Farmakologinis didelio afiniteto p-tiramino transporterio apibūdinimas žiurkių smegenų sinaptosomose | mokslinės ataskaitos

Farmakologinis didelio afiniteto p-tiramino transporterio apibūdinimas žiurkių smegenų sinaptosomose | mokslinės ataskaitos

Anonim

Dalykai

  • Ląstelių neuromokslas
  • Neurofiziologija

Anotacija

p- tiraminas yra archetipinis endogeninių monoaminų šeimos, žinomo kaip pėdsakų aminai, narys ir yra vienas iš endogeninių su aminorūgštinėmis susijusių receptorių (TAAR) 1 agonistų. Nors daug darbo buvo sutelkta į TAAR1 funkciją, labai mažai žinoma apie endogeninių agonistų reguliavimą. Anksčiau pranešėme, kad p- tiraminas lengvai kerta lipidų dvisluoksnius sluoksnius ir kad jo išsiskyrimas iš sinaptosomų yra neeksocitotinis. Tačiau toks išleidimas parodė vieno ar kelių pernešėjų modifikavimo ypatybes. Pateikiame pirmąjį tokio transporterio apibūdinimą. Naudodami priekinės žievės ir striatos sinaptosomas, parodėme, kad p- tiramino praėjimas per sinaptosomų membranas nėra modifikuojamas selektyviai slopinant nei dopamino, nei norenrenalino, nei 5-HT pernešėjus. Priešingai, 2-gabentojų įsisavinimo slopinimas žymiai sulėtino p- tiramino absorbciją. Naudodamiesi įvairaus selektyvumo inhibitoriais, mes nustatome, kad Organic Cation Transporter 2 (OCT2; SLC22A2 ) yra tarpininkas, sukeliantis aukštą afinitetą p- tiramino įsisavinime esant fiziologiškai svarbioms koncentracijoms. Be to, mes patvirtiname OCT2 baltymo buvimą sinaptosomose. Šie rezultatai leidžia pirmą kartą identifikuoti didelio afiniteto neuroninį p- tiramino pernešėją ir taip pat patvirtina neseniai aprašytą OCT2 lokalizaciją ikisinapsiniuose terminaluose.

Įvadas

Pėdsakų aminai yra endogeninių aminų grupė, susintetinta neuronuose ir randama visose tirtose rūšyse 1 . Archetipiniai šios šeimos nariai yra p- tiraminas, 2-feniletilaminas ir triptaminas. Nors jų yra labai mažai, iš tikrųjų iš pradžių buvo siekiama apibūdinti bet kokį endogeninį aminą, kurio audinių koncentracija yra mažesnė nei 100 ng / g audinio 2, tačiau jie yra nevienalytiškai pasiskirstę smegenyse 1 . 2001 m. Buvo nustatyta su stuburiniais G baltymais sujungtų receptorių, vėliau vadinamų su aminu susietų receptorių (TAAR), šeima, kurios pogrupį selektyviai aktyvino aminų pėdsakai 3, 4 . Vėliau buvo stengiamasi ištirti šiuos receptorius, ypač TAAR1, kuris parodė, kad jis moduliuoja dopaminerginį 5, 6, 7, 8, 9 serotonerginį 6 ir glutamaterginį 6, 10, 11 perdavimą; sąveikauti su dopamino (DAT) 12, 13, 14, noradrenalino (NET) 14, 5-HT (SERT) 14 ir glutamato (EAAT2) 15 pernešėjais; sumažinti potraukį įvairiems psichostimuliatoriams 16, 17, 18 ; ir reguliuoja apetitą 10, 19, miegą 7, 10 ir pažintinę funkciją 7, 10 . Remiantis tuo, TAAR1 agonistai ir (arba) daliniai agonistai buvo pasiūlyti kaip nauji vaistai šizofrenijai 10 ir piktnaudžiavimui vaistais 20 .

Nors padaryta įspūdinga pažanga nustatant TAAR1 farmakologiją ir fiziologiją, vis dar yra labai mažai žinoma apie taikomus homeostatinius procesus endogeninių agonistų valdymui. Archetipiniai pėdsakų aminai sintetinami dekarboksilinant prieškursorines aminorūgštis l-tiroziną, l-fenilalaniną ir l-triptofaną per fermento aromatinę l-amino rūgšties dekarboksilazę (AADC; EC 4.1.1.28) 1 . Skilimas pirmiausia vyksta per monoaminooksidazę (MAO; EC 1.4.3.4) -A ir -B1, kai 2-feniletilamiinas yra vis dar žinomas endogeninis junginys, pasižymintis dideliu selektyvumu MAO-B 21 . Nors šis metabolizmo būdas yra analogiškas monoamino neurotransmiterių metabolizmui, pėdsakų aminų apyvarta yra nepaprasta, o endogeninio telkinio pusinės eliminacijos laikas yra mažesnis nei 30 sekundžių 22 . Toks didelis apyvarta leidžia manyti, kad aminų pėdsakai nėra saugomi, ir tai atitinka ankstesnius pranešimus apie vezikulinio kaupimosi trūkumą 23 . Atsižvelgdami į tai, mes parodėme, kad ir p- tiraminas, ir 2-feniletilaminas lengvai išsisklaido per sintetinius lipidų dvisluoksnius sluoksnius 24 . Be to, ankstesni tyrimai parodė, kad nei p- tiramino, nei 2-feniletilamino išsiskyrimas iš neuronų preparatų nepadidėjo dėl kalio sukeltos depoliarizacijos 24, 25, 26, tai rodo, kad aminų pėdsakai neišsiskiria egzocitozės būdu, suderinamu su paprasta difuzija per lipidų dvisluoksnį sluoksnį. . Esant tokiai situacijai, sinapsinis aminų pėdsakų lygis būtų pastovus, kurį kontroliuoja tik santykinis sintezės ir skaidymo greitis.

