Oligomannurarato sulfatas slopina cxcl12 / sdf-1 sąlygojamą žmogaus naviko ląstelių proliferaciją ir invaziją in vitro | acta pharmaologica sinica

Oligomannurarato sulfatas slopina cxcl12 / sdf-1 sąlygojamą žmogaus naviko ląstelių proliferaciją ir invaziją in vitro | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

JG6 yra naujas jūrinis oligosacharidas, kuris slopina angiogenezę ir naviko metastazes. Šiame tyrime mes siekėme nustatyti galimą taikinį, atsakingą už JG6 priešvėžinį aktyvumą.

Metodai:

Buvo tiriama žmogaus kepenų vėžio ląstelių linija Bel-7402 ir žmogaus gimdos kaklelio vėžio ląstelių linija HeLa. CXCL12 stimuliuojamas ląstelių proliferacija ir migracija buvo nustatytos atitinkamai naudojant CCK-8 rinkinį ir transvelio tyrimą. Atliktas Western blot tyrimas CXCL12 / CXCR4 ašies pokyčiams ištirti. Norint apibūdinti galimą JG6 ir CXCL12 / CXCR4 ašies sąveiką, buvo atliktas molekulinis dokas ir paviršiaus plazmoninis rezonansas (SPR).

Rezultatai:

Gydymas CXCL12 stipriai stimuliavo proliferaciją ir migraciją tiek Bel-7402, tiek HeLa ląstelėse. Ląstelių apdorojimas JG6 (10, 50 ir 100 μg / ml) priklausomai nuo dozės trukdė CXCL12 stimuliuojamam ląstelių dauginimuisi ir migracijai. Be to, CXCL12 greitai sukėlė AKT, ERK, FAK ir Paxillin fosforilinimą Bel-7402 ir HeLa ląstelėse, tuo tarpu išankstinis gydymas JG6 priklausomai nuo dozės slopino CXCL12 sukeltą šių baltymų fosforilinimą. SPR tyrimas parodė, kad JG6 prisijungė prie CXCL12 su dideliu afinitetu. Molekulinio doko tyrime JG6 sąveikavo su CXCL12 per daugialypę poliarinę sąveiką, įskaitant 6 joninius ryšius ir 7 vandenilio ryšius.

Išvada:

CGCL12 / CXCR4 ašies slopinimas JG6 gali lemti jo priešvėžinį aktyvumą.

Įvadas

CXCL12, dar vadinamas stromos ląstelių išvestiniu faktoriu-1 (SDF-1), yra CXC chemokinas, kuris pirmiausia jungiasi su CXC receptoriais 4 (CXCR4). Šis jungimasis sukelia tarpląstelinį signalizavimą, kuris vaidina pagrindinį vaidmenį CXCR4 + navikinių ląstelių chemotaksijoje, ląstelių išgyvenime, proliferacijoje ir metastazėse prie organų, kurie ekspresuoja CXCL12 1, 2 . Buvo pranešta, kad CXCR4 + vėžys metastazuoja kaulus ir limfmazgius priklausomai nuo CXCL12 3, 4 . Todėl CXCL12 / CXCR4 ašis tapo potencialiu vėžio terapijos taikiniu.

Vis labiau stengiamasi kliudyti CXCL12 / CXCR4 ašies funkcijai, nukreipiant arba į ligandą, arba į receptorių, naudojant mažų molekulių receptorių antagonistus, receptorius rišančius antikūnus arba modifikuotus chemokinus 5, 6 . Tarp šių parinkčių yra efektyvus būdas blokuoti CXCL12 prieigą prie CXCR4. Buvo pranešta, kad glikozaminoglikanai (GAG) ir syndecan-4 kliudė invaziją į žmogaus navikines ląsteles (HeLa ląsteles), blokuodami CXCL12 ir CXCR4 7 sąveiką, ir šią išvadą patvirtino CXCL12 sąveikos su GAG 8 struktūrinė analizė , 9 . Atitinkamai, heparinas, sulfatuotas glikozaminoglikanas, blokavo CXCL12 sukeltą žmogaus vėžio ląstelių augimą, migraciją ir invaziją 7, 10 . Be to, žmogaus hepatomos ląstelių gydymas serijomis GAG mimetikų slopino CXCL12 sukeltą migraciją ir invaziją 11 .

