Oridoninas in vitro sukelia npm mutanto baltymo translokaciją ir apoptozę npm1c + ūmios mieloidinės leukemijos ląstelėse | acta pharmaologica sinica

Oridoninas in vitro sukelia npm mutanto baltymo translokaciją ir apoptozę npm1c + ūmios mieloidinės leukemijos ląstelėse | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

NPM mutantinio baltymo (NPM1c +) kaupimasis pasvirusiai citoplazmoje yra glaudžiai susijęs su leukemijos patogeneze. Šio tyrimo tikslas buvo ištirti, ar oridoninas, diterpenoidas, išskirtas iš kinų tradicinės medicinos Rabdosia rubescens , galėjo paveikti prekybą NPM1c + baltymais ir sukelti apoptozę NPM1c + ūminės mieloidinės leukemijos ląstelėse in vitro .

Metodai:

Ištirta OCI-AML3 ląstelių linija, turinti NPM1 geno mutaciją. Ląstelių augimas buvo nustatytas MTT tyrimu. Ląstelių apoptozė buvo įvertinta naudojant srauto citometriją ir Hoechst 33258 dažymą. Atitinkamų baltymų ekspresija ir tarpląstelinė lokalizacija buvo nustatyta naudojant Western blot ir imunofluorescencinį dažymą. MRNR ekspresija buvo nustatyta RT-PGR.

Rezultatai:

Oridoninas (2–12 μmol / L) nuo dozės priklausomai slopino OCI-AML3 ląstelių gyvybingumą (IC50 reikšmė buvo 3, 27 ± 0, 23 μmol / L 24 val.). Be to, oridoninas sukėlė OCI-AML3 ląstelių apoptozę, lydimą kaspazės-3 aktyvacijos ir branduolinio NPM1c + baltymo translokacijos. Oridoninas nepakeitė Crm1 ekspresijos (branduolio eksporto signalo turinčių baltymų eksporto receptorių), tačiau sukėlė Crm1 branduolio translokaciją. Oridoninas pastebimai padidino nukleoporin98 (Nup98), kuri vaidino svarbų vaidmenį Crm1 tarpininkaujant branduolinių baltymų eksportui, raišką ir paskatino Nup98 kaupimąsi branduolyje. Be to, oridoninas pastebimai padidino p14arf ir p53 raišką.

Išvada:

NPM1c + leukemijos ląstelėse oridoninas indukuoja NPM1c + baltymų translokaciją į branduolį, galbūt per branduolį kaupdamasis Crm1; junginys pastebimai padidina p53 ir p14arf raišką, o tai gali prisidėti prie ląstelių apoptozės.

Įvadas

Ūminė mieloleukemija (AML) yra agresyvus piktybinis navikas, kuriam būdingas reikšmingas klinikinis ir molekulinis heterogeniškumas. Per pastaruosius du dešimtmečius genetinė analizė ir molekulinė biologija atskleidė leukemogenezės mechanizmus ir pastebimai pagerino AML sergančių pacientų prognostinę stratifikaciją. 2005 m. Falini ir kt . Nustatė, kad heterozigotinės nukleofosmino (NPM) 1 mutacijos yra labiausiai paplitęs suaugusių AML genetinis pažeidimas (60% atvejų buvo normalus kariotipas) 1, kuris vėliau buvo pripažintas laikinuoju subjektu naujojoje 2008 m. PSO klasifikacijoje. 2 . Iki šiol buvo nustatyta apie 50 NPM1 mutacijų, kurios visos sukelia įsitvirtinusį citoplazminį NPM mutanto baltymo (NPM1c +) kaupimąsi ir, kaip manoma, atsakingos už leukemijos patogenezę 3 .

Pelių modelyje padidėjęs citoplazminio NPM-muto ekspresija sukėlė proliferacinį pranašumą 4 mieloidinėje linijoje, o zebrafish - citoplazmos NPM-mut ekspresija sąlygojo kraujodaros ląstelių 5 išsiplėtimą. Visos mutacijos lemia du kritinius NPM1 baltymo C galo pokyčius, įskaitant triptofano liekanų 288 ir 290 (neleidžiančių NPM1 prisijungti branduolyje) 6 praradimą ir naujo NES (branduolio eksporto signalo) motyvo generavimą (kuris sustiprina) nuo NPM1 baltymo priklausomo branduolinio eksporto nuo Crm1) 7 . Keletas įrodymų linijų rodo pakeistą nuo Crm1 priklausomą nukleofosminų prekybą kaip kritinį įvykį leukemogenezėje 3 . Todėl pakitusi prekyba AML nukleofosminu yra patrauklus terapinis taikinys.

