Farmakoforinis virtualus patikrinimas ir tankio funkcinės teorijos metodas naujų butirilcholinesterazės inhibitorių identifikavimui | acta pharmaologica sinica

Farmakoforinis virtualus patikrinimas ir tankio funkcinės teorijos metodas naujų butirilcholinesterazės inhibitorių identifikavimui | acta pharmaologica sinica

Anonim

Anotacija

Tikslas:

Identifikuoti kritines chemines savybes su patikimais geometriniais apribojimais, kurie prisideda prie butirilcholinesterazės (BChE) funkcijos slopinimo.

Metodai:

Ligandu pagrįstas farmakoforinis modeliavimas buvo naudojamas BChE inhibitorių kritinėms cheminėms savybėms nustatyti. Sukurtas farmakoforinis modelis buvo patikrintas naudojant įvairius metodus, tokius kaip Fischerio atsitiktinių imčių metodas, testų rinkinys ir jaukų rinkinys. Geriausias farmakoforinis modelis buvo naudojamas kaip užklausa atliekant virtualų patikrinimą, siekiant nustatyti naujus pastolius, kurie slopina BChE. Tiriant junginius, atrinktus pagal geriausią hipotezę virtualioje atrankoje, buvo tiriamos panašios į vaistus savybės, ir buvo atliktas molekulinio doko tyrimas, siekiant nustatyti optimalų paveiktų junginių orientaciją BChE aktyviojoje vietoje. Norint nustatyti patekusių junginių reaktyvumą, buvo atlikta pasienio orbitos analizė, naudojant tankio funkcijų teoriją.

Rezultatai:

Remiantis jos koreliacijos koeficientu (0, 96), kvadratinio vidurkio (RMS) nuokrypiu (1, 01) ir bendromis sąnaudomis (105, 72), kiekybinė hipotezė Hypo1, susidedanti iš 2 HBA, 1 Hy-Ali ir 1 Hy-Ar, buvo pasirinkta kaip geriausia hipotezė. Taigi Hypo1 buvo naudojamas kaip 3D užklausa atliekant virtualų Maybridge ir Chembridge duomenų bazių tikrinimą. Rezultatų junginiai buvo filtruojami naudojant ADMET, Lipinski's Rule of Five ir molekulinį doką, kad būtų sumažintas klaidingai teigiamų rezultatų skaičius. Galiausiai buvo atrinkti 33 junginiai pagal jų kritinę sąveiką su reikšmingomis aminorūgštimis BChE aktyviojoje vietoje. Norėdami patvirtinti inhibitorių potencialą, buvo apskaičiuota paveiktų junginių ir 7 treniruojamų junginių orbitos energija, tokia kaip HOMO ir LUMO. Iš 33 paveiktų junginių buvo atrinkta 10 junginių, kurių HOMO reikšmės buvo didžiausios, ir šis rinkinys buvo toliau susmulkintas iki 5 junginių, atsižvelgiant į jų energijos spragas, svarbias stabilumui ir energijos perdavimui. Remiantis bendrais rezultatais, 5 patvirtinti junginiai buvo potencialūs BChE inhibitoriai, tenkinantys visas Hypo1 farmakologines savybes.

Išvada:

Šis tyrimas nurodo svarbias chemines savybes ir geometrinius apribojimus, kurie prisideda prie BChE aktyvumo slopinimo. Penki junginiai išrenkami kaip geriausiai BchE slopinantys junginiai.

Įvadas

Cholinesterazės (ChE) dalyvauja cholino skaidymesi ir turi panašų baltymų seką, tačiau skiriasi jų kinetinės savybės. Remiantis substrato ir inhibitorių specifiškumu, cholinesterazės yra suskirstytos į dvi pogrupius: acetilcholinesterazes (AChEs; EC 3.1.1.7) ir butirilcholinesterazes (BChEs; EC 3.1.1.8). AChE daugiausia yra centrinėje ir periferinėje nervų sistemoje, taip pat raumenyse. Raumenyse AChE nutraukia impulsų perdavimą greitai atlikdama acetilcholino hidrolizę į acto rūgštį ir choliną 1 . BChE pirmiausia sintetinamas kepenyse ir išskiriamas į plazmą. Jis yra atsakingas už įvairių cholino (hidrofilinių ir hidrofobinių) ir necholino esterių hidrolizę 2 . BChE vaidina pagrindinį vaidmenį cholinerginėse sinapsėse, nutraukdamas acetilcholino veikimą, nors visa BChE fiziologinė funkcija išlieka neaiški 3 . Abu cholinesterazės fermentai priklauso α / β-hidrolazės raukšlės baltymų super šeimai 4 . Tiek AChE, tiek BChE egzistuoja kaip katalizinių subvienetų multimerai rutulinėse formose, tokiose kaip G1, G2 ir G4, turinčiose atitinkamai vieną, du arba keturis subvienetus. Abiejų fermentų substratų hidrolizė vyksta atliekant transaciliacijos etapą, apimantį nukleofilinius ir bendruosius rūgšties-bazės elementus 5 . BChE veikia kaip baltymas, apsaugantis cholinerginę sistemą nuo anticholinesterazės nuodų. BChE yra vienintelė karboksilesterazė 6, 7, turinti pripažintą toksikologinę ir farmakologinę reikšmę šalinant ir detoksikuojant daugelį esterių turinčių vaistų, priešvaistus 8, 9 ir nuodingus karbamilo ir fosforilo esterius, įskaitant nervų agentus 10, 11 .

