Su kiaušidžių naviku susijusi mikrorna-20a sumažina natūralaus žudiko ląstelių citotoksiškumą, nes sumažėja žėručio / b ekspresija | ląstelių ir molekulinė imunologija

Su kiaušidžių naviku susijusi mikrorna-20a sumažina natūralaus žudiko ląstelių citotoksiškumą, nes sumažėja žėručio / b ekspresija | ląstelių ir molekulinė imunologija

Anonim

Anotacija

MikroRNR (miRNR) yra mažų nekoduojančių reguliavimo RNR klasė, o miRNR pokyčiai yra susiję su naviko atsiradimu ir progresavimu. Tyrimai parodė, kad miR-20a yra per daug ekspresuojamas žmogaus kiaušidžių vėžio audiniuose ir kad ši miRNR pagerina ilgalaikį ląstelių dauginimąsi ir invazijos galimybes. Šiame tyrime buvo pastebėtas teigiamas ryšys tarp serumo miR-20a ekspresijos ir kiaušidžių vėžio stadijos. Mes nustatėme, kad miR-20a tiesiogiai jungiasi su 3-ų neperkeltu MICA / B mRNR regionu, todėl jo skilimas sumažėja ir baltymų kiekis plazmos membranoje sumažėja. Membranoje surištų MICA / B baltymų, kurie yra natūralių žudiko 2 grupės narių (NKG2D) receptorių, randamų natūralių žudikių (NK) ląstelėse, γδ + T ląstelėse ir CD8 + T ląstelėse, sumažinimas leidžia navikinėms ląstelėms išvengti imuniteto. tarpininkaujamas žudymas. Pabrėžtina, kad antagonizuojantis miR-20a veiksmas sustiprino naviko ląstelių žudymą NKG2D sąlygotame navikų in vitro ir in vivo modeliuose. Apibendrinant, mūsų duomenys rodo, kad padidėjęs miR-20a lygis navikinėse ląstelėse gali netiesiogiai slopinti NK ląstelių citotoksiškumą, sumažindamas MICA / B ekspresiją. Šie duomenys rodo galimą ryšį tarp metastazių ir naviko ląstelių imuninio pabėgimo iš NK ląstelių.

Įvadas

Su MHC I klasės grandinėmis susijusios A ir B molekulės (MICA ir MICB, kartu vadinamos MICA / B) yra plačiai ekspresuojamos epitelio naviko ląstelėse ir yra atpažįstamos γδ + T ląstelių, CD8 + T ląstelių ir natūralių žudikų (NK) ląstelių. pagal NK 2 grupės nario D (NKG2D) receptorius. NKG2D – MICA / B kelias vaidina pagrindinį vaidmenį atliekant imuninės sistemos stebėjimą nustatant piktybines ląsteles. 1, 2, 3 MICA / B ligandai ir juos aktyvinantis receptorius NKG2D vaidina svarbų vaidmenį NK, γδ + ir CD8 + T-ląstelių sąlygotame imuniniame atsake į navikus. Šiuos ligandus paprastai sukelia su naviku susijęs antigenas 6 ir hipoksinis stresas, paprastai susijęs su vėžiu. 7 Tačiau vėžio ląstelės sugeba sumažinti šių paviršiaus ligandų kiekį, sukeldamos jų žemą reguliavimą ir (arba) internalizavimą 8 ir priversdamos jas išnaikinti tarpląstelinius domenus, taip apsaugodamos imunines ląsteles nuo aptikimo. 9, 10 Neseniai MICA / B mRNR buvo nustatyta normalių sveikų žmogaus audinių 11, 12 ir suaugusių bei normalių embrionų pelėse. Šis atradimas rodo, kad gali būti tam tikri post-transkripcijos mechanizmai, siekiant užkirsti kelią šių mRNR transliacijai sveikiems asmenims, greičiausiai, siekiant išvengti autoimuniteto.

