukozės kiekį kraujyje ob / ob pelėms, vartojant 200 ir 400 mg / kg dozes. Vienkartinė geriamoji 400 mg / kg OL3 dozė žymiai pagerino gliukozės toleravimą ob / ob pelėms, tačiau, vartojant 200 mg / kg dozę, akivaizdaus efekto nepastebėta. Kadangi ob / ob pelės pasižymėjo dideliu atsparumu 38, 39 insulinui, norint pagerinti burnos gliukozės toleranciją, palyginti su ICR pelėmis, reikės didesnių OL3 dozių. Šie duomenys parodė, kad OL3 reguliuoja gliukozės homeostazę tiek normalių, tiek diabetinių gyvūnų modeliuose. Mūsų strategija sumažinti sisteminį šalutinį poveikį padidinant TGR5 agonistų MW ir tPSA buvo įrodyta, kad yra efektyvi.

Atsižvelgiant į tai, kad OL3 buvo susintetintas siekiant įtraukti linagliptiną ir kuris silpnai slopino DPP-4 in vitro , mes ištyrėme, ar OL3 galėtų slopinti DPP-4 in vivo . DPP-4 aktyvumas serume buvo kiekybiškai įvertintas atliekant OGTT ICR pelėms, o 26, 17% DPP-4 slopinimo greitis buvo stebimas praėjus 1 valandai po OL3 dozės 150 mg / kg. Tačiau iš mūsų rezultatų paaiškėjo, kad plazmoje buvo aptikta mažai OL3, o OL3 koncentracija serume buvo per maža, kad sukeltų slopinimą. Todėl mes spėliojome, kad linagliptinas, kuris gali būti OL3 metabolitas, galėtų prisidėti prie DPP-4 slopinimo in vivo . Kaip parodė farmakokinetiniai duomenys, išgėrus 150 mg / kg OL3, linagliptino koncentracija serume buvo 0, 19 ng / ml 1 val. Kadangi linagliptinas yra stiprus DPP-4 inhibitorius 24, 36, o IC50 buvo tik 2, 91 nmol / L, palyginti su mDPP-4, mūsų tyrime linagliptino koncentracija kraujo plazmoje gali būti pakankama DPP-4 slopinimui. Šie rezultatai leido manyti, kad mažai į plazmą absorbuoto OL3 buvo iš dalies metabolizuotas į linagliptiną, todėl in vivo buvo slopinamas DPP-4 poveikis.

Norėdami toliau ištirti OL3 gliukozės kiekį mažinančio poveikio mechanizmą, mes įvertinome aktyviąją GLP-1 formą plazmoje ICR pelių. Panašus linagliptino DPP-4 slopinimas su OL3 buvo nustatytas siekiant paneigti aktyvaus GLP-1 padidėjimą, kurį sukelia DPP-4 slopinimas. OL3 ne tik turėjo panašų slopinantį poveikį DPP-4, bet ir papildomai padidino GLP-1 aktyviosios formos plazmoje, palyginti su linagliptinu. Šie duomenys rodo, kad OL3 stimuliuojamos aktyvios GLP-1 formos padidėjimą lėmė ne tik DPP-4 slopinimas, bet ir TGR5 aktyvacija. Kartu šie rezultatai atskleidė, kad OL3 pagerino gliukozės homeostazę normaliems ir diabetu sergantiems gyvūnams, o tai priklausė nuo sinergetiškai aktyvios GLP-1 formos padidėjimo, aktyvinant TGR5 žarnyno L ląstelėse ir slopinant DPP-4 aktyvumą plazmoje.

Apibendrinant, susiedami linagliptiną su MN6, mes sukūrėme naują junginį OL3 - mažai absorbuojamą junginį su stipriu TGR5 aktyvinimu ir silpnu DPP-4 slopinimu. OL3 parodė gliukozės kiekį mažinantį poveikį, susijusį su aktyviosios GLP-1 formos padidėjimu plazmoje. Šį padidėjimą paskatino TGR5 aktyvinimas žarnyne ir DPP-4 slopinimas plazmoje be tulžies pūslės užpildymo dėl nedidelės sisteminės ekspozicijos. Mūsų tyrime pristatoma nauja TGR5 agonistų, nukreiptų į žarną, kūrimo strategija, siekiant išvengti sisteminio šalutinio poveikio gydant 2 tipo diabetą.

Autoriaus indėlis

Ying LENG ir Jian-hua SHEN sukūrė tyrimus; Šan-yao MA, Meng-meng NING, Qing-an ZOU, Ying FENG ir Yang-liang YE atliko tyrimus; Straipsnį parašė Shan-yao MA, Meng-meng NING, Yang-liang YE ir Ying LENG.