Partenogenetinės haploidinės embriono kamieninės ląstelės gamina derlingas peles | ląstelių tyrimai

Partenogenetinės haploidinės embriono kamieninės ląstelės gamina derlingas peles | ląstelių tyrimai

Anonim

Dalykai

  • Embrioninės kamieninės ląstelės
  • Daugiafunkcija

Gerb. Redaktoriau

Nenormalūs oocitai yra viena iš pagrindinių reprodukcinio nepakankamumo priežasčių ir taip pat riboja pagalbinio apvaisinimo efektyvumą 1 . Funkcinių oocitų susidarymas diferencijuojant pluripotencines kamienines ląsteles 2 arba auginant embriono lytinių organų keterus 3 in vitro dar nebuvo pasiektas. Neseniai mes ir kitos grupės pranešėme, kad gyvos derlingos pelės gali būti sėkmingai užaugintos švirkščiant androgenetines haploidinio embriono kamieno (ahES) ląsteles, turinčias tam tikrus tėvystės įspaudus į oocitus, vietoje spermos 4, 5 . Atsižvelgiant į jų partenogenetinę kilmę, būtų įdomu sužinoti, ar partenogenetinės haploidinės ES (phES) ląstelės 6, 7, 8 taip pat galėtų palaikyti embriono vystymąsi, kai jos pakeičia motinos genomą, ir ar jos galėtų tiesiogiai pateikti savo genomus gyvūnų lygmeniu. Čia mes sukūrėme keletą phES ląstelių linijų ir apibūdinome jų pluripotenciškumą ir diploidizacijos progresą in vivo . Mes taip pat parodėme, kad phES ląstelės gali rekonstruoti embrionus ir gaminti derlingas peles, kai jos suleidžiamos į oocitus vietoje motinos genomo.

Haploidiniai partenogenetiniai embrionai buvo gauti iš oocitų, turinčių vištienos β-aktino 4 arba Oct4 9 geno promotoriaus varomą padidintą žaliųjų fluorescencinių baltymų transgeną (trumpai tariant, EGFP arba Oct4-EGFP ). Mes iš viso sukūrėme 13 ES ląstelių linijų (pažymėtų kaip phGFP ląstelių linijos, papildoma informacija, S1 pav. Ir S1 lentelė) iš 40 haploidinių partenogenetinių morulių (iš EGFP oocitų) ir visos ląstelių linijos paveldėjo EGFP išraišką (1A pav.). Be to, devynios ląstelių linijos buvo palaikytos haploidinėje būsenoje po trijų ar daugiau gryninimo etapų, naudojant fluorescenciniu būdu aktyvuotą ląstelių rūšiavimą (FACS) ir po to padidėjusias haploidines ląsteles (1B paveikslas). Įdomu tai, kad šios ląstelių linijos išsaugojo savo haploidinį genomą net po to, kai buvo pasyvuotos daugiau nei 30 kartų (1C pav.). Taip pat gavome dvi Oct4-EGFP haploidines ląstelių linijas iš 30 aktyvuotų Oct4-EGFP pelių oocitų (žymimos kaip phES OG ląstelių linijos, papildoma informacija, S1 lentelė). Visų phES ląstelių linijų genominį vientisumą įvertinome atlikdami lyginamąją genominės hibridizacijos (CGH) analizę ir nepastebėjome jokių phES ląstelių linijų kopijų skaičiaus kitimo (1D pav.). Šie rezultatai parodė, kad phES ląstelės galėjo stabiliai išlaikyti nepažeistą haploidinį genomą, kaip buvo pranešta anksčiau 8 .