JG6 yra naujas jūrinis oligosacharidas, atrastas mūsų laboratorijoje. JG6 reikšmingai slopino vėžio augimą ir metastazes in vitro ir in vivo 12, 13, tačiau mechanizmai išlieka neaiškūs. Svarbu tai, kad mes pastebėjome, kad JG6 struktūra primena GAG struktūrą. Čia mes ištyrėme, ar JG6 turi galimą priešvėžinį aktyvumą, įsikišdamas į CXCL12 / CXCR4 ašį.

medžiagos ir metodai

Reagentai

JG6 buvo sukurtas pusiau sintezės būdu, po to modifikuojant sulfatu, reaguojant oligomannuraratą iš natrio alginato į formamidą turinčio ClSO 3H. Produktų pH buvo sureguliuotas iki 7, 0 naudojant 4 mol / l NaOH ir nudruskinamas naudojant Sephadex G-10. Produktai buvo sujungti ir užšaldyti. Analizė atlikta naudojant aukštos kokybės gelio skvarbos chromatografiją (HPGPC) su G3000W × 1 kolonėle (300 mm × 7, 8 mm) (TOSOH, Japonija). Struktūra pavaizduota 1 paveiksle. JG6 sudaro β- (1-4) glikozidiškai sujungtas D-mannuraratas su hidroksilo grupės sulfato modifikacijomis C2 / C3 padėtyje. „CXCL12“ buvo įsigytas iš „R&D Systems“ (Mineapolis, MN, JAV).

Image

JG6 cheminė struktūra.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Ląstelių kultūros

Žmogaus kepenų vėžio „Bel-7402“ ląstelės ir žmogaus gimdos kaklelio vėžio „HeLa“ ląstelės buvo gautos atitinkamai iš Biochemijos ir ląstelių biologijos instituto bei Amerikos tipo kultūros kolekcijos. Ląstelės buvo auginamos RPMI-1640 arba didelio gliukozės lygio DMEM terpėje (Gibco, Grand Island, NY, JAV), papildytas 10% vaisiaus galvijų serumu (Gibco, Grand Island, NY, JAV) ir antibiotikais (100 V / ml penicilino ir 100 μg / ml streptomicino). Ląstelės buvo palaikomos 5% CO 2 drėgnoje atmosferoje 37 ° C temperatūroje.

Platinimo tyrimas

„Bel-7402“ ir „HeLa“ ląstelės buvo inkubuojamos terpėje, kurioje nėra serumo, 6 valandas, po to veikiamos įvairiomis JG6 (0, 10, 50 arba 100 μg / ml) ir CXCL12 (300 ng / ml) koncentracijomis 72 valandas. Ląstelių proliferacija buvo nustatyta naudojant CCK-8 rinkinį (Dojindo, Kumamoto, Japonija).

Migracijos tyrimas

Ląstelių migracijos tyrimas buvo atliktas transvelio Boydeno kameroje (8 μm porų dydis, Costar, MA, JAV). Trumpai tariant, naviko ląstelės (3, 5x105 ląstelių kiekvienoje duobutėje) buvo pasėtos į viršutinę transvero kameros dalį, o apatinė kamera buvo užpildyta auginimo terpe, papildyta 50 arba 300 ng / ml CXCL12 ir JG6 (0, 10, 50, arba 100 μg / ml). CXCL12 nebuvo pridėtas prie neigiamos kontrolės grupės. Ląstelės buvo kultivuojamos 24–36 valandas 37 ° C temperatūroje gerai sudrėkintame inkubatoriuje, o tada visos migruotos ląstelės buvo fiksuotos, nudažytos 0, 1% krištolo violetinės spalvos ir pavaizduotos mikroskopu. Nudažytos ląstelės buvo ekstrahuotos 10% acto rūgštimi ir išmatuota OD vertė esant 595 nm.

