Patogeninis interferono β potencialas ūminės gripo infekcijos metu | gamtos komunikacijos

Patogeninis interferono β potencialas ūminės gripo infekcijos metu | gamtos komunikacijos

Anonim

Dalykai

  • Imunopatogenezė
  • Gripo virusas
  • Interferonai

Anotacija

Gripo simptomai skiriasi nuo lengvos ligos iki mirties; tačiau sunkumo veiksniai nėra aiškūs. I tipo interferonai (IFNαβ) yra pripažįstami kaip pagrindiniai antivirusiniai citokinai. Čia parodome, kad, stebėtinai, gripo užkrėstomis 129 pelėmis padidėjo plaučių pažeidimai, sergamumas ir mirtingumas, tačiau dar didesnis IFNαβ lygis nei C57BL / 6 pelėms. Nuosekliai IFNα gydymas gripo užkrėstomis C57BL / 6 pelėmis padidina sergamumą. IFNαβ receptorių trūkumas 129 pelėms sumažina sergamumą, plaučių pažeidimus, uždegimą sukeliančius citokinus ir į plaučius infiltruojančias uždegimines ląsteles ir sumažina mirtį sukeliančio receptoriaus DR5 ekspresiją plaučių epitelyje ir jo ligando TRAIL ant uždegiminių monocitų. PDCA-1 + ląstelių išeikvojimas arba TRAIL-DR5 sąveikos nutraukimas apsaugo užkrėstas 129 peles. Dėl selektyvaus IFNαβ signalo trūkumo stromos ląstelėse pašalinamas epitelio DR5 reguliavimas ir apoptozė, sumažėja šeimininko jautrumas. Taigi dėl per didelio IFNαβ signalo reaguojant į ūmią gripo infekciją gali kilti nekontroliuojamas uždegimas ir TRAIL-DR5 sukelta epitelio ląstelių mirtis, o tai gali paaiškinti sergamumą ir turėti svarbių padarinių gydant sunkią ligą.

Įvadas

Gripo sukeltos ligos sunkumo kitimai paprastai priskiriami įvairių gripo viruso atmainų virulentiškumui arba užkrėstų asmenų amžiui ar imuninei būklei. Genetiškai nustatytų veiksnių, susijusių su šeimininku, vaidmuo yra mažiau suprantamas 1, 2 ir tik neseniai žmonių populiacijose buvo nustatytas gripo viruso ribojimo faktorius IFITM3 3 . Šeimos sunkaus gripo grupės rodo, kad žmonių jautrumas nuo šeimininko yra 4, 5, 6, o tyrimai su pelių, auginamų peraugusiomis ir įbrėžusiomis pelėmis, parodė platų šeimininkams būdingą genetinį jautrumą daugeliui genų kandidatų, siūlomų padidinti jautrumą ar atsparumą 4, 7 .

I tipo interferonas arba IFNαβ turi antivirusinę funkciją in vitro 8, 9, 10, o IFNαβ signalo trūkumas receptorių (IFNαβR) deficito pelėse padidina jautrumą daugeliui kitų virusų, išskyrus gripo 11 virusą. Tačiau IFNαβ vaidmuo ribojant gripo infekciją in vivo yra ne toks aiškus 12, 13, 14, 15, 16, 17 . Visų pirma, nors kai kurie tyrimai rodo apsauginį IFNαβ vaidmenį, kiti nerado jokio poveikio. Galimos šių tyrimų neatitikimų priežastys yra užkrėtimas skirtingomis viruso dozėmis ir padermėmis, įskaitant tuos, kurių audinių tropizmas yra neįprastas, pvz., WSN, ir IFNαβR - / - arba signalo keitiklio ir transkripcijos aktyvatoriaus (STAT1 - / -) naudojimas ) pelės, kaip IFN signalizacijos trūkumo C57BL / 6, 129Sv / Ev, CD1 ar mišrių pelių fone modeliai, todėl sunku palyginti tyrimus ir tarp tyrimų. Dabar mes žinome, kad STAT1 yra transkripcijos faktorius, veikiantis atskirai arba kartu su kitais STAT šeimos nariais pasroviui nuo IFNαβ, -γ ir -λ receptorių ir daugelio kitų citokinų, turinčių platų poveikį, pavyzdžiui, interleukino (IL). -6, IL-10 ir IL-27 (nuoroda 18). Taigi didelis STAT1 - / - pelių jautrumas 13, 14 gali būti dėl jų nesugebėjimo reaguoti į daugelį citokinų. Visų pirma, IFNλ, arba III tipo IFN, yra neseniai atrastas antivirusinis IFN, kuris sužadina STAT1 aktyvaciją, įsitraukiant į nepriklausomą receptorių, randamą pirmiausia kvėpavimo ir virškinimo trakto epitelinėse ląstelėse. Tyrimuose, kuriuose pelės, kuriose trūko IFNαβ ir IFNλ, buvo užkrėstos 12 gripu, tik nesant abiejų receptorių, viruso kontrolė buvo žymiai prarasta.

Konkretus IFNαβ vaidmuo gripo infekcijoje vis dar neaiškus. Žinoma, kad I tipo IFN turi stiprų imunomoduliacinį poveikį, kuris gali sutrikdyti ar pakeisti antivirusinę funkciją. Pavyzdžiui, neseniai buvo įrodyta, kad IFNαβ gali slopinti uždegiminę aktyvaciją 19 - kelią, kuris, kaip manoma, turi svarbų vaidmenį imuniniame atsake į gripą 20 . Imunomoduliacinės IFNαβ savybės taip pat gali turėti neigiamos įtakos bakterinės infekcijos baigčiai. Taigi pelės, kurių IFNαβR nepakanka, buvo atsparesnės Listeria ir Trypanosoma 21, 22 infekcijoms, o padidėjęs IFNαβ lygis bent iš dalies paaiškina padidėjusį bakterinės infekcijos sunkumą po gripo infekcijos ar poli I: C gydymo 23, 24 . Apibendrinant, kokiomis sąlygomis IFNαβ apsaugo nuo gripo, lieka neišspręstas klausimas, o dar reikia nustatyti, koks yra jo antivirusinių ir imunomoduliacinių savybių indėlis į bendrą gripo sukeltos ligos baigtį.

Su naviko nekrozės veiksniu (TNF) susijęs apoptozę sukeliantis ligandas (TRAIL), dar žinomas kaip Apo2L, yra citokinų TNF superšeimos (TNFSF10) narys ir iš pradžių sulaukė dėmesio kaip patrauklus priešvėžinis vaistas dėl savo sugebėjimo sukelti specifinę apoptozę. transformuotose ląstelėse, bet ne normaliuose, netransformuotuose audiniuose 25 . Buvo aprašyti penki TRAIL receptoriai tiek žmonėms, tiek pelėms. Žmonėms tik TRAIL-R1 ir TRAIL-R2 (atitinkamai pelių DR4 ir DR5) ir tik DR5 pelėms, turinčioms mirties domenus, todėl sužadinus ląsteles TRAIL, ląstelės žūva, o likę TRAIL receptoriai laikomi apgauliais 26 . Neseniai buvo parodyta, kad imuninės ląstelės ir kitos netransformuotos ląstelės gali suaktyvinti tiek TRAIL, tiek DR5, dažniausiai infekcijos ir uždegimo atvejais 27, ir, kas svarbu, IFNαβ sukelta TRAIL išraiška buvo susijusi su T ląstelių mirtimi lėtinės ŽIV infekcijos metu 28 .

Daugelyje pelių padermių galime parodyti tiesioginį ryšį tarp didelio sergamumo ir mirštamumo bei aukšto IFNαβ lygio reaguojant į gripo infekciją. Mes tiesiogiai parodome, kad jautrioms 129 pelėms IFNαβ receptorių trūkumas sumažina sergamumą ir mirtingumą, aiškiai parodydami, kad per didelis IFNαβ kiekis prisideda prie ligos. Be to, mes pastebime, kad 129 pelėms yra padidėjęs hiperaktyviai reaguojančių pDC skaičius ir kad gripo sukeltas IFNαβ sukelia aukštą uždegiminių citokinų ir chemoattraktantų kiekį, masinį uždegiminių ląstelių įsisavinimą ir stiprią TRAIL ekspresiją uždegiminiuose monocituose ir DR5 epitelyje, kurių sąveika tarpininkauja. plaučių audinio pažeidimas. PDCA-1 + ląstelių išeikvojimas arba TRAIL-DR5 sąveikos užsikimšimas apsaugo 129 peles nuo sunkaus gripo. Apibendrinant, mes nubrėžiame konkrečiam šeimininkui būdą, atsakingą už didelę imunopatologiją ir jautrumą po gripo infekcijos, kai pagrindinis PDNAβ, gauto iš PDCA-1 + ląstelių, vaidmuo yra pagrindinis vaidmuo, o TRAIL-DR5 sąveika yra sergamumo tarpininkas.

