„p53-cbp / p300“ transkripcijos modulis reikalingas tarpo 43 ekspresijai, aksonų augimui ir regeneracijai | ląstelių mirtis ir diferenciacija

„p53-cbp / p300“ transkripcijos modulis reikalingas tarpo 43 ekspresijai, aksonų augimui ir regeneracijai | ląstelių mirtis ir diferenciacija

Anonim

Anotacija

Transkripcija reguliuoja aksonų išsiveržimą ir regeneraciją. Tačiau iki šiol nebuvo parodyta jokių transkripcijos kompleksų, kurie kontroliuotų aksonų augimą ir regeneraciją, reguliuodami aksonų augimo genus. Čia mes pranešame, kad naviko slopintuvas p53 ir jo acetiltransferazės CBP / p300 sudaro transkripcijos kompleksą, kuris reguliuoja su aksonų augimu susietą baltymą 43, gerai apibūdinamą proaksonų augimą ir regeneracijos baltymą. Acetilinis p53, esantis K372-3-82, skatina aksonų išstūmimą, GAP-43 ekspresiją ir suriša specifinius elementus neuronų GAP-43 promotoriuje chromatino aplinkoje per CBP / p300 signalizaciją. Svarbu tai, kad aksonų regeneracijos modelyje tiek CBP, tiek p53 K372-3-82 yra sužadinami po veido motorinių neuronų aksotomijos, kai p53 K372-3-82 GAP-43 promotoriaus užimtumas padidėja, kaip parodyta chromatino imunoprecipitacija in vivo . Galiausiai, palyginę laukinio tipo ir p53 nulines peles, parodome, kad p53 / GAP-43 transkripcijos modulis yra specialiai įjungtas aksonų regeneracijos metu in vivo . Šie duomenys padeda suprasti genų reguliavimą aksonų ataugoje ir gali pasiūlyti naujų molekulių taikinių aksonų regeneracijai.

Pagrindinis

Aksonų užaugimui, daigumui ir atsinaujinimui reikalinga orkestruota įvykių seka. Tai susideda iš tarpląstelinių ir ląstelinių signalinių baltymų, kurie keičia citoskeletą, kad modifikuotų aksonų ir augimo kūgio plastiškumą, ekspresijos. Transkripcijos lygiu jie yra reguliuojami transkripcijos veiksnių rinkiniu, apimančiu c-jun, C / EBP, CREB, STAT3 ir p53. 1, 2 Tačiau tikslią jų išraiškos sureguliavimą greičiausiai užtikrins tinkamas transkripcijos modulių, kurie apima transkripcijos faktorius, koaktyvatorius ir promotoriaus sekas, suformavimas.

Iki šiol nebuvo aprašyta, kad tiek specifiniai transkripcijos veiksniai, tiek transkripcijos kompleksai vaidina tiesioginį vaidmenį aksonų augime, užimant proaksonų augimo genų promotorius. Norėdami išspręsti šią problemą, mes pasirinkome ištirti prototipinio aksonų augimo faktoriaus, su augimu susijusio baltymo 43 (GAP-43), transkripcinį reguliavimą neurito / aksonų augimo ir regeneracijos kontekste. Tiesą sakant, mes tikime, kad GAP-43 transkripcijos aplinkos išaiškinimas gali suteikti įžvalgos apie bendruosius nuo transkripcijos priklausomus molekulinius mechanizmus, kurie reguliuoja aksonų augimą, daigumą ir regeneraciją tam tikrose nervų sistemos srityse.

GAP-43 yra nuo neurotrofinų priklausomas membranos surištas fosfoproteinas, randamas neuronų aksonuose ir augimo kūgyje. 3, 4 Jis labai išreikštas keliose plastinėse nervų sistemos srityse vystymosi metu, 5, 6 po ūminių periferinių nervų ir CNS traumų, tokių kaip insultas, galvos ir nugaros smegenų traumos, ir neuronuose, kuriuose vyksta sinapsinis plastiškumas ir aksonų dygimas. 7, 8, 9, 10, 11 GAP-43 prisideda prie aksonų sudygimo ir atsinaujinimo periferinėje nervų sistemoje, regos nerve, smegenų Purkinje ląstelėse, hipokampo samanų pluoštuose ir mažėjančioje rape-stuburo dalyje. stuburo traktai. 12, 13, 14, 15 Tačiau vien GAP-43 reikšmingai neskatina aortos regeneracijos kortikos-stuburo traktatuose ir nugaros šaknies ganglijose, kylančiose iš stuburo pluoštų, tačiau tai daro po nugaros kolonos pažeidimų, kai jie yra pernelyg išreikšti kartu su CAP-23. 16

Iki šiol buvo įrodyta, kad GAP-43 yra reguliuojamas tiek transkripcijos, tiek po transkripcijos lygiu. ELNA-Hu šeimos nariai, jungiantys RNR baltymus, yra pagrindiniai GAP-43 reguliatoriai po transkripcijos PC-12 ląstelėse, kuriantys neuronus ir tam tikrus subrendusius neuronus. 17, 18, 19, 20 Iš tikrųjų, prisijungdami prie konservuotų GAP-43 mRNR 3′-UTR motyvų, jie stabilizuoja GAP-43 citoplazmoje ir augimo kūge. 21

Tyrimai, kurių tikslas buvo išaiškinti GAP-43 transkripcinį reguliavimą, išryškino 1000 bp promotoriaus elemento, esančio prieš baltymą koduojančią sritį, svarbą jo neuroninei raiškai. 22, 23 Šiame promotoriaus regione buvo nustatytas reaguojantis į AP-1 elementas, 24 tačiau nenustatyta, kad nei Jun, tiek Fos transkripcijos faktoriai, kurie jungiasi prie AP-1, tiesiogiai reguliuotų GAP-43 raišką. Be to, in vitro tyrimai parodė, kad bazinis spiralės-kilpos-spiralės diferenciacijos faktorius Nex1 / MATH-2 jungiasi prie GAP-43 promotoriaus srities netoli transkripcijos pradžios vietos. 25

Neseniai mes išsiaiškinome, kad p53 yra reikalingas neurito augimui ir aksonų regeneracijai po periferinio nervo sužalojimo, iš dalies modifikuojant su citoskeletu susijusių baltymų Coronin 1b ir Rab13 ekspresiją. Svarbu tai, kad buvo pastebėta, kad GAP-43 yra ekspresuojamas kartu su Coronin 1b ir Rab13 kultivuojamuose neuronuose aksonų ataugų metu ir in vivo dygstančiuose aksonuose po nugaros smegenų sužalojimo. 26, 27

Dėl to mes paklausėme, ar aksonų užaugimą ir GAP-43 galima reguliuoti p53 specifinėje transkripcijos aplinkoje.

Rezultatai

p53 jungiasi su konkrečiais GAP-43 promotoriaus elementais ir skatina jų išraišką

Norėdami nustatyti tariamus GAP-43 neuronų genų ekspresijos transkripcijos veiksnius, atlikome in silico analizę, naudodami „MatInspector“ įrankį iš „Genomatix“ (www.genomatix.de) visame žiurkės GAP-43 5′-promotoriaus regione. Tai apėmė 1000 bp prieš baltymus koduojančią seką, kuri buvo anksčiau nustatyta sritis, reikalinga GAP-43 neuronų geno ekspresijai. 22, 23 Mūsų atlikta in silico analizė leido spėti, kad p53 rišančioji vieta yra maždaug 600 bp prieš GAP-43 baltymus koduojančią seką. P53 surišantis motyvas yra identiškas žiurkėms ir pelėms bei labai konservuotas žmonėms, todėl patvirtina jo fiziologinę svarbą (1a pav.).