Western blot analizė

Ląstelės badaujamos 24 valandas, iš anksto inkubuojamos su JG6 (0, 10, 50 arba 100 μg / ml) 6 valandas, o po to indukuojamos CXCL12 (R&D, Mineapolis, MN, JAV) esant 50 ng / ml 15 min. Po inkubacijos ląstelės buvo lizuotos 1x SDS lizės buferiu (50 mmol / l Tris-HCl, pH 6, 8, 100 mmol / L DTT, 2% SDS, 0, 1% bromfenolio mėlynojo ir 10% glicerolio), tada lizatai praskaidrinami. centrifuguojant 14 000 x g 10 min. SDS-PAGE buvo tiriami vienodi baltymų kiekiai ir perkeliami į nitroceliuliozės membranas (Amersham Pharmacia Biotech, JAV). Membranos buvo užkimštos 5% neriebiu pienu ir inkubuojamos su atitinkamais pirminiais antikūnais 4 ° C temperatūroje per naktį. Imunoreaktyvios juostos buvo vizualizuotos naudojant „SuperSignal West PicoChemiluminescent Kit“ (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, JAV), naudojant Image Quant LAS4000 (GE, JAV). Pirminiai naudojami antikūnai yra antikūnai, būdingi fosfopaksilinui (Y118), Paxillin, Fak, fosfo-Erk1 / 2, Erk1 / 2, fosfo-Akt (Ser473) ir Akt (ląstelių signalizacijos technologija, JAV), p-Fak (pY861). („Invitrogen“, JAV), „CXCL12“ ir „CXCR4“ („Abcam“, JK).

Molekulinis dokas

Chemokino CXCL12 BMR struktūra buvo gauta iš Brookhaveno baltymų duomenų banko (PDB įrašas: 2K03). Grandinė A ir C grandinė iš 2K03 buvo laikomos receptoriais, o grandinė B buvo pasirinkta tinklelio dėžutės centrui apibrėžti. Molekulinis dokas buvo atliktas naudojant „Glide“ su „XP“ režimu 14, 15 . Junginius eskizavo Maestro, o po to apdorojo LigPrep kartu su Epik protonų būsenoms gydyti. Tolesnei analizei buvo pasirinktos dokuotos konformacijos ligandą surišančioje vietoje.

Paviršiaus plazmono rezonanso analizė

Ryšio tarp JG6 ir CXCL12 reakcijos kinetika ir specifiškumas buvo analizuojami naudojant BIAcore paviršiaus plazmoninio rezonanso aparatą. Trumpai tariant, JG6 buvo imobilizuotas ant NLC jutiklio lusto pagal Ligand Thiol protokolą, aprašytą BIA taikymo vadove. Norint įvertinti rišamumą realiuoju laiku, 5–80 nmol / l CXCL12 buvo įšvirkščiamas ant jutiklio lusto paviršiaus imobilizuotu JG6 ir po to 5 minutes plaunamas HBS-EP buferiu. Jutiklio lusto paviršius buvo regeneruotas naudojant 60 μL NaCl (2 mol / L). Visi surišimo eksperimentai buvo atlikti 25 ° C temperatūroje, esant pastoviam HBS-EP srautui 10 μL / min. Norint atlikti surišimo afinitetą, asociacijos fazei buvo leista tęsti pusiausvyrą.

Neapdorotos paviršiaus dalys buvo užblokuotos etanolaminu. Norint ištaisyti nespecifinius surišimo ir tūrinio lūžio rodiklio pokyčius, kiekvieno eksperimento kontrolė buvo naudojama tuščiajam kanalui (FC2) be oligosacharido. Visų rišamųjų sąveikų sensorinės schemos buvo užfiksuotos realiu laiku, o tuščios kanalo parodymai buvo atimti iš rezultatų prieš analizę. Masės pokyčiai dėl surišimo atsako buvo registruojami kaip rezonanso vienetai (Ru). Įrišimo kinetika ir afinitetai buvo nustatyti SPR naudojant BIAcore programinę įrangą 3.1.