Rezultatai

IFNαβ ir -λ lygis koreliuoja su gripo ligos sunkumu

Palyginome gripo sukeltą ligą 129 / SvEvBrd-Hprt b-m2 (129S7 arba 129) ir C57BL / 6 (B6) pelėse ir pastebėjome ryškius sergamumo ir mirštamumo skirtumus po užsikrėtimo mažo patogeniškumo H3N2 gripo kamienu X31, pandemija H1N1. padermė Cal09 ir klasikinė H1N1 padermė PR8 (1a pav.). 129 pelėms pasireiškė ryškūs klinikiniai simptomai, įskaitant piloerekreciją, užmaskuotą laikyseną, sumažintą judėjimą ir sunkų kvėpavimą (1c pav.), Susijusius su ryškiu svorio metimu ir galiausiai pasiekus klinikinį humaniškos eutanazijos tašką, kurį nustatėme atlikdami nepriklausomus eksperimentus, kurie koreliuoja su šeimininko mirtingumu. Svarbu tai, kad, gavus viruso dozes, skirtas 129 pelėms sukelti, visos B6 pelės išgyveno ir prarado vos ne iki svorio. Šis skirtumas buvo pastebėtas per kelis viruso X31, PR8 ir Cal09 virusų pasėjimo žurnalus. Nepriklausomi kiaušinių ir MDCK gauti preparatai iš X31 viruso davė panašius rezultatus, o skirtumai tarp pelių padermių buvo stebimi tiek vyrams, tiek moterims.

Image

a ) 129S7 (užpildyti trikampiai) arba B6 (atviri apskritimai) pelės buvo užkrėstos nurodytomis gripo viruso padermėmis: X31 (800 TCID 50 ), Cal09 (1 000 TCID 50 ) arba PR8 (5 TCID 50 ), svorio kritimas ir mirtingumas įrašytas. ( b - d ) 129S7 ir B6 pelės buvo užkrėstos X31 (800 TCID50). ( b ) IFN lygis BAL skystyje buvo išmatuotas ELISA metodu, ir c ) pelėms buvo nustatyti klinikiniai simptomai (kaip aprašyta metoduose). ( d, e ) Viruso buvimas užkrėstuose plaučiuose buvo išmatuotas ( d ) qPCR būdu iš X31 matricos geno RNR iš visų plaučių arba ( e ) titruojant. Grafikai rodo vidurkį ± sem ir atspindi 2–5 nepriklausomus eksperimentus, kai n = 3 ELISA duomenims, n = 4 qPCR ir viruso titravimui ir n ≥ 6 svorio kritimui ir mirštamumui. *** P <0, 0001, ** P <0, 001, * P <0, 01 atliekant dvipusį ANOVA su Bonferroni post-bandymais (svorio metimas ir ELISA), kur simboliai grafikų dešinėje rodo visos kreivės, kaip išbandyta, statistinę reikšmę. naudojant dvipusį ANOVA ir minėtos konkrečios dienos rodo reikšmingumą, nustatytą atliekant post-testą, Log-rank (Mantel-Cox) testą (išgyvenimas) arba Mann – Whitney testą (viruso kiekybinis nustatymas).

Visas dydis

Iš kitų tirtų 129 substratų buvo įtrauktos 129 X1, S2, S5, S6 ir S8 padermės ir pelės, išaugintos vietoje skirtinguose gyvūnų vienetuose, ir pelės, importuotos iš komercinių selekcininkų. Visi 129 substratai, kuriuos mes išbandėme, parodė daug didesnį jautrumą nei B6 pelės (papildomas 1 pav.). Tarp įvertintų imunologinių parametrų mes nustatėme, kad gripo sukeliami antivirusinių citokinų IFNα, -β ir -λ lygiai bronchų alveolinio plovimo (BAL) skysčiuose buvo žymiai didesni jautriems 129 pacientams nei atsparių B6 pelių daugeliu atvejų po infekcijos. išbandytos gripo padermės (1b pav., papildomas 2a pav.). Panašūs rezultatai buvo gauti iš plaučių homogenatų.

Be to, mes ištyrėme daugybę nepriklausomų pelių padermių ir nustatėme, kad BALB / c pelės stebėjo atsparių B6 pelių ligos eigą ir turėjo palyginti žemą IFN lygį (papildomas 3a, b pav.), Tuo tarpu CBA / J ir DBA / 2 pelės didelis jautrumas gripui, primenantis 129 padermes, taip pat pasižymėjęs ilgalaikiu, aukštu IFNα, -β ir -λ lygiu visoje infekcijoje (papildomas 3c – f pav.). Be to, (B6 × 129) F1 pelėms buvo nustatytas vidutinis IFN lygis ir jautrumas gripui (papildomas 3g pav., H). Apibendrinant galima teigti, kad IFNαβ lygis tiesiogiai koreliuoja, o ne atvirkščiai, su gripo sukeltu sergamumu ir mirtingumu plačiame pelių genetiniame fone ir viruso padermėse.

IFNαβ gamybos skirtumai po užsikrėtimo gali būti būdingi šeimininkui arba atsirasti dėl greitesnio viruso dauginimosi ankstyvoje infekcijos vietoje, o tai lemia stipresnį stimulą gaminti IFN. Norėdami tai išspręsti, išmatuojome virusą, esantį pelių plaučiuose, atlikdami qRT – PGR, kad nustatytume gripo matricos RNR nuo 1 iki 48 h po užkrėtimo (1d pav.), Ir atlikdami viruso titravimą viso plaučio homogenate (1e pav., Papildomas 1 pav.) 2b). 129 ir B6 pelių virusų titrai buvo palyginami per 1 h ir 3 dienas po užsikrėtimo, tuo laikotarpiu, kai IFNα produkcijos skirtumai jau buvo nustatyti. Todėl darome išvadą, kad čia pavaizduoti šeimininko IFN lygio skirtumai nėra aukštesnio viruso titro ankstyvoje infekcijoje pasekmė.

Įgimtas imunitetas tarpininkauja tam tikram štamo jautrumui

Norėdami suprasti, ar pastebėti šeimininko jautrumo skirtumai atsiranda dėl įgimto ar adaptacinio imuniteto, palyginome Rag deficito turinčias 129 ir B6 peles, kurių trūksta tiek B, tiek T ląstelėms. Nors visos Rag - / - pelės galiausiai pasiduoda gripo infekcijai, 2a paveikslas parodo, kad užkrėstos Rag - / - (129) pelės, kaip ir jų laukinio tipo (wt) kolegos, prarado svorį ir pasiekė klinikinį galutinį tašką greičiau nei Rag / - (B6) pelėms ir jų BAL buvo didesnės IFNα, -β ir -λ koncentracijos (2c pav.). Viruso kiekybinis įvertinimas praėjus 9 dienoms po užkrėtimo (dpi), kai Rag - / - (129) pelės buvo klinikiniame galutiniame taške, tačiau visos Rag - / - (B6) pelės vis dar buvo gyvos, viruso kiekio plaučiuose skirtumų nenustatyta (pav.) 2b). Darome išvadą, kad padidėjęs 129 pelių jautrumas gripui greičiausiai atsiranda dėl įgimto imuninio atsako, nesusijęs su viruso kontrole ir yra susijęs su nuolat aukštu antivirusinių citokinų IFNα, -β ir -λ kiekiu.

Image

( a - c ) Rag deficito turinčios 129 (užpildyti trikampiai) arba B6 (atviri apskritimai) pelės buvo užkrėstos intranazaliai 800 TCID50 X31, ir ( a ) užfiksuotas svorio kritimas ir sergamumas. ( b ) Viruso RNR, esanti plaučiuose 9 dieną, buvo nustatyta viso plaučio RT – PCR metodu, ir ( c ) IFN baltymas buvo nustatytas ELISA metodu BAL skystyje. Grafikai rodo vidurkį ± sem ir yra reprezentatyvūs dviem nepriklausomiems eksperimentams, kai n = 5–6, norint numesti svorio ir išgyventi, ir n = 3–5, naudojant ELISA ir qPCR. *** P <0, 0001, ** P <0, 001, * P <0, 01 atliekant dvipusį ANOVA, naudojant Bonferroni post testus (svorio metimas ir ELISA) arba Log-rank (Mantel-Cox) testą (išgyvenimas) arba Mann – Whitney testą. (viruso kiekybinis įvertinimas). Grafikų dešinėje esantys simboliai rodo visos kreivės statistinę reikšmę, patikrintą dvipusio ANOVA.