Nepaisant padidėjusio aminų išsiskyrimo po depoliarizacijos, tai ne tik rodo neeksocitinį išsiskyrimą, bet taip pat rodo, kad reguliuojant sinapsių lygį dalyvauja vienas ar keli nešikliai. Esant fiziologiniam pH, aminai, kurie yra pirminiai aminai, turės grynąjį teigiamą krūvį. Taigi tarpląstelinio: tarpląstelinio pusiausvyros santykį galima numatyti esant bet kokiam membranos potencialui iš Nernsto lygties. Kaip parodyta 1 pav., Tokiomis situacijomis prognozuojamas koncentracijos santykis rūšims, turinčioms vieną teigiamą krūvį ir laisvai difunduojančioms per membranas, kinta nuo daugiau nei 10: 1 tarpląstelinio pasirinkimo esant tipinėms ramybės membranos galimybėms, iki apytiksliai 2: 2 : 1 tarpląstelinė nuostata, kai visiška depoliarizacija. Taigi, padidėjęs p- tiramino išsiskyrimas po depolarizacijos aiškiai rodo, kad yra kitų veiksnių, kurie neleidžia pasikeisti pasiskirstymui. Mes samprotavome, kad tai greičiausiai reiškia transporterio, kuris pakartotinai vartoja p- tiraminą į nervinį galą, buvimą.

Image

Tarpląstelinės ir tarpląstelinės koncentracijos santykis buvo numatytas pagal Nernsto lygtį. c in = tarpląstelinė koncentracija, c ex = tarpląstelinė koncentracija.

Visas dydis

Pranešama, kad iš daugelio žinomų baltymų transporterių aminorūgštys į savo substrato profilį įeina į pėdsakus, nors tai retai buvo tiriama fiziologiškai reikšmingų nanomolių lygmenyje. Tokie pernešėjai gali būti plačiai klasifikuojami kaip neuroniniai ir ekstraneuroniniai, apibrėžimai, kurie paprastai atitinka įsisavinimo-1 ir įsisavinimo-2 koncepciją, kurią iš pradžių pasiūlė „Iverson 27“ . Nors naujausi tyrimai rodo, kad tai yra pernelyg paprastas 28, 29 supaprastinimas, diskusijų palengvinimui mes čia paminėsime „įsisavinimo – 1“ ir „įsisavinimo – 2“ pernešėjus.

„Sugerties-1“ pernešėjai yra tipiški DAT, NET ir SERT - visi „Slc6“ šeimos nariai. Jie pasižymi dideliu selektyvumu, tačiau mažu pajėgumu, priklausomu nuo Na priklausomo transporto, kurie paprastai laikomi pirmiausia atsakingais už išlaisvintų neuromediatorių sinapsinį klirensą 30 . Mikroelementai mikroelementai ilgą laiką buvo pripažinti substratais šiems pernešėjams 31, 32, 33 . Tačiau tai buvo įrodyta tik esant dideliems mikromoliams ar net milimoliams lygiams, bent trimis dydžiais, viršijančiais maksimalią sinapsių koncentraciją (maždaug 100 nM), kuri, manoma, normaliomis sąlygomis yra aminų pėdsakams 1 . Taigi mažai tikėtina, kad šie pernešėjai prisideda prie sinapsinio aminų pėdsakų klirenso, nebent įvyktų koks nors kitas, anksčiau neapibūdintas, reguliavimo įvykis.

Neuroninių monoaminų atveju 2-absorbcijos pernešėjai yra tipiški organinių katijonų pernešėjų (OCT; Slc22A1-3) pernešėjų šeima ir plazminės membranos monoamino pernešėjų (PMAT; Slc29A4). Klasikiškai jie laikomi polispecifiniais, mažo selektyvumo, didelės talpos pernešėjais, kurie tarpininkauja sinapsinių neurotransmiterių pertekliniam klirensui, kai įsisavinimo-1 pernešėjai tampa sotūs 34 . Nors daug mažiau tirta, pranešta, kad visi šie keturi nešėjai į savo substrato profilį 35, 36, 37, 38, 39 įtraukė vieną ar daugiau aminų pėdsakų, kurių bent vienas yra OCT1, parodantis nanomolinį afinitetą p- tiraminui 35, 40 . Tačiau manoma, kad OCT1 nėra 41–42 neuronuose, todėl mažai tikėtina, kad jis vaidins anksčiau stebėtą poveikį. Priešingai, pranešta, kad OCT2 41, 43, 44, OCT3 42, 45 ir PMAT 46, 47 išreiškiami neuronais.

Šio tyrimo tikslas buvo sistemingai ištirti atskirų pernešėjų slopinimo poveikį p- tiramino atpalaidavimo charakteristikoms iš iš anksto pakrautų priekinės žievės žievės ir striatos sinaptosomų preparatų ir apibūdinti bet kokio pastebėto pernešėjo sukelto perėjos kinetiką. Nors selektyvieji absorbcijos-1 pernešėjų inhibitoriai yra gerai apibūdinami, yra nedaug prieinamų įvairių absorbcijos-2 nešiklių inhibitorių. Todėl mes pasirinkome atimamąjį ir dedukcinį požiūrį, kad būtų galima įvertinti įsisavinimo-2 pernešėjų vaidmenį kontroliuojant p- tiramino ekstraneuroninius lygius, slopinant įvairius pernešėjų derinius.

Rezultatai

Depolarizacijos poveikis p- tiramino išsiskyrimui

Pradiniai tyrimai patvirtino, kad pakanka 10 minučių inkubacijos 37 ° C temperatūroje su 100 nM [3H] p- tiramino, kad būtų galima subalansuoti krūvį tiek žievės, tiek striatos sinaptosomose (duomenys nepateikti). Aukštos kalio sukeltos sinaptosomų depoliarizacija, gauta iš priekinės žievės (2a pav.; F = 0, 8929 (3, 314), P = 0, 4451, n = 20) arba iš striatumo (2b pav.; F = 1, 574 (3, 362)), P = 0, 1953, n = 23) nepadidino iš anksto įkrauto p- tiramino išsiskyrimo. Nors išleidimo kreivėse buvo keletas plokščiakalnio srities (t = 2–5 min.) Įrodymų, dvifazio skilimo funkcija vienareikšmiškai neatitiko duomenų, todėl buvo priimtas vienfazis eksponentinis modelis.

Image

Sinaptosomos buvo iš anksto pakrautos inkubuojant su 100 nM [3H] p- tiraminu × 10 min. Depolarizaciją sukėlė 25 mM KCl. Išleidimo kreivės buvo pritaikytos prie vienfazio eksponentinio skilimo funkcijos ir buvo palygintos naudojant papildomą kvadratų sumos F testą. Duomenys rodo 20 (priekinės žievės) ir 23 (striatum) nepriklausomų bandymų vidurkį ± sem.