MikroRNR (miRNR) yra mažų nekoduojančių RNR, kurių dydis yra maždaug 22 nukleotidai, klasteris. miRNR po transkripcijos reguliuoja tikslinės mRNR raišką, atpažindamos komplementuojančias vietas tikslinės mRNR 3′-netransliuojamame regione (UTR), tokiu būdu stimuliuodamos ląstelių autonominį tikslinės mRNR skaidymą. Vis daugiau įrodymų rodo, kad miRNR dažnai keičiasi sergant vėžiu, todėl manoma, kad jie vaidina svarbų vaidmenį naviko formavime ir vystymesi. Didelės pastangos buvo skiriamos miRNR, kaip klinikinių mėginių, tokių kaip serumas, kaip potencialių vėžio diagnostinių biomarkerių, reikšmės tyrimui. Ankstesni tyrimai parodė, kad miR-20a padidėja esant sunkioms kiaušidžių karcinomoms, palyginti su normaliais kiaušidžių audiniais, ir kad miR-20a ekspresijos lygis koreliuoja su išgyvenimu pacientams, sergantiems sunkia kiaušidžių karcinoma. 15, 16 Šie duomenys leido mums suabejoti, ar miR-20a prisideda prie MICA / B ekspresijos po transkripcijos reguliavimo ir kiaušidžių karcinomos ląstelių imuninio pabėgimo.

Šiame tyrime mes nustatėme teigiamą koreliaciją tarp serumo miR-20a lygio ir kiaušidžių vėžio stadijos. Toliau mes ištyrėme miR-20a poveikį MICA / B ekspresijos reguliavimui, naudodami kiaušidžių vėžio ląstelių liniją SKOV3. Mes nustatėme, kad miR-20a slopina išraišką MICA / B, sąveikaudamas su MICA / B 3′-UTR. Mes taip pat parodėme, kad per didelis miR-20a ekspresija slopino MICA / B raišką ir NK citotoksiškumą in vivo . Apibendrinant, šio tyrimo duomenys papildo mūsų supratimą apie tai, kaip miR-20a raiška gali modifikuoti molekulinius mechanizmus, kuriais grindžiamas kiaušidžių vėžio imuninis pabėgimas.

Rezultatai

Padidėjusi miR-20a išraiška sergančiųjų kiaušidžių vėžiu serume yra susijusi su ligos progresavimu.

Ankstesni tyrimai, kuriuose buvo naudojami miRNR mikrotraumai, atskleidė, kad miR-200a, miR-141, miR-16, miR-200b, miR-200c ir miR-20a lygis yra padidėjęs (daugiau nei dvigubai), tuo tarpu miR-100 yra mažesnis kiaušidžių vėžiu sergantiems pacientams. nei naudojant sveiką kontrolę. 15, 16 Tarp šių miRNR, ypač miR-20a, buvo pranešta, kad jie reguliuoja T-ląstelių aktyvacijos genus tiek įsitvirtinimo, tiek numuštų T-ląstelių modeliuose. 22 Norėdami ištirti miR-20a raišką sergantiems kiaušidžių vėžiu ir nustatyti koreliaciją tarp miR-20a lygio ir ligos sunkumo, mes toliau tyrėme miR-20a vaidmenį serumo mėginiuose iš pacientų, sergančių epiteliniu kiaušidžių vėžiu.

MiR-20a ekspresija serume buvo įvertinta qRT-PGR metodu pacientams, sergantiems kiaušidžių navikais ( n = 34), pacientams, sergantiems kiaušidžių cistomis ( n = 10) ir sveikiems kontrolinės grupės pacientams ( n = 20). Kaip parodyta 1 lentelėje, ΔC TmiR20a buvo žymiai mažesnis pacientams nei įprastų kontrolinių grupių ( P <0, 05), tuo tarpu Δ C TmiR20a pacientų, sergančių kiaušidžių cistos liga, serume atrodė normalus, tai rodo, kad miR-20a lygis buvo žymiai didesni pacientams, sergantiems kiaušidžių vėžiu, nei normalios ir kiaušidžių cistų ligos kontrolėms. Norėdami įvertinti ryšį tarp miR-20a ir klinikinių patologinių kiaušidžių vėžio ypatumų, išanalizavome miR-20a lygį sergančiųjų kiaušidžių vėžiu serumuose, klasifikuojamuose pagal metastazes arba Tarptautinės ginekologijos ir akušerijos federacijos (FIGO) ligos stadiją. MiR-20a ekspresijos lygis reikšmingai padidėjo pacientams, sergantiems metastazėmis ir III – IV stadijos ligomis ( P <0, 05). Tarp miR-20a ekspresijos ir kitų naviko charakteristikų ryšys nenustatytas (1 lentelė). Šie rezultatai rodo, kad miR-20a gali būti susijęs su kiaušidžių vėžio progresavimu.