Visas dydis

IFNαβ tarpininkauja gripo sukeltam sergamumui

Padidėjęs IFN kiekis jautresnėje pelių padermėje leido mums tiesiogiai ištirti IFNα ir β signalo poveikį 129 fone. Kadangi visi IFNα ir β tipai signalizuoja tik per IFNαβR 11, mes palyginome 129 pelių, kurių organizme trūksta šio receptoriaus, ir jų atitinkamų wt kontrolę. Genetiškai pašalinus IFNαβ signalus 129 pelėms, padidėja atsparumas infekcijai dėl mažo patogeniškumo H3N2 padermės X31 ir pandeminio H1N1 gripo padermės Cal09 (3a pav.). Sergamumo skirtumai atsispindėjo plaučių audinio pažeidime, kai 129 pelių plaučiai 8-ą dieną po užkrėtimo rodo didelį ląstelių įsiskverbimą, sukeliantį didžiulį alveolių oro erdvės obstrukciją. IFNαβR - / - (129) pelėse infiltratas į plaučius yra sumažinamas ir apribotas peribronchialinėmis ir perivaskulinėmis sritimis, o alveolinė struktūra yra geriau išsaugota, palyginti su tėvų paderme (3b pav.). Remiantis jautrumo duomenimis, 129 pelėms, palyginti su IFNαβR - / - (129) pelėmis, uždelstas viruso klirensas (3c pav.); tačiau tai nebuvo statistiškai reikšminga. Antikūnų titrai esant 9 dpi taip pat rodo nedidelius, bet ne reikšmingus skirtumus, matuojant mikroneutralizacijos tyrimu (papildomas 4a pav.), Patvirtinančiais anksčiau paskelbtus rezultatus 15 apie IFN vaidmenį antikūnų gamyboje.

Image

( a - c ) 129 (atviri trikampiai) arba IFNαβR - / - (užpildyti trikampiai) pelės buvo užkrėstos X31, 800 TCID50 arba Cal09, 330 TCID50. a ) Buvo išmatuotas svorio kritimas ir mirtingumas. b ) hematoksilinu ir eozinu dažytos plaučių dalys (skalė 50 μm) iš plaučių, paimtos 0 ir 8 dienomis po užkrėtimo. Rodyklės rodo leukocitų infiltratą, o rodyklių galvutės rodo nepažeistą alveolių struktūrą. c ) Virusų titrai plaučių homogenatuose, paimti nurodytais laiko momentais, buvo išmatuoti nustatant TCID50 MDCK ląstelėse. ( d ) B6 pelės buvo užkrėstos X31 (8000 TCID 50 30 μl) arba apdorotos nešiklio kontrole ant D0, vėliau apdorotos žinduolių IFNα4 (3, 5 × 10 4 TV / 200 μl ip) arba tirpiklio kontrolė kas 24 valandas nuo nuo d1 iki d6. Laikui bėgant buvo užfiksuota svorio kritimas ir sergamumas. Grafikai rodo vidurkį ± sem ir atspindi 2–4 nepriklausomus eksperimentus, kai n = 5–6, norint numesti svorio ir išgyventi, o n = 4, titruoti virusą. X31 + IFNα4: X31 + Transporto priemonės valdymas *, X31 + IFNα4: Transporto priemonės valdymas + IFNα4 . *** arba ○ ○ ○ P <0, 0001, ** arba ○ ○ P <0, 001, * arba P <0, 01 atliekant dvipusį ANOVA su Bonferroni posttestais (svorio metimas) arba Mann – Whitney testas (viruso kiekybinis nustatymas) arba Log-rank (Mantel – Cox) testas (išgyvenimas). Grafikų dešinėje esantys simboliai rodo visos kreivės statistinę reikšmę, patikrintą dvipusio ANOVA.

Visas dydis

IFNαβ nėra būtinas antivirusinių genų indukcijai epitelyje

Kadangi IFNαβ gali sukelti antivirusines programas, galima teigti, kad praradus IFNαβ signalizaciją, turėtų sumažėti antivirusinių genų indukcija ir dėl to palengvėtų virusų dauginimasis užkrėstuose audiniuose. Tačiau antivirusinę funkciją turintys interferono stimuliuojami genai (ISG) buvo panašiai sureguliuojami užsikrėtus X31 viruso kamienu pirminėse kvėpavimo takų epiteliuose iš 129 pelių ir IFNαβR - / - (129) pelių (4a pav.), Atitinkančiais siūlomą IFNαβ perteklių. ir IFNλ epitelio ląstelėse 29, 30 . Priešingai, STAT1 - / - (129) epiteliai negalėjo sureguliuoti ISG dėl gripo infekcijos (4a pav.).

Image

( a, b ) STAT1 - / - (129), IFNαβR - / - (129) ir 129 epitelio ląstelių kultūros buvo užkrėstos X31, esant MOI 1. 24 val. po užkrėtimo atnaujinamas ( a ) Oasl2, STAT2, IRF9, IFi203, ( b ) IL-28 (IFNλ) mRNR ir X31 replikacija buvo įvertinta RT – PGR. c ) STAT1 - / - (129) (perbraukti apskritimai), IFNαβR - / - (129) (užpildyti trikampiai) ir 129 pelės (atviri trikampiai) buvo užkrėsti 800 TCID50 (viršutinės plokštės) arba 80 TCID 50 (apatinės). plokštės) iš X31. Svorio kritimas ir išgyvenimas buvo užregistruoti per visą infekciją. Grafikai rodo vidurkį ± sem ir yra reprezentatyvūs dviem nepriklausomiems eksperimentams, kai n = 5 qPCR ir n = 6 svorio netekimui ir išgyvenimui. 129: STAT1 - / - (129) * ir IFNαβR - / - (129): STAT1 - / - (129) , kur **** arba P <0, 00001, ** arba P <0, 001, * P <0, 01 pagal dvipusį ANOVA (svorio netekimas), Log-rank (Mantel-Cox) testą (išgyvenimas) arba Mann – Whitney testą (RT – PCR kiekybinis įvertinimas). Grafikų dešinėje esantys simboliai rodo visos kreivės statistinę reikšmę, patikrintą dvipusio ANOVA.

Visas dydis

Atsižvelgiant į ISG indukciją, praėjus 24 val. Po užsikrėtimo, viruso titrai IFNαβR - / - (129) epitelyje buvo panašūs kaip ir wt epitelijoje ir reikšmingai padidėjo STAT1 - / - epitelijoje (4b pav.). Kaip ir tikėtasi, visų genotipų epiteliai parodė gripo sukeltą genų, tokių kaip IFNλ (IL28, 4b pav.), Kurie yra prieš IFN tarpininkaujamo STAT1 indukcijos, padidėjimą. Panašūs rezultatai buvo gauti naudojant PR8 (papildomas 5a – c pav.).

Iš šių duomenų darome išvadą, kad antivirusinė programa, nustatoma pagal ISG indukciją, yra nepažeista IFNαβR - / - (129) plaučių epitelijoje, tuo tarpu STAT1 - / - epitelyje ISG nėra indukuojama ir sutrinka viruso kontrolė. Todėl STAT1 - / - pelių nesugebėjimas sureguliuoti ISG, turinčių antivirusinę funkciją, gali prisidėti prie didelio STAT1 - / - (129) pelių jautrumo gripo infekcijai (4c pav.). Priešingai, kadangi vien tik IFNαβ signalizacija daro nedidelį poveikį viruso kontrolei epitelyje, žalingas IFNαβ poveikis yra tikėtinas dėl jo imunomoduliacinės funkcijos.

Norėdami suprasti, ar dėl intervencijų, skirtų padidinti IFNαβ lygį, atsparios pelės taps jautresnės, mes užkrėtėme B6 pelėmis ir gydydavome jas egzogeninėmis IFNα4. Šioms pelėms padidėjo sergamumas, palyginti su užkrėstomis B6 pelėmis, kurios nebuvo gydomos IFNα (3d pav.). Taigi, pašalinus IFNαβ signalizaciją gripo infekcijos metu, 129 pelės palengvina ligą, o egzogeninis IFNα skyrimas B6 pelėms padidina ligą, o ne padeda kontroliuoti viruso plitimą. Šie duomenys kartu rodo, kad didelės dozės IFNαβ dozės prisideda prie gripo patologijos, tuo tarpu antivirusinių ISG indukcija nedaro įtakos, jei viruso replikacijos vietoje nėra IFNαβ signalų.

IFNαβ tarpininkauja gripo sukeltam uždegimui

Norėdami geriau suprasti imunopatologinį aukšto lygio IFNαβ poveikį, mes ištyrėme uždegiminius citokinus ir imunines ląsteles infekuotuose 129 masės ir IFNαβR - / - plaučiuose. Įdomu tai, kad IFNαβ ir IFNλ lygiai IFNαβR - / - (129) BAL buvo mažesni nei 129 BAL masėje ir palyginami su lygiais, kurie randami atspariame W6 B6 (5a pav.). Tai rodo, kad norint išlaikyti aukštą tiek IFNαβ, tiek IFNλ lygį, kurį stebime 129 fone, reikalingas IFNαβ signalas. Nepaisant to, šių IFN lygių pakanka pasirinktų ISG indukcijai in vivo . Kaip parodyta 5b pav., Užkrėstų IFNαβR - / - (129) plaučių aptiktas ISG reguliavimas tiksliai atspindi IFNαβR - / - (129) epitelio sugebėjimą iš naujo sureguliuoti ISG, reaguojant į gripą in vitro (4a pav. Ir papildomas 5 pav.) 5a).