Visas dydis

„Uptake-1“ inhibitorių poveikis p- tiramino atpalaidavimui

DAT selektyvus slopinimas (3a pav.; F = 0, 3480 (3, 42), P = 0, 7908, n = 3), NET (3b pav.; F = 1, 063 (3, 58), P = 0, 3718, n = 4). arba SERT (3c pav.; F = 0, 1259 (3, 42), P = 0, 9442, n = 3) neturėjo jokio poveikio p- tiramino išsiskyrimo savybėms, gautoms iš žievės (3 pav.) arba striatos sinaptosomų, esant abiejų bazinių dalių (pav. 3) arba depoliarizuojančios (žr. Papildomą S1 pav.).

Image

Iš priekinės žievės paruoštos sinaptosomos buvo iš anksto pakrautos iš anksto inkubuojant su 100 nM p- tiramino, kaip aprašyta anksčiau. Išsiskyrimas bazinėmis (nedepoliarizuojančiomis) sąlygomis buvo matuojamas nesant ir esant 50 nM GBR 12783 ( a ), 100 nM maprotilino ( b ) ar 50 nM citalopramo ( c ) kreivėms, tinkančioms vienfaziam eksponentiniam skilimo funkcijai. . Kreivės, gautos neturint atskirų inhibitorių ir nedalyvaujant, buvo palygintos naudojant papildomą kvadratų sumos F testą. Duomenys rodo vidurkį ± sem, n = 3 (GBR 12783, citalopramas), 4 (maprotilinas).

Visas dydis

„Uptake-2“ inhibitorių poveikis p- tiramino atpalaidavimui

Visos OCT + PMAT inhibitorius decynium-22 34, 37 žymiai padidino akivaizdų p- tiramino išsiskyrimą tiek baziniame (4a pav.; F = 5, 261 (3, 58), P = 0, 0028, n = 4), tiek depoliarizuojantis ( 4b pav., F = 4, 473 (3, 58), P = 0, 0068, n = 4) sąlygos. Tai pirmiausia pasireiškė kaip išsiskyrimo kreivės pusinės eliminacijos laiko sumažėjimas abiem sąlygomis (bazinis = 3, 01 min; bazinis + decynium-22 = 1, 24 min; depoliarizuojantis = 3, 07 min; depoliarizuojantis + decynium-22 = 0, 77 min). Panašus poveikis buvo stebimas ir žievės, ir striatos preparatuose.

Image

Priekinės žievės sinaptosomų preparatai buvo iš anksto pakrauti [3H] p- tiraminu, kaip aprašyta anksčiau, ir išleisti, jei nėra ir nėra 1 μM decinium-22, nustatyto bazinėmis ( a ) ir depoliarizacinėmis ( b ) sąlygomis. Depolarizacija buvo sukelta inkubuojant, esant 25 mM KCl. Išsiskyrimo kreivės buvo pritaikytos prie vienfazio eksponentinio skilimo funkcijos ir buvo palygintos, kai nėra ir decynium-22, naudojant papildomą kvadratų sumos F testą kiekvienoje būklėje. Duomenys parodo 4 nepriklausomų eksperimentų vidurkį.

Visas dydis

Šiek tiek selektyvesnis chinidino inhibitorius (viso UŠT slopinimas, be PMAT slopinimo) 48, 49 davė panašų poveikį kaip decynium-22, padidindamas tariamą p- tiramino išsiskyrimą iš abiejų bazinių dalių (5a pav .; F = 106, 6 (3, 58), P <0, 0001, n = 4) ir depoliarizacijos (5b pav.; F = 72, 07 (3, 58), P <0, 0001, n = 4) sąlygos. Atsakymai vėlgi buvo siejami su ryškiu p- tiramino atpalaidavimo pusinės eliminacijos periodo sumažėjimu (bazinis = 2, 52 min., Bazinis + chinidinas = 0, 82 min .; depoliarizacija = 3, 10 min., Depoliarizacija + chinidinas = 0, 91 min.). Selektyvusis PMAT inhibitorius lopinaviras 50 visiškai neturėjo jokio poveikio baziniam (5c pav.; F = 0, 645 (3, 58), P = 0, 5895, n = 4) arba depoliarizuojančiam (5d pav.; F = 0, 094 (3, 58) ), P = 0, 9630, n = 4) sąlygos. Vėlgi, iš esmės identiški atsakai į kiekvieną inhibitorių buvo gauti striatos ir žievės preparatuose.

Image

Iš striatumo paruoštos iš anksto įdėtos sinaptosomos buvo inkubuotos bazinėmis arba depoliarizuojančiomis sąlygomis, kai nebuvo ir 50 μM chinidino, arba 30 μM lopinaviro. Depolarizacija buvo sukelta inkubuojant, esant 25 mM KCl. Išsiskyrimo kreivės kiekvienomis sąlygomis buvo pritaikytos prie vienfazio eksponentinio skilimo funkcijos, o kreivės, gautos nesant inhibitoriaus ar jo neturint, buvo palygintos naudojant papildomą kvadratų sumos F testą kiekvienoje būklėje. Duomenys parodo 4 nepriklausomų eksperimentų vidurkį.

Visas dydis

Selektyvus OCT3 slopinimas vartojant kortikososteroną 36, 51 nepakeitė p- tiramino atpalaidavimo charakteristikų nei baziniame (6a pav.; F = 0, 078 (3, 58), P = 0, 9716, n = 4), nei depoliarizuojantis (6b pav.; F). = 0, 021 (3, 58), P = 0, 9957, n = 4) sąlygos bet kuriame smegenų regione. Tačiau pentamidinas, OCT1 + OCT2 inhibitorius 52, žymiai padidino tariamą p- tiramino išsiskyrimo greitį baziniame (7a pav.; F = 3, 008 (3, 42), P = 0, 041, n = 3) ir depoliarizuodamasis (7 pav.) 7b; F = 2, 930 (3, 42), P = 0, 045, n = 3) sąlygos. Kaip ir anksčiau, tai pirmiausia lėmė ryškus išsiskyrimo pusinės eliminacijos periodo sumažėjimas (bazinis = 3, 44 min., Bazinis + pentamidinas = 1, 21 min .; depoliarizacija = 2, 26 min., Depoliarizacija + pentamidinas = 0, 52 min.). Priešingai, selektyvusis OCT1 inhibitorius atropinas 48 neturėjo jokio poveikio baziniam (7c pav .; F = 0, 311 (3, 42), P = 0, 8175, n = 3) ir depoliarizuojantis (7d pav.; F = 0, 2394 (3, 42). ), P = 0, 8683, n = 3) sąlygos. Tas pats atsakas į inhibitorius buvo pastebėtas tiek striatos (7 pav.), Tiek žievės (žr. Papildomą S2 pav.) Preparatuose.