Image

p53 užima GAP-43 promotoriaus TFBS ir moduliuoja jo transkripciją neuronų ląstelėse. ( a ) p53 TFBS suderinimas su GAP-43 promotoriumi žiurkėms, pelėms ir žmonėms. Pagrindinis konservuotas surišimo domenas yra paryškintas dėžutėje. Šie TFBS buvo identifikuoti silikone naudojant „Genomatix“ įrankį „MatInspector“. ( b ) ChIP tyrimas rodo in vivo w5p53 chromatino aplinkoje sąveiką su p53 TFBS, gautu iš žiurkės GAP-43 promotoriaus. PC-12 ląstelės nebuvo gydomos arba 30 valandų buvo apdorotos NGF (100 ng / ml), kad sukeltų diferenciaciją. Po to ląstelės buvo susietos su formaldehidu ir imunosistema nusodintos polikloniniu antikūnu, atpažįstančiu visą ilgį p53 (FL-393). Įeinantys mėginiai buvo surinkti prieš kritulį ir naudojami kaip normalizavimo kontrolė. WAF1 / p21 promotoriaus sritis buvo naudojama kaip teigiama p53 surišimo kontrolė. GAP-43 geno 3′ kraštai buvo naudojami kaip p53 užimtumo GAP-43 promotoriaus specifiškumo kontrolė. ( c ) Analogiškas ChIP tyrimas buvo atliktas kaip ir b punkte, PC-12 ląstelėse, stabiliai ekspresuojančiose p53DN. Šiuo atveju p53 neįrodo jungimosi prie GAP-43 arba p21 / WAF1 promotoriaus (dešinėje). ( d ) ChIP tyrimas, atliktas kaip b punkte, rodo, kad GAP-43 promotorių užima endogeninis p53 kultivuotuose žiurkių žievės neuronuose. ( e – g ) Wt žiurkės GAP-43 promotoriaus elementas, turintis p53 TFBS ( e ir f ), bet nesušifruota seka ( g ), reaguoja į wt p53 perdėtą ekspresiją žiurkės žievės neuronuose ( e ) ir PC-12 ląstelėse ( f ir g ). Po to, kai p53 buvo ekspresuotas perrašant viso ilgio p53, dvigubos luciferazės tyrimas buvo atliktas žiurkės žievės neuronuose ( e ) ir NGF apdorotose (100 ng / ml) arba neapdorotose PC12 ląstelėse ( f ir g ). Aktyvumas, išreikštas tiek sušukto, tiek p53 TFBS turinčio luciferazės konstrukto kartų pokyčiais, buvo normalizuotas pcDNA3 tuščių vektorių transfekuotose ląstelėse. Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, išanalizuotą nesusiejant dvipusio t- testo, kurio P vertė <0, 01, trigubai. Po kiekviena juostų schema yra vesternų blotai, kurie parodo p53 raiškos lygius po transfekcijos. β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė

Visas dydis

Norint įvertinti, ar endogeninis p53 gali prisijungti chromatino aplinkoje prie GAP-43 promotoriaus srities, kurioje yra in silico identifikuota numanomo surišimo vieta, buvo atlikti chromatino imunoprecipitacijos tyrimai (ChIP). Pirmiausia buvo panaudotos į neuronus panašios PC-12 ląstelės, nes jos ekspresuoja ir p53, ir GAP-43. Buvo nustatyta, kad endogeninis p53 užima endogeninio GAP-43 promotoriaus in- silico numatytą transkripcijos faktorių surišimo vietą (TFBS) PC-12 ląstelėse (1b pav.). Pridedant nervų augimo faktorių (NGF), šis užimtumas reikšmingai nepadidėja (1b pav.). Užimtumas prieš NGF stimuliaciją rodo, kad p53 prisijungimas prie GAP-43 promotoriaus taip pat vyksta nepriklausomai nuo NGF signalizacijos. Anksčiau mes parodėme, kad dominuojantis neigiamas p53 (p53DN R175H) slopina nuo p53 priklausomą transkripciją. 28 Čia mes konkrečiai parodome, kad tik laukinio tipo endogeninis p53 jungiasi prie GAP-43 promotoriaus elementų. Tiesą sakant, atliekant ChIP tyrimą, atliktą PC-12 ląstelėse, stabiliai transfekuotose p53DN mutantu, p53 neužima šios GAP-43 promotoriaus srities (1c paveikslas). Tada, dar svarbiau, mes atlikome ChIP tyrimus pirminiuose žievės neuronuose, kurie taip pat rodo endogeninio p53 užimtumą GAP-43 promotoriaus elementuose (1d pav.). Kaip teigiama p53 užimtumo kontrolė čia buvo naudojamas standartinis p53 taikinys, pavaizduotas p21 promotoriaus elementais (1b – d pav.). Be to, GAP-43 DNR 3 ′ galo regionai buvo naudojami kaip vidinė P53 jungties su GAP-43 specifiškumo kontrolė (1b – d pav.).

Norėdami patikrinti p53 sąveikos su GAP-43 promotoriaus elementais funkcionalumą, šį GAP-43 promotoriaus p53 rišančios vietos sritį klonavome į luciferazės ekspresijos vektorių. Laukinio tipo p53 transfekcija į PC-12 ir žiurkės žievės neuronus parodė, kad p53 per didelis ekspresija labai padidina GAP-43 promotoriaus sukeltą luciferazės aktyvumą (1e ir f paveikslai). PC-12 ląstelėse NGF paskyrimas sustiprina šią indukciją, bet vėlgi to nereikia (1f pav.). P53 specifiškumas šiai sąveikai buvo nustatytas naudojant luciferazės reporterį, kuriame yra sukramtytas GAP-43 p53 šerdies elementas TFBS, o tai nesukelia luciferazės aktyvumo indukcijos po p53 perdėtos ekspresijos (1g paveikslas).

Visi šie duomenys rodo, kad endogeninis p53 jungiasi su in silico identifikuojamais GAP-43 specifiniais promotoriaus elementais ląstelių linijose, taip pat su pirminiais neuronais, kad skatintų GAP-43 ekspresiją.

p53 reikalingas GAP-43 ekspresijai neurito ir aksonų ataugų metu

Patvirtinimas, kad p53 užima ir teigiamai reguliuoja GAP-43 promotoriaus elementus neuronuose, sukėlė hipotezę, kad p53 turėtų reguliuoti GAP-43 ekspresijos lygius neurito ir aksonų ataugimo metu. Pirmiausia išbandėme šią hipotezę diferencijuotose PC-12 ir P19 ląstelėse, kurios išreiškia aukštą GAP-43 ir p53 lygį (žr. Internetinę papildomą informaciją). Apibendrinant, šie eksperimentai patvirtina išvadą, kad p53 reikalingas GAP-43 ekspresijai kartu su neurito aksonų augimu į neuronus primenančiose ląstelėse (papildomi 1–3 paveikslai).