Augaliniai vaistai ir iš jų gaminami vaistai tūkstančius metų buvo naudojami kaip alternatyvi gydymo priemonė visame pasaulyje 8 . Didėja susidomėjimas galimu natūralių produktų naudojimu piktybinėms ligoms gydyti ir jų galimybėmis derinti juos su dabartiniais veiksmingais vaistais 9 .

Oridoninas yra neseniai aprašyto natūralaus produkto pavyzdys, galintis turėti kancerogenezės ir uždegimo inhibitorių 10 . Oridoninas yra iš Rabdosia rubescens išskirtas augalinis diterpenoidas, dažniausiai naudojamas kaip tradicinė kinų medicina. Iki šiol buvo siūloma naudoti oridoniną kaip vėžio chemoterapinį vaistą sergant keliais vėžiais, įskaitant storosios žarnos vėžį 11, 12, kasos vėžį 13, fibrosarkomą 14 ir kepenų ląstelių karcinomą 15 . Be to, kiti pranešimai parodė, kad oridoninas daro reikšmingą slopinamąjį poveikį hematologiniams piktybiniams navikams, įskaitant NB4 16, HL-60 17, U937, kausima-1, K562 ir OCIM2 18, 19 leukemijos ląsteles, pirmines AML ląsteles 19 ir daugybinės mielomos RPMI8266 ląsteles. 20 . Nors Zhou ir kt. Nustatė, kad oridoninas sukėlė apoptozę t (8; 21) AML ląstelėse, taikydamasis į AML1-ETO (AE) sulietą baltymą, kuris vaidina svarbų vaidmenį leukemogenezėje 19, 21, oridonino poveikis NPM1c + leukemijai ląstelės ir tikslūs molekuliniai mechanizmai vis dar nežinomi.

Mes ištyrėme, ar oridoninas galėjo įtakoti NPM1 raišką ir subkilulinę lokalizaciją bei sukelti apoptozę ir galimą pagrindinį mechanizmą OCI-AML3 ląstelėse (žinomose apie NPM1 geno mutaciją), kurios yra perspektyvus ikiklinikinis junginių, skirtų trukdo prekybai NPM pakeista nukleo-citoplazma. Todėl mes įvertinome augimą slopinantį poveikį, kaspazių apdorojimą, PARP skilimą ir NPM-mut ir NPM-wt ekspresiją ar tarpląstelinę lokalizaciją. Be to, mes ištyrėme, ar oridoninas gali turėti įtakos Crm1, kuris yra laikomas kritiniais pakitusios nukleo-citoplazminės apyvartos, raiška ir subkiluliarine lokalizacija.

Rezultatai

Oridoninas skatina augimo slopinimą OCI-AML3 ląstelėse

Pirmiausia ištyrėme oridonino poveikį ląstelių gyvybingumui, naudodamiesi MTT tyrimu OCI-AML3 ląstelėse. Kaip parodyta 1 paveiksle, oridoninas turėjo nuo dozės ir laiko priklausomą antiproliferacinį poveikį OCI-AML3 ląstelėms, veikiamos 24, 48 ir 72 valandas. Gyvybingų ląstelių skaičius sumažėjo padidėjus oridonino koncentracijai ekspozicijos metu. OID-AML3 ląstelių oridonino IC50 per 24 valandas buvo 3, 27 ± 0, 23 μmol / L. Pailgėjus ekspozicijos laikui, IC50 vertės šiek tiek pasikeitė. IC50 vertės po 48 ir 72 val. Buvo atitinkamai 3, 18 ± 0, 42 μmol / L ir 3, 13 ± 0, 23 μmol / L.