Image

( a - c ) 129S7 (atviri trikampiai), IFNαβR - / - (129) (užpildyti trikampiai) arba B6 (atviri apskritimai) pelės buvo užkrėstos X31 800 TCID50. a ) IFN lygis BAL skysčiuose buvo išmatuotas ELISA metodu ir c ) nurodytos priešuždegiminės citokinų koncentracijos buvo išmatuotos naudojant Multiplex. b ) Šilumos žemėlapis, parodantis pasirinktus reikšmingai reguliuojamus antivirusinius atsako genus. Bendra RNR iš juokingų ir X31 infekuotų plaučių buvo ištirta naudojant Affymetrix Mouse Genome 430 2.0 mikrotraumus 5 dienas po užsikrėtimo. Prižiūrima analizė buvo atlikta naudojant statistinį filtravimą (≥ keturis kartus pokytis, palyginti su modeliu užkrėstu C57BL / 6; 2 krypčių ANOVA, P <0, 01, Benjamini-Hochberg kelių bandymų pataisa). Grafikai rodo vidurkį ± sem ir atspindi du nepriklausomus eksperimentus, kur n = 3–4. 129: IFNαβR - / - (129) * ir 129: B6 , kur *** arba P <0, 0001, ** arba P <0, 001, * P <0, 01 dvipusio ANOVA ir „Bonferroni“ post testai. . Grafikų dešinėje esantys simboliai rodo visos kreivės statistinę reikšmę, patikrintą dvipusio ANOVA.

Visas dydis

Be antivirusinių funkcijų, IFN turi stiprų imunomoduliacinį poveikį, įskaitant chemokinų ir citokinų indukciją bei plataus spektro imuninių ląstelių aktyvavimą. Todėl mes išanalizavome citokinų ir chemokinų koncentracijas infekuotų B6, 129 ir IFNαβR - / - (129) pelių BAL skystyje ir nustatėme, kad masiškai padidėjo chemoterapinių medžiagų MCP-1, Mip-1β, IP-10, IL-6 kiekiai, Eotaksinas ir kiti nuo 4 iki 6 dienų 129 pelėms, palyginti su B6 pelėmis. Įdomu tai, kad IFNαβR - / - (129) pelės neparodė uždegimo sukeliančių citokinų padidėjimo, kaip matyti iš tėvų padermės, tačiau labiau primena atsparias B6 peles (5c pav.), Parodydamos, kad priešuždegiminiam citokinui reikalingas IFNαβ signalas. aplinka rasta 129 pelėms. Kartu su didžiuliu priešuždegiminių citokinų reguliavimu, 129 pelėse taip pat pastebime padidėjusį IL-10 kiekį, o tai gali prisidėti prie ligos sunkumo mažindami specifines efektoriaus funkcijas, net jei 129 pelėms viruso kontrolė nėra slopinama (3c pav.) ).

NK ląstelės, uždegiminiai monocitai ir CD8 T ląstelės yra tarp IFN taikinių ląstelėse, o chemoattraktantų, kurių padaugėjo 129 pelėse. Ląstelinio infiltrato į užkrėstus B6, 129 ir IFNαβR - / - (129) plaučius FACS analizė parodė, kad visais tirtais laiko momentais IFNαβR - / - (129) pelėms yra mažesnis uždegiminių monocitų ir NK ląstelių dažnis bei skaičius nei 129 pelėms. (6a pav.). Be to, šių uždegiminių ląstelių skaičius buvo panašus tarp atsparių IFNαβR - / - (129) ir B6 padermių plaučių. Atvirkščiai, bendro ir gripui būdingų CD8 T ląstelių dažnis ir skaičius, išmatuotas naudojant NP 366–374 H- 2Db tetramero dažymą, nepasikeitė tarp 129, IFNαβR - / - (129) ir B6 pelių (papildomas 4b pav. ). Tai dar labiau iliustruoja, kad nuo IFN priklausomi įgimti imuniniai atsakai yra susiję su padidėjusiu jautrumu, stebimu 129 pelėmis, ir IFNαβ nukreipia prieš stiprų priešuždegiminių citokinų indukciją ir uždegiminių ląstelių pritraukimą.

Image

( a ) 129S7 (atviri trikampiai), IFNαβR - / - (129) (užpildyti trikampiai) arba B6 (atviri apskritimai) pelės buvo užkrėstos X31 ir atliktas pDC, NK ląstelių ir plaučių uždegiminių monocitų srauto citometrinis įvertinimas. 129S7: IFNαβR - / - (129) *, 129S7: B6 . ( b - e ) 129S7 pelės buvo gydomos ardančio mAb αPDCA-1 arba izotipo kontrole, kaip nurodyta, b ) buvo išmatuotas svorio kritimas ir mirtingumas, c ) IFNα baltymas BAL skystyje buvo išmatuotas ELISA metodu, d ) viruso titras Buvo nustatytas BAL skystis ir ( e ) ląstelių įsiskverbimas buvo įvertintas kaip a . ( f ) 129S7 pelės buvo gydomos ardančiais mAb RB6-8C5 (užpildyti trikampiai), 1A8 (atviri deimantai) arba kontroliuojant izotipu (atviri trikampiai), po to užkrėstos X31. ( g ) 129S7 pelės buvo gydomos αAsialo GM1 (užpildyti trikampiai) arba nešiklio kontrole (atviri trikampiai), po to užkrėstos X31. ( f, g ) Buvo užfiksuotas mirtingumas ir svorio kritimas. ( h ) BM gauti pDC iš 129 (atviros kolonėlės), IFNαβR - / - (129) (patikrintos kolonėlės) ir B6 (užpildytos kolonėlės) pelių buvo stimuliuoti in vitro naudojant X31. Po 24 val. Supernatantai buvo surinkti ir IFNα, β ir λ koncentracijos išmatuotos ELISA metodu. Grafikai rodo vidurkį ± sem ir yra reprezentatyvūs 2–3 nepriklausomiems eksperimentams, kai n = 2–4 ląstelių įsisavinimui, viruso titravimui ir ELISA metodui, n = 5–6 svorio netekimui ir išgyvenimui, išskyrus b, kai duomenys kaupiami iš dviejų eksperimentų ( n = 12). *** arba P <0, 0001, ** arba P <0, 001, * P <0, 01 pagal dvipusį ANOVA su Bonferroni posttestais (ląstelių skaičius, svorio praradimas ir ELISA laiko kursas), log-rank (Mantel) -Cox) Testas (išgyvenimas) arba Mann-Whitney testas (pDC supernatantai). Grafikų dešinėje esantys simboliai rodo visos kreivės statistinę reikšmę, patikrintą dvipusio ANOVA.

Visas dydis

Gausūs hiperreaktyvūs 129 pDC sukelia IFNαβ perteklių

Pagrindinis sisteminio IFNαβ šaltinis yra plazcitoidinės dendritinės ląstelės (pDC) 31, kurių, kaip įrodyta, gausu naiviose 129 pelėse, palyginti su kitomis pelių padermėmis 32 . Visais tirtais pelės plaučių pDC dažniais ir skaičiumi 129 pelėse visais tikrinimo laikotarpiais po infekcijos, palyginti su IFNαβR - / - (129) ir B6 pelėmis (6a pav.). Svarbu tai, kad efektyvus PDCA-1 + ląstelių, įskaitant visą pDC populiaciją, sunaikinimas (6e pav. Ir papildomas 6 pav.) 129 pelėms lėmė mažesnį IFNα kiekį, tendenciją mažesnį IFNβ kiekį ir žymiai sumažino svorio praradimą bei sergamumą, nepaveikdamas. viruso klirensas (6b – e ir 7a pav.), parodantis, kad sergamumą sąlygojo IFNαβ, gautas iš pDC ar kitų ląstelių, padidinančių PDCA-1, infekcijos metu.

Image

( a, b ) 129S7 pelės buvo gydomos αPDCA-1 (užpildyti trikampiai) arba izotipo kontrole (atviri trikampiai) ir užkrėstos X31. Citokinų koncentracijos BAL skysčiuose buvo išmatuotos ( a ) naudojant IFNβ ir λ ELISA metodu ir b ) naudojant Multiplex nurodytiems citokinams. Grafikai rodo vidurkį ± sem, kai n = 2–3 ir *** P <0, 0001, ** P <0, 001, * P <0, 01 pagal dvipusį ANOVA su Bonferroni po bandymų. Grafikų dešinėje esantys simboliai rodo visos kreivės statistinę reikšmę, patikrintą dvipusio ANOVA.