Po to buvo atlikti eksperimentai su pelių smegenyse ir pirminiuose neuronuose, siekiant ištirti p53 GAP-43 ekspresijos reguliavimą in vivo ir neuronuose. Realiojo laiko RT-PCR metodu parodėme, kad GAP-43 mRNR raiška sumažėja 60% p53 nulio pelių smegenyse, palyginti su laukinio tipo (wt) pelėmis, taip parodydami, kad p53 yra reikalingas fiziologiniam GAP-43 lygiui. išraiška smegenyse (2a pav.). Be to, GAP-43, kuris ankstyvame amžiuje yra sužadinamas kultūriniuose pirminiuose žievės žievės neuronuose, kai vystosi aksonai ir jų atauga, yra slopinamas neuronuose, užkrėstuose p53DN lentivirusu (2b paveikslas). Atlikdami GAP-43 imunocitochemiją, mes pastebėjome, kad p53DN raiška taip pat slopina aksonų vystymąsi ir jų augimą, palyginti su neuronais, užkrėstais tik GFP (2c paveikslas). Be to, pastebimai sumažėjęs aksonų ilgio sumažėjimas, koreliuojantis su sumažinta GAP-43 ekspresija, buvo pastebėtas išaugintose pelių žievės neuronuose iš p53 nulinių pelių (2d paveikslas).

Image

p53 reguliuoja GAP-43 ekspresiją ir neurito / aksonų augimą smegenyse ir žievės neuronuose. ( a ) Realaus laiko RT-PGR eksperimentai rodo reikšmingą GAP-43 mRNR ekspresijos sumažėjimą p53 negalvose smegenyse, palyginti su wt pelėmis. Žvaigždutė rodo reikšmingą skirtumą, išanalizuotą nesuporuotų dviejų krypčių t- testu, kurio P vertė <0, 01, trigubų eksperimentų. ( b ) Imunoblotai rodo GAP-43 slopinimą po infekcijos p53DN lentivirusu 4 dieną žiurkių žievės neuronuose. Anti-V5 antikūnai buvo naudojami nustatyti p53DN lygį užkrėstose ląstelėse. β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Brūkšninėje diagramoje parodyta densitometrinė duomenų analizė: tipinių GAP-43 juostų intensyvumas buvo normalizuotas iki β- aktino. ( c ) Imunofluorescencija rodo neurito ataugimo ir išsišakojimo slopinimą p53DN, išreikšto branduolyje, palyginti su eGFP, lentivirusiniu virusu infekuotų žiurkių žievės neuronuose. Neuritų matavimai rodo reikšmingą kelių parametrų skirtumą tarp eGFP ir p53DN užkrėstų neuronų (Žvaigždutės: neporuotas dvipusis t- testas, kurio P vertė yra <0, 01, eksperimentai trijose vietose). Masto juosta: 50 μm . ( d ) E16 pelės žievės neuronai (DIV3) iš p53 nulinių pelių rodo GAP-43 ekspresiją ir neurito pailgėjimą, palyginti su wt neuronais. Neuritų matavimai parodo reikšmingą neurito ilgio skirtumą (Žvaigždutės: nesuderintos dvipusės t vertės testas, kai P vertė <0, 01, eksperimentai trijose vietose). Masto juosta: 50 μm

Visas dydis

Šie rezultatai patvirtina išvadą, kad p53 reikalingas tinkamai GAP-43 ekspresijai pelės smegenyse kartu su aksonų augimu pirminiuose neuronuose.

GAP-43 pirmiausia reguliuojamas nuo CBP / p300 priklausomo p53 acetiliavimo komplekso

Nustatyta, kad ląstelių hiperacetiliacija daro neuroprotekcinį poveikį neuronams tiek in vitro, tiek in vivo . 29 p53 gali būti acetilinami esant kelioms lizino liekanoms jo C-galiniame domene, įskaitant Lysine 320 (K320), tarpininkaujant acetiltransferazei P / CAF, 30 ir Lysines 372-3 ir 382 (K373), tarpininkaujant CBP / p300. . 31, 32 Kiekvienas iš šių dviejų acetilinimo būdų nukreipia p53 į specifinius promotorius. Vis dėlto pirminiuose neuronuose p53 acetilinimo vaidmuo skatinant neurito aksonų augimą ir augimą skatinančias medžiagas nebuvo nagrinėjamas.

Čia mes ištyrėme, ar GAP-43 raišką reguliuoja specifiniai p53 acetiliacijos keliai. Pirmiausia išmatuojome acetilintų p53 baltymų kiekį. Imunoblotiškumas specifinėms p53-acetilinėms formoms rodo panašius neuronų baltymų ekspresijos lygius p53 acetil K373 ir p53 acetil K320 (3a pav.). Tada imunofluorescencijos būdu parodome p53 acetilo K373 ir P / CAF branduolinę ekspresiją ir p53 acetilo K320 bei CBP raišką tiek branduoliuose, tiek neuronų procesuose (papildomas 4 paveikslas).

Image

p53 acetilas K373 pirmiausia užima GAP-43 promotorių per CBP / p300. a ) Pilno ilgio p53 (FL393), p53 acetilo K320 ir acetil K373 imunoblotavimas DIV 3 auginamuose pirminiuose neuronuose. Neuronų p53 K373 ir K320 ekspresijos lygiai yra panašūs. β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. ( b ) ChIP tyrimai rodo p53 K373 ir p53 K320 chromatino aplinkoje in vivo sąveiką su p53 TFBS, gautu iš žiurkės GAP-43 promotoriaus, auginamuose žiurkių žievės neuronuose. Imunoprecipitacijai buvo naudojami specifiniai antikūnai, atpažįstantys p53 acetil K373 ir p53 acetil K320. Rezultatai rodo, kad p53 acetilas K373, palyginti su acetil p53 K320, yra prisijungęs prie GAP-43 promotoriaus. „WAF1 / p21“ promotoriaus sritis buvo naudojama kaip teigiama p53 surišimo kontrolė. PGR taip pat buvo atliktas naudojant pradmenis, kurie amplifikuoja 3-galo vietą GAP-43 gene kaip kontrolę, kad būtų galima įvertinti p53 promotoriaus užimtumo specifiškumą atliekant visus ChIP tyrimus ( b - g ). ( c ) ChIP tyrimai, atlikti kaip b punkte, buvo atlikti realiojo laiko kiekybiniai PGR. Brūkšninėje diagramoje parodytas kartotinis padidėjęs jungimosi afinitetas su GAP-43 promotoriaus elementais, esančiais p53 acetile K373, palyginti su p53 acetilu K320, kaip analizuota po ChIP. „The WAF1 / p21“ promotoriaus sritis buvo naudojama kaip teigiama p53 promotoriaus užimtumo kontrolė. Įeinantys mėginiai, surinkti prieš nusodinimą, ir antikūnų neturintys mėginiai buvo naudojami kaip normalizavimo kontrolė. Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, išanalizuotą nesusiejant dvipusio t- testo, kurio P vertė <0, 01, trigubai. ( d ) ChIP tyrimai buvo atlikti PC-12 ląstelėse, kurios nebuvo gydomos arba 30 valandų buvo gydomos NGF (100 ng / ml), kad sukeltų diferenciaciją. p53 acetilas K373 jungiasi su GAP-43 promotoriaus elementais, palyginti su p53 acetilu K320. „The WAF1 / p21“ promotoriaus sritis buvo naudojama kaip teigiama p53 promotoriaus užimtumo kontrolė. ( e ) ChIP tyrimai, atlikti kaip ( d ) punkte, buvo atlikti realiojo laiko kiekybiniai PGR. Brūkšninė diagrama rodo specifinio promotoriaus užimtumo padidėjimą kartų tarp p53 acetilo K373 ir p53 acetilo K320 neapdorotose PC-12 ląstelėse, kaip analizuota realiojo laiko kiekybine PGR po ChIP. Šie duomenys yra panašūs į tuos, kurie gauti pirminiuose neuronuose ( c ). Be to, rezultatai rodo, kad NGF palengvina p53 acetilo K373 ir acetilo K320, bet žymiai labiau K373, panaudojimą GAP-43 promotoriui. Įeinantys mėginiai, surinkti prieš nusodinimą, ir antikūnų neturintys mėginiai buvo naudojami kaip normalizavimo kontrolė. Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, išanalizuotą nesusiejant dvipusio t- testo, kurio P vertė <0, 01, trigubai. ( f ) ChIP tyrimai rodo GAP-43 promotoriaus užimtumą koaktyvatorių CBP / p300 pagalba. Tyrimas buvo atliktas, kaip aprašyta d punkte, ir buvo naudojami specifiniai CBP ir p300 antikūnai. ( g ) ChIP ir realaus laiko PGR tyrimai po CBP / p300 perdėtos ekspresijos arba CBP / p300 genų nutildymo atitinkamai rodo ryškų p53 acetil K373 prisijungimo prie GAP-43 promotoriaus elementų indukciją arba slopinimą. PC-12 ląstelės buvo transfekuotos viso ilgio CBP / p300 genais arba kontroline pcDNR, o RNR - CBP / p300 arba suplaktomis RNR (scRNR). Imuninis nusodinimas buvo naudojamas specifinis anti-p53 acetil K373 antikūnas, kaip aprašyta d punkte. Brūkšninė diagrama rodo p53 acetil K373 prisijungimo prie GAP-43 promotoriaus elementų padidėjimo ar sumažėjimo raukšlę, stebėtą atlikus kiekybinę ChIP analizę po CBP / p300 perraiškos arba CBP / p300 nutildymo, palyginti su kontroline pcDNR arba sušifruotomis RNR (scRNR). atitinkamai. Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, išanalizuotą nesusiejant dvipusio t- testo, kurio P vertė yra mažesnė kaip 0, 01, trijų bandymų. ( h ) RT-PCR parodo CBP ir p300 ekspresijos lygius po perdėtos ekspresijos ir RNR eksperimento, atlikto ( g )

