Parkinas kaip vėžį slopinantis genas kepenų ląstelių karcinomai onkogenas

Parkinas kaip vėžį slopinantis genas kepenų ląstelių karcinomai onkogenas

Anonim

Anotacija

Parkinas pirmiausia buvo identifikuotas kaip genas, susijęs su autosominiu recesyviniu nepilnamečių parkinsonizmu. Tačiau parkin geno reguliavimo panaikinimas buvo pastebėtas sergant įvairiais žmogaus vėžiais, o tai rodo, kad parkin genas gali būti svarbus navikogenezėje. Norėdami sužinoti apie parkinio fiziologinį vaidmenį, sukūrėme parkin - / - peles, neturinčias 3 parkin geno egzono. Čia mes parodėme, kad parkininės pelės padidino kepenų ląstelių proliferaciją ir išsivystė makroskopiniai kepenų navikai, turintys kepenų ląstelių karcinomos požymius. Mikrorajonų analizė atskleidė, kad parkinso trūkumas keitė genų ekspresijos profilius kepenyse. Tarp jų endogeninis follistatinas paprastai yra reguliuojamas tiek auglių, tiek ne auglių, tiek navikų pelių, kuriems trūksta parkinio, srityje. Dėl Parkino deficito buvo slopinama kaspazės aktyvacija ir paversti hepatocitus atspariais apoptozei priklausomai nuo follistatino. Šie rezultatai leido manyti, kad parkinso deficitas padidino kepenų ląstelių proliferaciją ir atsparumą apoptozei, dėl to kepenų navikai išsivystė iš dalies per endogeninio follistatino reguliavimą . Išvada, kad pelėms, kurioms trūksta parkinio, yra jautrios hepatokarcinogenezei, pateikė pirmuosius įrodymus, kad parkinas iš tikrųjų yra naviko slopinimo genas.

Įvadas

Parkinas pirmiausia buvo identifikuotas kaip genas, susijęs su autosominiu recesyviniu nepilnamečių parkinsonizmu (ARJP) - dažniausia šeiminės Parkinsono ligos forma (Farrer, 2006). Parkin geno mutacijos buvo rasta tarp ARJP šeimų visame pasaulyje (Kitada et al., 1998). Parkin baltymui būdingas į ubikvitiną panašus domenas N gale ir du RING piršto motyvai bei tarp RING piršto (IBR) motyvas C gale (Kahle ir Haass, 2004). Vis daugiau tyrimų, įskaitant mūsų, rodo, kad parkinas yra E3 ubikvitino ligazė, nukreipta į įvairius baltymų kandidatus, sukeliančius proteosominį skilimą (Jackson ir kt., 2000; Shimura ir kt., 2000; Takahashi ir kt.). ., 2003). Galimi parkinio substratai: o- glikozilintas α-sinfilinas; α-sinukleiną sąveikaujantis baltymas, sinfilinas-1 ir Pael-R (Dawson ir Dawson, 2003). Šie substratai rodo lemiamą parkinio vaidmenį keliuose ląsteliniuose procesuose. Tačiau parkinio, ypač organų, išskyrus smegenis, fiziologinis vaidmuo nebuvo išaiškintas.

Žmogaus vėžys išsivysto per daugiapakopį procesą, apimantį genetinių pakitimų, kurie skatina normalių ląstelių vystymąsi į piktybinius darinius, kaupimąsi (Lengauer ir kt., 1998). Įrodyta, kad žmogaus vėžio išsivystymą gali paskatinti įvairios alelinės delecijos, kuriose teoriškai galėtų būti naviko slopinimo genai. Iš tiesų, daugelis navikų yra susiję su chromosomų sričių, turinčių naviko slopintuvus p53 ir Rb, ištrynimu (Hahn ir Weinberg, 2002). Reikia atkreipti dėmesį į tai, kad heterozigotumo (LOH) praradimas chromosomų srityje 6q25 – q27 yra dažnai susijęs su įvairių tipų tvirtu naviku, įskaitant kiaušidžių karcinomas (Saito ir kt., 1996; Tibiletti ir kt., 1996)., krūtys (Rodriguez ir kt., 2000), inkstai (Morita ir kt., 1991), plaučiai (Kong ir kt., 2000) ir melanomos (Millikin ir kt., 1991). Kita vertus, žmogaus 6 chromosomos perkėlimas į melanomos ląsteles prarado jų gebėjimą formuotis navikams pelėms (Trent ir kt., 1990). Be to, normali 6 chromosoma pakeitė naviko augimo savybes in vitro ir slopino krūties vėžio ląstelių tumorigeninį poveikį (Negrini ir kt., 1994). Šie duomenys rodo, kad neapibrėžtigenai, esantys 6 chromosomoje, gali vaidinti naviko slopinimo genus. Neseniai atlikus fizinį žemėlapių sudarymą kartu su LOH analize, parkinas buvo identifikuotas kaip galimas naviko slopinimo genas, nes chromosomų sritis, kurioje yra labai nestabili FRA6E bendrosios trapios vietos sritis 6q25 – q27, dažnai ištrinama iš krūties ir kiaušidžių navikų (Cesari et al., 2003; Denison ir kt., 2003). Be to, dar vienas tyrimas pranešė, kad 4 iš 11 kepenų ląstelių karcinomos (HCC) ląstelių linijų buvo heterozigotinis parkinio egzono ištrynimas ir kad parkinio baltymo ekspresija reikšmingai sumažėjo arba jo nebuvo visose 11 HCC ląstelių (Wang et al., 2004). Šie duomenys rodo, kad parkinas yra svarbus kaip naviko slopiklis ir yra susijęs su žmogaus vėžio vystymusi. Norėdami sužinoti apie parkinio fiziologinį ir patologinį vaidmenį, mes sukūrėme parkin - / - - peles ir išanalizavome jų fenotipus.