Image

Iš anksto pakrautos striatos sinaptosomos buvo inkubuotos bazinėmis (5 mM KCl) arba depoliarizuojančiomis (25 mM KCl) sąlygomis, kai nebuvo ir nebuvo 1 μM kortikosteroono. Išsiskyrimo kreivės kiekvienomis sąlygomis buvo pritaikytos prie vienfazio eksponentinio skilimo funkcijos, o kreivės, gautos nesant inhibitoriaus ar jo neturint, buvo palygintos naudojant papildomą kvadratų sumos F testą kiekvienoje būklėje. Duomenys rodo vidurkį ± sem, n = 4.

Visas dydis

Image

Iš anksto pakrautos striatos sinaptosomos buvo inkubuotos bazinėmis (5 mM KCl) arba depoliarizuojančiomis (25 mM KCl) sąlygomis, kai nebuvo ir 200 μM pentamidino, arba 10 μM atropino. Išsiskyrimo kreivės kiekvienomis sąlygomis buvo pritaikytos prie vienfazio eksponentinio skilimo funkcijos, o kreivės, gautos nesant inhibitoriaus ar jo neturint, buvo palygintos naudojant papildomą kvadratų sumos F testą kiekvienoje būklėje. Duomenys parodo 3 nepriklausomų eksperimentų vidurkį.

Visas dydis

Aukščiau pateikti tyrimai rodo, kad p- tiraminas per sinaptosomų membranas yra pernešamas OCT2 arba bent pernešėjo, turinčio į OCT2 panašų farmakologinį profilį. Norėdami dar labiau patvirtinti OCT2 kaip pernešėją ir atmesti galimybę, kad poveikis atsirado dėl to, kad slopindami daugybę pernešėjų pašalino neselektyvų atleidimą, mes pakartojome tyrimus su selektyvių inhibitorių, kurie slopins OCT1 (atropinas), OCT3 (kortikosteroonas), kokteiliu. ir PMAT (lopinaviras), tačiau nepalieka OCT2 tarpinio transporto. Šis inhibitorių kokteilis neturėjo jokio poveikio p- tiramino išsiskyrimo charakteristikoms tiek baziniame (F = 0, 5212 (3, 58), P = 0, 6694, n = 4), tiek depoliarizuojančiame (F = 0, 2931 (3, 58), P = 0, 8302, n = 4) sąlygos (žr. papildomą S3 pav.). Be to, Western blot analizė patvirtino OCT2 buvimą sinaptosomų preparatuose (8 pav. Pagrindinė plokštė).

Image

Pagrindinė plokštė: Priekinės žievės ir striatumos sinaptosomų preparatų (iš viso 200 μg baltymų) baltymai buvo atskirti denaturuojančiame 4–12% gradiento bis-tris akrilamido gelyje prieš perpilant į nitroceliuliozės membraną. Anti-SLC22A2 antikūnų dažymas nustatė baltymą, kurio molekulinė masė buvo maždaug 66 kDa, atitinkančio OCT2. Pradėjimas: ta pati juosta buvo nustatyta inkstų homogenatuose. Vaizdai yra reprezentatyvios dėmės. Kiekviename iš trijų nepriklausomų eksperimentų buvo gauti identiški rezultatai.

Visas dydis

Toliau apibūdinome transporterio kinetiką. Tokius tyrimus gali supainioti paruošta p- tiramino difuzija per lipidinius dvisluoksnius sluoksnius, jei nėra membranų pernešėjų. Todėl mes apibrėžėme bendrą ir difuzijos sukeltą įsisavinimą kaip įvykstantį, jei nėra ir nėra 400 μM pentamidino, atsižvelgiant į skirtumą tarp dviejų, dėl kurių susidaro mediatoriaus tarpininkavimas (9 pav.). Taikant šį metodą, Michaelio-Menteno analizė parodė pentamidinui jautrų įsisavinimą, kai Vmax = 30, 2 fmol / mg baltymo / s, o Kt = 101, 5 nM.

Image

Priekinės žievės sinaptosomos buvo inkubuotos esant didėjančioms p- tiramino koncentracijoms, o absorbcija buvo nutraukta įvairiais laiko momentais. Iš gautų kreivių kiekvienai koncentracijai buvo nustatytas pradinis įsisavinimo greitis. Bendras įsisavinimas yra apibrėžiamas kaip tas, kuris vyksta nesant 400 μM pentamidino. Nespecifinis įsisavinimas yra apibrėžiamas kaip tas, kuris vyksta esant pentamidinui. Tada pentamidinui jautrus įsisavinimas nustatomas pagal skirtumą tarp dviejų kreivių. Vertės reiškia 4 nepriklausomų eksperimentų vidurkį ± sem.

Visas dydis

Diskusija

Su stuburinių G baltymu sujungtų receptorių, iš kurių bent keletas selektyviai aktyvuojami 2-feniletilamino ir p- tiramino 3, 4, šeimos identifikavimas paskatino domėtis vadinamaisiais pėdsakų aminais. Nors tai lėmė pastebimą pažangą aiškinantis TAAR1 farmakologiją ir fiziologiją, vis dar trūksta supratimo apie homeostatinius mechanizmus, skirtus endogeninių ligandų reguliavimui. Žinoma, kad sintetinio fermento AADC aktyvumas yra reguliuojamas reaguojant į dopaminerginį 53, 54, 55 ir noradrenerginį 56 receptorių aktyvavimą - tai poveikis, kuris keičia 2-feniletilamino 57, bet ne 58, 59 dopamino, sintezės greitį. Metabolizmas daugiausia vyksta per MAO, kai 2-feniletilaminą pirmiausia metabolizuoja MAO-B 21, o p- tiraminą - maišytą MAO-A / MAO-B substratą 22, 60 .