Visas dydis

Norėdami ištirti šių dviejų p53 acetilinimo formų afinitetą GAP-43 promotoriaus elementams, mes atlikome ChIP tyrimus tiek pirminiuose neuronuose, tiek PC-12 ląstelėse. Šie eksperimentai rodo acetilinto p53 užimtumą K373 ir K320 (3b – e pav.). Tačiau jie rodo daug didesnį acetilinto p53 promotoriaus užimtumą K373 temperatūroje nei p53, acetiliuotą esant K320 (3c ir e paveikslai). Šiuos efektus sustiprino NGF signalizacija PC-12 ląstelėse (4e pav.). ChIP eksperimentai taip pat buvo atlikti imunodepresuojant GAP-43 promotoriaus elementus su antikūnais prieš CBP / p300 acetiltransferazes. CBP ir p300 buvo užfiksuoti promotoriais, parodydami, kad CBP / p300 sudaro GAP-43 promotoriaus transkripcijos kompleksą (3f pav.). Šie duomenys rodo, kad specifinis nuo CBP / p300 priklausomas p53 acetiliacijos modelis (p53 K372-3-82) pirmiausia užima GAP-43 promotoriaus elementus.

Image

p53 K373Q specifiškai indukuoja GAP-43 transkripcijos elementus ir ekspresiją bei skatina didžiausią neurito ataugų padidėjimą žievės neuronuose. ( a ) PC-12 ląstelėse buvo atliktas dvigubos luciferazės tyrimas po to, kai buvo ekspresuoti skirtingi p53 mutantai, imituojantys acetiliaciją (p53 K373Q, K320Q) arba kurie negali būti acetilinami (p53 K373R) esant specifinėms lizino liekanoms. Juostinės schemos rodo, kad tik p53 K373Q varo GAP-43 promotoriaus elementus. Nei p53 K320Q, nei p53 K373R nesuaktyvina GAP-43 promotoriaus. Kiekvieno konstrukto santykinio luciferazės aktyvumo raukšlės indukcija buvo normalizuota naudojant pcDNA3 kontrolinį vektorių. Žvaigždutės rodo reikšmingą pcDNA3 vektoriaus ir p53 mutantų skirtumą, išanalizuotą nesuporuotu dvipusiu t- testu, kurio P vertė <0, 01, trigubų mėginių. P53 Western blotai rodo ekspresijos lygius po transfekcijos (taip pat b ir c ). β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. ( b ir c ) Imunoblotai parodo GAP-43 baltymo ekspresijos indukciją po p53 K373Q perdėtos ekspresijos PC-12 p53DN ir P19 ląstelėse, bet ne su p53 K320Q padidinta ekspresija. β- aktinas buvo naudojamas kaip įkrovos kontrolė. Brėžinių diagramose parodyta densitometrinė duomenų analizė: tipinių GAP-43 juostų intensyvumas buvo normalizuotas iki β- aktino. ( d ) Kultūriniai žiurkių žievės neuronai buvo transfekuoti 3 dieną 72 valandas eGFP, p53 K373Q-GFP, p53 K320Q-GFP arba p53 K373R-GFP mutantų plazmidžių DNR. Reprezentatyvūs transfekuotų neuronų vaizdai rodo, kad p53 K373Q, taip pat p53 K320Q per didelis ekspresija padidina neurito augimą, lyginant su eGFP transfekuotomis ląstelėmis. Tačiau p53 K373Q diskai žymiai pagerino neuritų vystymąsi nei p53 K320Q. Transfekcija su p53 K373R nepadidina neurito augimo, palyginti su eGFP perneštais neuronais. Brūkšninėje diagramoje parodyti kiekybiniai neuritų užaugimo matavimai po transfekacijų, išreikšti procentais, kad būtų kontroliuojamos eGFP transfekuotos ląstelės. Didžiausias padidėjimas stebimas po p53 K373Q transfekcijos. Neuritų matavimai rodo reikšmingą skirtumą tarp eGFP ir p53 K373Q arba K320Q transfekuotų neuronų. Reikšmingas skirtumas yra ir tarp p53 K373Q ir K320Q. Žvaigždutės: nesuporuotas dvipusis t- testas, kurio P vertė <0, 01, trigubas eksperimentas. Masto juosta: 200 μm

Visas dydis

Todėl mes siekėme ištirti CBP / p300 acetiltransferazių vaidmenį moduliuojant p53 surišimą su GAP-43 promotoriaus elementais.

ChIP tyrimai buvo atlikti nutildžius CBP / p300, naudojant specifinius RNR trukdžių oligonukleotidus ir imunoprecipipaciją p53 naudojant specifinį antikūną prieš p53 acetil K373. Rezultatai rodo, kad CBP / p300 nutildymas žymiai sumažina p53 K373 galimybę užimti GAP-43 promotoriaus elementus (3g paveikslas). Atlikus analogišką ChIP eksperimentą, per didelis viso ilgio CBP / p300 ekspresija padidina p53 acetilo K373 afinitetą tiems patiems promotoriaus elementams (3g paveikslas). CBP / p300 per didelis ekspresas arba nutildymas atitinkamai padidino arba sumažino mRNR lygį (3h pav.).