Statistinė analizė

Duomenys pateikiami kaip vidurkis ± SD. Statistinis reikšmingumas buvo išanalizuotas naudojant dvipusį Studento t- testą. Vertė P <0, 05 buvo laikoma reikšminga.

Rezultatai

JG6 kliudė CXCL12 sukeltai vėžio ląstelių proliferacijai

CXCL12 / CXCR4 biologinė ašis vaidina svarbų vaidmenį reguliuojant navikinių ląstelių proliferaciją. Pirmiausia mes ištyrėme, ar JG6 turėjo įtakos CXCL12 stimuliuojamų ląstelių augimui. CCK-8 tyrimas buvo atliktas norint išmatuoti Bel-7402 ląstelių ir HeLa ląstelių proliferacijos greitį. Kaip anksčiau buvo pranešta 10, CXCL12 stimuliavo naviko ląstelių augimą. Apdorojant 300 ng / ml CXCL12, proliferacijos greitis padidėjo beveik 50% (2A paveikslas). Šis poveikis buvo beveik panaikintas, kai ląstelės tuo pačiu metu buvo gydomos JG6. JG6 sukėlė CXCL12 stimuliuojamų Bel-7402 ląstelių proliferacijos slopinimą nuo dozės. Ląstelių proliferacijos greitis buvo slopinamas 22, 2%, esant 10 μg / ml, 46, 5%, esant 50 μg / ml, ir 51, 0%, esant 100 μg / ml. Panašūs rezultatai buvo pastebėti HeLa ląstelėse, kurių gydymas 10, 50 arba 100 μg / ml JG6 davė atitinkamai 22, 2%, 37, 2% ir 41, 5% mažesnį ląstelių proliferacijos greitį nei nesant JG6 (2A pav.). Tačiau JG6 neslopino Bel-7402 ir HeLa ląstelių proliferacijos in vitro normaliomis ląstelių kultūros sąlygomis (duomenys neparodyti).

Image

JG6 blokavo CXCL12 sukeltą vėžio ląstelių dauginimąsi ir migraciją in vitro . (A) JG6 slopino vėžio ląstelių proliferaciją, sukeltą CXCL12. (a) CXCL12 sukėlė Bel-7402 (kairėje) ir HeLa (dešinėje) ląstelių proliferaciją. Bel-7402 (b) ir HeLa (c) ląstelės buvo apdorotos CXCL12 (300 ng / ml) ir 0, 10, 50 arba 100 μg / ml JG6 72 valandas. (B, C) JG6 slopino CXCL12 sukeltą ląstelių migraciją Bel-7402 (B) ir HeLa ląstelėse (C). Parodytas reprezentatyvus ląstelių migracijos vaizdas (didinimas: 200 ×; +: apdorojimas CXCL12). Ląstelių migracijos slopinimo greitis JG6 buvo parodytas procentais nuo gydymo CXCL12 (vidurkis ± SD, iš trijų nepriklausomų eksperimentų. B P <0, 05, c P <0, 01, palyginti su kontrole).

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

JG6 slopino CXCL12 sukeltą vėžio ląstelių migraciją

Taip pat žinoma, kad CXCL12 / CXCR4 biologinė ašis moduliuoja vėžio ląstelių chemotaksinį judrumą. Toliau įvertinome, ar JG6 šį procesą slopina. Kaip parodyta 2B paveiksle, Bel-7402 ląstelės reagavo į CXCL12 indukciją, kai JG6 koncentracija buvo 50 ng / ml 48 valandas, kai pastebimas pastebimas migruojančių ląstelių padidėjimas, palyginti su neigiama kontroline grupe (kuri buvo inkubuota be CXC12 ir FBS). ). JG6 slopino CXCL12 sukeltą Bel-7402 ląstelių migraciją priklausomai nuo dozės, užtikrindamas 100% slopinimą 100 μg / ml. Be to, nors HeLa ląstelės mažiau reagavo į CXCL12 stimuliaciją nei Bel-7402 ląstelės, JG6 panašiai sumažino CXCL12 sukeltą migraciją HeLa ląstelėse 44%, 88% ir 97% po gydymo 10, 50 arba 100 μg / ml. JG6 (2C pav.). Tačiau JG6 netrukdė Bel-7402 ląstelių migracijai, kurią sukėlė 10% FBS (duomenys nepateikti).