Ankstesni tyrimai rodo, kad nei 2-feniletilaminas, nei p- tiraminas nelaikomi sinapsinėse pūslelėse; jų tarpląstelinį lygį lemia tik viso audinio lygis 26, o jų išsiskyrimas iš nervų galų nepadidėja depoliarizuojant 25, 26 . Tuo remiantis anksčiau buvo pasiūlyta, kad aminų pėdsakai lengvai pasklistų po neuronų membranas, o jų sinapsių lygis būtų pastovus, kontroliuojamas santykiniu sintezės ir skilimo greičiu 1, 61 . Yra keletas įrodymų, pagrindžiančių laisvą aminų pėdsakų difuziją per biologines membranas 62, 63, nors kiti pasiūlė įtraukti nežinomą 64, 65 pernešėją. Anksčiau pateikėme pirmą tiesioginį aminų difuzijos pėdsaką tarp lipidų sluoksnių, kuriuose nėra baltymų, ir patvirtinome, kad tai įvyko žymiai greičiau nei monoamino neurotransmiterių dopamino, noradrenalino ir 5-HT24. Be to, mes patvirtinome ankstesnius Dyck 26 stebėjimus, kurie parodė, kad nei 2-feniletilamiinas, nei p- tiraminas nebuvo atpalaiduojami iš sinaptosomų priklausomai nuo aktyvumo 24 . Rezultatai kartu rodo, kad aminų pėdsakai ne tik išsiskiria neeksocitotiniu būdu, bet ir tai, kad nervo galuose gali būti baltymas, kuris vėl įsisavina. Kaip pirminiai aminai, tiek 2-feniletilaminas, tiek p- tiraminas teigiamai įkraunami esant fiziologiniam pH. Jų perėjimą per lipidų dvisluoksnį sluoksnį galima numatyti pagal Nernsto lygtį. Iš to galima aiškiai matyti, kad nesant kitų procesų, difuzijos sukeliamas išsiskyrimas turėtų padidėti, reaguojant į membranos depoliarizaciją (žr. 1 pav.): Kad to nėra (2 pav.), Lengviausia paaiškinti buvimu transporterio, kuris pakartotinai sunaudoja išleistą p- tiraminą. Anksčiau patvirtinome, kad dopamino išsiskyrimas iš tų pačių preparatų padidėja dėl didelio kalio sukeltos depoliarizacijos 24, tai patvirtina mūsų sinaptosomų preparatų funkcionalumą. Šis tyrimas pateikia pirmąjį didelio afiniteto p- tiramino pernešėjo farmakologinį apibūdinimą.

Pranešama, kad daugelis žinomų nešiotojų į savo substrato profilį įtraukė vieną ar daugiau aminų pėdsakų, nors apie tai pranešta beveik tik esant viršfiziologinėms koncentracijoms. Endogeninių aminų pėdsakų lygis yra mažas ng / g audinio diapazonas, kuris, kaip manoma, atitinka apytiksliai 10–100 nM audinio lygius 1 . Čia mes iš anksto pakrauname sinaptosomų preparatus, inkubuodami su 100 nM [3H] p- tiraminu, kad apytiksliai atitiktume fiziologines koncentracijas, kuriose tikimasi įsisavinti. Remiantis ankstesniais tyrimais, rodančiais, kad p- tiraminas gabenamas tik mililiarinėmis 31, 32, 33 koncentracijomis, selektyvus DAT (Slc6A3), NET (Slc6A2) arba SERT (Slc6A4) slopinimas neturėjo įtakos p- tiramino išsiskyrimo charakteristikoms (pav. 3), patvirtinantį, kad fiziologinėmis sąlygomis p- tiraminas nėra šių pernešėjų substratas.

Skirtingai nuo Slc6 nešiklių šeimos, retkarčiais gautame pranešime teigiama, kad p- tiraminas yra vieno ar kelių polispecifinių UŠT (Slc22A1-3) ir PMAT (Slc29A4) pernešėjų substratas, ir tai gali atsirasti esant ne mažesnei kaip 100 koncentracijai. nM 35, 40 . Kadangi aprašytų Slc22 / Slc29 šeimų narių yra keletas tikrai selektyvių inhibitorių, mes ištyrėme įvairių nešiklių derinių slopinimo poveikį p- tiramino atpalaidavimo charakteristikoms, stengiantis nustatyti galimą pernešėją. Decynium-22, neselektyvus OCT1-3 ir PMAT 34, 37 inhibitorius, žymiai padidino tariamą p- tiramino išsiskyrimo greitį (4 pav.). Nors buvo pranešta, kad UŠT pernešėjai yra abipusiai 66, ir todėl toks padidėjęs išsiskyrimas per transporterį yra įmanomas decinium-22, greičiausias paaiškinimas yra tas, kad buvo slopinamas p- tiramino įsisavinimas.

Chinidinas, OCT1-3 inhibitorius, bet ne PMAT 48, 49, turėjo panašų poveikį kaip decynium-22 (5a, b pav.), Kas rodo, kad PMAT gali nedalyvauti transportuojant p- tiraminą. Tai dar kartą patvirtino nepakankamas PMAT selektyvaus inhibitoriaus lopinaviro 50 poveikis (5c pav., D). Kortikososteronas, selektyvus OCT3 36, 51 inhibitorius, taip pat neturėjo jokio poveikio (6 pav.), Kas rodo, kad OCT1 arba OCT2 buvo atsakingi už p- tiramino transportavimą. Tai dar kartą patvirtino pentamidino sukeltas akivaizdus p- tiramino išsiskyrimo greičio padidėjimas (7a, b pav.). Kadangi pranešama, kad OCT1 nėra 41, 42 centriniuose neuronuose, mes pagrįstai įsitikinome, kad OCT2 (arba pernešėjas, turintis savo farmakologinį profilį) veikė kaip nanodalelių p- tiramino koncentracijų pernešėjas žiurkių smegenų sinaptosomose. OCT1 sukelto pernešimo trūkumą dar kartą patvirtino atropino (selektyvaus OCT1 inhibitoriaus 48 inhibitoriaus) nebuvimas (7c pav., D).