Todėl čia mes parodėme, kad CBP / p300 signalizacija padidina p53 galimybę užimti GAP-43 promotorių.

Norėdami išspręsti klausimą, ar specifinis p53 acetilinimas K373 taip pat yra atsakingas ir reikalingas šių GAP-43 promotoriaus elementų ekspresijai skatinti, mes atlikome dvigubus luciferazės tyrimus PC-12 ląstelėse. Šiame eksperimente mes per daug ekspresijavome p53 acetilinimo imituojančius mutantus, kurie buvo gauti pakeičiant teigiamai įkrautą liziną neutraliu arba neįkrautu glutaminu K372-3-82 (K373Q) arba K320 (K320Q). Rezultatai rodo, kad tik p53 K373Q sukelia reikšmingą GAP-43 promotoriaus elementų luciferazės aktyvumo padidėjimą (4a pav.). Mes taip pat ištyrėme kitą p53 mutantą, kurio negalima acetilinti Lizine 372-3-82 (K373R) dėl lizino pakeitimo argininu. Šis mutantas nesukelia luciferazės aktyvumo, palaikančio specifinį p53 K373Q aktyvumą GAP-43 promotoriaus elementuose (4a pav.).

Aukšto raiškos eksperimentai, transfekuojant p53 K373Q ir K320Q į PC-12 p53DN ir P19 neuronus primenančias ląsteles, rodo, kad tik 373 forma skatina GAP-43 baltymų ekspresiją (4b ir c pav.). Svarbu tai, kad p53 K373Q per didelis ekspresija įveikia GAP-43 slopinimą PC-12 ląstelėse, stabiliai transfekuotose p53DN (5b paveikslas). Palyginimui, mutanto, negalinčio acetiliuoti, p53 K373R, transfekcija nepadidina GAP-43 ekspresijos (duomenys nepateikti).

Image

p53 acetilas K373 indukuojamas veido motoriniuose neuronuose atlikus aksonų perskirstymą. ( a ir b ) Imunofluorescencija parodo p53 acetilo K373 ( a ) ir CBP ( b ) ekspresiją FMN (NeuN teigiamose ląstelėse) 48 valandas po veido nervo aksotomijos pelėms. Padidėjęs ekspresijos lygis yra transektinėje (trans) pusėje, palyginti su priešingos pusės kontroline (ctr) puse. Rodyklės rodo išraišką konkrečiuose FMN. Masto juosta: 40 μm . c ) Pikselių intensyvumo įvertinimas rodo reikšmingą p53 acetil K373 ir CBP ekspresijos padidėjimą transektose, palyginti su kontroline puse (vidutinis veido veido branduolio kelių skyrių intensyvumas vienai pelei trijose skirtingose ​​pelėse). Žvaigždutės: nesuderintas dvipusis t- testas, kurio P vertė <0, 01. ( d ) P53 acetilo K373 ir CBP ( d ) bei GAP-43 ( e ) imunologiniam tyrimui 48 valandas po veido aksomijos buvo panaudoti išpjaustytų MNR branduoliniai arba ( e ) citoplazminiai ekstraktai. Kraunant kontrolę buvo naudojami β III tubulinas ir β- aktinas. Rezultatai rodo p53 acetil K373 ir CBP ekspresijos padidėjimą po transekcijos (trans). Parodyti kiekybiniai juostų grafikai (savavališki vienetai)

Visas dydis

Visi šie duomenys rodo, kad GAP-43 transkripcijos ir ekspresijos moduliavimas labai priklauso nuo specifinio p53 acetilinimo Lizine 372, 3–82 per CBP / p300 signalizaciją.

Acetilintas p53 skatina pirminių neuronų neuronų augimą

Norėdami patikrinti, ar p53 acetilinimas Lizine 372-3-82 daro įtaką neuronų augimui pirminiuose žievės žieduose, mes transfekavome žiurkės pirminius žievės neuronus vienu iš mutantinių p53 plazmidės DNR K373Q-GFP arba K320Q-GFP 72 val. palyginimas su kontroliniu eGFP vektoriu. Kaip ir tikėtasi, p53 K320Q mutantas sugebėjo padidinti bendrą proceso ilgį (39, 9% ± 9, 24 SD) ir ilgiausio proceso ilgį (30, 1% ± 9, 24) (4d paveikslas) iki panašaus lygio, kaip parodyta anksčiau. 26 Tačiau čia parodome, kad p53 K373Q mutantas skatina didžiausią proceso išaugimą, palyginti su eGFP, padidindamas 64, 4% ± 11, 3 bendro proceso ilgio ir 50, 6% ± 5, 9 ilgiausio proceso metu (4d paveikslas) ). Be to, p53 K373Q sukelia žymiai didesnį užaugimą, palyginti su p53 K320Q (4d pav.). Ilgiausias procesas beveik visada atitiko aksonus, kuriuos nustatė GAP-43 ir tau imuninis dažymas (neparodyta). Svarbu tai, kad nepastebėdami neuronų ląstelių žūties padidėjimo po transfekacijų su p53 acetilinimo imitacijomis, naudodamiesi MTT tyrimu, kuris parodo ląstelių gyvybingumą nepadalijamosiose ląstelėse, tokiose kaip neuronai, ir po ląstelių suskaičiavimo ir branduolinės morfologijos analizės (5 papildomas paveikslas).

Šie duomenys pateikia įrodymų, kad C-galo p53 acetilinimas skatina neurito ir aksonų išstūmimą, tačiau tai pirmiausia daroma atliekant acetilinimą p53 372-3-82 padėtyje, kuris taip pat yra atsakingas už GAP-43 ekspresijos aktyvavimą.

p53 acetil K373 signalizavimas rodo padidintą GAP-43 promotoriaus elementų ekspresiją ir užimtumą tik tranzituotuose veido motoriniuose neuronuose po nervo pjovimo

Veido nervo transekcija, aksonų atsinaujinimo ir tikslo atsinaujinimo modelis 34 leidžia ištirti su GAP-43 susijusią molekulinę reakciją į aksonų sužalojimą. Tiesą sakant, veido motorinių neuronų (FMN) GAP-43 mRNR koncentracija piko metu būna nuo 48 iki 72 val. Po aksotomijos ir prisideda prie aksonų regeneracijos. 8, 35 Čia išmatuota p53, p53 acetil K320 ir acetil K373, taip pat CBP išraiška FMN po veido aksotomijos. Mes atlikome dvigubus imunofluorescencinius eksperimentus su kiekvienu iš aukščiau išvardytų baltymų ir su neuronų žymeniu NeuN, atlikdami kriosekcijas visuose veido branduolių baseinuose, ir išraiškos lygius kiekybiškai įvertinome matuojant pikselių intensyvumą konkrečiai NeuN teigiamų motorneuronų paveiksluose. Duomenų analizė rodo, kad p53, acetilinto esant K373 ir CBP, raiška žymiai padidėja 48 valandas po aksotomijos esančio FMN branduolyje (5a – c pav.). Be to, neuronai, išreiškiantys CBP ir p53 acetil K373, neparodo apoptozinių požymių (duomenys nepateikti). Po aksomijos nenustatyta nei indukcija, nei silpna branduolio lokalizacija visame p53 ir p53 acetil K320 FMN (papildomas 6 paveikslas). Imunoblotiškumas taip pat buvo atliktas atliekant 48 valandas po aksotomijos padarytus FMN branduolinius ir citoplazminius ekstraktus ir parodžius padidintą p53 acetilo K373, CBP ir GAP-43 ekspresiją aksotomizuotame FMN, palyginti su priešingos pusės kontroline puse (5d ir e paveikslai).