Pilno dydžio lentelė

miR-20a ekspresija ir kiaušidžių vėžio prognozė

Norint nustatyti, ar miR-20a yra susijęs su kiaušidžių vėžiu sergančių pacientų prognozėmis, visų pacientų santykinės miR-20a ekspresijos mediana (Δ C T = 1, 55) buvo naudojama aukštos ir žemos ekspresijos grupių apibrėžimui ( n = atitinkamai 15 ir 19). Didelės raiškos grupės pacientams bendras išgyvenimas buvo trumpesnis ( P = 0, 048), palyginti su pacientais, kurių ekspresija buvo maža miR-20a (1 paveikslas). Tai rodo, kad miR-20a gali vaidinti svarbų vaidmenį kiaušidžių navikogenezėje ir imuniteto stiprinime.

Image

Pacientų kiaušidžių vėžiu išgyvenamumo kreivės pagal miR-20a ekspresijos būklę. Pacientų, kuriems nustatyta aukšta miR-20a ekspresija ( n = 15), prognozės buvo žymiai prastesnės nei pacientų, kurių miR-20a ekspresija buvo maža ( n = 19) ( P = 0, 048; log-rank testas).

Visas dydis

„miR-20a“ sumažina MICA / B išraišką

Norėdami ištirti, ar miR-20a dalyvavo imuniniame reguliavime, nukreipdami į MICA / B mRNR, mes panaudojome „TargetScan“ algoritmą, 23, kuris nustatė galimas miR-20a surišimo vietas MICA / B ligandų 3′-UTR.

Eksperimentiškai patvirtinant, ar miR-20a reguliuoja MICA / B baltymų ekspresiją vėžio audinyje, buvo atliktas funkcinis tyrimas SKOV3 ir ES-2 kiaušidžių karcinomos ląstelėse in vitro . miR-20a mimika ir anti-miR-20a oligonukleotidai buvo perkrėsti į ląsteles, o miR-20a, MICA / B mRNR ir MICA / B baltymų lygiai ląstelių paviršiuje buvo ištirti qRT-PCR ir FCM (2 paveikslas). .

Image

„miR-20a“ specifiškai mažina MICA / B raišką SKOV3 kiaušidžių karcinomos ląstelėse. ( a ) miR-20a lygių polimerazės grandininės reakcijos analizė SKOV3 ląstelėse, transfekuotose miR-20a (kairėje) arba miR-20a oligonukleotidų inhibitoriais (dešinėje). ( b ) MICA / B mRNR lygiai transfekuotose SKOV3 ląstelėse buvo analizuojami realaus laiko PGR. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis. c ) MICA / B raiška transfekuotų SKOV3 ląstelių paviršiuje buvo nustatyta naudojant srauto citometriją. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. * P <0, 05 ir *** P <0, 01, palyginti su kontrole. PGR, polimerazės grandininė reakcija.

Visas dydis

Rezultatai parodė, kad MICA / B mRNR (2a ir b pav.) Ir baltymų (2c paveikslas) reikšmingai sumažėjo miR-20a transfekuotose ląstelėse in vitro . Be to, sumažėjęs miR-20a reguliavimas, perkeliant ląsteles anti-miR-20a (nuo trijų iki keturių kartų), padidino MICA / B mRNR ir baltymo ekspresiją. Šie duomenys rodo, kad miR-20a reguliuoja MICA / B raišką kiaušidžių karcinomos ląstelėse.

„miR-20a“ tiesiogiai jungiasi su MICA / B 3′-UTR

Norėdami patikrinti, ar „miR-20a“ tiesiogiai nukreiptas į MICA / B, mes sukūrėme keturis „Firefly“ liuciferazės reporterių vektorius: dviejuose yra laukinio tipo MICA ir MICB 3′-UTR, kituose dviejuose yra MICA ir MICB 3′-UTR su mutavusia miR –20a surišimo vieta (numatoma pagal „TargetScan“ algoritmą; 3a ir b paveikslai). Šie vektoriai buvo transfekuoti į SKOV3 ląsteles, kurios taip pat buvo transfekuotos miR-20a (40 ir 80 nM) arba kontrolinėmis (netikslinėmis) RNR oligomis.

