Retasis branduolinis receptorius nur77 yra reikalingas choleros toksino sukeltoms c6 gliomos ląstelėms diferencijuoti | acta pharmaologica sinica

Retasis branduolinis receptorius nur77 yra reikalingas choleros toksino sukeltoms c6 gliomos ląstelėms diferencijuoti | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Ištirti galimą reguliatoriaus geną, dalyvaujantį choleros toksino sukeltoje žiurkės C6 gliomos ląstelių diferenciacijoje.

Metodai:

Choleros toksino sukelti mRNR raiškos modelio pokyčiai buvo analizuojami naudojant genų mikroschemą. Tada pasirinktas genas buvo nutildytas dėl RNR įsikišimo arba perreguliuotas su ORF plazmidė, kad būtų galima nustatyti jo būtinumą šiame procese.

Rezultatai:

Nur77, našlaičių branduolinių receptorių šeimos (NR4A) narys, diferenciacijos metu buvo aiškiai sureguliuotas. Be to, nur77 RNR susilpnino choleros toksino indukcinį poveikį C6 ląstelėms, tuo tarpu per didelis Nur77 ekspresija lėmė panašiai diferencijuotą elgesį, įskaitant morfologinius ir biomarkerinius pokyčius, taip pat ląstelių ciklo sustojimą.

Išvada:

Nur77 aktyviai ir iš esmės dalyvavo kaip svarbus reguliatorius choleros toksino sukeltoje C6 ląstelių diferenciacijoje.

Įvadas

Gliomos, gautos iš astrocitomų, yra labiausiai paplitęs pirminis žmogaus smegenų auglys ir sudaro daugiau kaip 60% visų pirminių smegenų navikų 1 . Pripažįstama, kad paliatyvios yra daugelio piktybinių daugiaformės glioblastomos (GBM, PSO IV laipsnio) navikų, įskaitant chemoterapiją, radioterapiją ir chirurgiją, gydymas. Vidutinis GBM sergančių pacientų išgyvenimo laikas per pastaruosius 25 metus nedaug pagerėjo 2 .

Primityvios būklės vėžio diferencijavimo terapija yra koncepcija, kuri buvo pasiūlyta tik neseniai. Retino rūgštis, pirmasis nustatytas diferenciacijos agentas, turi diferenciaciją sukeliantį poveikį ūminei promielocitinei leukemijai (APL) ir yra naudojama kaip įprasta diferenciacijos terapija APL 3 . Nors sėkmingai buvo atlikti nauji gydymo būdai, skirti tam tikroms molekulėms, susijusioms su kitų rūšių piktybiniais navikais, 4, veiksmingų diferenciacijos priemonių kai kuriems kietiems navikams, pavyzdžiui, GBM, dar nerasta.

Anksčiau mes parodėme, kad choleros toksinas, tradicinis biotoksinas, gali sukelti ląstelių diferenciaciją tiek žiurkės C6 ląstelėse, tiek pirminėse kultūrinėse žmogaus gliomos ląstelėse 5 . Choleros toksino sukeltai diferenciacijai būdingi tipiniai pokyčiai, pvz. , Morfologijoje, bionomikoje ir ląstelių cikle. Šie radiniai parodė choleros toksino potencialą toliau plėtojant gliomų diferenciacijos terapiją. Tačiau molekuliniai C6 ląstelių diferenciacijos veiksniai liko nežinomi.

Šiame darbe mes analizavome globalius mRNR raiškos modelių pokyčius C6 diferenciacijos proceso metu, kurį sukėlė choleros toksinas, naudojant mikrotraumos technologiją. Mūsų rezultatai parodė, kad diferenciacijos metu pasikeitė daugiau nei 1000 genų (> 3% analizuotų genų) ekspresija, o proceso metu 29 genų ekspresija buvo stabili. Tarp jų, du našlaičių branduolinių receptorių 4 grupės A grupės (NR4A) nariai - NR4A1 (dar žinomas kaip Nur77) ir NR4A3 (Nor1), buvo žymiai labiau sureguliuoti visame diferenciacijos procese. Mes nustatėme, kad nur77 išraiškos sumažėjęs reguliavimas gali susilpninti sukeltą diferenciacijos efektą, tuo tarpu, jei per didelis Nur77 išraiška sukelia panašius pokyčius, susijusius su diferenciacija. Remiantis šiais rezultatais, mes siūlome, kad nur77 veiktų kaip pagrindinis reguliuojamas indukuotas C6 ląstelių diferenciacija.