Tada mes atlikome ChIP tyrimus veido motoriniuose branduoliuose po nervo transekcijos (žr. Medžiagos ir metodai bei papildomas 7 paveikslas, skirtas vizualizuoti procedūrą), kurie parodė, kad p53 acetilas K373 žymiai padidino GAP-43 promotoriaus užimtumą aksotomizuotame FMN ( 6 pav.).

Image

Veido aksotomija skatina GAP-43 promotoriaus užimtumą p53 acetil K373. ChIP realiojo laiko PGR parodo in vivo GAP-43 promotoriaus užimtumą p53 acetilo K373 būdu iš transektos, palyginti su priešingos pusės FMN. Trumpai tariant, susieti FMN in vivo buvo išpjaustyti praėjus 24 ir 48 valandoms po veido aksotomijos. Kontrolinės priešingos ir transegmentinės MNM buvo atskirai surinktos ir apdorotos ChIP tyrimui, o po to sekė realaus laiko PGR, norint nustatyti promotoriaus užimtumą. Viename eksperimente buvo naudojamos trys pelės. Kairėje ChIP rezultatai parodo in vivo GAP-43 promotoriaus užimtumą p53 acetil K373 iš transektos, palyginti su priešingos pusės FMN. Įėjimo mėginiai, surinkti prieš kritulį, ir be antikūnų mėginiai buvo naudojami kaip normalizavimo kontrolė. Čia GAP-43 geno 3′ kraštai buvo naudojami kaip p53 užimtumo specifiškumo GAP-43 promotoriui kontrolė. Dešinėje brūkšninėje diagramoje parodytas konkretaus promotoriaus užimtumo padidėjimas (2, 4 karto per 24 val. Ir 2, 8 karto per 48 val.), Naudojant p53 acetilą K373 tarp aksonomizuoto ir kontrolinio priešinginio FMN, analizuojamą realiojo laiko kiekybine PGR atlikus ChIP. Įeinantys mėginiai, surinkti prieš nusodinimą, ir antikūnų neturintys mėginiai buvo naudojami kaip normalizavimo kontrolė. Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, išanalizuotą nesusiejant dvipusio t- testo, kai P vertė <0, 01, trigubas eksperimentas

Visas dydis

Visi šie duomenys leidžia teigti, kad pro regenerijos faktoriaus GAP-43 tiesioginis transkripcinis reguliavimas atliekamas nuo CBP / p300 priklausomo acetilinto p53 K373 in vivo nervų regeneracijos modelyje.

Atliekant aksonų regeneraciją in vivo, reikalingas p53 / GAP-43 transkripcijos modulis

Norėdami įvertinti, ar GAP-43 ekspresija priklauso nuo p53 aksonų regeneracijos metu in vivo , palyginome GAP-43 ekspresijos lygius ir nervo atsinaujinimo laipsnį p53 nulyje, palyginti su wt pelėmis po veido nervo aksotomijos. Regeneracijos mastas buvo įvertintas suskaičiavus retrogradinio nervo žymiklio „FluoroGold“ pažymėtą FMN praėjus 28 dienoms po sužalojimo, kuris atitinka regeneruojančius pluoštus. Pelėms, auginančioms masę, neuronų regeneracijos procentas buvo 29, 7% ± 2, 6 (SEM), reikšmingas, palyginti su 10, 9% ± 2, 9 (SEM) p53 nulinėse pelėse (7a paveikslas). Nissl dažytas FNN, suskaičiuotas per 28 dienas po aksotomijos, atrado mažiau išgyvenusių motorinių neuronų tranzituotoje pusėje, palyginti su kontroline puse, esant 64, 8% ± 7 (SEM), palyginti su kontroline puse, palyginti su p53 tuščiomis pelėmis, esant 76, 2% ± 8 (SEM) (7a paveikslas). ). Kaip dar buvo pranešta anksčiau, tai patvirtina p53 vaidmenį pašalinant labai pažeistas ląsteles ir išgyvenančių neuronų aksonų regeneraciją. 26

Image

p53 reikalingas GAP-43 ekspresijai aksonų daigais aksono regeneracijos metu. ( a ) Kaip regeneracijos žymeklis, FluoroGold atgaline data teigiamas FMN rodomas praėjus 28 dienoms po veido nervo perstatymo. Parodytas reikšmingas „FluoroGold“ teigiamų neuronų skaičiaus sumažėjimas p53 - / -, palyginti su p53 svoriu po nervo perstatymo (trans). Pirmasis brūkšninis diagrama parodo regeneruojančių veido motoroneuronų kiekį praėjus 28 dienoms po veido aksotomijos. Parodytas bendras paženklintų neuronų santykis operuotoje / neoperuotoje pusėje po viso veido branduolio pjovimo (penkios pelės kiekvienoje grupėje, Žvaigždutės: nesuderintos dvipusės t vertės, kai P reikšmė <0, 01). Antra brūkšninė diagrama parodo išgyvenamų neuronų kiekį per 28 dienas po veido perėjimo su p53 - / - pelėmis. Rodomas bendras išgyvenusių veido motorneuronų santykis operuotoje / neveikiančioje pusėje (penkios pelės kiekvienoje grupėje). Masto juosta: 100 μm . ( b ) Realaus laiko RT-PGR eksperimentai rodo reikšmingą GAP-43 mRNR ekspresijos padidėjimą wt, bet ne p53 - / - pelių FMN, nepaisant p53 - / - pelių aksonomis, palyginti su priešingomis pusėmis, praėjus 28 dienoms po aksotomijos. Žvaigždutės rodo reikšmingą skirtumą, išanalizuotą nesusiejant dvipusio t- testo, kai P vertė <0, 05, trigubas eksperimentas. c ) Imunofluorescencija parodo GAP-43 ekspresiją aksonų daigais 28 dienas po aksotomijos wt ir p53 - / - pelėms. Būdinga GAP-43 imunokalizacija FMN citoplazmoje (strėlės) ir aksonų daiguose (strėlių galvutės). Kiekybinis GAP-43 pikselių intensyvumas rodo reikšmingą wt padidėjimą, palyginti su p53 - / - pelėmis (Žvaigždutės: neporuotas dvipusis t- testas, kurio P vertė <0, 01). Masto juosta: 50 μm . ( d ) Scheminė schema apibendrina mūsų naujus atradimus. Transkripcinis kompleksas, susidaręs p53 acetilinant K372, 3-82 ir acetiltransferazių CBP / p300, yra įdarbinamas į GAP-43 promotorių vystymosi metu ir po traumos. Jis skatina GAP-43 ekspresiją, tokiu būdu sukeldamas aksonų augimą.

Visas dydis

GAP-43 mRNR raiškos analizė naudojant qRT-PGR rodo reikšmingą FMN padidėjimą (48%), palyginti su priešine puse, praėjus 28 dienoms po aksonotomijos, kai vyksta regeneracija, tik wt, bet ne p53. pelės be nulio (7b paveikslas). Įspūdinga, kad smegenų kamieno imunofluorescenciniai eksperimentai, praėjus 28 dienoms po aksotomijos, taip pat rodo GAP-43 ekspresijos indukciją FMN post-aksotomijoje, kuris yra žymiai sutrikęs pelių, esančių p53 be nulio (7c pav.). GAP-43 ekspresijos lygiai nesusijusiose pusėse, neturinčiose wt ir p53 nulinių pelių. Atvirkščiai, GAP-43 raiška indukuojama tiek ląstelių kūneliuose, tiek sudygusiuose aksonuose po aksotomijos regeneruojant vyt., Bet ne p53 nulinėms pelėms (7c paveikslas).