Image

„miR-20a“ tiesiogiai jungia MICA / B 3′-UTR. a ) MICA / B 3′-UTR ir numatomų miR-20a rišamųjų vietų scheminis pavaizdavimas (sėklos padėties bazės 207–213 MICA 3′ – UTR ir sėklos padėties bazės 50–56 3′– MICB UTR). ( b ) miR-20a suderinimas su MICA / B mutavusia 3′-UTR. c ) Santykinis luciferazės aktyvumas po nurodytų reporterio plazmidžių (MICA / B 3′-UTR arba mutantų MICA / B mut 3′-UTR) transfekcijos į SKOV3 ląsteles, ekspresuojančias 40 nm hsa-miR-10b, 80 nm hsa-miR -10b arba kontrolinė miRNR. „Firefly“ luciferazės aktyvumas buvo normalizuotas iki „ Renilla“ luciferazės aktyvumo ir vėliau normalizuotas iki vidutinio kontrolinio reporterio aktyvumo. Duomenys parodomi kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. * P <0, 05 ir *** P <0, 01, palyginti su kontrole. miRNR, mikroRNR; UTR, neišverstas regionas.

Visas dydis

Esant miR-20a, pastebėtas reikšmingas MICA ir MICB luciferazės aktyvumo sumažėjimas, tuo tarpu MICA ir MICB 3′-UTR mutacijos šį poveikį panaikino (3c paveikslas). Šis rezultatas rodo, kad miR-20a tiesiogiai nukreiptas į MICA / B numatytoje surišimo vietoje.

Sumažėjęs MICA / B reguliavimas miR-20a sumažina NKG2D tarpininkaujamą žudymą

Toliau mes ištyrėme, ar MICR / 20 sąlygotas MICA / B reguliavimas daro įtaką biologinėms funkcijoms in vitro . SKOV3 tikslinės ląstelės buvo transfekuotos miR-20a, anti-miR-20a imitacijomis arba kontrolinėmis RNR oligomis. Tada mes iš anksto paženklinome transfekuotas SKOV3 ląsteles CFSE ir įvertinome miR-20a vaidmenį NK citotoksiškumo tyrimuose, kurie buvo atlikti kultivuojant SKOV3 ląsteles su NK ląstelėmis. Kaip parodyta 4 paveiksle, transfekcija su miR-20a sąlygojo nedidelį NK92 ląstelių citolitinio aktyvumo sumažėjimą esant įvairiems efektoriaus ir tikslo santykiams. Be to, anti-miR-20a panaikino šį slopinantį poveikį. Visi šie rezultatai rodo, kad miR-20a sąlygotas MICA / B ekspresijos sumažėjimas sumažino NK ląstelių žudymą.

Image

MiR-20a sumažinus MICA / B reguliavimą, sumažėja NKG2D tarpininkaujantys žudymai. ( a ) Dviejų parametrų taškų diagrama rodo gyvas SKOV3 tikslines ląsteles (viršutinis kairysis kvadrantas, Q1), paženklintas CFSE, palyginti su negyvomis tikslinėmis ląstelėmis (viršutinis dešinysis kvadrantas, Q2), paženklintomis CFSE ir PI. Ląstelės buvo transfekuotos miR-Ctrl, miR-20a, anti-miR-Ctrl arba anti-miR-20a. Parodytas trijų nepriklausomų eksperimentų pavyzdys. b ) Dešinė histograma parodo statistinius duomenis, pateiktus kairiajame diagramoje (Q2 / (Q2 + Q1) × 100%). Eksperimentas buvo atliktas naudojant efektoriaus ir taikinio ląstelių santykį 20 ∶ 1, kaip aprašyta skyriuje „Medžiagos ir metodai“. Duomenys pateikiami kaip trijų nepriklausomų eksperimentų vidurkis ± sd. * P <0, 05 ir *** P <0, 01, palyginti su kontrole. CFSE, karboksifluoresceino diacetato sukcinimidilo esteris; NKG2D, 2 grupės natūralių žudikų narys D; PI, propidium jodidas.