Image

Parthenogenetinės haploidinės ES ląstelės gamina derlingas peles. (A) PhES ląstelių, pernešančių EGFP transgeną, fluorescencinis aptikimas. Mastelio juosta, 50 μm. (B) FES ląstelių (phGFP-3, 11 pasažas, raudona ) DNR kiekis analizuojamas FACS. Ląstelės buvo tris kartus išgrynintos FACS atrenkant G0 / G1 fazės haploidines ląsteles, po to auginant dar tris pasus. Kaip kontrolė buvo naudojamos diploidinės ES ląstelės (mėlynos spalvos) su 2n chromosomų rinkiniais. (C) phES ląstelių linijų kariotipų analizė. Parodytas yra standartinis ph-GFP-3 ląstelių kariotipas, jungiantis GGPP-3 (12 pasažas) su 19 + X chromosomų rinkiniu. (D) Lyginamoji dviejų phES ląstelių linijų (phGFP-1 16 passage ir phGFP-3 passage 16) analizė - genomo hibridizacijos (CGH) analizė. PhES ląstelių ir kontrolinio C57BL / 6 kontrolinio pelės inksto genominės DNR palyginamieji rezultatai buvo parodyti kaip y ašis log 2 bazinėje skalėje. (E) diagrama, rodanti phES jauniklių generaciją. hpa, valandos po aktyvavimo. (F) rekonstruotų embrionų (6-7 hpa) dažymas 5 ir 5 hmC branduoliu po spermos injekcijos. ICSI embrionai buvo rodomi kairiajame skydelyje, o rekonstruoti ICPI embrionai buvo rodomi dešiniajame skydelyje. (G) ICPI embrionų, pagamintų injekuojant phES ląsteles, implantacija prieš implantavimą. Mastelio juosta, 50 μm. (H) Kairiajame skydelyje pavaizduotas E10.5 ICPI vaisius su EGFP ekspresija, kurį sukūrė phGFP-3. Dešiniajame skydelyje rodomas vienas P2 ICPI šuniukas (phGFP-3) su EGFP išraiška ir vienas P2 laukinio tipo ICSI šuniukas. (I) ICPI jauniklių genetinio fono analizė. Trys nesudėtingos sekos ilgio polimorfizmo (SSLP) DNR žymenys iš skirtingų chromosomų ir teigiama EGFP analizė parodė, kad šuniukas kilęs iš hibridinio genetinio fono, ty C57BL / 6 kamieno (phGFP-3 kilmės) ir 129Sv kamieno (spermos kilmės). . Grunto sekos buvo nurodytos „Mouse Genome Informatics“ svetainėje (//www.informatics.jax.org/). (J) Suaugęs pelės patinas, pagamintas atliekant PHES ląstelių (phGFP-3) injekciją. (K) Snrpn ir H19 įspaustų genų DMR sekos analizė bisulfito seka. Naudotos pelės uodegos DNR, išskirtos iš ICSI, ir phES suaugusiųjų šaltiniai. Užpildyti apskritimai žymi metiliuotas CpG vietas, tuo tarpu atviri apskritimai žymi nemetilintas CpG vietas. Grunto sekos buvo išvardytos Papildomos informacijos S3 lentelėje. (L) ICPI embrionų vystymasis in vivo .