Visas dydis

Svarbu tai, kad anksčiau įvertintų priešuždegiminių citokinų koncentracijos taip pat reikšmingai sumažėjo PDCA-1 turinčių 129 pelių BAL skystyje, palyginti su kontrolinėmis pelėmis (7b pav.). Čia aptikti priešuždegiminiai citokinų lygiai yra panašūs į citokinų ir chemokinų kiekius, kurie randami IFNαβR - / - (129) pelėse, ir tai rodo, kad IFNαβ, gautas iš PDCA-1 + ląstelių, skatina šių uždegimo mediatorių gamybą. Priešingai, IFNλ lygis nepakito dėl PDCA-1 išeikvojimo (7a pav.), Kas rodo, kad kiti ląstelių tipai, galbūt plaučių epitelis, prisideda prie šio citokino gaminimo užkrėstame organizme.

Uždegiminių monocitų ir NK ląstelių (identifikuotų taip, kaip parodyta papildomame 6 pav.) Dažnis ir skaičius buvo sumažintas dėl PDCA-1 išeikvojimo (6e pav.), Kuris gali būti sąlygotas tiesioginio monocitų ir NK ląstelių išeikvojimo derinio, PDCA-1 infekcijai ir netiesioginiam sumažėjusio citokinų lygio poveikiui. Be to, mes gavome nepriklausomą pDC ir monocitų vaidmens patvirtinimą, kai sunaikinome mAb RB6-8C5, kuris būdingas antigenui Gr-1, kurį sudaro Ly6C, išreikštas pDC ir uždegiminiai monocitai, ir Ly6G, išreikštas neutrofilai. 129 pelių gydymas tokiu, su mAb turinčiu pDC, uždegiminiais monocitais ir neutrofilais, ir dėl to drastiškai sumažėjo su gripu susijęs sergamumas. Pagerėjęs 129 atsparumas neatsirado dėl neutrofilų išeikvojimo, nes neutrofilams specifinis mAb 1A8 nepakeitė ligos eigos (6f pav.). Gydymas anti-Asialo GM1, siekiant sunaikinti NK ląsteles gripo infekcijos metu, taip pat neapsaugojo 129 pelių nuo sunkios ligos (6g pav.), Tai rodo, kad vien NK ląstelės neparduoda ligos sunkumo 129 gripo infekuotomis pelėmis.

Iš 129 pelių gaunami BM gauti Flt3-pDC sukelia daugiau IFNαβ ir IFNλ nei B6 pDC, kai buvo paveikti gyvo gripo viruso in vitro (6h pav.), Patvirtindami panašius stebėjimus, atliktus su blužniniais pDC, kurie buvo gydomi paraformaldehido inaktyvuotu virusu 32 . Šie duomenys kartu rodo, kad 129 pelėms būdingas didesnis IFNαβ atsakas dėl bendro pDC pagrindinėje linijoje poveikio, didesnio infekcijos įplaukimo į plaučius ir didesnio įdarbintų pDC, o galimai ir kitų PDCA - reagavimo į ląstelę. 1+ ląstelių.

Nuo TRNαβ priklausoma TRAIL ir jos ligando DR5 ekspresija

Buvo pasiūlyta, kad esant sunkiam gripui, TRAIL makrofagų sąveika su epitelio ląstelėse esančiu TRAIL receptoriumi DR5 sukelia pastarųjų ląstelių populiacijos apoptozę 33 . Todėl mes įvertinome abiejų molekulių lygius IFNαβR - / - (129) ir 129 svorio pelėse ir nustatėme padidėjusią TRAIL raišką ant uždegiminių monocitų ir DR5 ant epitelio ląstelių užkrėtimą 129 masės pelėse, palyginti su pelėmis, kurių IFNαβ signalizacija buvo nepakankama (2 pav. 8a, b). Svarbu tai, kad DR5 ekspresija tiesiogiai koreliavo su ląstelių apoptozės dažymu wt, bet ne IFNαβR - / - plaučių epitelio ląstelėse (8b pav.). TUNEL dažymas ant histologinių pjūvių iš užkrėstų 129 ir IFNαβR - / - plaučių taip pat patvirtino didesnį epitelinių ląstelių apoptozės dažnį pelėms, sergančioms wt (8c pav.).

Image

( a, b ) 129S7 (atviri trikampiai) arba IFNαβR - / - (129) (užpildyti trikampiai) pelės buvo užkrėstos intranazaliai X31, o plaučių suspensijos buvo paruoštos nurodytais laiko momentais po užkrėtimo. Tam tikrais laiko momentais buvo atlikta srauto citometrinė analizė, siekiant įvertinti ( a ) TRAIL raišką uždegiminiuose monocituose (kurie buvo surakinti, kaip parodyta papildomame 6 pav.). Histogramos rodo TRAIL išraišką d6. b ) DR5 ekspresijos epitelio ląstelėse (E kadherinas +, CD45−) srauto citometrinė analizė per tam tikrą laiką. 7 apimties epitelio ląstelės buvo įvertintos kaip laisvas aminų dažymas kaip apoptozės matas. Taškiniai brėžiniai parodo koreliaciją tarp laisvojo amino ir DR5 dėmės ant D7. c ) Kontrolinių ir užkrėstų pelių, nurodytų genotipų, plaučių pjūviai buvo apkrėsti TUNEL apoptozinėms ląstelėms. Raudonos rodyklės galvutės rodo TUNEL signalą. Svarstyklės, 100 μm. ( d, e ) 129S7 pelės buvo gydomos TRAIL blokuojančiu mAb αCD253 (150 μg per 200 μl ip) arba naudojant izotipo kontrolę, kaip nurodyta, mirtingumas ir sergamumas užfiksuotas visos infekcijos metu ir ( e ) 7 dpi epitelio ląstelės buvo įvertintos DR5 raiška ir apoptozė. f ) Buvo sugeneruotos BM chimeros: 129S7> 129S7 (masė> wt, atviros juostos), IFNaβR - / - (129)> 129S7 (KO> wt, pilkos juostos), 129S7> IFNaβR - / - (129) (wt> KO, grey checked bars) and IFNaβR−/−(129)>IFNaβR−/−(129) (KO>KO, checked bars) and infected with X31, and expression of DR5 on epithelial cells and epithelial cell apoptosis was assessed at 7 dpi Graphs show mean±sem and are representative of 2–3 independent experiments where n =3 for FACS data and n =6 for weight loss and survival. *** P <0.0001, ** P <0.001, * P wt:KO>KO, +stands for KO>KO:wt>KO and represents KO>KO:KO>wt. The symbols on the right of graphs indicate statistical significance of the whole curve, as tested by two-way ANOVA.

Visas dydis

To confirm that TRAIL and DR5 expressions require type I IFN and are not a function of disease burden, we also assessed expressions of TRAIL and DR5 on STAT1−/− inflammatory monocytes and epithelial cells. In spite of STAT1−/−(129) mice having a higher disease burden than their wt controls (Fig. 4c), STAT1−/− inflammatory monocytes and epithelial cells did not upregulate TRAIL or DR5 on their surface (Supplementary Fig. 7a). Furthermore, the low IFN-responding, resistant mouse strains B6 and BALB/c did upregulate TRAIL on monocytes and DR5 on epithelia, albeit not to the extent of the 129 strain (Supplementary Fig. 8a, b). Taken together, these data demonstrate that both TRAIL and DR5 expressions depend on type I IFN signalling and are not a result of severe disease burden.

Since TRAIL upregulation on CD8+ T cells, NK cells and pDCs has also been described 34, 35, we tested whether IFNαβ signalling is required for TRAIL expression on these cells. We find no difference in TRAIL levels on IFNαβR−/−(129) versus wt 129 CD8+ T cells, NK cells and pDCs, indicating that here type I IFNs are not required for TRAIL expression on these cells (Supplementary Fig. 9). In addition, the human apoptosis-inducing TRAIL receptors DR4 and DR5 are upregulated by influenza infection on the human alveolar epithelial cell line A549, demonstrating that this process is also observed in human cells (Supplementary Fig. 7b).

To test whether TRAIL/DR5 interaction contributes to epithelial cell apoptosis and morbidity of 129 mice, we blocked TRAIL using a blocking mAb in 129 mice and found that weight loss and morbidity were significantly reduced in mAb-treated mice (Fig. 8d). Consistent with this increased resistance to influenza-induced disease, anti-TRAIL-treated 129 mice had a significantly lower frequency of apoptotic airway epithelial cells at 7 dpi However, anti-TRAIL treatment did not affect DR5 expression on epithelial cells (Fig. 8e). These results indicate that IFNαβ causes induction of TRAIL on monocytes recruited into the lung and of DR5 on lung epithelia, and that the interaction of these molecules leads to epithelial cell apoptosis. Blockage of this interaction protects from the severe disease observed in influenza-infected 129 mice.