Image

Oridoninas sukėlė augimo slopinimą OCI-AML3 ląstelėse. OCI-AML3 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis oridonino koncentracijomis, kaip nurodyta 24, 48 ir 72 valandas, o augimo slopinimas buvo įvertintas MTT tyrimu. Šios vertės parodo vidurkį ± SD. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus su panašiais rezultatais.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Oridoninas sukelia apoptozinę ląstelių mirtį OCI-AML3 ląstelėse

Norėdami išsiaiškinti, ar pastebėta oridonino sukelta ląstelių mirtis nebuvo susijusi su apoptozės indukcija, OCI-AML3 ląstelės buvo inkubuojamos su įvairiomis oridonino koncentracijomis 24 valandas, o apoptozinių ir gyvybingų ląstelių procentas buvo įvertintas V priede pateiktu FITC / PI dvigubu tirpalu. dažymas. Rezultatai, pateikti 2A paveiksle, parodė nuo dozės priklausomą ląstelių, teigiamų aneksinui V ir neigiamą PI, padidėjimą, rodantį apoptozės atsiradimą oridoninu apdorotose ląstelėse. Apoptozės dažnis padidėjo nuo (6, 9% ± 1, 2%) iki (22, 5% ± 3, 5%) po gydymo oridoninu. Galime daryti išvadą, kad oridonino poveikį OCI-AML3 ląstelių gyvybingumui daugiausia lemia padidėjusi apoptozė, o ne nekrozė, ką patvirtina padidėjusi ankstyvųjų apoptozinių ląstelių populiacija. Papildomas padidėjusios apoptozės įrodymas buvo padidėjęs bendras aneksino V teigiamų ląstelių procentas, matuojant antrines apoptozės ląsteles (2B paveikslas).

Image

Oridoninas sukėlė apoptozę OCI-AML3 ląstelėse. (A) OCI-AML3 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis oridonino koncentracijomis, kaip nurodyta 24 valandas, ir apoptozinės ląstelės buvo aptiktos dažant AV-PI, naudojant srauto citometriją. Histograma rodo apoptotinę normą (B). (C) OCI-AML3 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis oridonino koncentracijomis, kaip nurodyta 24 valandas, ir apoptozinė morfologija buvo nustatyta atliekant „Hoechst 33258“ testą. (D) Po apdorojimo nurodytomis oridonino koncentracijomis OCI-AML3 ląstelių lizatai buvo nutepami PARP ir kaspazės-3 antikūnais, o γ-tubulinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. (E) Histograma parodo santykinį šių baltymų tankį. Šios vertės parodo vidurkį ± SD. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus su panašiais rezultatais. b P <0, 05, c P <0, 01 rodo statistinį reikšmingumą, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Be to, mes stebėjome oridonino poveikį apoptozės OCI-AML3 ląstelėms dažydami Hoechst 33258, naudodami konokalinę mikroskopiją lazeriu. Kontrolinės būklės ląstelių branduoliai buvo taisyklingos formos, tačiau po gydymo oridoninu ląstelės buvo susitraukusios ir tamsios spalvos (2C paveikslas). Norėdami nustatyti, ar proapopotinį oridonino poveikį lydi kaspazės aktyvacija, mes ištyrėme kaspazės-3 apdorojimą Western blot analize, naudodami specifinius antikūnus, atpažįstančius prokapazę ir aktyvius kaspazės-3 fragmentus. OCID-AML3 ląstelėse, gydomose oridoninu, pro-kaspazės-3 ekspresijos lygis sumažėjo, o suskaidytos kaspazės-3 lygis žymiai padidėjo. Norėdami dar labiau patvirtinti kaspazės-3 aktyvaciją, įvertinome DNR atstatymo fermento PARP, vieno iš pagrindinių aktyvuotos kaspazės-3 substratų, skilimą. PARP (116 kDa) suskaidomas į du fragmentus: N-galinį DNR rišantį domeną ir C-galo katalizinį domeną (85 kDa). Kaip parodyta 2D ir 2E paveiksluose, gydant oridoninu padidėjo suskaidyto PARP kiekis (85 kDa).