Šiuo metu BChE yra svarbus farmakologinis taikinys Alzheimerio ligos (AD) terapijoje 12 . ADh smegenų neuronų plokštelėse buvo nustatyta 40–90% BChE ekspresijos ir aktyvumo padidėjimas 13 . BChE yra pajėgus kompensuoti sumažėjusias AChE katalizines funkcijas sinapsiniame plyšyje 14, 15 ir rodo žymiai padidėjusį aktyvumą (30–60%) per AD 16, 17 . Taigi pastaraisiais metais daugelis mokslininkų ir tyrėjų parodė didelį susidomėjimą kuriant mažas molekules, kurios gali slopinti BChE aktyvumą 18, 19, 20, 21, 22, 23 . Tačiau taip pat yra vis daugiau įrodymų apie BChE dalyvavimą necholinerginėse funkcijose, tokiose kaip ląstelių diferenciacija 24, neurogenezė ir amiloidinių plokštelių formavimasis AD 25, 26, 27 .

Šiame darbe mes panaudojome kompiuterinius narkotikų projektavimo metodus, kad nustatytume naujus ir stiprius BChE inhibitorius. Farmakoforiniai tyrimai yra ekonomiškesni nei eksperimentinis didelių duomenų bazių cheminis patikrinimas. BChE buvo sukurtas 3D farmakoforinis modelis, pagrįstas žinomų inhibitorių serijomis. Geriausias kiekybinis modelis buvo naudojamas kaip 3D užklausa atliekant virtualų cheminių duomenų bazių tikrinimą, siekiant aptikti naujus svarbius junginius. Virtualūs atrankos rezultatai atskleidė nedidelį duomenų bazių junginių pogrupį, kuris žadėjo galimus junginius, kad galėtų slopinti BChE. Vėliau įvykiai buvo filtruojami pagal Lipinski's Rule of Five, ADME (absorbcija, pasiskirstymas, metabolizmas ir ekskrecija) savybes ir molekulinį doką. Galiausiai tankio funkcinė teorija (DFT) buvo naudojama apskaičiuojant molekulių, apžiūrimų doku, orbitos energijos vertę ir energijos atotrūkį.

Skaičiavimo metodai

Farmakoforinis modeliavimas yra vienas iš dažniausiai naudojamų ir vertingiausių metodų norint atrasti naujus pastolius įvairiems taikiniams.

Junginių pasirinkimas

Kad būtų sukonstruotas BChE duomenų rinkinys, buvo surinktas 71 junginys su atitinkamomis nurodytomis slopinamojo aktyvumo vertėmis (IC50), kurie buvo išbandyti naudojant tą pačią biologinio tyrimo metodą iš įvairių publikacijų 28, 29, 30, 31, 32 . BChE duomenų rinkinys buvo padalytas į dvi grupes: treniruočių ir testų rinkinius, kuriuose buvo atitinkamai 26 ir 45 junginiai. Treniruočių rinkinys buvo parengtas remiantis šiais kriterijais: (i) siekiant išvengti bet kokio atsitiktinumo koreliacijos, buvo parinkta mažiausiai 16 skirtingų junginių; ii) veiklos duomenys turėtų būti 4–5 laipsnių diapazonas; iii) junginiai turėtų būti parinkti taip, kad būtų aiški, glausta informacija, kad būtų išvengta pertekliaus ar paklaidų tiek struktūrinių savybių, tiek aktyvumo diapazonu; iv) turėtų būti įtraukti patys aktyviausi junginiai, kad jie suteiktų informacijos apie svarbiausias savybes, kurių reikia patikimam / racionaliam farmakoforiniam modeliui; ir v) reikia vengti bet kokio junginio, kuris, kaip žinoma, neaktyvus dėl stearinių kliūčių, įtraukimo. Treniruočių rinkinys buvo naudojamas norint sudaryti kiekybinę hipotezę, pagrįstą struktūros įvairovės principais ir IC50 reikšmėmis, apimančiomis platų aktyvumo diapazoną - nuo 3, 6 nmol / L iki 11000 nmol / L (1 paveikslas). Tyrimo rinkinys buvo naudojamas sukurto farmakopfo modelio numatomiesiems gebėjimams įvertinti. Tiek treniruočių, tiek testų rinkiniai buvo suskirstyti į tris kategorijas pagal jų aktyvumo reikšmes. Junginiai, kurių IC50 vertės buvo mažesnės arba lygios 100 nmol / L, buvo laikomi labai aktyviais (+++), o junginiai, kurių aktyvumo intervalas nuo 100 nmol / L iki 10000 nmol / L, buvo laikomi vidutinio aktyvumo (+ +), o junginiai, kurių IC50 vertės yra didesnės arba lygios 10000 nmol / L, buvo nustatyti kaip mažo aktyvumo junginiai (+). Treniruočių ir testų rinkinių molekulių 2D struktūros buvo nubraižytos naudojant „ChemSketch 24“, o struktūros buvo konvertuotos į atitinkamą 3D formą naudojant DS.