Visas dydis

„miR-20a“ sukėlė imuninės sistemos vengimą in vivo

Nepaisant to, kad žmogaus MICA / B skiriasi nuo pelių, imunokompetentingos pelės gali pašalinti žmogaus piktybines ląsteles per NKG2D – MICA / B kelią. 21 pelės, gydomos blokuojančiu anti-NKG2D monokloniniu antikūnu (siekiant sunaikinti NKG2D + imunines ląsteles), buvo naudojamos tiriant miR-20a sukeltą imuninį poveikį in vivo . Praėjus penkioms valandoms po injekcijos skirtingais ląstelių mišiniais (SKVO3 ląstelėmis, paženklintomis CFSE, ir HeLa ląstelėmis, pažymėtomis DiD), buvo paruoštos signalo ląstelių suspensijos, o miR-20a reikšmė nukreipiant į MICA / B in vivo buvo ištirta fluorescenciniu būdu aktyvuotas ląstelių rūšiavimas. Kaip parodyta 5a paveiksle, SKM3 ląsteles (CFSE + ) ir HeLa ląsteles (Vybrant DiD + ) FCM galėjo sėkmingai atskirti. SKOV3 santykis su HeLa ląstelėmis 5b paveiksle rodo, kad įšvirkštų pelių plaučiuose buvo reikšmingas miR-20a per daug ekspresuojančių SKOV3 ląstelių praturtėjimas, palyginti su ląstelėmis, ekspresuojančiomis kontrolinę miRNR. Dėl kempinės „anti-miR-20a“ sumažėjo naviko ląstelių išgyvenamumas plaučiuose, nes jos padidino MICA / B raišką. Anti-NKG2D monokloninis antikūnas panaikino pastebėtus NKG2D atpažinimo blokavimo skirtumus (5b paveikslas). Taigi, miR-20a sąlygotas MICA / B sumažinimas apsaugo navikines ląsteles nuo NK ląstelių imunologinio citotoksiškumo in vivo .

Image

„miR-20a“ sukeltas imuninės sistemos vengimas in vivo . a ) Ląstelių, pažymėtų Vybrant DID (HeLa ląstelės, apatinė dešinė) ir CFSE (SKOV3 ląstelės, perkeltos miR-Ctrl, miR-20a arba miR-20a inhibitoriumi, viršuje, kairėje), FACS analizė vienaląsčių suspensijų iš IgG izotipo grupės plaučiai. ( b ) SKOV3 ir HeLa naviko ląstelių santykis plaučiuose buvo apskaičiuotas praėjus 5 val. po injekcijos IgG izotipo grupėje ir anti-NKG2D IgG grupėje. „HeLa“ ląstelės nėra efektyviai naikinamos pelių NK ląstelėmis, todėl buvo naudojamos kaip vidinė kontrolė. Šis santykis atspindi SKOV3 ląstelių, perkeltų įvairiais konstruktais, išgyvenamumą. Anti-NKG2D mAb panaikino pastebėtus skirtumus. Duomenys pateikiami kaip vidutinis ± sd * P <0, 05, palyginti su kontrole. CFSE, karboksifluoresceino diacetato sukcinimidilo esteris; FACS, fluorescenciniu būdu aktyvuotas ląstelių rūšiavimas; mAb, monokloninis antikūnas; NK, natūralus žudikas; NKG2D, natūralių žudikų grupės 2 narys D.

Visas dydis

Diskusija

Aktyvinantis receptorius NKG2D ir jo ligadai vaidina svarbų vaidmenį NK, γδ + ir CD8 + T ląstelių sąlygotame imuniniame atsake į navikus. 14, 17 Tačiau navikai sukūrė įvairius mechanizmus, padedančius išvengti imuninių ląstelių pašalinto eliminavimo, tokiu būdu leidžiant navikui atsinaujinti. 24 Naujausi tyrimai nustatė, kad naviko ląstelės nenormaliai ekspresuoja daugybę miRNR, o šis nenormalus miRNR raiškos profilis reikšmingai prisideda prie naviko imuninio pabėgimo. 25 Ankstesni tyrimai pranešė, kad miR-20a yra susijęs ne tik su naviko vystymusi 26, 27, bet ir su invaziniu aktyvumu kiaušidžių karcinomos ląstelėse. 28 Šiame tyrime mes ištyrėme miR-20a vaidmenį ir jo po-transkripcinį MICA / B reguliavimą kiaušidžių karcinomai.