Oridoninas perkelia NPM-mutą ir padidina p53 baltymo ekspresiją

NPM-mut ir NPM-wt ekspresija buvo įvertinta Western blot analize, naudojant OCI-AML3 ląstelių, apdorotų įvairiomis oridonino koncentracijomis, baltymų ekstraktus. Kaip parodyta 3A ir 3B paveiksluose, ir NPM-mut, ir NPM-wt baltymų lygis OCI-AML3 ląstelėse nepakito po 24 val. Įdomu tai, kad imunofluorescencinis dažymas (3C pav.) Atskleidė, kad NPM-mut baltymas, perkeltas iš citoplazmos į branduolį, inkubuotas su oridoninu 24 valandas, o tai dar kartą patvirtino citozolinio / branduolinio baltymo blotinimo analizė. Kaip parodyta 3D paveiksle, citoplazmos baltymų NPM-mut lygis sumažėjo, tačiau branduolinių baltymų kiekis padidėjo po gydymo oridoninu. Be to, mes ištyrėme NPM-wt tarpląstelinį pasiskirstymą, kaip parodyta 3E paveiksle, ir NPM-wt liko branduolyje. P14arf naviko slopintuvo įdarbinimas NPM1 mutantu iš branduolio į nukleoplazmą ir citoplazmą galėjo vaidinti leukemogenezę, be to, ankstesni tyrimai parodė, kad NPM1 taip pat sąveikauja su p53 ir daro įtaką ląstelių apoptotiniam atsakui 7 . Todėl mes toliau tyrėme p14arf ir p53 išraišką. Inkubuojant su oridoninu 24 valandas, baltymų p53 ir p14arf lygis padidėjo, kas rodo, kad NPM-mut translokacija gali stabilizuoti p14arf ir p53 ir prisidėti prie apoptozės OCI-AML3 ląstelėse.

Image

Oridonino poveikis NPM ekspresijai ir lokalizacijai OCI-AML3 ląstelėse. OCI-AML3 ląstelės 24 valandas buvo gydomos didėjančiomis oridonino koncentracijomis, o santykinis viso NPM-muto ir NPM-wt baltymo ekspresijos intensyvumas buvo nustatytas naudojant Western blot (A). γ-tubulinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. (B) Histograma parodo santykinį šių baltymų tankį. Po 24 val. Gydymo 8 μmol / L oridoninu, OCI-AML3 ląstelės buvo fiksuotos ir inkubuotos su specifiniais antikūnais, išaugintais prieš NPM-mut (C) ir NPM-wt (E), po to inkubuojamos su Cy3 pažymėtu antruoju antikūnu ir Hoechst 33258. (D) Citoplazmos / branduolinio NPM mutanto baltymo LaminB1 ir β-aktino, kurie buvo naudojami kaip kontroliniai, reprezentaciniai Western blot vaizdai. (F) Po apdorojimo skirtingomis oridonino koncentracijomis 24 valandas, OCI-AML3 ląstelių lizatai buvo užpūsti nurodytais antikūnais, o γ-tubulinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. (G) Histograma parodo santykinį šių baltymų tankį. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus su panašiais rezultatais.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Crm1 kaupiasi branduolyje, o Nup98 mRNR ir baltymų lygis yra padidintas po gydymo oridoninu

„Exportin Crm1“ atpažįsta ir perneša baltymus, turinčius daug leucino turinčio branduolinio eksporto signalų seką. Keli įrodymai rodo, kad pakitęs nuo Crm1 priklausomas nukleofosminas yra kritinis leukemogenezės įvykis NPMc + leukemijoje. Norėdami išaiškinti NPM-mut persiskirstymo, kurį sukelia oridoninas, mechanizmą, mes ištyrėme Crm1 raišką ir tarpląstelinę lokalizaciją Western blot metodu. Kaip parodyta 4B paveiksle, baltymų Crm1 lygis nepakito po gydymo oridoninu 24 valandas; tačiau oridoninas gali nukreipti Crm1 į branduolį (4E pav.). Kadangi Oka ir kt. Parodė, kad Nup98 vaidina svarbų vaidmenį atliekant Crm1 tarpininkaujamų branduolinių baltymų eksportą, tada paklausėme, ar oridoninas daro poveikį OCI-AML3 ląstelėms moduliuodamas Nup98 raišką. OCI-AML3 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis oridonino koncentracijomis, o jų bendra mRNR ir baltymų ekstraktai buvo įvertinti atitinkamai Nup98 ekspresijai, naudojant RT-PCR ir imunoblotus. Kaip parodyta 4A paveiksle ir atsižvelgiant į imunoblotų rezultatus (4B paveikslas), Nid98 2 - △ t Ct vertės oridoninu paveiktose ląstelėse buvo žymiai padidintos, palyginti su vertėmis negydomose ląstelėse ( P <0, 05, P <0, 01). Be to, imunofluorescencinis dažymas (4D pav.) Atskleidė, kad Nup98 branduolinė ekspresija buvo žymiai padidėjusi po inkubacijos su oridoninu 24 valandas. Crm1 vieta nuo citoplazmos iki branduolio gali būti susijusi su Nup98 ekspresijos padidinimu.