Image

26 chemiškai įvairių junginių rinkinys, naudojamas kaip treniruočių rinkinys 3D-QSAR atradimų studijos / farmakopfo generavimo metu. Kiekvieno junginio IC50 vertės, nmol / l, nurodytos skliaustuose.

Visas dydis

Farmakoforinis modeliavimas

Sudarytos kiekybinės hipotezės, o geriausia hipotezė buvo parinkta remiantis modelio gebėjimu numatyti naujų junginių biologinį aktyvumą iš įvairių cheminių duomenų bazių naudojant „Discovery Studio v2.5.5“ (DS, www.accelrys.com, San Diego, CA, JAV). ). Paprastai yra du būdai molekulinei konformacijai generuoti: FAST ir BEST. FAST algoritmas atsižvelgia tik į esamus konformerius ir nutraukia paiešką, kai tik randamas farmakopfo atitiktis, tuo tarpu BEST algoritmas papildomai „patikslina“ skriejančių prieš tai sugeneruotų konformatorių jungčių atstumus, kampus ir diakritinius kampus, kad būtų pasiektos geriausios atitiktys. Čia mes panaudojome BEST konformacijos metodą, kad gautume daugkartines priimtinas kiekvieno junginio, esančio treniruočių ir bandymų rinkiniuose, konformacijas, kai energijos ribinė vertė yra 20 kcal / mol 33 . Farmakoforui sugeneruoti buvo naudojami visi numatytieji parametrai, išskyrus numatytąją neapibrėžties vertę (3.0) buvo pakeista į 2.0 34 . Neapibrėžtis yra nurodytos aktyvumo vertės santykis su mažiausiuoju, o maksimalios vertės turi būti didesnės nei 1, 0. Neapibrėžties vertė turi įtakos ligandų suskirstymui į duomenų rinkinį kaip aktyvūs arba neaktyvūs junginiai ir naudojama konstruktyvioje bei atimamoje fazėse. Čia neapibrėžties vertė 2, 0 buvo tinkamesnė mūsų duomenų rinkiniui, nes junginio veikla apėmė reikalaujamas 4 didumo klases; šį pasirinkimą patvirtino įrodymai literatūroje 35, 36 . Funkcijų kartografavimas / DS protokolas buvo naudojamas nustatyti bendrus bruožus, esančius aktyviuose BChE inhibitoriuose. Pagal šį protokolą galima apskaičiuoti ne daugiau kaip 1000 galimų farmakoforo savybių atrinktų ligandų žemėlapius. Funkcijų kartografavimo būdu pasirinktos funkcijos buvo naudojamos kaip viena pagrindinių įvesties 3D-QSAR farmakoforų generavimo moduliui, naudojant „HypoGen“ algoritmą. „HypoGen“ algoritmas toliau įvertina kiekvieno treniruočių rinkinio junginio aktyvumą, apskaičiuodamas regresijos analizę, naudodamas tokius parametrus kaip geometrinio tinkamumo vertės ir neigiamo aktyvumo logaritmo santykis. Kuriant kiekybinį modelį, hipotezėms sudaryti buvo pasirinktas mažiausiai nuo 0 iki 5 bruožų. Buvo sugeneruota dešimt kiekybinių farmakoporų modelių su atitinkamais statistiniais parametrais, tokiais kaip išlaidų vertės, šaknies vidurkis (RMS) ir tinkamumo vertės. Geriausios kokybės hipotezė buvo išrinkta remiantis išlaidų vertėmis, kaip apibrėžta Debnath metodais 34 .