To assess whether type I IFN signalling was required in epithelial cells for DR5 upregulation and for increased host morbidity, we generated bone marrow chimeras containing either IFNαβR-deficient stroma cells (wt>KO, KO>KO) or wt stroma cells (wt>wt, KO>wt). In these chimeras, epithelia insensitive to type I IFN signalling (wt>KO, KO>KO) did not upregulate DR5 expression in response to X31 infection. Conversely, chimeras generated in 129S7 hosts, where epithelial cells could sense IFNαβ signalling (wt>wt and KO>wt), showed an infection-induced increase in epithelial DR5 expression, and this correlated with increased epithelial apoptosis (Fig. 8f). Collectively, these data indicate that type I IFN signalling is required in epithelia for DR5 upregulation, leading to increased epithelial apoptosis.

Infection of the four types of chimeras with X31 revealed that susceptibility to influenza mediated pathology correlated with the ability of stromal cells such as epithelia to respond to type I IFN signalling (Supplementary Fig. 10a). To assess the type I IFN signal that induces DR5 expression on epithelial cells, we first measured levels of IFNα, -β and -λ in BAL fluid throughout X31 infection. wt>wt and KO>KO chimeras closely match the intact mice of the same genotype, while the wt>KO and KO>wt chimeras have intermediate levels of type I IFNs (Supplementary Fig. 10b). In the KO>wt chimeras, it is therefore unclear which cells are the source of IFNαβ and of the TRAIL-mediated signal required for epithelial apoptosis. To analyse these BM chimeras more in depth, we generated them using congenic wt 129.CD45.1 mice, to allow us to trace the origin of immune cells in the infected lung. In KO>CD45.1 wt chimeras, we find a residual population of CD45.1+ wt monocytes of host origin, and direct comparison between wt and IFNαβR−/− monocytes in these chimeras show that TRAIL levels are higher on the wt than on the KO cells, confirming that TRAIL upregulation on monocytes requires an IFNαβ signal (Supplementary Fig. 10d).

To understand whether the residual wt monocyte subset found in KO>wt chimera could also contribute to IFN production, we compared in vitro 129 and IFNAR−/−(129) BM-derived macrophages (BMDMs) in their ability to produce IFN in response to influenza exposure. We find that, like pDCs, 129 BMDMs produce more IFN than IFNAR−/−(129) BMDMs (Supplementary Fig. 10c), suggesting that KO>wt chimeras show intermediate IFN levels thanks to IFN production by residual wt host immune cells including monocytes. In conclusion, radioresistant host monocytes are the source both of IFNαβ and of TRAIL in KO>wt chimeras.

Similar mechanisms of severe disease in DBA/1 and 129 mice

The correlation between high IFN levels and severe disease on influenza infection was found across a range of mouse strains (Fig. 1, Supplementary Figs 2 and 3). To test further whether the same underlying immune mechanisms lead to severe disease, we tested DBA/1 mice, which are described to be highly susceptible to influenza 36 . Similar to 129 mice, influenza-infected DBA/1 show high morbidity, high IFN type I and type III levels and high frequencies of lung pDCs, NK cells and inflammatory monocytes. In addition, TRAIL and DR5 levels are high on monocytes and epithelial cells, respectively, and epithelial apoptosis is increased compared with resistant B6 mice (Supplementary Fig. 11a–c). Importantly, reducing inflammation by administration of a mAb directed against Gr-1, which depletes pDCs and monocytes and improves disease in 129 mice (Fig. 6f), also rescues DBA/1 mice from severe disease (Supplementary Fig. 11d). Similarly, blocking TRAIL rescues DBA/1 mice (Supplementary Fig. 11e) as it does with 129 mice (Fig. 8d). We conclude that the IFNαβ-driven inflammation leading to severe disease is a general phenomenon in action across a wide range of mouse models of influenza.

Diskusija

Here, we demonstrate that host-intrinsic differences can determine the outcome of influenza infection and that IFNαβ is a host-specific determinant with a dose-dependent detrimental potential. More susceptible mouse strains produce markedly higher levels of IFNαβ in response to influenza infection than resistant strains. Detailed comparison of susceptible 129 with resistant B6 mice allows us to delineate a disease pathway leading from high numbers of hyper-reactive pDCs producing excessive IFNαβ amounts sustained over time, which in turn causes uncontrolled inflammation and lung epithelial damage mediated by TRAIL–DR5 interaction.

Here we identify IFNαβ as a host factor that directly mediates inflammation, morbidity and mortality in an acute viral infection. Our findings are, however, reminiscent of infection by HIV or SIV. Higher and more sustained IFN responses are detected in pathogenic SIV infection in rhesus macaques, while natural hosts without disease progression show lower IFN levels 37, 38 . Similar data were found in humans when rapid progressors were compared with viremic nonprogressors 39 . Interestingly, the expression of IFNα in pDCs and of TRAIL and DR5 in tonsil tissue was found to be higher in HIV progressors compared with long-term nonprogressors 40 . Furthermore, IFNαβ has recently been demonstrated to contribute to the establishment and maintenance of chronic lymphocytic choriomeningitis virus infection in mice, where an elevated type I IFN response correlated to increased expression of immunosuppressive genes leading to an impaired adaptive immune response 41, 42 . In contrast, we show here that in acute influenza infection, IFNαβ contributes to morbidity and mortality through excessive innate immune responses leading to tissue damage.

Modern histopathological analysis of autopsy samples from human H1N1 1918 influenza infection revealed massive lung damage involving significant destruction of the respiratory epithelium in severe influenza 43 . Here we demonstrate that IFNαβ-mediated DR5 upregulation on lung epithelial cells resulted in epithelial cell apoptosis and therefore host morbidity. IFNαβR deficiency in 129 epithelia or blockade of TRAIL/DR5 interaction protected mice against destruction of respiratory epithelium. By identifying TRAIL and DR5 interaction as a downstream mediator of IFNαβ-dependent morbidity and mortality in influenza infection, we provide a molecular mechanism that links high IFNαβ levels to epithelial cell death and therefore high susceptibility. Our data are in agreement with previous studies showing an involvement of TRAIL in severe forms of influenza 33 and report on the IFN dependence of TRAIL upregulation on monocytes 44 . Our data demonstrate in vivo that IFNαβ signalling is specifically required in epithelial cells for DR5 upregulation, which leads to epithelial apoptosis and eventually to host morbidity. HIV progression has also been linked to IFNαβ-dependent, TRAIL-mediated death of virus-infected CD4 T cells 28 . An alternative mechanism was described by van Grevenynghe et al. 45 who show TRAIL-mediated B-cell apoptosis in HIV infection due to disrupted IL-2 signalling. As similar observations were made in hepatitis C infection 46, a common theme appears to emerge that one pathway of immunopathology in virus infection may be excessive apoptosis induction in virus-infected cells downstream of high levels of IFNαβ and TRAIL.

IFNαβ has well-documented antiviral effects. Our finding that lack of IFNαβ signalling does not have deleterious consequences for virus control is most likely explained by the redundancy between IFNαβ and other cytokines including IFNλ 12 . Although devoid of type I IFN signalling, 129 IFNαβR−/− mice exhibit IFNλ concentrations that are comparable to resistant B6 mice during infection. The similar levels of IFNλ in both resistant genotypes may therefore be sufficient to keep influenza virus replication under control. In fact, the induction of ISGs with antiviral function was comparable in infected airway epithelia from IFNαβR−/− and parental 129 mice. In contrast, influenza infection did not induce ISGs in STAT1−/− epithelia, and STAT1−/−(129) mice were even more susceptible to influenza infection than 129 wt mice. These results are in agreement with previous studies using STAT1−/−(129) mice 13 . In conclusion, comparison between wt, IFNαβR−/− and STAT1−/− genotypes in a high IFN producer genetic background such as 129 allowed us to unmask the pathogenic potential of IFNαβ and its nonredundant role in causing excessive inflammation in response to influenza infection. In contrast, we show that IFNαβ is redundant for the induction of antiviral ISGs at the epithelial sites of influenza replication.

Results contrasting our own were obtained when IFNαβR−/−(129) mice were infected with the influenza strain WSN and were shown to be more susceptible than wt 129 mice 13 . However, the WSN strain shows an unusual neurotropism that might explain this apparent discrepancy: if infected neurons cannot rely on IFNλ as a back up system to induce an antiviral state, then IFNαβR deficiency may have a great impact on viral control in these cells, leading to increased susceptibility to WSN infection. Since influenza virus usually infects preferentially airway epithelia and IFNαβ is redundant for ISG induction at this site, blockade of IFNαβ signalling will change the outcome of disease through modulation of the nonredundant, immunostimulatory IFNαβ effects. While our data place IFNαβ upstream of the cytokine storm associated with severe disease in 129 mice, it will be interesting to determine the downstream cell type that is triggered by IFNαβ to produce these high levels of inflammatory cytokines. Candidates include immune cells and endothelial cells, both of which are potential cytokine sources in influenza infection 47 .