Rezultatai

Choleros toksino sukelta C6 gliomos ląstelių diferenciacija

Žiurkių C6 gliomos ląstelių diferenciacija pirmiausia buvo apibūdinta morfologine transformacija. C6 gliomos ląstelių, apdorotų 10 ng / ml choleros toksinu atitinkamai mikroskopiniai vaizdai atitinkamai 0, 3, 6, 12, 24 ir 48 h, parodyti 1A paveiksle. C6 ląstelių morfologija pamažu tapo panaši į subrendusių astrocitų morfologiją ilgesnį laiką veikiant choleros toksinu. Palyginti su daugiausia daugiakampiu kontrolinių ląstelių morfologija, C6 ląstelės, apdorotos choleros toksinu, turėjo mažesnius apvalius branduolius ir daug ilgesnius, smulkius, smailėjančius kūnus. Šis rezultatas parodė, kad choleros toksinas gali sukelti gliomos ląstelių diferenciaciją į labiau subrendusius astrocitus.

Image

Nur77 raiškos indukcija C6 gliomos ląstelių diferenciacijos metu. A) C6 gliomos ląstelių diferenciacija buvo sukeltas choleros toksino priklausomai nuo laiko. Laikas parodo valandų skaičių, kai ląstelės buvo inkubuotos su choleros toksinu (CT, 10 ng / ml). B) Nur77 buvo sureguliuotas indukuotos C6 ląstelių diferenciacijos metu. C) Nur77 ir GFAP buvo reguliuojami aukščiau, o PCNA buvo žemai reguliuojami C6 ląstelių indukuotos diferenciacijos metu.

Visas dydis

Tada mes ištyrėme GFAP, gerai žinomo subrendusių astrocitų žymeklio, ir PCNA, tipiško su proliferacija susijusio baltymo, raišką piktybinėse proliferuojančiose ląstelėse, raišką. Palyginti su kontrole, Western blot analizė patvirtino reikšmingą GFAP ekspresijos padidėjimą choleros toksinu apdorotose ląstelėse teigiamu, nuo laiko priklausančiu būdu (1C pav.), Tuo tarpu PCNA raiška buvo ypač suvaržyta neigiamai, priklausomai nuo laiko. . Rezultatai parodė, kad piktybinis C6 ląstelių dauginimasis sulėtėjo ir atsirado normalių astrocitų ląstelių savybės.

Genero ekspresija greitai ir tvirtai pasikeitė dėl choleros toksino sukeltos diferenciacijos

C6 ląstelės rodė tvirtą transkripcijos reakciją, o daugelio genų ekspresija buvo pakitusi. 3, 6, 12, 24 ir 48 h laiko taškais mes radome 61, 149, 266, 682 ir 506 aukštyn reguliuojamus genus ir atitinkamai 123, 192, 247, 491 ir 291 genus, kurių žemyn yra reguliuojami genai. . Reaguojant į choleros toksiną, išraiškos pakitimų laipsnis pamažu tapo akivaizdus. Tuo pačiu metu taip pat buvo padidintas dalyvaujančių kelių skaičius ir genų ontologijos duomenų bazių skaičius (2 pav.).

Image

Choleros toksino sukeltos diferenciacijos metu genų ekspresija greitai ir tvirtai pasikeitė. 3, 6, 12, 24 ir 48 valandų laiko taškais buvo atitinkamai 61, 149, 266, 682 ir 506 aukštyn reguliuojami genai ir atitinkamai 123, 192, 247, 491 ir 291 genai, reguliuojami žemyn. . Susiję keliai padidėjo nuo 26, 46, 53, 92 ir 86 (parodyta skiltyje). Ištyrus genų ontologijos (GO) duomenų bazėje, pakitusią raišką turinčius genus galima būtų suskirstyti į tris pagrindines funkcines grupes: molekulinę funkciją, biologinį procesą ir ląstelinį komponentą. Genų skaičius kiekvienoje grupėje (parodytas su linija, detalė neparodyta) atitinkamai buvo pakeistas indukuoto diferenciacijos proceso metu.

Visas dydis

Tada mes stebėjome geną su stabiliais išraiškos profiliais (skirtingu laiko tarpu) C6 ląstelių diferenciacijos metu. Rezultatai atskleidė, kad per visą diferenciacijos procesą 22 genai buvo nuosekliai reguliuojami aukštyn, o 7 genai buvo žemai sureguliuoti (1 lentelė). Dauguma genų buvo perrašyti lokusai ir ankstyvojo atsako genai. Iš jų du A grupės branduolinių receptorių pošeimio nariai NR4A1 (Nur77) ir NR4A3 (Nor1) nuo pat pradžių buvo dramatiškai sureguliuoti ir išliko visą diferenciacijos procesą. Dėl greito reagavimo ir svarbios funkcijos tolesnei analizei buvo pasirinktas NR4A1 (Nur77).