Kadangi aukščiau pateikti rezultatai parodė poveikį tik tiems junginiams, kurie slopina daugiau nei vieną transporterį, mes papildomai patvirtinome selektyvų transportavimą OCT2 tipo transporteriu, ištyrę, ar selektyvių inhibitorių kokteilis pakeitė p- tiramino atpalaidavimo savybes. Atropino, kortikososterono ir lopinaviro derinys, slopinantis OCT1, OCT3 ir PMAT, tačiau nepaliekantis OCT2 aktyvumo, taip pat neturėjo įtakos išsiskyrimo charakteristikoms (žr. Papildomą S2 pav.). Tai parodė, kad p- tiramino atpalaidavimo savybės nebuvo keičiamos dėl to, kad buvo slopinami keli pernešėjai ir tokiu būdu pašalinamas transportavimo dubliavimasis, tačiau kad per neuronų membranas gabenti turėjo tik OCT2 arba dar nežinomas transporteris, turintis farmakologinį profilį su OCT2. Yra keletas „Slc22“ šeimos narių, kurie šiuo metu yra prastai apibūdinami, įskaitant įvairius organinius katijonus į transporterį primenančius baltymus 67, ir šiuo metu negalime galutinai atmesti galimybės, kad jie vaidins čia stebimą poveikį. Atrankinis OCT2 numušimas ir (arba) transfekcija ląstelių linijose padėtų tai išspręsti, nors atskirtos sinaptosomos nėra lengvai pritaikomos tokiam metodui.

Mes patvirtinome, kad OCT2 yra ir priekinės žievės, ir striatos sinaptosomų preparatuose, naudojant Western blot metodą (8 pav.). Vyravo vyraujanti maždaug 66 kDa juosta, atitinkanti numatomą žiurkės OCT2 68 molekulinę masę, tiek striatinėje, tiek priekinėje žievės sinaptosomose. Tai atitinka neseniai pateiktą pranešimą apie OCT2 buvimą monoaminerginiuose ir cholinerginiuose ikisinapsiniuose terminaluose 69, įskaitant cholinerginius sinapsinius pūsleles 70 . OCT2 daugiausia yra ekspresuojamas inkstuose 66 ir kaip teigiamą kontrolę mes patvirtinome, kad tokio paties dydžio juosta taip pat buvo visuose inkstų homogenatuose (plg. 8 pav. Pagrindinę plokštę ir intarpą).

Galiausiai siekėme nustatyti p- tiramino transportavimo pentamidinui jautriu transporteriu kinetiką. Šiuo atžvilgiu sudėtinga p- tiramino difuzija per lipidinius dvisluoksnius sluoksnius (t ½ ≈ 15 s) 24 . Todėl mes apibrėžėme bendrą (nešiotojo + difuzijos sąlygojamą) ir pentamidinui nejautrų (difuzinės mediacijos) įsisavinimą sinaptosomose, skirtumą prilygstantį pentamidinui jautriam transporterio tarpininkavimui. Taikant tokį metodą Michaelis-Mentenas nustatė k t = 101, 5 nM ir Vmax = 30, 2 fmol / mg baltymo / s absorbcijos kinetinius parametrus. Kt gerai atitinka p- tiramino endogeninių audinių koncentracijų audiniuose vertinimus, rodančius, kad šio pernešėjo absorbcija greičiausiai yra fiziologiškai svarbi. Vmax prilygsta 1, 8 pmol / mg baltymo / min. Vertei ir yra panašus į reikšmes, nurodytas selektyviame dopamino pernešime DAT 71 arba serotonino per SERT 72 sinaptosomų preparatuose. Nors mes kontroliavome p- tiramino difuziją į sinaptosomas, mes negalime užkirsti kelio difuzijai grįžti atgal, ir tai gali lemti, kad gaunamas tariamasis grynasis V max yra tikrosios vertės neįvertinimas.

Įdomu pastebėti, kad p- tiramino, TAAR1, taikinys yra ne tik, kad vyrauja tarpląsteliniu būdu 4, 73, todėl reikalingas membranos praleidimas dėl postinapsinio tarpininkavimo, bet ir gana plačiai suderintas atsižvelgiant į ligandų selektyvumą 74, 75 . Visa UŠT šeima, įskaitant OCT2, taip pat pasižymi labai plačiu substrato selektyvumu 76, nors pranešta, kad keli junginiai rodo nanomolinį afinitetą, kurį stebėjome p- tiramino atžvilgiu. Pranešama, kad tiek d-amfetaminas, tiek MDMA (3, 4-metilendioksimetamfetaminas) rodo didesnį afinitetą OCT2 nei kiti šeimos nariai 42 ir abu yra didelio afiniteto ligarai TAAR1 4 . Iš esmės yra panašumų tarp OCT2 substrato selektyvumo ir TAAR1 ligando selektyvumo. Ar reikia kitų aminų, tokių kaip 2-feniletilamino, taip pat pernešti OCT2, reikia atlikti papildomus tyrimus. Tačiau anksčiau buvo pranešta, kad 2-feniletilamino membranos praeina nepriklausomai nuo visų žinomų OCT 65 .

Taip pat įdomu pastebėti, kad neseniai buvo pranešta, kad OCT2 išmušti gyvūnai turi GSK-3β signalizacijos 44 trūkumų, o įrodyta, kad TAAR1 aktyvinimas skatina β-arrestin-2 / GSK-3β transdukcijos kaskadą 9, 73 . TAAR1 yra gerai žinomas kaip konstituciškai aktyvus arba toniškai aktyvinamas endogeninių 5, 7 ligandų, ir tai padidina galimybę, kad OCT2 išmušusiems gyvūnams stebimas deficitas, bent jau iš dalies, gali būti sumažėjęs dėl tonizuojančio TAAR1 aktyvavimo. dėl sumažėjusio p- tiramino membranos praėjimo, nesant OCT2. Tokioje situacijoje galima numatyti, kad TAAR1 agonistai, tokie kaip RO5166017 77, gali pakeisti fenotipą, susijusį su OCT2 išmušimu. Galiausiai didelis p- tiramino afinitetinis pernešimas, kurį sukelia UŠT2, taip pat rodo, kad reikia atsižvelgti į aminų homeostazės pėdsakų pokyčius, atsižvelgiant į įvairių terapinių vaistų 78, 79, kurie sąveikauja su UŠT, farmakologinius profilius „nuo tikslo ribos“ .