Rezultatai

Kepenų ląstelių karcinomos vystymasis pelių parkinyje

Mutantinis parkinio alelis, neturintis 3 eksono, buvo sukurtas atliekant homologinę rekombinaciją pelių AK18.1 ES ląstelėse (129S4 / SvJaeSor), o parkinio mutacija buvo išlaikyta mišriame 129 / C57BL6SJL (75/25) genetiniame fone (Kitao et al. 2007). Parkin - / - pelės gimė gyvos ir atrodė sveikos, tačiau tiek patinų, tiek patelių parkin - / - pelių kūno svoris buvo ženkliai sumažėjęs, palyginti su laukinio tipo pelėmis (31, 77 ± 0, 72 g pelių, parkinta / / - pelėms, palyginti su 36, 23 ± 0, 58). g laukinių pelių patinų 48 metų amžiaus; n = 42 kiekvienai; 1a pav.) Parkin - / - pelės buvo neurologiškai normalios, nepastebėta jokių akivaizdžių elgesio pokyčių, o senyvo amžiaus parkin - / - pelėse nebuvo pastebėta jokių neuropatologinių pokyčių - tai atitinka paskutinius pranešimus (Goldberg ir kt., 2003; Itier ir kt., 2003; Palacino). et al., 2004; Von Coelln ir kt., 2004; Perezas ir Palmiteris, 2005). Skirtingai nuo neuropatologinių anomalijų nebuvimo, parkinio pelių kepenyse įvyko ryškus fenotipinis pokytis. Nepaisant mažo parkavimo pelių kūno svorio, jų kepenys buvo padidintos: 48 savaičių amžiaus kepenų svoris buvo 1, 5 karto didesnis nei laukinio tipo pelių (1, 55 ± 0, 24 vs 1, 09 ± 0, 34 g; 1b paveikslas). . Taigi pelių kepenų ir kūno svorio santykis 48 kartus buvo maždaug dvigubai didesnis nei laukinio tipo pelių.

Image

Padidėjęs kepenų hepatocitų proliferacija. a ) Laukinio tipo (+ / +, atviros juostos) ir parkinio ( - / - , juodos juostos) pelių kūno svorio pokyčiai. * P vertė <0, 05, nustatyta pagal Studentų t- testą. b ) Pelių, sergančių parkingais, kepenų anomalijomis. Makroskopinė hepatomegalija buvo pastebėta 48 savaičių amžiaus parginamosioms pelėms.

Visas dydis

Senų parkuotų pelių kepenys turėjo savitą fenotipą. Be hepatomegalijos, makroskopiniai kepenų navikai išsivystė atitinkamai 33% (12/36) ir 45% (19/42) pelių, sergančių parkingais / - 72 ir 96 savaičių amžiaus. Priešingai nei pelėms, sergančioms parkingais / / - , kepenų navikų nepastebėta laukinio tipo pelėms ir to paties amžiaus parketo +/– pelėms. Histologinis tyrimas atskleidė, kad šie navikai buvo trabekulinio tipo kepenų vėžys, panašus į žmogaus HCC (2a pav.). Pastebėtina, kad visi tirti HCC audiniai išreiškė α-fetoproteiną (AFP), geriausiai žinomą naviko žymeklį žmogaus HCC, tuo tarpu AFP raiškos nepastebėta nei parkingeniškių, nei kepenų, nei laukinio tipo kepenų neaugliuose regionuose (2b paveikslas). ). Be to, PARK - / - - pelių HCC audiniuose buvo pastebėtas stiprus imunoreaktingumas β-kateninui, tuo tarpu nenustatytas β-kateninas neaktyviame parkinio-kepenų srityje (2c paveikslas).

Image

Kepenų ląstelių karcinomos vystymasis pelėms, sergančioms parkinu. a ) Pelių kepenų naviko pavyzdžių, gautų 72 savaičių amžiaus, histologinė analizė. Viršutinėse plokštėse pavaizduota 200 netogeninių kontrolinių kepenų dalių (+ / +, kairė) ir hematoksilino bei eozino (HE) dažytos kepenų sekcijos × 200 padidinimu ir pelių, auginamų nuo parkinio, neauglio srityje ( - / - , dešinėje). Masto juosta = 200 μm. Apatinėse plokštelėse parodyti pelių, esančių parkinyje, kepenų navikai. Parodytas reprezentatyvaus kepenų naviko (kairėje) ir HE dažytos kepenų naviko dalies (dešinėje; × 200) makroskopinis vaizdas. Skalės juosta = (kairėje) 1 mm, (dešinėje) 200 μm. ( b, c ) α-fetoproteino (AFP) ir β-katenino imuninis padengimas kepenų navike, išsivysčiusiuose pelių parkinge . Imunohistocheminis AFP ( b ) ir β-katenino ( c ) baltymų tyrimas buvo atliktas pelių neauglio regione (NT) ir naviko (T) (padidinimas: × 200). Masto juosta = 200 μm.

Visas dydis

Genų ekspresijos profiliai navikiniuose ir navikiniuose pelių, sergančių parkinta / / -, kepenų audiniuose