Nors ankstesni tyrimai parodė, kad miR-20a yra labai ekspresuojamas kiaušidžių vėžyje, šie tyrimai daugiausia dėmesio skyrė miR-20a ekspresijai audiniuose. Mūsų tyrimas patvirtina, kad miR-20a išraiška yra ne tik reikšmingai didesnė pacientams, sergantiems kiaušidžių vėžiu, nei įprastai, bet ir reikšmingai susijusi su metastazavimu ir bloga kiaušidžių vėžio prognoze. MiRNR serume, kurios daugiausia gaunamos iš ląstelių su pažeista plazmos membrana, 29 cirkuliuoja kraujyje be ląstelių ir santykinai stabilios formos 30 ir yra laikomos perspektyvia nauja biomarkerių klase. 31 Tačiau norint atlikti išsamų miR-20a serumo diagnostinį potencialą sergant kiaušidžių vėžiu, būtina atlikti tolesnius klinikinius tyrimus konkrečių perspektyvių tyrimų metu. Šiame tyrime mes pranešame, kad miR-20a raiška žymiai padidėja pacientams, sergantiems kiaušidžių vėžiu, kurių CA-125 yra ≤500 V / ml, bet ne tiems, kurių CA-125 yra> 500 V / ml, ir tai gali sukelti individualūs pokyčiai. Tačiau norint išsamiai įvertinti CA-125 ir serumo miR-20a santykį kiaušidžių vėžyje, būtina atlikti papildomus klinikinius tyrimus.

Kadangi miR-20a lygiai yra koreliuojami su ligos metastazėmis, mes iškėlėme hipotezę, kad šis ryšys gali kilti dėl miR-20a tarpininkaujantio MICA / B mRNR reguliavimo. Norint ištirti šią galimybę, SKOV3 ir ES-2 ląstelės buvo transfekuotos miR-20a, kad būtų galima nustatyti miR-20a ekspresijos poveikį MICA / B lygiams. RT-PCR ir FCM analizė parodė, kad miR-20a sumažino MICA / B mRNR ir baltymų kiekį transfekuotose ląstelėse. Toliau, naudodamiesi in vitro modeliu, mes nustatėme, kad miR-20a nukreiptas į MICA / B 3′-UTR, dėl to sumažėja NKG2D atpažinimas ir vėliau sumažėja K562 ląstelių žudymas NK ląstelėmis. Galiausiai išsiaiškinome, kad dėl miR-20a-tarpinio MICA / B reguliavimo sumažėja NK ląstelių eliminacija in vivo, nes sumažėja NKG2D atpažinimas.

Atsižvelgiant į tai, kad MICA / B nėra išreikštas pelėmis, sunku įvertinti miR-20a sukeltą imuninės sistemos vengimą in vivo . Naujausias „Pinchas 21“ grupės darbas parodė, kad pelių NK ląstelės gali žymiai sunaikinti žmogaus naviko ląsteles per NKG2D – MICA / B kelią in vivo . Čia mes parodėme, kad transfekcija su miR-20a lėmė MICA / B sumažėjimą ant naviko ląstelių paviršiaus, taip pagerindama naviko ląstelių išgyvenimą in vivo . Be to, mes parodėme, kad konkuruojantis miR-20a inhibitorius (kempinė-miR-20a) reikšmingai išvalė naviko ląsteles in vivo . Be to, išgyvenamumo skirtumas, stebimas įvairiose naviko ląstelėse pelės plaučiuose, galėtų būti pašalintas blokuojant anti-NKG2D mAb.

Pabaigoje mes nustatėme, kad miR-20a nukreiptas į MICA / B, kad būtų išvengta NKG2D tarpininkaujamo imuninės atakos, ir kad miR-20a reguliavimas kiaušidžių vėžyje sumažina MICA / B raišką per sąveiką su jo 3′-UTR. Tai nejautrina navikinių ląstelių, išreiškiančių žemą MICA / B kiekį, kad NK / T-ląstelės žūtų. Visi šie duomenys rodo naują „miR-20a“ vaidmenį naviko vystymesi ir suteikia naujų įžvalgų apie MICA / B moduliaciją vėžio imuninės priežiūros metu.

Įmokos

Shuli Zhao suprojektavo tyrimą, atliko eksperimentus, išanalizavo duomenis ir parašė rankraštį. Mengna Liu ir Jingyan Xie atliko eksperimentus, padėjo tyrimo dizainą, išanalizavo duomenis ir komentavo rankraštį. Yujuan Li, Yunzhong Nie ir Qiongyu Mi atliko eksperimentus.