Pilno dydžio lentelė

Affymetrix ekspresijos duomenų patvirtinimas atliekant RT-PGR ir Western blot analizę

Norėdami patvirtinti duomenis, gautus iš „Affymetrix“ genų ekspresijos masyvo, buvo tiriama ir mRNR ekspresija, ir nur77 baltymų lygis C6 ląstelėse. Rezultatai parodė, kad nur77 buvo greitai ir stabiliai sukeltas reaguojant į choleros toksiną tiek atliekant RT-PCR, tiek Western blot analizę (1B paveikslas, 1C). Kaip ir tikėjomės, mRNR ir nur77 baltymų lygiai buvo suderinti su mRNR mikrotraumos rezultatais.

Nutildęs Nur77 sumažino choleros toksino sukeltą C6 gliomos ląstelių diferenciaciją

Siekiant išsiaiškinti nur77 vaidmenį choleros toksino sukeltoje diferenciacijoje, nur77 raišką slopino RNR trukdžiai. Mažos sintezės trukdančios RNR, nukreiptos į žiurkės Nur77, ir bejūtės siRNR buvo perneštos į C6 ląsteles 24 valandas prieš pridedant choleros toksiną. Transfekcijos efektyvumas, stebimas transfekuojant FAM pažymėtą siRNR atskirame šulinyje, buvo maždaug 90%.

Po 24 valandų inkubacijos su choleros toksinu, dėl nur77 nutildymo choleros toksino sukelti morfologiniai pokyčiai buvo sušvelninti. Reguliuojantis nur77, prieš pridedant choleros toksino, sumažino subrendusios morfologijos vystymąsi (3A pav.), Palyginti su indukuotomis C6 ląstelėmis, kurios buvo panašios į subrendusius astrocitus. Plokščias daugiakampis siur77 ląstelių vaizdas buvo panašesnis į normalių C6 ląstelių formą nei į astrocitus. Tuo tarpu choleros toksino sukeltas padidėjęs GFAP reguliavimas ir sumažėjęs PCNA baltymo reguliavimas buvo smarkiai sumažintas siur77 (3C pav.).

Image

Nur77 buvo reikalingas choleros toksino sukeltai C6 gliomos ląstelių diferenciacijai. C6 ląstelės buvo auginamos 24 valandas be (a grupė) arba su choleros toksinu (10 ng / ml, b grupė). Ląstelės buvo transfekuotos nur77 siRNR (c grupė) arba neszense siRNR (d grupė) 24 valandas ir po to inkubuojamos su choleros toksinu (10 ng / ml) dar 24 valandas. (A) Choleros toksino sukeltus morfologinius pokyčius susilpnino nur77 sumažėjęs reguliavimas. (B) Nur77 raišką slopino RNR trukdžiai. (C) Žemyn reguliuojantis Nur77 slopino choleros toksino sukeltą GFAP raišką, o ląstelės atgavo aukštą PCNA lygį. (D, E) Nur77 žemyn reguliuojantis choleros toksino sukeltas ląstelių ciklo sustabdymas panaikintas. Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD ( n = 3) kontrolei. c P <0, 01 prieš choleros toksino grupę.

Visas dydis

Choleros toksino sukelta diferenciacija lėmė G 1 / S sulaikymą: G 1 fazėje ląstelių dalis padidėjo nuo 66, 9% iki 90, 4%, o S fazėje sumažėjo nuo 28% iki 4, 3% (3D pav., 3E). . Kai mes sureguliavome nur77 , ląstelių ciklo sulaikymas buvo panaikintas, o S fazės ląstelių procentas grįžo į 22, 7% ( P <0, 01 prieš choleros toksino grupę), tai rodo, kad buvo atkurtas didelis ląstelių proliferacijos greitis. Visose grupėse srauto citometrija neparodė akivaizdžios sub-G1 smailės (apoptozinės smailės).

Apibendrinant, aukščiau pateikti rezultatai parodė, kad choleros toksino sukeliamą diferenciacijos poveikį silpnino žemyn reguliuojantis nur77 .