Apibendrinant, mes parodome, kad GAP-43 reikalingas tiesioginis nuo p53 priklausomas transkripcijos reguliavimas ir baltymų ekspresija ir jie yra tik FMN aksonų regeneracijos metu.

Diskusija

Šiame darbe identifikuojamas naujas aksonų augimo ir regeneracijos transkripcijos modulis, kurį suformuoja CBP / p300 ir acetilinis p53 ant GAP-43 promotoriaus (schema apibendrina mūsų išvadas, 7d pav.).

Mūsų nauji radiniai rodo, kad p53 skatina neuronų GAP-43 ekspresiją ir jungiasi su specifiniais promotoriaus elementais neuronuose chromatino aplinkoje. Čia aprašyta p53 jungimosi vieta yra per pirmuosius 1000 bp (619–639) priešais baltymus koduojančią seką - promotoriaus sritį, kuri laikoma svarbia GAP-43 neuronų genų ekspresijai. 36 Ši GAP-43-p53 surišanti vieta yra nauja, o jos branduolį rišantis elementas aCATGt ir du besiribojantys nukleotidai (mažais atvejais) turi klasikinę p53 sutarimo jungties vietą 37, kuri yra konservuota pelėms, žiurkėms ir žmonėms.

P53 aktyvumo įvairovę ir specifiškumą reguliuoja posttransliacinės modifikacijos, kurios gali nukreipti p53 transkripcijos aktyvumą specifinių promotorių link, taip suaktyvindamos skirtingas transkripcijos kaskadas. 38 Svarbu pažymėti, kad proapoptozinis neuronas p53 dažnai fosforilinamas per kaskadas, kuriose dalyvauja MAPKs, JNKs ir p38. 39, 40, 41

Neseniai, priešingai, mes įrodėme, kad mutantas p53, kuris imituoja acetiliaciją K320, dalyvauja skatinant neuritų augimą ir reguliuojant išaugančių faktorių Coronin 1b ir Rab13 raišką. Šie duomenys kartu su vis gausėjančiais įrodymais, kad praturtinta acetilinta aplinka apsaugo neuronus nuo ląstelių žūties in vitro ir in vivo, 29 paskatino mus ištirti dar neatrastą endogeninio p53 acetilinimo pirminiuose neuronuose įtaką aktyvinant proaksoną. augimo genas GAP-43.

Histono acetiltransferazės (HAT) acetiliuoja daugelį baltymų, svarbių transkripcijai pradėti, pavyzdžiui, nukleosominius histonus ir transkripcijos faktorius (TF). HAT modifikuoja pagrindinių histonų uodegas, atlikdami specifinių lizino liekanų post-transliacinį acetilinimą, sukeldami chromatino modifikaciją ir pagerindami DNR prieinamumą TF. 42 P53 acetilinimas CBP / p300 ir P / CAF padidina jo baltymų stabilumą ir transakcijos galimybes, palengvindamas sąveiką su specifiniais promotoriais ir kitais transkripcijos mechanizmo baltymais. 33, 43

Čia parodyta, kad GAP-43 promotoriaus elementus daugiausia užima acetilinis p53 žievės neuronuose ir in vivo veido motoriniuose neuronuose po aksonomijos per CBP / p300 signalizaciją, kuri yra atsakinga už maksimalų GAP-43 transkripcijos aktyvavimą.

Abu mutantai p53, imituojantys acetilinimą endogeniniais CBP / p300 ir P / CAF atitinkamai K372-3, 82 ir K320, skatina neuritų augimą pirminiuose žievės neuronuose ir nesukelia ląstelių žūties. Tačiau nuo CBP / p300 priklausomas p53 acetiliacijos modelis sukelia didžiausią pirminio neuronų neurito užaugimo padidėjimą.

Specifinis CBP / p300 acetilinto p53 vaidmuo aksonų augime taip pat buvo nustatytas atlikus aksotomiją. In fact, we show that expression of p53 K373 and CBP is induced in FMN in the brain stem following facial nerve axotomy, a model of axon regeneration. In transected FMN, p53 K373 preferentially occupies the GAP-43 promoter as shown by in vivo ChIP, at a time that coincides with the well-known upregulation of GAP-43 transcript and protein, 8, 35 whose expression we demonstrate to be dependent upon p53 following axotomy.

Importantly, our data demonstrate that C-terminal acetylated p53 induces pro-axon growth promoters and does not trigger cell death in primary neurons. In contrast, acetylation of p53 in cancer cell lines and models promotes cell cycle arrest and DNA repair as well as apoptosis. 33, 44 This supports the concept that similar p53 post-translational patterns serve distinct functions in diverse cell types and signaling pathways, and shows for the first time that in neurons acetylation may be not only neuroprotective, but also pro-axon growth.

Post-translational modifications not only affect DNA–protein interactions but also influence protein–protein interaction events within transcriptional complexes. Therefore, the pro-axon growth properties of CBP–p53 signaling might cooperate with the CREB-dependent transcription pathway. In fact, CREB was recently shown to protect neurons from cell death and to promote neurite outgrowth by inducing arginase I expression. 45

Therefore, future challenges include the identification of additional transcriptional machinery that participates at pro-axonal growth and regeneration promoters. In addition, it will be paramount to establish the effectiveness of different transcription factors on pro-growth promoters, as well as identifying a set of target genes that drive cytoskeleton remodeling and axon growth.

In conclusion, our work defines a novel role for CBP/p300-p53-GAP-43 transcriptional module in axon growth and regeneration that, ultimately, may offer a novel molecular target to foster axon re-growth in neurodegenerative conditions.

Medžiagos ir metodai

Ląstelių kultūros

See online Supplementary Materials.

In silico transcription factor-binding sites analysis

The entire promoter sequence of the selected gene GAP-43 was analyzed using MatInspector, a software tool provided by Genomatix Software that identifies TFBS in nucleotide sequences using a large library of weight matrices.

Chromatino imunoprecipitacijos tyrimai

ChIP assays were performed according to the manufacturer's recommendations (Upstate). Experiments were done in RCN and PC-12 cells (at least 4 × 10 6 cells were used for each assay) and in facial motor neurons (FMN). PC-12 cells were grown in the absence or presence of NGF (100 ng/ml). Cultured cells were fixed in a 1% formaldehyde-PBS solution. Following cell lysis (0.5% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA), extracts were sonicated to shear DNA to lengths of 200–400 bp. Also, in a set of experiments, transfection of full length p300 and CBP plasmid DNA expressed from pcDNA vector or siRNA for p300 and CBP were performed before fixing the cells. Chromatin solutions were incubated overnight with rotation using 5 μ g of rabbit polyclonal anti-p53 antibody (FL-393, Santa Cruz, USA), rabbit polyclonal anti-p53 acetyl Lys320 (06–915, Upstate) or rabbit polyclonal anti p53 acetyl Lys373 (06–916, Upstate). The following day protein A agarose beads, that had been blocked with salmon sperm DNA, were added to each reaction to precipitate antibody complexes. The precipitated complexes were washed and then incubated for 4 h at 65 °C in parallel with input samples to reverse the crosslink. DNA was isolated by P:C:I extraction, which was followed by ethanol precipitation in the presence of sodium acetate.