Remiantis anksčiau praneštais parkin - / - pelių modeliais (Goldberg ir kt., 2003), imunobloto analizė neparodė reikšmingų pokyčių kelių parkinio substrato baltymų ekspresijos lygiuose (duomenys nepateikti). Kita vertus, buvo įrodyta, kad parkinas turi RING-IBR-RING motyvą, kuris, kaip buvo prognozuojama, dalyvaus genų ekspresijos reguliavime (Morett ir Bork, 1999). Norėdami gauti įžvalgą apie molekulinį mechanizmą, pagal kurį parkinio deficitas prisideda prie hepatokarcinogenezės, mes analizavome pelių, auginamų neparodijusių ir navikinių audinių genų ekspresijos profilius, naudojant cDNR mikrotraumų analizę. Iš 43 800 išanalizuotų genų mes nustatėme daugybę genų, kurie buvo sureguliuoti arba sureguliuoti pelių, sergančių parkinga, kepenų audiniuose. Tarp jų 302 genų (įskaitant 59 nežinomos funkcijos genus) ekspresijos santykis navikiniuose kepenų audiniuose buvo didesnis nei penkis kartus, palyginti su normalių laukinio tipo pelių kepenimis (1 papildoma lentelė). Panašiai mes nustatėme 96 genus (įskaitant 31 nežinomos funkcijos genus), kurie buvo sureguliuoti nesuborizuotuose pelių, sergančių parkin / - - kepenų audiniuose, palyginti su laukinio tipo pelių kepenų audiniais (2 papildoma lentelė). Norėdami nustatyti pagrindinę molekulę, atsakingą už padidėjusį hepatocitų proliferaciją ir tokiu būdu hepatokarcinogenezę, parkin - / - pelėse, mes ieškojome genų, kurie paprastai buvo sureguliuoti tiek nesuborziniuose, tiek navikiniuose parkinio - / - pelių kepenų audiniuose. Tai užtikrino, kad atrinkti genai neapsiribojo vien tik navikiniais ar navikiniais audiniais. Naudodami šį filtrą mes nustatėme 13 genų, kurie paprastai buvo reguliuojami pelių, sergančių parkingais / kepenų kepenimis (1 lentelė). Šie 13 iš naujo sureguliuotų genų apėmė tuos, kurie ekspresuoja fermentus (citochromo p450 (4a10), abhidrolazės domeną, kuriame yra 1, hidroksisteroidų dehidrogenazę-4 ir asparagino sintetazę), metabolizme dalyvaujančias molekules, chemokino ligandą 1 ir aktyvino antagonistą follistatiną . Filtras taip pat nustatė genus, kurių nereglamentuota navikų (104 genai) ir navikinių kepenų audinių (138 genai) parkin - / - pelėse, kurių ekspresijos santykis buvo mažesnis nei penkis kartus nei atitinkamų genų normaliose kepenyse. Tarp jų 17-os genų buvo nereglamentuojami tiek navikiniai, tiek navikiniai parkinio pelių kepenų audiniai (3 papildomoji lentelė), tačiau šių genų vaidmuo navikogenezėje šiuo metu nėra aiškus. Mikropakopų duomenys buvo pateikti viešojoje „Gene Expression Omnibus“ (GEO) duomenų bazėje, esančioje Nacionaliniame biotechnologijų informacijos centre (NCBI), registracijos numeriu GSE9651.

Pilno dydžio lentelė

Endogeninio follistatino reguliavimas pelėse, kuriose yra parkingas

Follistatinas yra endogeninis aktyvino antagonistas ir kontroliuoja daugelio tipų ląstelių proliferaciją, diferenciaciją ir apoptozę autokrininiu ir paracrininiu būdu (Chen et al., 2002; Harrison et al., 2005). Naujausi tyrimai parodė, kad per didelis follistatino ekspresija susijęs su padidėjusiu hepatocitų dauginimu, dėl kurio in vivo padidėja kepenys (Kogure et al., 2000; Takabe et al., 2003). Kadangi follistatino išraiška paprastai yra reguliuojama pelių, sergančių parkingais, kepenyse, mes sutelkėme dėmesį į folistatino ekspoziciją kepenyse, kad išsiaiškintume, kokiu būdu parkinio deficitas sukelia HCC. Norėdami patvirtinti mikrotraumų duomenų patikimumą, pirmiausia ištyrėme follistatino išraišką, naudodami pusiau kiekybinius ir kiekybinius realaus laiko RT – PGR tyrimus su pradmenimis, būdingais pelės follistatinui . Β- aktino ir 18S rRNR nuorašų ekspresija buvo vidaus kontrolė. Nors follistatino transkripcija normaliose laukinio tipo pelių kepenyse buvo nedidelė, follistatino ekspresija buvo iš esmės sureguliuota tiek augliniuose, tiek neaugliuose parkinio / - pelių kepenų audiniuose (3a paveikslas). Taip pat buvo ištirti kepenų audinių transformuojančių augimo faktoriaus β superšeimos genų, įskaitant inhibino-A, inhibino-B, BMP2 ir BMP4 , transkriptai, tačiau jų raiškos skirtumai tarp laukinio tipo ir parkinio / - pelės (3b pav.). Norėdami dar labiau patvirtinti follistatino ekspresijos reguliavimą parkin - / - pelėse, atlikome imunobloto analizę, naudodami specifinius follistatino antikūnus. Laistinio tipo pelių kepenų audinių lizatuose nebuvo nustatyta follistatino baltymo. Atvirkščiai, follistatino baltymas buvo aiškiai aptinkamas navikinių pelių navikiniuose kepenų audiniuose (3c paveikslas), atitinkantis duomenis, gautus atliekant kiekybines realiojo laiko RT – PGR analizes. Siekiant ištirti specifinę follistatino ekspresiją audiniuose, buvo ištirti visi RNR mėginiai, išgauti iš laukinio tipo ir parkin - / - pelių audinių (kepenų, inkstų, plaučių, plonosios žarnos ir smegenų), naudojant kiekybinį realaus laiko RT – PGR. Mes nustatėme, kad follistatino mRNR buvo labai ekspresuojama pelių, sergančių parkinga, kepenyse, o žymiai mažesnis follistatino ekspresijos lygis buvo stebimas įvairiuose laukinio tipo pelių audiniuose ir +/– pelių kepenų parketuose (3d paveikslas). .

Image

Follistatino išraiškos reguliavimas kepenų, kuriose trūksta parkinio. a ) Endogeninio follistatino (Fst, viršutinė panelė) arba β-aktino (apatinė panelė) ekspresija laukinio tipo (+ / +), nesuboruojančio (NT) ir navikinio (T) audinio parkuose, kuriems trūksta pelių. Apatiniai grafikai rodo santykinius follistatino mRNR lygius, išmatuotus kiekybiniu realaus laiko RT – PGR, naudojant vidinę kontrolę 18S rRNR (vidurkis ± sd; n = 3). * P vertė <0, 05, nustatyta pagal Studentų t- testą. ( b ) Bendra RNR buvo išskirta iš laukinių rūšies (+ / +), NT ir T kepenų audinių parkin - / - pelių kepenų audinių. RT – PGR buvo atlikta naudojant 0, 5 μg kiekvienos RNR kaip šabloną, o oligonukleotidų pradmenų rinkiniai, būdingi pelių inhibinui A, inhibinui B, BMP2 , BMP4 ir β-aktinui. c ) Visas baltymas buvo išskirtas, o imunoblotiniai tyrimai buvo atlikti naudojant anti-Fst (viršutinė panelė) arba anti-β-aktiną (apatinė panelė) laukinio tipo (+ / +), NT ir T kepenų audiniuose. parkin - pelių. d ) Endogeninio follistatino ekspresijos lygis įvairiuose organuose. Kiekybinis realaus laiko RT – PGR buvo atliktas naudojant bendrą RNR, išskirtą iš įvairių laukinio tipo (+ / +, atvirų briaunų ) organų ir parkinio / pelių (juodų juostų) organų. Fst nuorašų išraiškos lygiai +/– parkeno kepenyse taip pat rodomi kaip pilka juosta.