JG6 blokavo CXCL12 sukeltą signalo perdavimą

Mes parodėme, kad JG6 veiksmingai slopino CXCL12 sukeltą ląstelių proliferaciją ir migraciją Bel-7402 ir HeLa ląstelėse. Tada mes ištyrėme jo poveikį CXCL12 / CXCR4 ašies paskesniems signalams. 3 paveiksle pateikti Western blotting duomenys rodo, kad 50 ng / ml CXCL12 per 15 minučių greitai sukėlė AKT, ERK, FAK ir Paxillin fosforilinimą Bel-7402 ir HeLa ląstelėse. Priešingai, 6 valandų išankstinis inkubavimas su JG6 slopino CXCL12 sukeltą šių baltymų fosforilinimą priklausomai nuo dozės. Panašūs rezultatai buvo pastebėti HeLa ląstelėse.

Image

JG6 užblokavo CXCL12 / CXCR4 ašies signalo keitimą „Bel-7402“ (A) ir „HeLa“ ląstelėse (B). Šie du ląstelių tipai buvo badaujami ir po to inkubuojami su CXCL12 (50 ng / ml) arba CXCL12, iš anksto inkubuoti su JG6 (10, 50 arba 100 μg / ml) 15 min.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

JG6 sąveikavo su CXCL12

Toliau įvertinome, kaip JG6 veikia CXCL12 / CXCR4 ašies signalizaciją. Ankstesni tyrimai mūsų laboratorijoje parodė, kad JG6 struktūra primena GAG struktūrą ir kad GAG sąveikauja su CXCL12. Todėl mes panaudojome SPR testą, kad nustatytume galimą CXCL12 ir JG6 sąveiką. JG6 buvo imobilizuotas ant NLC jutiklio lustų. Kai CXCL12 buvo suleistas į biosensorių, tipiškas SPR atsako padidėjimas, atitinkantis asociacijos fazę, buvo stebimas priklausomai nuo dozės (5–80 nmol / L). Chemokiną pakeitus veikiančiu buferiu, pastebimas SPR atsako signalo sumažėjimas, atitinkantis disociacijos fazę (4 paveikslas). Pririšimo kreivė buvo pritaikyta ir parodytas daugiavalentis surišimo būdas, kai aiški asociacijos greičio konstanta ( k ant ) yra 11, 7 nmol / L, o pusiausvyros disociacijos greičio konstanta - 16, 5 nmol / L. Šie duomenys patvirtino aukščiau pateiktus duomenis, kurie rodo, kad JG6 turi didelį afinitetą CXCL12.

Image

JG6 prisijungia prie CXCL12. (A) Įrišimo atsako kreivė. (B) pusiausvyros disociacijos kreivė. JG6 ir CXCL12 sąveikos paviršiaus plazmoninio rezonanso (SPR) analizė. CXCL12 buvo sušvirkštas esant 80, 40, 20, 10, 5 nmol / l koncentracijai (iš viršaus į apačią). Pusiausvyros disociacijos konstanta buvo apskaičiuota naudojant BIAcore programinę įrangą 3.1.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

JG6-CXCL12 sąveikos pavyzdys buvo automatizuotas dokų modeliavimas, siekiant suprasti jų sąveikos režimą. Žmogaus CXCL12 kristalų struktūra buvo panaudota kaip tikslinė struktūra, o JG6 disacharidas buvo naudojamas kaip jungiamasis zondas. Mes nustatėme, kad JG6 gerai pritvirtintas prie CXCL12, turintis mažą doko energiją -13, 08 kcal / mol. Atrodė, kad JG6 sąveikavo su CXCL12 per daug polinių sąveikų, įskaitant 6 jonines jungtis ir 7 vandenilio jungtis (5 pav.).