Nur77 per didelis ekspresija sukėlė diferenciaciją C6 ląstelėse

Norėdami nustatyti, ar nur77 lemia diferenciaciją, į C6 ląsteles įvedėme nur77 ORF plazmidę, kad pasiektume tvirtą nur77 išraišką . Per didelis Nur77 ekspresija sugebėjo imituoti choleros toksino sukeltą diferenciacijos fenotipą (4 pav.). Nur77 padidėjusios ekspresijos grupėje dauguma C6 ląstelių buvo morfologiškai panašios į choleros toksinu apdorotą grupę, turinčios mažesnius, apvalius branduolius ir dailiai ištemptas rankas (4A pav.). GFAP padidėjimas ir PCNA baltymo sumažėjimas (4C pav.) Sutapo su tuo pokyčiu. S fazės frakcija sumažėjo nuo normalios 21, 8% iki 9, 0% ( P <0, 01, palyginti su kontrole, 4D pav., 4E), o G1 fazės ląstelių dalis padidėjo nuo 69, 0% iki 87, 5% ( P <0, 01, palyginti su kontroline). Šie pokyčiai parodė, kad dauguma ląstelių išėjo iš aktyviosios proliferacijos fazės ir ląstelių ciklas buvo sulaikytas.

Image

Nur77 per didelis ekspresija paskatino C6 gliomos ląstelių diferenciaciją. C6 ląstelės buvo auginamos 24 valandas be (a grupė) arba su choleros toksinu (10 ng / ml, b grupė). Ląstelės buvo transfekuotos nur77 ORF pCMV6 vektoriu (c grupė) arba tuščiu pCMV6 vektoriu (d grupė) 6 valandas, tada pakeistos į normalų DMEM (+ 1% FBS) ir išanalizuotos po 24 valandų. (A) Kai nur77 buvo per daug ekspresuotas, C grupės C6 gliomos ląstelės priėmė diferencijuotą morfologiją, kurią galima atskirti nuo normalių C6 ląstelių. (B) Nur77 buvo per daug ekspresuotas, naudojant pCMV6 įėjimo vektoriaus NR4A1 ORF cDNR kloną. (C) Perviršinis Nur77 išraiška padidino GFAP raišką ir žemyn sureguliuojamą PCNA raišką. (D, E) Dėl pernelyg didelio Nur77 ekspresijos ląstelių ciklas buvo sustabdytas panašiai kaip choleros toksino poveikis. Rezultatai išreiškiami kaip vidurkis ± SD ( n = 3) kontrolei. b P <0, 05, c P <0, 01 palyginti su kontrole.

Visas dydis

Rezultatai parodė, kad per didelis Nur77 ekspresija gali paskatinti C6 gliomos ląstelių diferenciaciją, kuri buvo analogiška choleros toksino poveikiui.

Diskusija

Žiurkės C6 ląstelių linija yra viena iš labiausiai nusistovėjusių gliomos ląstelių linijų ir turi nediferencijuotą fenotipą bei oligodendrocitines, astrocitines ir neuronines savybes. Todėl C6 ląstelės yra naudingas modelis glialinių ląstelių diferenciacijos tyrimams 6 . Choleros toksinas skatina C6 ląsteles transformuotis į labiau subrendusią astrocitinę būseną, ir šią transformaciją galima išmatuoti naudojant biologinius žymenis GFAP ir PCNA.

Pirmiausia išanalizavome C6 gliomos ląstelių genų ekspresijos profilius choleros toksino sukeltos diferenciacijos metu. Rezultatai mums pateikė bendrą genų ekspresijos duomenų bazę tolimesniems C6 gliomos diferenciacijos tyrimams.

Genų ekspresijos profilis atskleidė, kad C6 diferenciacijos metu pakito daugiau nei 1000 genų (> 3% analizuotų genų) ekspresijos lygis. Į sukeltą diferenciaciją buvo įtraukti daugybė iš eilės einančių paskesnių genų ir kelių. Tuomet reikėjo atlikti papildomus tyrimus, siekiant parodyti, kaip šie genai dalyvavo diferenciacijoje. Tarp šių skirtingai išreikštų genų stabilūs pokyčiai buvo retesni. Tik 22 genai buvo stabiliai reguliuojami aukštyn, o 7 genai buvo stabiliai reguliuojami. Dauguma šių genų dalyvavo transkripcijoje arba buvo reguliatoriai. Remiantis jų originaliomis funkcijomis ir stabilia aukšta išraiška, galima manyti, kad jie prisiima didesnę atsakomybę už C6 ląstelių diferenciaciją.