Input, IP and no-Ab fractions were then analyzed by PCR and quantitative PCR (ABI 7000) analysis with appropriate primer pairs to amplify p53 responsive elements. The primers used were as follows: rat WAF1/p21 5′ site Forward 5′-TTGAGGGAAAGATCTCCAGAAAA-3′ rat WAF1/p21 5′ site Reverse 5′-CCAGATGGAGACCAGCTTA-3′; rat WAF1/p21 3′ site Forward 5′-GCCTTTGCAGAGAACATTCCT-3′ rat WAF1/p21 3′-site Reverse 5′-AGCCTAGGGCGTGGACTA-3′; rat GAP-43 5′ site Forward 5′-GCAGCTGTAACTTGTGTGCA-3′ rat GAP-43 5′ site Reverse 3′-GGTCCAGATTGGAGGTGTTTA-5′; rat GAP-43 3′ site Forward 5′-TTCCTTAGGCAATGTTTTGGAAAG-3′ rat GAP-43 3′ site Reverse 5′-TCAGGCATGTTCTTGGTCAG-3′; mouse GAP-43 3′ site Forward 5′-ACAATAGCTTGCTGGGGATG-3′ mouse GAP-43 3′ site Reverse 5′-CCATAGCAGAAAGCCTCCAG-3′.

For real-time quantitation of PCR products and fold change measurements after ChIP, we have first calculated the presence of enrichment in our p53 IP assays on GAP-promoter and the control 3′end regions as compared with input DNA by real-time PCR. All samples using primers on GAP-43 promoter regions presented enrichment as expected, whereas no signal was detected in the 3′end sequences. Then, each experimental sample was normalized to input and no-Ab fractions and presented as fold change between individual experimental conditions throughout our results.

Facial nerve transection-ChIP real-time PCR

Facial nerve transection was performed as described above in male B6. On day one and two following facial nerve transection, three mice per time point were deeply anesthetized and perfused with 0.9% saline solution followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer. The brain stem was then removed and placed in 4% paraformaldehyde at 4 °C for 10 h. Here, 50- μ m thick cross serial sections were cut using the vibratome and Nissl stain was performed to identify slices containing FMN. Subsequently, FMN were finely dissected from the axotomized and the contralateral side from serial sections of the brain stem spanning the whole facial nuclei. Dissected FMN from the contralateral and axotomized sides were collected in different vials and homogenized with an Ultra Turrax Disperser (IKA-Werke, Staufen, Germany) in lysis buffer (0.5% SDS/100 mM NaCl/50 mM Tris–HCl, pH 8/5 mM EDTA) containing protease inhibitors. Extracts were sonicated to shear DNA. Chromatin solutions were precipitated as described earlier in the chromatin immunoprecipitation assays section. An antibody against p53 acetyl K373 was employed. ChIP was followed by PCRs, which were performed as described above. ChIP reactions from contralateral and axotomized FMN were compared to evaluate the degree of GAP-43 promoter occupancy by using real-time PCR. Each experimental sample was normalized to input and no-Ab fractions. Fold change measurements after ChIP included three independent PCRs and three individual samples and were performed according to real-time PCR standard procedures.

Liuciferazės tyrimai

For luciferases assays, the region of the GAP-43 promoter containing the putative p53-binding site identified by in silico analysis and the scrambled DNA control site, were generated. For further details, see online Supplementary Information.

Realaus laiko RT-PGR analizė

RNA was extracted from wt, p53DN, p53-silenced, CBP/p300-silenced and CBP/p300-overexpressing PC-12 cells and from both wt and p53−/− mouse brain using TRIZOL reagent (Invitrogen) and cDNA was synthesized from 1 μg of RNA using random hexamers from the SuperScript II Reverse Transcriptase kit (Invitrogen). See online Supplementary Information.

Clones and transfection/infection experiments

See online Supplementary Information.

RNR trukdžiai

See online Supplementary Information.

Antibodies, immunoblotting and immunocytochemistry

See online Supplementary Information.

Neurite outgrowth assay

See online Supplementary Information.

p53 null mice and facial nerve transection

Homozygous p53−/− FVB.129S2 (B6)-Trp53 tmltyj (Jackson Laboratories), and FVB.129S2 (B6) control mice were used for our experiments. The genotype of p53 null mice was confirmed by Southern blot analysis. Our experiments were performed starting at 6 weeks of age in male homozygous p53 null and wt mice ( N =5). Facial nerve transection was performed as described earlier. 26 Briefly, mice were anesthetized by an intramuscular injection of a combination of xylazine (13 mg/kg) and ketamine HCl (85 mg/kg). A skin incision was made behind the left ear and the facial nerve exposed, and transected about 2 mm posterior to the foramen stylomastoideum. The same incisions without transection were also made on the contralateral side for sham-operated intra-animal controls. The wounds were sutured, and the animals were allowed to recover in a darkened room on isothermal pads warmed at 37 °C for approximately 30 min.

Regeneration in facial nuclei in the brain stem following facial nerve transection was evaluated at day 28 by retrograde axonal tracing with FluoroGold. Three days before being killed, mice from each group were anesthetized and 1.5 μ l of 3% FluoroGold was injected through a micropipette with a tip diameter of 25 μ m into the whisker pads bilaterally. After 3 days, the mice were deeply anesthetized and perfused with 0.9% saline solution followed by 4% paraformaldehyde in 0.1 M phosphate buffer. The brain stem was removed and placed in 30% sucrose for 24 h. The entire facial nuclei were sectioned and reconstructed and all sections of both facial nuclei per each animal were evaluated (235 for the control and 225 for the transected side). Transverse serial frozen sections, 20- μ m thick, were cut and mounted on slides and photographed under a fluorescence microscope. Only labeled neurons with visible nuclei were counted and taken to represent the number of regenerated motor neurons. For analysis, retrograde-labelled regenerating motor neurons were divided by total cells stained with cresyl violet, and this number was normalized to the uninjured (contralateral) side in each animal for intra-animal control. Thus, the overall ratio of FluoroGold-positive neurons was compared between p53 null and wt animals. The Abercrombie formula for cell counting was included in our analysis to correct for tissue volume.

Immunofluorescence (IF) for p53, p53 acetyl K320, p53 acetyl K373 and CBP was performed in 35 μ m thick brain stem sections spanning the whole facial nucleus 48 h following axotomy in three wt mice. Evaluation of the intensity of the fluorescence was performed in multiple sections per mouse to measure the expression levels in FMN for each protein in the axotomized transected side versus the control contralateral side. Intensity of IF in FMN was calculated by using the AlphaEaseFC software and intensity values for each protein were normalized to the intensity of NeuN expression in FMN and compared between the control and transected side.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomi skaičiai

  2. 2.

    3 papildomas paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Žodynas

C / EBP

CCAAT-enhancer-binding proteins

CBP

CREB-binding protein

CREB

cAMP reaguojantis elementus surišantis baltymas

JNKs

c-Jun N-terminal kinases

ŽEMĖLAPIS

mitogen-activated protein kinases

NFAT

nuclear factor of activated T-cells

P/CAF

p300/CBP-associated factor

STAT3

signalo keitiklis ir transkripcijos aktyvatorius 3

Papildoma informacija pridedama prie dokumento apie ląstelių mirtį ir diferenciaciją svetainėje (//www.nature.com/cdd)