Image

Oridonino poveikis Nup98 ekspresijai ir lokalizacijai OCI-AML3 ląstelėse. OCI-AML3 ląstelės buvo apdorotos skirtingomis oridonino koncentracijomis, kaip nurodyta 24 valandas, ir Nup98 mRNR lygis (A) buvo aptiktas RT-PCR būdu. (B) Nup98 ir Crm1 baltymų lygiai buvo įvertinti naudojant „Western blot“, o γ-tubulinas buvo naudojamas kaip vidinė kontrolė. Histograma (C) rodo santykinį šių baltymų tankį. (D) Po apdorojimo 8 μmol / l oridonino 24 valandas, OCI-AML3 ląstelės buvo fiksuotos ir inkubuotos su antikūnu, išaugintu prieš Nup98, kuris vėliau buvo inkubuojamas su Cy3 pažymėtu antruoju antikūnu ir Hoechst 33258. (E) OCI- AML3 ląstelės 24 valandas buvo gydomos didėjančiomis oridonino koncentracijomis, o santykinis citoplazmos / branduolinės Crm1 intensyvumas buvo nustatytas Western blot būdu. Kaip kontrolė buvo naudojami „LaminB1“ ir β-aktinas. Šios vertės parodo vidurkį ± SD. b P <0, 05, c P <0, 01, palyginti su kontrolinėmis ląstelėmis. Visi eksperimentai buvo pakartoti tris kartus su panašiais rezultatais.

Visas dydis

  • Atsisiųskite „PowerPoint“ skaidrę

Diskusija

Mutacijos, susijusios su NPM1 genu, yra dažniausi normaliojo kariotipo tipo AML molekuliniai pakitimai, kurie sudaro 60% atvejų 6 . Dėl šių mutacijų pasikeičia NPM1 mutantinių baltymų, esančių ląstelėse, judėjimas, dėl kurio atsiranda nenormalus citoplazmos kaupimasis leukemijos ląstelėse, kuris laikomas kritiniu įvykiu 2 leukemogenezėje. Mes ištyrėme, ar oridoninas, natūralus junginys, kuris neseniai apibūdintas kaip galintis sukelti vėžio chemoterapiją, galėjo sukelti apoptozę NPM1c + ląstelėse ir jo gebėjimą trukdyti NPM mutantų baltymų judėjimui in vitro, naudojant OCI-AML3 ląstelių liniją, kuri gali būti naudojama kaip ikiklinikinis narkotikų ir kitų produktų tikrinimo modelis. Oridoninas sukėlė apoptozę OCI-AML3 ląstelėse, kuriai būdinga kaspazės-3 aktyvacija, PARP skilimas ir NPM-mut translokacija. OCI-AML3 ląstelių veikimas oridoninu lėmė p14arf ir p53 reguliavimą. Taip pat išsiaiškinome, kad padidėjo Nup98 mRNR ir baltymų kiekis, kurį lydėjo branduolių kaupimasis po gydymo oridoninu. Be to, nekeisdamas Crm1 išraiškos, oridoninas perkėlė Crm1 iš citoplazmos į branduolį, ir tai rodo, kad NPM-mut perkėlimą gali sukelti Crm1 kaupimasis branduolyje.