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar parkinas dalyvauja translistaciniame follistatino reguliavime, mes ištyrėme parkino poveikį endogeninio follistatino ekspresijai, naudojant kultivuojamas hepatomos gautas ląsteles. Pirmiausia patvirtinome, kad follistatino baltymo ekspresija pastebimai sumažėjo Hep3B ląstelėse su parkinio ekspresija (papildomas 1a paveikslas). Kiekybinės realiojo laiko RT – PGR analizės atskleidė, kad dėl per didelio parkinio išaugintų hepatomos ląstelių ekspresijos reikšmingai sumažėjo follistatino ekspresija, tuo tarpu mutantinis parkinas, neturintis 3–4 egzonų, neturėjo reikšmingo poveikio follistatino ekspresijai (papildomas 1b paveikslas). . Be to, parkino ekspresija Huh7 ląstelėse sąlygojo nuo dozės priklausomą follistatino nuorašų santykinį sumažėjimą (papildomas 1c paveikslas). Žurnalistų plazmidžių, koduojančių follistatino geno promotoriaus sritį, panaudojimas parodė, kad parkinio ekspresija žymiai sumažino luciferazės aktyvumą transfekuotose ląstelėse (papildomas 1d paveikslas). Galiausiai mes ištyrėme follistatino ir parkino geno raiškos profilius klinikiniuose žmogaus HCC audinių mėginiuose. Mes nustatėme, kad daugumoje kepenų vėžio mėginių, kuriems nebuvo parkuotos ekspresijos, follistatino reguliavimas buvo padidėjęs, palyginti su negimdiniu kepenų regionu (papildomas 2a paveikslas). Priešingai, žmogaus HCC mėginiai, kurių parkinas buvo ekspresuojamas panašiai kaip neaugantys regionai, neparodė tokio sustiprinto follistatino nuorašų ekspresijos (papildomas 2b paveikslas). Visi šie duomenys rodo, kad follistatino ekspresija buvo ypač padidėjusi kepenų, kurių parkinas buvo nepakankamas, ir rodo, kad parkinas dalyvauja transkripciniame follistatino ekspresijos reguliavime kepenų ląstelėse.

Dėl Parkin deficito, kurį sudaro follistatino reguliavimas, hepatocitai tampa atsparesni apoptozei

Norint ištirti pelių, sergančių parkin / / - pelėmis, hepatomegalijos molekulinę bazę, hepatocitų proliferacijos greitis buvo nustatytas naudojant PCNA (proliferuojančio ląstelės branduolinio antigeno) žymėjimą. Atsižvelgiant į hepatomegalijos išsivystymą, 48 savaičių parkinio - / - pelių kepenyse buvo pastebėtas padidėjęs hepatocitų proliferacija (4a paveikslas). Padidėjusį parkinio - / - hepatocitų dauginimąsi dar labiau palaikė pirminių hepatocitų žymėjimas 5-bromodeoksiuridinu (BrdU), kuris parodė, kad stimuliuojant hepatocitų augimo faktorių (HGF), parkingas - / - hepatocitai buvo aukštesni nei BrdU. laukinio tipo pelių (4b paveikslas). Norėdami išsiaiškinti follistatino padidėjusio funkcinio reikšmingumo svarbą, ištyrėme, ar parkiną sukeliantys hepatocitai yra atsparūs apoptozei dėl follistatino padidėjusio reguliavimo . Norint nustatyti, ar kaspazės aktyvacija slopinama parkinio hepatocituose, buvo paruošti citozoliniai ekstraktai iš parkinio ir / arba laukinių pelių kepenų, normalizuoti pagal bendrą baltymų kiekį ir apdoroti citochromu c arba granizmu B. Kontroliniuose ekstraktuose iš laukinio tipo pelių citochromas c arba granizimas B sukėlė kaspazių aktyvaciją, matuojant kaspazės substrato Ac-DEVD-pNR suskaidymu. Palyginimui, citochromo c arba granzimo B indukuotuose ekstraktuose iš parkinio kepenų žymiai mažiau kaspazės aktyvumo (4c paveikslas). Norėdami ištirti antiapoptotinius parkinio - / - hepatocitų požymius, mes nustatėme kultivuojamus pirminius parkin - / - pelių hepatocitus ir palyginome cisplatinos (CDDP), doksorubicino (DOX) ar etopozido (VP-16) sukeltą apoptozės lygį tarp parkinio / - hepatocitai ir laukinio tipo ląstelės. Kaip parodyta 4d paveiksle, CDDP, DOX arba VP-16 sukelta žymiai mažiau ląstelių žūties parkinio hepatocituose, palyginti su normaliais hepatocitais, ir tai atitinka išvadą, kad parkino trūkumas sukėlė kaspazės aktyvacijos slopinimą. Aneksino-V tyrimas parodė žymiai sumažintą apoptozinių parkinio / - - hepatocitų skaičių po gydymo DOX, palyginti su hepatocitais, gautais iš laukinio tipo pelių (4e paveikslas).