Tarp genų, dalyvaujančių transkripcijos reguliavime, branduoliniai receptoriai buvo ypač svarbūs koordinuojant aplinkos aplinkos pokyčius. Gebėjimas pajusti ir greitai reaguoti į pokyčius ląstelės aplinkoje, atrodo, yra šios pošeimos bruožas. Aukščiau sureguliuota nur77 ir nor1 išraiška buvo atitinkamai 1, 6 ir 3, 4 karto didesnė nei kontrolinės išraiškos trečią valandą. Mūsų RT-PGR rezultatai sutapo su mikrotraumos duomenimis. Pokytis buvo reikšmingas viso diferenciacijos proceso metu, tai rodo, kad jie aktyviai dalyvavo sukeltoje C6 ląstelių diferenciacijoje.

Nur77 (dar vadinamas NR4A1, NGFI-B arba TR3) priklauso našlaičių branduolinių receptorių 4 pošeimiui, A grupei (NR4A). Pošeimį sudaro dar du izotipai, plačiai žinomi kaip Nurr1 (NR4A2) ir Nor1 (NR4A3). NR4A funkcijos apima neuroendokrininį reguliavimą, nervų diferenciaciją, kepenų regeneraciją, apoptozę ir mitogeninę bei uždegiminę stimuliaciją 7, 8, 9, 10 . Nur77, Nurr1 ir Nor1 yra tipiški greito ir ankstyvo atsako genai, kuriuos greitai gali sukelti įvairūs tarpląsteliniai dirgikliai 11, 12 . Nors Nur77 dažnai buvo pranešta kaip svarbus apoptozę skatinantis faktorius neigiamai atrenkant T ląstelių 12, 13 arba naviko ląstelių linijas, tokias kaip melanomos ląstelės 14 ir kiaušidžių vėžio ląstelės 15, įrodymų apie jo vaidmenį ląstelių apoptozėje mūsų nerasta. sukeltas diferenciacijos modelis, rodantis, kad nur77 išraiška čia nesukėlė apoptozės.

Nur77 yra daugiausiai eksploatuojamas suaugusiųjų žinduolių smegenyse 16 ir gali būti sukeltas daugelio augimo faktorių skirtingose ​​ląstelėse. Skirtingi Nur77 raiškos modeliai smegenų vystymosi ir audinių pasiskirstymo metu rodo, kad tai gali atspindėti skirtingą transkripcijos vaidmenį smegenyse 16, 17 . Pavyzdžiui, Nur77 kaip transkripcijos faktorius vaidina svarbų vaidmenį nervų augimo faktoriaus (NGF) sukeltų PC12 ląstelių diferenciacijoje 18 . Įrodėme, kad nur77 buvo greitai ir nuolat reguliuojamas diferencijuojant C6 gliomos ląsteles, kurias sukėlė choleros toksinas. Šie atradimai parodė, kad nur77 padarė didelį diferenciaciją skatinantį poveikį ne tik normaliose smegenų ląstelėse, bet ir piktybinėse naviko ląstelėse, pvz. , C6 gliomos ląstelėse.

Kai RNAi nutildėme Nur77 , indukuota diferenciacija labai susilpnėjo. Per didelis Nur77 ekspresija patikimai skatino diferenciaciją C6 ląstelėse, todėl buvo parodytas tinkamas ląstelės fenotipas. Šie dvikryptiai eksperimentiniai rezultatai įrodė, kad nur77 buvo būtinas ir būtinas indukuotai C6 ląstelių diferenciacijai.

Neseniai iš Angelica sinensis chloroformo ekstrakto išskirtas natūralus junginys, n- butilideneftalidas, buvo tiriamas dėl priešvėžinio poveikio GBM tiek in vitro, tiek in vivo . Nur77 buvo nustatyta kaip galimas tokio poveikio tikslinis genas 19, identifikuojantis Nur77 kaip galimą genų taikinį diferenciacijos tyrimuose ir terapijoje.

Apibendrinant, atlikdami mikrotraumos analizę, mes nustatėme, kad branduolinio receptoriaus genas nur77 buvo labai sukeltas diferencijuojant C6 ląsteles. Mes parodėme nur77 svarbą atliekant žemyn ir aukštyn reguliuojančius eksperimentus, priversdami spėlioti, kad jis gali vaidinti svarbų vaidmenį sukeltoje gliomos ląstelių diferenciacijoje. Tolesnis tyrimas reguliuojamoje kaskadoje gali padėti atskleisti tikrąjį nur77 vaidmenį diferencijuojant C6 gliomos ląsteles.

Autoriaus indėlis

„Guang-mei YAN“ sukurti tyrimai; Dong XU ir Yi-jun HUANG atliko tyrimus; Yan LI ir Wei YIN pateikė naujų analizės priemonių ir reagentų. Dong XU išanalizavo duomenis ir parašė darbą.