Oridoninas, ent-kaurane diterpenoidas, yra svarbi tradicinė kinų žolelių priemonė. Šiame tyrime mes įvertinome, ar oridoninas gali būti veiksmingas NPMc + ląstelių terapinis agentas. Mes sutelkėme dėmesį į NPM-mut ir NPM-wt raišką, kad nustatytume, ar oridoninas gali modifikuoti baltymus, svarbius skatinant NPM-mut ląstelių leukemogenezę. Sprendimas naudoti NPM-mutą ir NPM-wt buvo pagrįstas šiais pastebėjimais: 1) naujai nustatyta AML su NPM mutacija, pasižyminti išskirtinėmis biologinėmis ir klinikinėmis savybėmis 6 ; 2) In vivo ir in vitro tyrimai parodė, kad NPM-mut ir NPM-wt vaidina lemiamogenezę 2 . OCI-AML3 ląstelių gydymas oridoninu galėtų nukreipti NPM-mutą į branduolį, nekeisdamas NPM-mut ir NPM-wt baltymų lygio. Manoma, kad NPM-mut translokacija stabilizavo p14arf ir p53 aktyvumą ir galėjo palengvinti apoptozę. Tačiau oridonino poveikį p53 gali tiesiogiai paveikti jis pats, todėl norint išspręsti šią problemą reikia atlikti papildomus eksperimentus.

Buvo nustatyta, kad „Crm1“, NES turinčių baltymų 23 eksporto receptorius, tarpininkauja NPM-baltymo baltymo eksportui, sąveikaudamas su nauju NES motyvu, kurį sukuria NPM mutacija. Daugybė įrodymų rodo, kad pakitęs nuo Crm1 priklausomas nukleofosminų gabenimas yra kritinis įvykis leukemogenezėje 24 . Todėl AMM Crm1 su NPM mutacija yra patrauklus terapinis taikinys. Be to, naujausiame darbe nustatyta, kad „Nup98“ sąveikauja su Crm1 per savo N-galinį FG-pakartojimo domeną priklausomai nuo RanGTP ir kad „Nup98“ vaidina svarbų vaidmenį „Crm1“ tarpininkaujant branduolinio produkto eksportui 25, kas rodo, kad NPM-muto tarpląstelinė lokalizacija kartu su „Nup98“ ir „Crm1“. Iš tiesų, mūsų išvados rodo, kad OCI-AML3 ląstelių gydymas oridoninu padidino Nup98 mRNR ir baltymų lygius, kuriuos lydėjo branduolių kaupimasis, o vėliau pakito Crm1 subkauliarinė lokalizacija, rodanti, kad oridoninas gali turėti įtakos pakitusiam nukleofosminų judėjimui. išlaikant Crm1 branduolyje per padidintą Nup98 ekspresiją.

Tačiau kai NPM1 mutantinės ląstelės buvo tiriamos in vitro su leptomicinu B, natūraliu produktu, kuris negrįžtamai jungiasi prie Crm1, netgi branduolyje persikėlęs mutantinis baltymas, o Crm1 inhibitorių naudojimas in vivo NPM1 mutavusioje AML neatrodo problemiškas. nemokama 24 . Taip pat, kadangi oridoninas galėjo pakartotinai paskirstyti mutantinį NPM į nukleoplazmą, jis negalėjo nukreipti NPM į branduolį (NPM1 fiziologinę vietą). Todėl mes spėjame, kad be poveikio mutantų NPM translokacijai atgal į branduolį, oridoninas žymiai padidina Nup98, p53 ir p14arf raišką, o tai taip pat gali prisidėti prie apoptozės leukemijos ląstelėse.

Apibendrinant galima pasakyti, kad oridoninas gali būti veiksmingas terapinis agentas gydant NPMc + leukemijos ląsteles, todėl jo tyrimas reikalauja tolesnio tyrimo.

Autoriaus indėlis

Šis darbas buvo atliktas bendradarbiaujant visiems autoriams. Yan CHEN, Guo-hui CUI, Fei-fei LI ir Sha YI apibrėžė tyrimo temą. Fei-fei LI, Sha YI, Guo-hui CUI ir Jing HE suprojektavo metodus ir eksperimentus, atliko laboratorinius eksperimentus, išanalizavo duomenis, interpretavo rezultatus ir parašė darbą; Lu WEN ir Li-jing YANG sukūrė ir kartu išanalizavo susijusių duomenų rinkimą ir aiškinimą. Jing HE, Ben-ping ZHANG ir Jie ZHAO sukūrė eksperimentus, aptarė analizę, interpretaciją ir pristatymą. Visi autoriai yra matę ir patvirtinę rankraštį.

Konkuruojantys interesai

Autoriai pareiškia, kad konkuruojančių interesų nėra.