Image

Padidėjęs ląstelių proliferacija ir sumažėjusi parkininių pelių hepatocitų apoptozė. a ) Padidėjęs hepatocitų, gautų iš nepoporinių pelių, esančių ne parūkyje, dauginimasis. Hepatocitų proliferacija laukinio tipo (+ / +) ir parkinio ( - / - ) pelių pelėse buvo įvertinta dažant ląstelių branduolinį antigeną (PCNA). Masto juosta = 200 μm. ( b ) 5-bromodeoksiuridino (BrdU) ženklinimas ant pirminių hepatocitų prieš ir po gydymo hepatocitų augimo faktoriumi (HGF). Pelės pirminiai hepatocitai buvo nustatyti iš parkinio - / - arba laukinio tipo (+ / +) pelių ir 24 valandas buvo auginami šviežioje terpėje, po to 48 valandas buvo apdorojami rekombinantiniu HGF (10 ng / ml). BrdU žymėjimo lygiai buvo nustatyti srauto citometrine analize. c ) Parkino trūkumas sukėlė bendrą kaspazės aktyvacijos slopinimą, kurį sukėlė citochromas c (Cyt-c) ir granizimas B (Gra-B). Lizatai buvo paruošti iš laukinių (+ / +) pelių, parkin - / - pelių kepenų mėginių ir normalizuoti, kad būtų bendras baltymų kiekis. Kaspazės aktyvumas buvo matuojamas naudojant kaspazės-3 substratą, Ac-DEVD-pNR (10 mM), pridėjus Cyt-c ir dATP (kairysis grafikas) arba Gra-B (grafikas dešinėje). Rezultatai išreiškiami atsižvelgiant į kaspazės aktyvumą, sugeneruotą įprastose laukinio tipo pelių kepenyse (vidurkis ± sd; n = 3). Reakcijos mišinys be Cyt-c arba Gra-B buvo įtrauktas kaip neigiama kontrolė (NC). * P vertė <0, 05, nustatyta pagal Studentų t- testą. ( d, e ) Parkin - / - hepatocitai pasižymi atsparumu apoptozei, kurią sukelia įvairūs priešvėžiniai vaistai. Pirminiai hepatocitai buvo nustatyti iš laukinio tipo (+ / +) ar parkinio pelių. Tada ląstelės 48 valandas buvo apdorotos 200 μM cisplatina (CDDP), 10 μM doksorubicino (DOX) arba 400 n M etopozidu (VP-16). Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas atliekant bandinių mėlynųjų dažų išskyrimo testą ( d ) ir dažant aneksino-V ( e ) (vidurkis ± sd; n = 3). Apoptozinių ląstelių procentas buvo nustatytas iš> 200 ląstelių, rankiniu būdu suskaičiuotų trimis egzemplioriais. * P vertė <0, 05, nustatyta pagal Studentų t- testą.

Visas dydis

Norėdami nustatyti, ar follistatino reguliavimas mažina apoptozę parkinio ląstelėse, mes panaudojome mažai trukdančią RNR (siRNR), norėdami slopinti endogeninio follistatino ekspresiją pirminiuose pelių hepatocituose. Indukcionuojant specifiniams, bet ne kontroliuojamiems follistatino, RNR, sumažėjo endogeninio follistatino transkripto lygis tiek normaliuose, tiek parkinyje esančiuose pelių hepatocituose, nors tik pėdsakai follistatino buvo aptinkami hepatocituose, gautuose iš laukinio tipo pelių (5a paveikslas). ). Pirminių hepatocitų, gautų iš pelių, gautų iš parkinio / / - pelių, gydymas DOX buvo veiksmingesnis apoptozės sukėlimui kepenų ląstelėse, gydomose follistatino siRNR, palyginti su tais, kurie buvo gydomi kontroline siRNR (5b pav.). Atvirkščiai, daug mažiau slopinantis endogeninio follistatino numušimo poveikis buvo pastebėtas normalių hepatocitų apoptozėje. Šie duomenys rodo, kad follistatino padidėjęs reguliavimas yra glaudžiai susijęs su kaspazės aktyvacijos ir apoptozės slopinimu parkiniuose hepatocituose.

Image

Apoptozės reguliavimas endogeninio follistatino pagalba parkinio ląstelėse. ( a ) Iš laukinio tipo (+ / +) ir parkin - / - pelių nustatyti pirminiai hepatocitai buvo transfekuoti mažais trukdžiais RNR (siRNR), nukreipiančiais į follistatino -siRNR (Fst-siRNR) arba kontrolinę siRNR (CTR-siRNR). Follistatino (Fst, viršutinė panelė) arba β- aktino (apatinė panelė) ekspresijos lygis buvo tiriamas atliekant RT – PGR analizę. ( b ) Apoptozinių ląstelių procentas (vidurkis ± sd; n = 3) buvo nustatytas atliekant trypano mėlynojo dažų išskyrimo tyrimą, kultivuojant Fst-siRNR arba kontroliniais (CTR-siRNR) transfekuotais pelių pirminiais hepatocitais su 10 μM DOX. .

Visas dydis

Diskusija

Žmogaus HCC vystymosi molekuliniai įvykiai nėra gerai suprantami. Tačiau manoma, kad daugiapakopis genetinių pokyčių procesas lemia hepatokarcinogenezę (Feitelson ir kt., 2002; Laurent-Puig ir Zucman-Rossi, 2006). Vėžiui vystytis ir progresuoti būdingas naviko slopinančių genų inaktyvavimas ir pasirinktų onkogenų amplifikacija (Farazi ir DePinho, 2006). Nors buvo įrodyta, kad keli transgeniniai pelių modeliai sukelia kepenų vėžį, pagrindinės naviko slopintuvo molekulės, dalyvaujančios hepatokarcinogenezėje, nėra aiškios. Šiame tyrime pirmą kartą įrodėme, kad parkinas yra svarbus reguliuojant hepatocitų proliferaciją ir apoptozę, o parkinio ekspresijos praradimas lemia HCC vystymąsi. Trūksta duomenų apie tai, ar genai, susiję su Parkinsono liga, yra svarbūs kancerogenezėje būtinuose biocheminiuose keliuose (West ir kt., 2005). Priešingai nei epidemiologiniai tyrimai, rodantys neigiamą ryšį tarp Parkinsono ligos ir vėžio, naujausi pranešimai rodo, kad parkinas dalyvauja įvairių žmogaus vėžio formų vystymo srityje (Cesari et al., 2003; Denison et al., 2003; Picchio ir kt., 2004). ; Wang ir kt., 2004). Dabartiniai mūsų duomenys, kurie parodo, kad parkinistinės pelės yra jautrios HCC, pateikė įrodymų, kad parkinas yra svarbus naviko slopinimo genas.