When infections with low- or high-pathogenicity viruses are used to compare mild with severe influenza, high production of proinflammatory cytokines is mostly associated with severity, and immune-mediated pathology is one of the suggested mechanisms 1, 48 . In contrast to those cytokines, IFNαβ induction correlates sometimes directly and sometimes inversely with the pathogenicity of the virus 49, 50, 51, 52 . These comparisons do not allow the distinction between virus-specific and host-specific factors contributing to disease severity. Back-crosses between influenza-susceptible and -resistant mouse strains show higher levels of proinflammatory cytokines in susceptible strains 53 . Here we demonstrate that in response to infection by the same amount of the same strain of influenza virus, and in the face of identical amounts of virus detected in the lung throughout the early phase of infection, IFN levels diverge early on in the response depending on the mouse strain background, showing that host-specific factors are important to determine the magnitude of the IFN response. One of these factors appears to be the steady-state and influenza-induced number of pDCs present in the host.

Genetic loci determining absolute numbers and frequencies of pDCs have been recently identified, confirming that the size of the pDC compartment is a genetic trait 54 . Previous studies have assessed the role of pDCs in influenza infection. Since most of these studies were performed in BALB/c or B6 backgrounds where low levels of IFNαβ appear to be protective, these studies did not find effects similar to the results presented here 55, 56 . In contrast, no studies had been performed so far in 129 mice known to contain high numbers of pDCs. Interestingly, one study on lethal influenza shows that pDCs contribute to mortality through Fas:FasL-mediated elimination of CD8 T cells 57 ; however, no involvement of IFNαβ was indicated in that report. Although a similar mechanism may contribute to mortality in 129 mice, we found increased mortality of 129 compared with B6 mice also on a Rag-deficient background, and we did not find differences between B6, 129 and IFNαβR−/−(129) mice in the numbers or activation phenotype of influenza-specific CD8 T cells as identified by MHC class I tetramer staining. This further indicates that another suggested mechanism linking TRAIL expression on CD8 T cells to the control of the CD8 response 35 is not the mechanism at work here. We find no differences in CD8 TRAIL expression between the different mouse genotypes under study here and strain differences in susceptibility are also found in Rag−/− mice devoid of CD8 T cells.

The protective potential of exogenous IFNα or β has been tested in animal models. In all those studies, animals were treated before infection, with the aim of inducing an antiviral state in cells before they were infected. This situation is different to high IFN induction during infection as reported here, where IFN is a consequence of viral infection and does not precede it. Even in infection models of a natural host for influenza, the ferret, pretreatment with IFNα had minor effects that often lasted only 1 day 58 . Another study demonstrated that oral application of high IFN doses to mice did not improve influenza-induced disease, while low dose regimens did 59, findings that are in line with our data. We also observe that IFNα treatment post infection leads to higher morbidity of B6 mice and renders their disease phenotype similar to that of susceptible 129 mice with endogenously high IFN responses. However, we believe that influenza-induced IFNαβ levels are not the only host difference between the resistant and susceptible strains assessed here, as the host background also determines what effect IFN can have. This was evident in studies where IFNα pretreatment of Mx1+/+ mice helped control a high-pathogenicity influenza strain, while pretreatment had no effect on Mx1−/− mice 60 .

Interferon induces a transcriptional response through autocrine, paracrine or systemic effects. Among the hundreds of proteins induced by interferon, an anti-influenza effect was shown for a subgroup including the Mx gene products, PKR, and the families of IFITM, IFIT and RNase L proteins 61 . IFITM3 was recently shown to be relevant to anti-influenza resistance not only in mice but also in humans, and they appear to function similarly in both species 3, suggesting that IFITM3 is an important viral restriction factor conserved through evolution. The Mx1 gene product in outbred mice has been shown to have strong antiviral effects on some influenza strains 62, while other strains, including the pandemic H1N1 strain used in this study, are resistant to Mx effects, as the presence or absence of the Mx gene did not alter replication of these virus strains in vitro and in vivo 63, 64 . The human Mx homologue is less efficient in its antiviral function in vivo 65, perhaps reflecting the different antiviral mechanisms used by human and mouse Mx1 gene products or viral adaptation to evade human Mx effects, and no genetic study in humans has linked the existing polymorphisms in the human Mx genes to altered susceptibility 4 .

A group of subjects with increased IFN induction on influenza virus exposure and stronger responses to IFNαβ are individuals with Down's syndrome who carry three copies of the human chromosome 21 containing genes encoding the IFNαβR, and, interestingly, MxA and MxB. Trisomic blood cells show strongly increased IFN responses to influenza virus 66, and trisomic macrophages show higher sensitivity to IFN 67 . Intriguingly, these individuals are reported to have a higher incidence of respiratory infections including seasonal and pandemic influenza and a higher risk of influenza-related severe disease 68, 69, therefore representing a patient group where heightened IFN levels and responsiveness are linked to higher influenza severity.

In conclusion, we show here through genetic, cell ablation and mAb-blocking experiments that in influenza-infected hosts, excessive amounts of IFNαβ produced by PDCA-1+ cells are upstream of a proinflammatory, pathogenic mechanism culminating in high morbidity and mortality mediated by TRAIL–DR5 interaction. In the human population, the at-risk group for severe influenza may contain individuals with high frequencies of pDCs or a propensity to strong IFN responses. Our observations therefore have important implications for prediction of susceptibility to severe influenza and for treatment of disease induced by this infection.

Metodai

Pelės

129/SvEvBrd-Hprt b-m2 mice and IFN type I receptor α-chain-deficient (IFNαβR−/−) generated on the 129SvEv background 11 were purchased from B&K Universal. Identity of the genetic background between these strains was confirmed by SNP and microsatellite analysis (Charles River). CBA/J mice were kindly provided by Dr A. O'Garra (MRC-NIMR). Recombination activating gene-2-deficient (Rag-2−/−) mice on the 129Sv background were kindly provided by Dr F. Powrie (Univ. of Oxford). The above mice, 129S8 mice, BALB/c, C57BL/6 mice and Rag-1−/− mice on the C57BL/6 background were bred at the MRC-National Institute for Medical Research under specific pathogen-free conditions. DBA/1 and 129 × 1/SvJ mice were purchased from Jackson Laboratory, DBA/2 mice from Harlan, 129S6/SvEv-Stat1 tm1Rds (Stat1−/−), 129S5 and 129S6 from Taconic, and kept in specific pathogen-free isolators until use for experiments. Unless otherwise stated, experiments were performed on 6- to 12-week-old male mice. Clinical symptoms during influenza infection were scored based on presentation of piloerection, hunched posture, labored breathing, swaying gait, hypothermia and reduced spontaneous or provoked movement, with each symptom scoring as 1. All protocols for breeding and experiments with animals were approved by the local ethical committee of the MRC-NIMR and are part of a project license approved by the Home Office, UK, under the Animals (Scientific Procedures) Act 1986.

Influenza viruses

A/PR/8/34 (PR8, H1N1), X31 (a H3N2 reassortant with PR8 backbone) and A/California/04/09 (Cal09, H1N1) (kind gifts from Dr J. Skehel, MRC-NIMR) were grown in the allantoic cavity of 10 day-embryonated hen's eggs and were free of bacterial, mycoplasma and endotoxin contamination. Alternatively, virus was grown in Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) cells, a kind gift from Dr J. McCauley, MRC-NIMR. All viruses were stored at −80 °C and titrated on MDCK cells. Mice were anaesthetised by inhalation with isofluorane and infected via the intranasal (in) route with 30μl of indicated influenza strain diluted in PBS. Virus was quantified in infected lungs by qPCR on cDNA from whole lungs for the Matrix gene:

Image

Alternatively, virus was titrated on MDCK cells, and the 50% tissue culture infective dose (TCID 50 ) was determined by eight replicates of 10-fold serial dilutions using the Spearman and Faerber fit.

Treatment of mice

C57BL/6 mice were infected with X31 (8, 000 TCID 50 per 30μl) or inoculated with Vehicle control in, then treated with Recombinant Mouse IFNα4 (PBL), 3.5 × 10 4 IU per 200 μl or Vehicle Control via the intraperitoneal (ip) route on days 1–6 post infection. To specifically deplete pDCs, 129 mice were treated with αPDCA-1 (Cambridge Bioscience) or IgG2b isotype-matched control, 500 μg per 200 μl ip on day 1 of infection with X31: 800 TCID 50, and every 48 h thereafter. 129 mice were treated with the Gr-1 reactive RB6-8C5, Ly6G reactive 1A8 or Isotype control (IgG2b) (500 μg per 200 μl ip) on day 1 of infection and repeated every 48 h throughout X31 (800 TCID 50 ) infection. To deplete NK cells, 129 mice were treated with rabbit αAsialo GM1 serum (200 μl) on days 1, 3 and 7 post X31 infection. All depletions were confirmed by flow cytometry. To block TRAIL action, 129 mice were treated ip with 150 μg per 200 μl of αCD253 (N2B2) (Cambridge Bioscience) or isotype control (IgG2a) every 24 h on days 0–9 post infection with 800 TCID 50 of X31.