Image

JG6 ir CXCL12 sąveikos režimas, sumodeliuotas molekuliniu doku. (A) JG6 struktūra disacharido pavidalu. (B) JG6 ir CXCL12 sąveikos režimas. „CXCL12“ rodomas baltame animaciniame filme, o „JG6“ rodomas kaip žalios spalvos lazdelės. Pagrindiniai CXCL12 likučiai, sąveikaujantys su JG6, taip pat rodomi kaip lazdelės. Vandenilio ryšius žymi raudonos punktyrinės linijos, o jonų ryšius - geltonos punktyrinės linijos.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Šie duomenys, kartu paėmus, rodo, kad JG6 sutrikdė CXCL12 / CXCR4 ašį, tikėtina, dėl tiesioginės sąveikos su chemokinu CXCL12, dėl ko sutriko tarpląstelinis signalo perdavimas pasroviui po CXCL12 stimuliacijos.

Diskusija

CXCL12 / CXCR4 ašis vaidina kritinį vaidmenį vėžio progresavime, įskaitant ląstelių dauginimąsi, išgyvenimą, angiogenezę ir ypač chemotaksinę metastazę. Dėl to CXCL12 / CXCR4 ašis tapo plačiai ištirtu vaistų nuo vėžio taikiniu. Šiame tyrime mes parodėme, kad JG6, naujas jūrų kilmės oligosacharidas, įsiterpia į CXCL12 / CXCR4 signalizacijos ašį ir su ja susijusias biologines funkcijas vėžio ląstelėse. JG6 ne tik reikšmingai panaikino CXCL12 sukeltą vėžio ląstelių proliferaciją, bet ir dramatiškai sumažino CXCL12 tarpininkautų ląstelių migraciją in vitro .

CXCL12 jungiasi su GAG, tokiais kaip heparino sulfatas (HS). CXCL12 jungiasi prie HS S-domenų, turinčių didelį afinitetą, daugiausia per 2-O- ir N-sulfato grupes 16 . HS grandinės yra linijiniai pasikartojantys polimerai, sudaryti iš β- D- gliukuronato ir α- D -N-acetilgliukozamino 17, turintys santykinai vienodą kintančių sulfatuotų ir nemodifikuotų sričių schemą palei HS grandinę 18 . Ankstesni HS struktūros tyrimai nustatė CXCL12 rišantį domeną 8, 19 . Be to, sulfatinių GAG mimetikų, skirtų CXCL12, serija parodė priešvėžinį aktyvumą 11 . Remdamiesi JG6 ir GAG struktūriniu panašumu, mes iškėlėme hipotezę, kad JG6 greičiausiai prisijungs prie CXCL12. Naudodamiesi SPR tyrimu, mes parodėme, kad JG6, kaip ir HS, tiesiogiai jungiasi prie CXCL12 daugiavalenčiame jungimosi režime, kuris atitiko sąveikos molekulinio doko modelį. Apskaičiuota energija parodė, kad JG6 gali efektyviai jungtis prie CXCL12 su palyginti maža energija (-13, 28 kcal / mol). Visi šie rezultatai rodo, kad JG6 gali tiesiogiai sąveikauti su CXCL12, tokiu būdu blokuodamas CXCL12 / CXCR4 ašį ir kitas biologines funkcijas, tokias kaip naviko augimas ir migracija.

Apibendrinant galima pasakyti, kad mūsų tyrimas rodo, kad JG6 struktūrinės savybės leidžia jam sąveikauti su CXCL12 ir suteikia alternatyvą nukreipti CXCL12 / CXCR4 ašį. JG6 poveikis CXCL12 / CXCR4 ašiai gali lemti JG6 priešvėžinį aktyvumą.

Autoriaus indėlis

Wei-wei WEN, Yi CHEN ir Jian DING suprojektavo tyrimą; Wei-wei WEN atliko eksperimentus, išanalizavo rezultatus ir parašė rankraštį; Yi CHEN, Jian DING ir Mei-yu GENG peržiūrėjo rankraštį; Xian-ling XIN sintetiniai junginiai; ir Shao XIE dalyvavo tyrime.