Visas dydis

Pluripotencija yra svarbi haploidinių ES ląstelių savybė. Įdomu tai, kad phES ląstelės parodė pagrindinių pluripotencinių žymenų genų, tokių kaip Oct4 , Sox2 , Nanog , SSEA-1 ir Klf4 (papildoma informacija, S2A ir S2B pav.), Labai panašių į diploidines ES ląsteles, raišką. Be to, bendras phES ląstelių genų ekspresijos profilis (phGFP-3) parodė aukštą koreliaciją ( r = 0, 955) su diploidinėmis ES ląstelėmis, tačiau mažesnę koreliaciją ( r = 0, 779 arba 0, 799) su pelių embriono fibroblastų (MEF) (papildoma informacija, pav. S2C). Įdomu tai, kad phES ląstelės sudarė teratomas su visais 3 gemalo sluoksniais, kai po oda buvo švirkščiamos pelės į SCID (sunkus kombinuotas imuniteto nepakankamumas) (papildoma informacija, S2D pav.). Toliau mes panaudojome chimerų susidarymo analizę, norėdami išanalizuoti phES ląstelių diferenciacijos potencialą ir diploidizacijos proceso eigą in vivo . FACS rūšiuotos EGFP turinčios G0 arba G1 fazės phES ląstelės buvo gautos iš pelių su juodos spalvos sluoksniais ir įšvirkštos į CD-1 blastocistas (gautas iš pelių su baltos spalvos sluoksniais). Mes nustatėme, kad šios ląstelės tinkamai chimerizavo embrionus E6.5, E8.5, E10.5 ir E13.5 stadijose, kaip atsispindi jų EGFP ekspresijoje (papildoma informacija, S3 pav.). Tačiau E6.5 embriono stadijoje buvo aptikta tik 1, 8% haploidinių EGFP teigiamų ląstelių populiacijos (papildoma informacija, S3A pav.), Kas rodo, kad phES ląstelės po diferenciacijos greitai diploidizuojasi, o tai buvo panašus į ankstesnius rezultatus 7 . Iš 38 E13.5-chimerinių embrionų, gautų iš Oct4-EGFP transgeninių phES ląstelių (papildoma informacija, S2 lentelė), 2 embrionai išreiškė EGFP savo lytinių organų keterose (papildoma informacija, S2E pav.), Nurodant sėkmingą phES ląstelių perdavimą gemaline linija. (phES OG-1). Galiausiai iš viso buvo gauti šeši chimeriniai jaunikliai (papildoma informacija, S2 lentelė). Tačiau tik keturi išgyveno iki pilnametystės (papildoma informacija, S2F pav.). Iš suaugusių chimerinių pelių, pagamintų iš phGFP ląstelių linijos, EGFP ekspresija pasireiškė daugelyje organų, įskaitant inkstus (7, 7%), blužnį (3, 9%), širdį (14, 6%) ir kepenis (12, 6%), o tai atspindėjo plačią phES ląstelių diferenciacijos savybę. in vivo (papildoma informacija, S4 paveikslas). Be to, visos EGFP teigiamos ląstelės buvo diploidinės. Apibendrinant, mūsų rezultatai patvirtino, kad phES ląstelės buvo daugialypės, nors turėjo diploidinę būseną.

Norėdami patikrinti, ar phES ląstelės genomas gali įvykti iš motinos genomo, pirmiausia atlikome intracitoplazminę spermos injekciją (ICSI), po to pašalindami suklį, kad sukurtume androgenetinį haploidinį embrioną 4 . Po valandos mes atlikome intracitoplazminę phES ląstelių (G0 / G1 stadijoje) injekciją (ICPI), norėdami generuoti diploidinius rekonstruotus embrionus (1E pav.). PhES ląstelės (phGFP ląstelių linijos) suformavo „motininius“ pseudopronukleatus ir parodė genominį metilinimo modelį, labai panašų į ICSI embrionus (1F pav.). ICPI embrionai toliau vystėsi į morulą ir blastocistą in vitro (1G pav.) Ir paveldėjo EGFP transgeną, gautą iš phES ląstelių. Norint nustatyti ICPI embrionų vystymąsi in vivo , iš viso 290 2 ląstelių stadijos embrionų buvo perkelti į pseudo nėščias peles. Iš to pagaliau buvo gauti du pilnametiai šuniukai. Ir EGFP ekspresija (1H pav.), Ir paprastos sekos ilgio polimorfizmo (SSLP) analizė (1I pav.) Patvirtino, kad šuniukai iš tiesų buvo gaminami iš phES ląstelių. Įdomu tai, kad vienas iš šių dviejų šuniukų išgyveno iki pilnametystės (1J pav.) Ir parodė normalų Snrpn ir H19 diferencijuotų metilinių regionų (DMR) metilinimo modelį (1K paveikslas). Šis suaugęs pelių patinas buvo derlingas ir pagimdė normalius šuniukus, kurie paveldėjo EGFP transgeną (1L pav.). Tai parodė Mendelio atskyrimo teoriją (papildoma informacija, S5 pav.). Apibendrinant, mūsų rezultatai rodo, kad phES ląstelės galėtų funkciškai pakeisti motinos genomą ir palaikyti visišką embriono vystymąsi, nors ir mažai efektyviai.