Kelios kitos grupės savarankiškai generavo parkin - / - peles su įvairiomis tikslinėmis parkino geno delecijomis (Goldberg ir kt., 2003; Itier ir kt., 2003; Palacino ir kt., 2004; Von Coelln ir kt., 2004; Perez ir Palmiteris, 2005). Dvi grupės aprašė egzono 3 išbrauktų pelių modelius, panašius į mūsų, ir pranešė, kad jie neturėjo dopaminerginių neuronų nuostolių (Goldberg ir kt., 2003; Palacino ir kt., 2004). Neseniai paskelbtoje ataskaitoje taip pat buvo įrodyta nereikšmingų neurologinių funkcijų, mokymosi ar atminties trūkumų naudojant 2 egzono išbrauktus modelius (Perez ir Palmiter, 2005). Šie duomenys rodo, kad pelės, sergančios parkin / - , nekaupia parkinsonizmo simptomų. Tačiau visi šie ankstesni tyrimai buvo skirti centrinės nervų sistemos fenotipinėms analizėms. Taigi neaišku, ar šioms pelėms, sergančioms parkingais / / - išsivystė kepenų navikai. Atsižvelgiant į tai, kad kitoms pelėms, kurioms buvo parkingas, nebuvo HCC, skirtingose ​​laboratorijose pastebėtas nenuoseklus fenotipas gali būti susijęs su padermių genetinio fono skirtumais. Kaip alternatyva, mūsų ir kitų rezultatų neatitikimas galėjo atsirasti dėl kepenų fenotipo analizės laiko. Mūsų parkin - / - pelių modelis neparodė kepenų navikų po 48 savaičių. Didžioji dalis navikų buvo aptikta sulaukus 72 savaičių ar vyresnių, tuo tarpu kai kurios ankstesnės parkin - / - pelių analizės buvo atliktos, kai pelės buvo jaunesnės nei 72 savaičių (Goldberg ir kt., 2003; Palacino ir kt.) al., 2004). Tolesnės analizės yra būtinos norint nustatyti, ar dėl padidėjusio hepatocitų proliferacijos ir HCC išsivystymo įvairiuose parkinio / pelės modeliuose visada atsiranda parkinio deficitas. Priešingai nei hepatomegalija, mes nustatėme, kad pelių, sergančių parkingais / kūno svoris, kūno svoris buvo žymiai mažesnis nei laukinio tipo pelių dėl nežinomos priežasties. Viena iš prielaidų yra manyti, kad dėl su metabolizmu susijusių molekulių lygio pokyčiai buvo susiję su mažais parkinio pelių kūno svoriais.

Svarbu tai, kad mes parodėme, kad follistatinas paprastai yra reguliuojamas tiek navikiniuose, tiek navikiniuose pelių, sergančių parkin / -, kepenų audiniuose. Mūsų išvados taip pat parodė, kad parkinio ekspresija sumažino follistatino nuorašų raiškos lygius in vitro . Šiuo metu neaiškus molekulinis mechanizmas, atsakingas už folistino transkripcijos parkinu reguliavimą. Tačiau buvo parodyta, kad parkinas reguliuoja monoaminooksidazės genų transkripciją įvairiose ląstelėse (Jiang ir kt., 2006). Pažymėtina, kad parkino gebėjimas slopinti monoaminooksidazės ekspresiją neatrodo priklausomas nuo jo ubikvitino ligazės aktyvumo. „Parc“, kaip į parkiną panaši ubiquitino ligazė, taip pat turi RING-IBR-RING motyvą ir veikia kaip citoplazminis p53 baltymo inkaras, todėl slopinama nuo p53 priklausoma nuo transkripcijos (Nikolaev et al., 2003). Dabartiniame tyrime reporterio plazmidės tyrimas atskleidė, kad parkinio ekspresija smarkiai sumažino follistatino geno promotoriaus aktyvumą. Taigi, galima manyti, kad parkinas dalyvauja translistaciniame follistatino geno ekspresijos reguliavime, nepriklausomai nuo jo E3 ligazės funkcijos arba dėl tikslinio baltymo proteosominio skilimo, susijusio su follistatino transkripcijos reguliavimu. Be galimo follistatino transkripcinio reguliavimo per parką, HCC audiniuose stebimas β-katenino aktyvinimas gali būti siejamas su padidėjusia follistatino geno ekspresija, nes įrodyta, kad β-katenino aktyvinimas sukelia follistatino ekspresija įvairiose vėžio ląstelėse (Willert ir kt., 2002; Germann ir kt., 2003).

Mūsų duomenys parodė, kad parkininiai hepatocitai buvo žymiai atsparesni ląstelių mirčiai kartu su follistatino reguliavimu . Follistatinas sekretuojamas ir kartais yra susijęs su membrana, todėl daro įtaką kaip stipriausias endogeninis aktyvino inhibitorius (Harrison ir kt., 2005). Kaupiami įrodymai rodo, kad aktyvino / follistatino sistema dalyvauja reguliuojant hepatocitų proliferaciją ir apoptozinių ląstelių mirtį (Chen ir kt., 2002; Harrison ir kt., 2005; Rodgarkia-Dara ir kt., 2006). Keletas gyvūnų modelių ir klinikinių pavyzdžių analizė atskleidė, kad aktyvino signalų panaikinimas, daugiausia pasiektas padidinus follistatino reguliavimą, prisideda prie patologinių sąlygų, tokių kaip kepenų uždegimas, fibrozė ir kepenų vėžys (Rossmanith ir kt., 2002; Grusch ir kt., 2006; Patella). et al., 2006). Aktyvus ekspressas sukelia hepatocitų apoptozę in vitro ir in vivo (Schwall et al., 1993; Hully ir kt., 1994), tuo tarpu follistatino vartojimas sumažino hepatocitų apoptozę hepatito pelės modelyje (Patella et al., 2006). Be to, follistatino vartojimas intraportalinės infuzijos būdu arba perdėta adenoviruso pagalba stimuliuoja normalių žiurkių kepenų DNR sintezę ir kepenų augimą (Kogure et al., 2000; Takabe et al., 2003). Eksperimentiškai sukeltų graužikų kepenų navikai, taip pat žmogaus HCC, rodo sureguliuotą follistatino ekspresiją (Grusch ir kt., 2006). Šie duomenys rodo, kad aktyvinimo išraiškos ir jų antagonisto follistatino pusiausvyros panaikinimas gali padėti padidinti hepatocitų augimo pranašumą ir sukelti kepenų vėžį. Todėl tikėtina, kad follistatino padidėjimas yra susijęs su HCC išsivystymu pelėse, kurioms parkinta .