Apibendrinant galima pasakyti, kad šis tyrimas pateikia pirmąjį didelio afiniteto p- tiramino transporterio, esančio žiurkių smegenų sinaptosomų preparatuose, farmakologinį apibūdinimą. Šio transporterio profilis atitinka OCT2, kurį patvirtiname esant sinaptosomose iš priekinės žievės ir striatumos. Tai taip pat teikia papildomą paramą priešsinapsinei OCT2 terminalo vietai. Šio transporterio p- tiramino įsisavinimo kinetika atitinka tuos, kurie parodo monoamino neurotransmiterių įsisavinimą jų selektyviųjų pernešėjų metu. Šis tyrimas padidina supratimą apie normalius homeostatinius mechanizmus, susijusius su pėdsakų aminerginio veikimo valdymu stuburinių centrinėje nervų sistemoje.

Metodai

Gyvūnai

Visi tyrimai buvo atlikti vadovaujantis Kanados gyvūnų globos tarybos gairėmis ir buvo patvirtinti Niufaundlendo memorialinio universiteto institucinio gyvūnų priežiūros komiteto. Vyriškos lyties „Wistar“ žiurkės (200–400 g) buvo naudojamos visuose tyrimuose ir buvo laikomos po dvi kiekvienoje narve esant 20 ± 1 ° C temperatūrai, esant 40–70% drėgnumui, 12 valandų šviesoje: tamsus ciklas su maistu ir vandeniu ad libitum . Visos procedūros buvo atliekamos lengvuoju ciklo etapu.

Sinaptosomų paruošimas

Sinaptosomos buvo paruoštos, kaip aprašyta aukščiau 24, iš 4 (kinetikos) arba 5 (išsiskyrimo tyrimai) gyvūnų audinių, sujungtų kiekvienam nepriklausomam eksperimentui, kuris nustatė [3H] p- tiramino išsiskyrimą tiek bazinėmis, tiek depoliarizuojančiomis sąlygomis, jei tokio nebuvo ir nebuvo. arba daugiau transporterio inhibitorių. Trumpai tariant, sujungti priekiniai žievės žiedai arba striatos buvo homogenizuoti 10 tūrių 0, 32 M ledo šaltos sacharozės ir gauta suspensija centrifuguota 4 ° C temperatūroje 1000 g x 10 min. Supernatantas pašalinamas ir toliau centrifuguojamas 4 ° C temperatūroje 10 000 g x 20 min. Gautas supernatantas išmetamas, o P2 nuosėdos pakartotinai suspenduojamos ledo šalto tyrimo buferyje (25 mM HEPES, 120 mM NaCl, 5 mM KCl, 2, 5 mM CaCl2, 1, 2 mM MgS04, 2 μg / ml d-gliukozės, 0, 2). μg / ml askorbo rūgšties; pH 7, 5; 1 ml buferio priekinėje žievės porcijoje arba striatoje). Visuose buferiuose taip pat buvo 10 μM pargilino, 100 μM dietilditiokarbamato ir 2, 5 μM OR-486, kad būtų užkirstas kelias p- tiramino metabolizmui. Visų sinaptosomų preparatų mėginiai buvo laikomi užšaldyti –20 ° C temperatūroje, kad būtų galima atlikti baltymų analizę ir (arba) Western blot analizę.

Paleidimo testai

Sinaptosomos (50 μL alikvotinės dalys) buvo iš anksto pakrautos inkubuojant su 100 nM [3H] p- tiramino (0, 1 Ci / mmol; American Radiolabeled Chemicals Inc., Sent Luisas, MO) 37 ° C × 10 min. Preliminarūs tyrimai patvirtino, kad to pakako, kad pridėtas p- tiraminas būtų suvartotas pusiausvyrai. Įsisavinimas buvo sustabdytas pridedant 1 ml ledo šalto tyrimo buferio ir panardinant reakcijos mėgintuvėlį į ledą, po to centrifuguojant 10 000 g x 4 min 4 ° C temperatūroje. Supernatantas buvo išmestas, o nuosėdos išplautos pakartotinai suspenduotos 0, 5 ml ledo šalto bandymo buferio ir pakartotinai centrifuguotos. Tyrimams, kurių metu buvo tiriamas transporterių inhibitorių poveikis, šis buferis buvo papildytas inhibitoriumi (-iais), esant nurodytai koncentracijai (-oms), ir transporterio inhibitoriai buvo įtraukti į visus paskesnius buferio tirpalus. Gautos granulės buvo pakartotinai suspenduotos baziniame arba depoliarizuojančiame (25 mM KCl) tyrimo buferyje. Buvo naudojami šie inhibitoriai: GBR-12783 (50 nM; DAT slopinimas), citalopramas (50 nM; SERT slopinimas 80 ), maprotilinas (100 nM, NET slopinimas), decynium-22 (1 μM; pan-OCT + PMAT slopinimas)., lopinaviras (30 μM; PMAT slopinimas), chinidinas (50 μM; pan-UŠT slopinimas 81 ), atropinas (10 μM; OCT1 slopinimas), kortikosteroonas (1 μM; OCT3 slopinimas) ir pentamidinas (200 μM; OCT1 ir OCT2). ). Įvairių šiame tyrime naudojamų inhibitorių selektyvumas apibendrintas 1 papildomoje lentelėje 80, 81, 82 .

Iš anksto pakrautos sinaptosomos buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje skirtingą laiką. Iškart po inkubacijos pavyzdžiai buvo centrifuguoti 10 000 g x 4 min 4 ° C temperatūroje. Supernatantai buvo pašalinti, granulės pakartotinai suspenduotos 0, 5 ml NP-40 lizės buferyje (20 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 10% (v / v) glicerolio, 1% (v / v) NP-40, 2 mM EDTA, pH 8, 0) ir inkubuotas 37 ° C × 30 min. Po inkubacijos suspensijos buvo perkeltos į atskirus scintiliacijos buteliukus ir pridėta 5 ml scintiliacijos kokteilio (ScintiSafe, ThermoFisher Scientific, Otava, ON) ir leista stovėti per naktį. Tada bendras tričio kiekis kiekviename mėginyje buvo suskaičiuotas skystos scintiliacijos būdu, naudojant „Tri-Carb 2810TR“ skysčio scintiliacijos skaitiklį (Perkinas Elmeris, Waltham, MA), veikiantis 60–65% efektyvumu. Kiekvieno mėginio suminės dpm buvo konvertuotos į pmol p- tiraminą, palyginus su standartine kiekvieno bandymo kreive. Kiekviename eksperimente duomenų analizei buvo naudojamas dubliuotų mėginių vidurkis kiekvienu laiko momentu ir apdorojimas. Duomenys buvo normalizuoti atsižvelgiant į bendrą sinaptosomų preparato baltymų kiekį ir pritaikyti vienos fazės eksponentinio skilimo funkcijai, naudojant GraphPad Prism 6.0 (GraphPad, LaJolla, CA).