In vitro stimulation of pDCs and macrophages

129, IFNαβR−/−(129) or C57BL/6 bone marrow cells were obtained by flushing femurs and tibias with RPMI-1640 (BioWhittaker), using a 23 gauge needle. Red blood cells were lysed using ammonium chloride, and cells were cultured in Flt3 supplemented (100 ng ml −1 ) (Pepro Tech) for pDCs or, for macrophages, L cell sup supplemented (10%) (a kind gift from Anne O'Garra, MRC-NIMR) culture media (10% fetal calf serum (PAA), L -glutamine, penicillin, streptomycin, and β-mercaptoethanol in RPMI-1640). Media was replaced at day 4 of macrophage cultures, which were harvested at day 7 by collection of the adherent cells. Culture was found to contain 95% macrophages, identified as FSC hi, SSC hi, F4/80 +, CD11b + by flow cytometry. For pDCs, media was replenished at days 3 and 6 of culture, and cells were harvested at day 9. Harvested cells were preincubated with Fc block and biotin-conjugated B220 in 2% BSA (PBS) before a 30-min incubation with anti-biotin conjugated magnetic beads. pDCs were then positively selected using an LS Columns and the QuadroMACS separator, as per manufacturer's instructions (Miltenyi Biotech) and found to be 95% pure based on FSC lo, SSC lo, αPDCA-1 +, Siglec-H +, CD11b CD11c int as analysed by flow cytometry. pDCs were seeded at 6 × 10 4 cells per well, macrophages at 2 × 10 5 cells per well and rested for 24 h before stimulation with X31 multiplicity of infection (MOI) of 1 or vehicle control for 24 h. Supernatants were then collected and stored at −70 °C until samples were analysed.

RNR ekstrahavimas

Whole lungs were collected in TRIzol (Invitrogen) and homogenized using Polytron PT 10–35 GT (Kinematica). MTEC cultures were lysed directly in the transwells, using the Qiagen RNeasy mini kit, according to the manufacturer's instructions. Total RNA was prepared using phenol/chloroform extraction, and cDNA was generated from these samples using Thermoscipt RT–PCR system, as per manufacturer's instructions (Invitrogen). The cDNA served as a template for the amplification of genes of interest and the housekeeping gene (Hprt1) by real-time PCR, using TaqMan Gene Expression Assays (Applied Biosystems), universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) and the ABI-PRISM 7900 sequence detection system (Applied Biosystems). The fold increase in mRNA expression was determined using the ΔΔCt method relatively to the values in mock-treated samples, after normalization to Hprt1 gene expression.

Mikro matricų duomenų analizė

Lungs were homogenized in TRI Reagent (RiboPure kit, Ambion), and total RNA isolated according to manufacturer's instruction. RNA was hybridized to Illumina.SingleColor.Mouse WG-6_V2_0_R0_1127 microarrays. Raw data were processed using GeneSpring GX version 11.5 (Agilent Technologies). After background subtraction each probe was attributed a flag to denote its signal intensity detection P -value. Flags were used to filter out probe sets that did not result in a 'present' or 'marginal' call in at least 50% of the samples, in any one out of six experimental conditions. Next, a per-gene normalization was applied by dividing each messenger RNA transcript by the median intensity of mock-infected samples. All statistical analysis was performed after this stage: a two-way ANOVA (parameters: treatment and genotype) was performed to identify gene significantly differentially expressed relative to controls (≥fourfold change; P <0.01, Benjamini-Hochberg multiple test correction).

Baltymų analizė

BAL fluid was recovered from naive and infected mice, centrifuged at 1, 300 rpm, 5 min at 4 °C and supernatant collected. X31-stimulated pDC supernatants were collected after 24 h stimulation. Concentrations of IFNα, β (PBL Biomedical Laboratories) and λ (R&D) were measured by ELISA as per the manufacturer's instructions. Concentrations of Eotaxin, G-CSF, IFNγ, MCP-1, IP-10, Mip-1β, IL10, IL-9 and IL-6 were assessed by using Milliplex Map Kit (Millipore) as per the manufacturer's instructions and read on a Luminex 100 (BioRad).

Mikroneutralizacijos tyrimas

Neutralizing antibodies in serum were assessed by using a microneutralization assay. In brief, serum samples were heat inactivated for 30 min at 56 °C, diluted 1:100 then serially diluted 1:3 in duplicate in 96-well flat-bottomed plates. Serum dilutions were preincubated with X31, 300 TCID 50 per well for 1 h at 37 °C then added to MDCK cells and incubated for a further 22 h at 37 °C. After incubation, cells were washed and fixed, and neutralization capability was then assessed by staining for FITC-conjugated influenza nucleoprotein (Oxoid) and detected with a horseradish peroxidase-conjugated anti-FITC antibody (Roche). The reaction was then developed with tetramethylbenzidine substrate (eBioscience) for 15 min, stopped using H 2 SO 4, and absorbance was read at 450 nm using a Safire2 reader (Tecan).

Srauto citometrija

Leukocytes from the lung were enumerated using flow cytometry. In brief, lungs were excised from naive and infected mice and homogenized using gentleMACS (Miltenyi), as per the manufacturer's instructions. Lungs were then passed through a 70-μM cell strainer and washed with FACS buffer (10% BSA in PBS Azide). Red blood cells were lysed using ammonium chloride, and cells were seeded into a 96-well U-bottom plate at 1 × 10 6 per well. Cells were preincubated with anti-FcγRIII/II (Fc block) in FACS buffer before a 30-min incubation with one or more of the following fluorochrome-labelled antibodies (used at a dilution of 1:200 and purchased from Cambridge Bioscience, unless otherwise stated): FITC-conjugated αPDCA-1 (Clone: 927, dilution 1:2, 000) (Dendritics), FITC-conjugated NKp46 (Clone: 29A1.4), FITC-conjugated E-Cadherin (Clone: 36/E-Cadherin) (BD Pharmingen), FITC-conjugated Ly6C (Clone: HK1.4), FITC-conjugated NP 366–374 H-2D b tetramer (a kind gift from Carmela De Santo and Vincenzo Cerundolo, University of Oxford) PE-conjugated Siglec-H (Clone: 551), PE-conjugated TRAIL (Clone: N2B2), PE-conjugated DR5 (Clone: MD5-1), PerCP Cy5.5-conjugated Ly6C (Clone: HK1.4, dilution 1:2, 000), PE Cy7-conjugated CD11b (Clone: M1/70, dilution 1:4, 000), APC-conjugated CD45 (Clone: 30-F11), APC-conjugated F4/80 (Clone: BM8, dilution 1:100), APC Cy7-conjugated Ly6G (Clone: 1A8), APC Cy7-conjugated CD3 (Clone: 17A2), BD Horizon V450-conjugated CD11c (Clone: HL3) (BD bioscience). Cells were then washed with PBS x2 and counter stained with LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain (Life Technologies) and, or 7AAD (Life Technologies) to enumerate apoptotic and dead cells (respectively) then analysed using a LSR II (Becton Dickinson).

Histologija

Whole lungs were perfused with 10% neutral buffered formaldehyde (NBF) in situ . Tissue was then fixed overnight in 10% NBF, embedded in paraffin and sectioned. Lung specimens were stained with haematoxylin and eosin (H&E) and then subjected to gross and microscopic pathologic analysis. For TUNEL staining, slides were deparaffinized and stained for apoptotic cells using ApopTag Fluorescein In Situ Apoptosis Detection Kit (Miltenyi) as per the manufacturer's instructions.

Primary mouse tracheal epithelial cell culture

Isolation and culture of primary mouse tracheal epithelial cell culture (MTEC) were performed as follows 70 : in brief, cells isolated by enzymatic treatment were seeded onto a 0.4-μm pore size clear polyester membrane (Corning) coated with a collagen solution. At confluence, media was removed from the upper chamber to establish an air-liquid interface (ALI). Fully differentiated, 10- to 14-day-old post ALI cultures were routinely used for experiments.

A549 ląstelių linija

Human A549 cells (a kind gift from Dr J. McCauley, MRC-NIMR) were maintained in Dulbecco's modified Eagle's medium-high glucose, (DMEM GlutaMAX Supplement) (gibco-Life technologies) supplemented with 5% fetal calf serum (FCS). A549 cells were seeded on to 24-well plates and when confluent, used for experiments.

Statistinė analizė

Data shown as the means ±sem Sample sizes were designed to give statistical power, while minimizing animal use. Data sets were analysed by two-way ANOVA with Bonferroni post tests (weight and cytokine concentration time courses) Log-rank (Mantel-Cox) Test (survival) and Mann–Whitney Test. GraphPad Prism 5 (GraphPad Software, San Diego, CA) was used for data analysis and preparation of all graphs. P -values less than 0.01 were considered to be statistically significant.

Prisijungimai

Genų ekspresijos omnibusas

  • GSE55403

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

    Supplementary Figures 1-11

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.