Apibendrinant, mūsų išvados rodo, kad parkinas yra svarbus reguliuojant hepatocitų proliferaciją ir apoptozę ir kad parkinio ekspresijos praradimas gali prisidėti prie kepenų kepenų proliferacijos, sukeliančios hepatokarcinogenezę. Kadangi β-katenino aktyvacija buvo pastebėta navikiniame, bet ne navikiniame parkinio, kuriam trūksta kepenų, srityje, norint sukurti HCC, gali prireikti papildomų genetinių pokyčių, susijusių su parkintu, kurio trūkumas.

medžiagos ir metodai

Parkinio pelių generavimas

Mutantinis parkinio alelis, kuriam trūko maždaug 2 kb parkinio 3 egzono 3 genomo sekos, buvo sukurtas mišriu 129SV / C57BL6 (50/50) genetiniame fone (Kitao ir kt., 2007). Pelės buvo globojamos humaniškai pagal Nacionalinės mokslų akademijos parengtus ir Nacionalinių sveikatos institutų išleistus laboratorinių gyvūnų priežiūros ir naudojimo vadovus (NIH leidinys 86–23).

Pelių pirminių hepatocitų išskyrimas ir kultūra

Pelės pirminiai hepatocitai buvo gauti iš 10–11 savaičių pelių dviejų pakopų kolagenazės perfuzijos metodu (Seglen, 1976). Trumpai tariant, hepatocitų suspensijos buvo gautos praleidžiant II tipo kolagenazės (Gibco BRL, Life Technologies Inc., Rockville, MD, JAV) suvirškintas kepenis per 70 μm ląstelių kamštį, po to centrifuguojant, kad būtų surenkami subrendę hepatocitai. Po išskyrimo hepatocitai buvo suspenduoti Dulbecco modifikuoto Eagle terpėje (DMEM; Gibco-BRL), papildytame 10% vaisiaus galvijų vaisiaus serumo, ir pasėti ant 1 tipo kolageno dengtų indų, kurių tankis yra 8x104 ląstelės / cm2. Ląstelės buvo palaikomos 37 ° C temperatūroje sudrėkintoje 5% CO 2 atmosferoje.

siRNR dupleksai, sudaryti iš 25 nukleotidų senseno ir antisense sruogų, naudojamų nukreipti į follistatiną, buvo gauti iš „Invitrogen“ (Carlsbad, CA, JAV). siRNR (20 μM) 60 μl Trans-IT-TKO reagento („Mirus Bio Corporation“, Madison, WI, JAV) buvo inkubuota Opti-MEM terpėje, kurioje nėra serumo (Qiagen, Valensija, CA, JAV) 10 min. po to pridedamas transfekcijos mišinys į ląsteles.

Kiekybinis realaus laiko RT – PGR

RNR buvo ekstrahuota naudojant „Sepasol-RNA 1 Super“ (Nacalai Tesque, Kiotas, Japonija). RT reakcijai visa RNR buvo atvirkščiai perrašyta į cDNR, naudojant Superscript III pirmosios grandinės sintezės sistemą ir oligo-dT 12–18 pradmenis (Invitrogen; Matsumoto ir kt., 2006). PGR amplifikacija buvo atlikta naudojant Takara Ex Taq DNR polimerazę (Takara, Tokijas, Japonija). Šiame tyrime naudojami oligonukleotidiniai pradmenys yra parodyti 4 papildomoje lentelėje. Genų ekspresijos kiekybinis įvertinimas buvo atliktas kiekybiniu realaus laiko RT – PGR, naudojant 7300 realaus laiko PGR sistemą (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, JAV) ir Platiną. „SYBR Green qPCR SuperMix UDG“ („Invitrogen“), kaip aprašyta (Kou et al., 2006). Norint įvertinti izoliuotos RNR kiekį, taip pat cDNR sintezės efektyvumą, tikslinės cDNR buvo normalizuotos pagal namų tvarkymo etaloninio geno 18S rRNR endogeninius mRNR lygius (Matsumoto ir kt., 2006). Paprastumo dėlei tikslinio geno raiškos lygiai buvo išreikšti palyginti su kontrolinio mėginio ekspresijos lygiais. Žmogaus kepenų audiniai RT – PGR analizei buvo gauti iš naviko audinių biopsijos mėginių, esančių šviežiai atrinktų mėginių proksimaliniame krašte, ir nedelsiant užšaldyti skystame azote.