Transporterio kinetika

Sinaptosomų alikvotinės dalys buvo inkubuojamos 37 ° C temperatūroje su [3H] p- tiraminu esant įvairioms koncentracijoms įvairiais laiko momentais bazinio tyrimo buferyje, nesant ir 400 μM pentamidino. p- tirramino įsisavinimas buvo sustabdytas pridedant 1 ml ledo šalto bandymo buferio ir iškart dedant reakcijos indą į ledo vonią, po to centrifuguojant 4 ° C temperatūroje 10 000 g x 4 min. Supernatantas buvo išmestas, o nuosėdos buvo pakartotinai suspenduotos 0, 5 ml NP-40 lizės buferio ir suskaičiuotos, kiek bendro tričio yra, kaip aprašyta aukščiau. Kiekvieno mėginio suminės dpm buvo konvertuotos į pmol p- tiraminą, palyginus su standartinėmis kiekvieno bandymo kreivėmis. Visi mėginiai buvo tirti dviem egzemplioriais su dviejų duomenų analizei naudojamų rodmenų vidurkiu. Vertės buvo normalizuotos atsižvelgiant į bendrą sinaptosomų preparatų baltymų kiekį.

Buvo sudaryti bendro p- tiramino įsisavinimo ir laiko grafikai, o tiesinė regresija nustatyta pradinė (<45 s) kiekvienos p- tiramino koncentracijos tiesinė absorbcijos sparta (v o ). Po to, kai nebuvo ir nebuvo 400 μM pentamidino, Michaelio-Menteno, palyginti su p- tiramino koncentracija, grafikai buvo naudojami norint nustatyti, koks yra pentamidinui jautrus įsisavinimas k t ir v max, naudojant „GraphPad Prism 6.0“.

Baltymų analizė

Bendras baltymų kiekis sinaptosominiuose preparatuose buvo nustatytas naudojant Pierce bicinchinin rūgšties (BCA) rinkinį („ThermoFisher Scientific“, Otava, ON) pagal gamintojo instrukcijas. Trumpai tariant, mėginiai buvo praskiesti 0, 9% fiziologiniu tirpalu (priekinė žievė 1:20; striatum 1:10) ir 10 μL praskiesto mėginio, inkubuoti su BCA reagentu 37 ° C × 30 min. Absorbcija buvo nustatyta esant 562 nm, naudojant „BioTek Synergy 2“ mikrotinklių plokštelių skaitytuvą (BioTek, Winooski, VT), o bendras baltymas nustatytas palyginus su galvijų serumo albumino standartine kreive, paruošta kiekvienu tyrimu.

Vakarų botas

Sinaptosomų preparatai buvo praskiesti baziniu HEPES buferiu iki baltymų koncentracijos 50 μg / ml. Baltymai buvo atskirti ant paruoštų Bolt ® 4–12% bis-tris akrilamido gelių („ThermoFisher Scientific“, Otava, ON) denatūravimo sąlygomis ir po to pernešti į nitroceliuliozės membraną naudojant „iBlot 2“ sauso blotinimo sistemą („ThermoFisher Scientific“, Otava, ĮJUNGTA) prieš tai mirkant 20% etanolyje x 5 minutes, kaip nurodyta gamintojo instrukcijose. „Western blot“ buvo atliktas naudojant „iBind Western“ sistemą („ThermoFisher Scientific“, Otava, ON), naudojant triušio polikloninį anti-SLC22A2 antikūną („eLabScience“, „Bethesda“, MD), skiedžiant 1: 200, ir krienų peroksidaze konjuguotą ožkos anti-triušio antrinį antikūną. (Bio-Rad, Misisauga, ON) skiedžiant santykiu 1: 600. Po blotinimo membrana buvo plaunama dejonizuotu vandeniu ir buvo indukuota chemiliuminescencija, inkubuojant su Clarity Western ECL substratu (50:50 (t / t) vandenilio peroksido: luminolio / stipriklio tirpalu; Bio-Rad, Misisauga, ON) × 5 min. Chemiliuminescencija buvo vizualizuota naudojant ImageQuant LAS4000 gelio dokumentacijos sistemą („GE Healthcare Life Sciences“, Misisauga, ON). Juostos buvo lyginamos su biotiniluotų baltymų kopėčių rinkiniu (Cell Signaling Technology, Whitby, ON), vizualizuotos chemiliuminescencijos būdu po inkubacijos su pateiktu krienų peroksidaze konjuguotu anti-biotino antikūnu.

Duomenų analizė ir statistika

Visi sinaptosomų atpalaidavimo ir kinetiniai tyrimai buvo analizuojami naudojant „GraphPad Prism 6.0“ visuotinės kreivės pritaikymo funkcijas. Išsiskyrimo kreivės buvo pritaikytos prie vienfazio eksponentinio skilimo funkcijos ir buvo palygintos naudojant papildomą kvadratų sumos F testą, kai α = 0, 05, o reikšmingumas imamas esant P <0, 05.

Papildoma informacija

Kaip pacituoti šį straipsnį : Berry, MD et al . Farmakologinis didelio afiniteto p- tiramino transporterio apibūdinimas žiurkių smegenų sinaptosomose. Mokslas. Rep. 6, 38006; „doi“: 10.1038 / srep38006 (2016).

Leidėjo pastaba: „ Springer Nature“ išlieka neutralus paskelbtų žemėlapių jurisdikcijos reikalavimų ir institucinių ryšių atžvilgiu.

Papildoma informacija

PDF failai

  1. 1.

    Papildoma informacija

Komentarai

Pateikdami komentarą jūs sutinkate laikytis mūsų taisyklių ir bendruomenės gairių. Jei pastebite ką nors įžeidžiančio ar neatitinkančio mūsų taisyklių ar gairių, pažymėkite, kad tai netinkama.