Mūsų duomenys parodė, kad phES ląstelės buvo daugialypės, prisidedančios prie chimerinių pelių sudygimo ir galėjo gaminti gyvą pelę per ICPI. Tačiau efektyvumas buvo labai žemas, kurį galėjo lemti dvi priežastys: 1) ICPI embriono manipuliacijos, ypač verpstės pašalinimo procedūra galėjo pakenkti tolesniam embriono vystymuisi 10 ; 2) phES ląstelių epigenetinė būsena gali skirtis nuo veleno ir tokiu būdu pakenkti vystymuisi. Būsimos pastangos modifikuoti manipuliacijos procesą, mažųjų junginių panaudojimas siekiant sumažinti neigiamą verpstės pašalinimo poveikį ir phES ląstelių epigenetinės būklės stabilizavimas, ypač motinos įspaudas, gali pagerinti ICPI embrionų vystymosi efektyvumą. Kai moterys išgyvens tokias sąlygas kaip kiaušidžių vėžys, phES ląstelės galėtų būti alternatyvi priemonė vaisingumui palaikyti, o ICPI procedūra galėtų pagimdyti vaiką, kuris paveldėjo savo DNR. Palyginti su kiaušialąsčių šaltuoju konservavimu, phES ląstelių konservavimas yra lengvesnis ir patogesnis, ir žinoma, kad šios ląstelės skystame azote išgyvena daug ilgiau. PhES ląstelių paskyrimas taip pat suteikia naują genų terapijos būdą gydyti sunkias žmonių ligas, kurias sukelia ląstelės, turinčios mitochondrijų defektus, paveldėtus per kiaušinio citoplazmą. ICPI injekcija galėtų perduoti motinos DNR ir mažiau mtDNR nei verpstės perkėlimo procedūra ir tokiu būdu užtikrinti geriausią aiškų mtDNR pakeitimą oocituose. Nepaisant to, mūsų tyrimas parodė, kad phES ląstelės gali palaikyti embriono vystymąsi pakeičiant motinos genomą, o tai dar suteikia naują modelį embriono vystymosi epigenetiniam reguliavimui tirti ir gali parodyti naują informaciją apie pagalbinį apvaisinimą.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija, S1 pav

    Partenogenetinių haploidinių ES ląstelių darinio schema.

  2. 2.

    Papildoma informacija, S1 lentelė

    Partenogenetinių haploidinių ES ląstelių linijų derivacija.

  3. 3.

    Papildoma informacija, S2 pav

    Partenogenetinių haploidinių ES ląstelių plipipotencija.

  4. 4.

    Papildoma informacija, S3 pav

    Pelių phES ląstelių daugiapotencija ir diploidizacija (phGFP-3).

  5. 5.

    Papildoma informacija, S2 lentelė

    Pelių phES ląstelių daugiapotencija ir diploidizacija.

  6. 6.

    Papildoma informacija, S4 pav

    Skirtingų audinių, išskirstytų iš suaugusių chimerinių pelių, DNR kiekio kraujyje analizė.

  7. 7

    Papildoma informacija, S5 pav

    ICPI pelė, sugeneruota intracitoplazminių phES ląstelių (phGFP-3) injekcijos, ir jos palikuonys.

  8. 8.

    Papildoma informacija, S3 lentelė

    Gruntai, naudojami atliekant PGR analizę.

    ( Papildoma informacija yra susieta su internetine straipsnio versija ląstelių tyrimų svetainėje.)