RNR paruošimas ir hibridizavimas su mikrotraumu

Visa RNR buvo ekstrahuota iš pelių kepenų audinių, naudojant RNR tyrimo mini rinkinį (Qiagen). Pirmosios grandinės cDNR buvo susintetinta iš 500 ng visos RNR, dalyvaujant Cy5 arba Cy3 dCTP. Cy3 ir Cy5 pažymėti mėginiai, gauti iš laukinio tipo ir parkin - / - pelių, sulaukusių 72 savaičių, buvo įšvirkšti į tą pačią visos pelės 60-merių oligo mikrotrauminio vietą (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, JAV). ). Po hibridizacijos 17 valandų 65 ° C temperatūroje, stikleliai buvo plaunami 6 × SSC, turinčiu 0, 005% Triton X-102, ir išdžiovinami naudojant azotu užpildytą oro pistoletą. Masyvo vaizdo gavimas ir ypatybių išgavimas buvo atliktas naudojant „Agilent G2565AA Microarray“ skaitytuvą su funkcijų išgavimo programine įranga (8.5.1.1 versija; „Agilent Technologies“). Statistinis vertinimas buvo atliktas naudojant Agilent sukurtą algoritmą masyvo analizei. Buvo svarstomi genai, kurių navikiniuose ir nesuborziniuose kepenų audiniuose buvo daugiau nei penkis kartus padidintas arba nereguliuotas kepenų audinys, palyginti su normaliais kepenų audiniais ir kurių P- reikšmė buvo mažesnė nei 0, 05.

Imunoblotų analizė

Baltymų mėginiai buvo atskirti SDS – poliakrilamido gelio elektroforezės (PAGE) 10% (m / t) poliakrilamido geliais ir atlikti imunoblotų analizę, kaip aprašyta anksčiau (Endo ir kt., 2007). Polikloniniai antikūnai prieš pelės follistatiną ir α-tubuliną buvo įsigyti atitinkamai iš „Santa Cruz Biotechnology“ (Santa Krusas, CA, JAV) ir „Calbiochem“ (San Diegas, CA, JAV).

Imunohistocheminio dažymo analizė

Imunohistocheminis dažymas buvo atliktas pagal anksčiau aprašytą protokolą (Toda ir kt., 1999). Polikloniniai PCNA, AFP ir β-katenino antikūnai buvo įsigyti atitinkamai iš „Santa Cruz Biotechnology“, „Dako Cytomation“ (Glostrup, Danija) ir „Transduction Labs“ (Palo Alto, CA, JAV).

Kaspazės aktyvumo matavimas ir apoptozės tyrimas

Pelių kepenų audiniai buvo paruošti buferiniame tirpale A (1 M KCl, 1 M MgCl2, 1 M 4- (2-hidroksietil) -1-piperazinetansulfonrūgšties, 0, 5 M EDTA ir 10% CHAPS) ir normalizuojami atsižvelgiant į bendrą baltymų kiekį. 30 μg baltymo mėginys buvo inkubuotas su 10 ng B fermento (Calbiochem) arba 0, 5 nmol citochromo c (Sigma, Sent Luisas, MO, JAV) ir 1 mM DATP 37 ° C temperatūroje 30 minučių, kaip aprašyta (Marusawa). et al., 2003). Tada 5 μl reakcijos mišinio buvo inkubuotas su kaspazės-3 substratu Ac-DEVD-pNA (10 mM), ir kaspazės aktyvumas buvo įvertintas naudojant kolorimetrinę CaspACE analizės sistemą (Promega, Madison, WI, JAV). Kaspazės-3 aktyvumui matuoti plokštelės buvo nuskaitytos 405 nm bangoje, naudojant mikro plokštelių skaitytuvą (Molecular Devices Co., Tokijas, Japonija). Ląstelių mirčiai įvertinti pelių pirminiai hepatocitai buvo kultivuojami DMEM ant indų, padengtų kolagenu. Po 24 valandų izoliacijos ląstelės 48 valandas buvo apdorojamos CDDP (200 μM), DOX (10 μM) arba VP-16 (400 nM). Ląstelių gyvybingumas buvo nustatytas atliekant trypano mėlynojo išskyrimo testą (Marusawa ir kt., 2003) arba „Annexin-V-Fluos“ apoptozės aptikimo rinkinį (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, JAV) pagal gamintojo instrukcijas.

Srauto citometrinė analizė

Iš viso 1 × 105 ląstelių buvo dedamos ant 10 cm kolageno dengtų indų. Praėjus dviem dienoms po apdorojimo HGF (PeproTech, Londonas, JK), kurio koncentracija buvo 10 ng / ml, BrdU (20 μM; Roche, Bazelis, Šveicarija) 12 val. Tada ląstelės buvo fiksuotos 70% ledo šaltame etanolyje ir inkubuojamos 4 ° C temperatūroje per naktį. Pridėjus propidiumjodido, fluorescencija buvo nustatyta naudojant FACScan srauto citometrą (Becton Dickinson, Franklin Lake, NJ, JAV). Duomenys buvo surinkti ir išanalizuoti naudojant CELLQuest programinę įrangą (Becton Dickinson).

Ląstelių kultūra, transfekcija ir reporterio plazmidės tyrimas

Žmogaus iš hepatomos gautos ląstelių linijos Huh-7 ir Hep3B buvo palaikomos DMEM, turinčioje 10% galvijų vaisiaus serumo. Plazmidės transfekcijai mes panaudojome lipofektaminą (Invitrogen) Huh-7, o Trans-IT 293 (Mirus Bio Corporation) - Hep3B. Norėdami nustatyti follistatino geno promotoriaus aktyvumą, reporterio plazmidės buvo gautos įterpiant į PGL amplifikuotus follistatino geno 196- ir 361-bp 5′-proksimalinius promotoriaus regionus (de Groot et al., 2000). 3 luciferazės vektoriai (Promega). The reporter construct and pRL-TK (Promega) were then co-transfected with an expression plasmid-encoding parkin or control vector into NIH3T3 cells. The cell lysates were analysed for luciferase activity using the Dual-Luciferase Reporter Assay System (Promega; Tanaka et al., 2006).

Prisijungimai

„GenBank“ / EMBL / DDBJ

  • GSE9651

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildomas S1 paveikslas

Vaizdo failai

  1. 1.

    Papildomas S2 paveikslas

„Word“ dokumentai

  1. 1.

    1 papildoma lentelė

  2. 2.

    2 papildoma lentelė

  3. 3.

    3 papildoma lentelė

  4. 4.

    4 papildoma lentelė

  5. 5.

    Papildomos figūros legendos

    Papildoma informacija pridedama prie dokumento „Oncogene“ svetainėje (//www.nature.com/onc)