Hipotezės patvirtinimas

Apskritai, farmakoforiniai modeliai turėtų būti statistiškai reikšmingi, tiksliai numatyti molekulių aktyvumą ir nuskaityti aktyvius junginius iš duomenų bazių. Geriausias farmakoforinis modelis buvo patvirtintas naudojant įvairius veiksmingus metodus, tokius kaip Fischerio atsitiktinumas, testų rinkinys ir jaukų rinkinys 33 . Pagrindinis kiekybinio farmakoforinio modelio įteisinimo tikslas yra nustatyti jo gebėjimą identifikuoti aktyvius junginius, taip pat jo numatomą gebėjimą atitinkamoms molekulėms. Pirminės hipotezės generavimo metu Fischerio atsitiktinių imčių testas buvo atliktas tuo pačiu metu ir sukūrė daugybę atsitiktinių skaičiuoklių, priklausomai nuo pasirinkto reikšmingumo lygio (90%, 95%, 98% ir 99%), pamaišant treniruočių rinkinyje esančias aktyvumo vertes. Čia buvo pasirinktas 95% reikšmingumo lygis. Buvo sukurta devyniolika atsitiktinių skaičiuoklių, atsitiktinai paskirstant treniruočių rinkinių junginių aktyvumo vertę, o testas sukūrė hipotezes, naudojant tas pačias chemines savybes ir parametrus, kurie buvo naudojami kuriant pirminę hipotezę. Testo ir apgaulės rinkiniai buvo naudojami siekiant patikrinti, ar geriausia hipoteze buvo galima parinkti molekules, kurių aktyvumo laipsniai buvo panašūs į aktyviųjų treniruočių rinkinį, ir nustatyti, kaip modelio hipotezė galėjo atskirti potencialius BChE inhibitorius nuo kitų junginių. Tiriamąjį rinkinį sudarė struktūriškai įvairūs cheminiai junginiai iš treniruočių komplekto, kad būtų galima išsiaiškinti farmakoforų nuspėjamumo plotį. Masalų rinkinys buvo paruoštas apskaičiuojant 25 aktyvių BChE inhibitorių ir 2075 neaktyvių ar nežinomų molekulių 1D savybę. EF ir GF buvo apskaičiuoti naudojant šias lygtis:

Image

kur H a yra bendras aktyviųjų junginių skaičius įvykių sąraše, H t - iš duomenų bazės gautų įvykių skaičius, A yra bendras duomenų bazėje esančių aktyvių junginių skaičius ir D yra bendras duomenų bazėje esančių molekulių skaičius .

Virtuali atranka

Ieškant galimų junginių, galinčių slopinti ar sukelti BChE aktyvumą, buvo naudojama farmakoporinė duomenų bazių paieška. Sugeneruota, gerai patvirtinta hipotezė buvo naudojama kaip 3D struktūrinė užklausa atliekant virtualų duomenų bazių, tokių kaip „Maybridge“ ir „Chembridge“, tikrinimą, siekiant atrasti naujus pastolius BChE slopinimui. „ Ligand Pharmacophore Mapping / DS“ greitasis lankstus paieškos metodas buvo pritaikytas norint atrasti atitikmenis, atitinkančius cheminės sudėties reikalavimus, ir erdviniu žemėlapiu pažymėti atitinkamas funkcijas farmakoporinėje užklausoje37.

Vaistų panašumo filtravimas

Prastos farmakokinetinės savybės yra viena iš pagrindinių priežasčių, dėl kurių junginys gali patekti arba progresuoti vaisto kūrimo procese. Vaistiniam chemikui reikia junginių, turinčių gerų farmakokinetinių savybių; Taigi, visi svarbūs junginiai, gauti iš duomenų bazių paieškos, buvo filtruojami taikant ADME ir Penkių taisyklių taisyklę, kurią sukūrė Lipinski 38 . Norėdami gauti junginius, pasižyminčius geromis farmakokinetinėmis savybėmis, buvo apskaičiuoti ADMET aprašai. ADMET buvo naudojamas patikrinti, ar junginiai gali peržengti kraujo ir smegenų barjerą (BBB), ar jie gerai tirpsta, ar absorbcija žmogaus žarnyne (HIA), ar mažai toksiški. Čia daugiausia dėmesio buvo skiriama peroraliniam biologiniam prieinamumui, mažam hepatotoksiškumui ar jo nebuvimui bei gebėjimui įsiskverbti į BBB, kuris yra pagrindinis sprendimų filtras nustatant vaistus centrinei nervų sistemai. Junginiai, kurie atitiko aukščiau nurodytas savybes, buvo atrinkti molekulinio doko tyrimams. Lipinskio 5 taisyklė teigia, kad clogP≤5, molekulinė masė ≤ 500, vandenilio jungčių akceptorių skaičius ≤ 10 ir donorai ≤ 5. Junginiai, pažeidžiantys daugiau nei vieną iš šių taisyklių, gali turėti problemų dėl biologinio prieinamumo, todėl šiuos parametrus DS apskaičiavo, kad būtų pašalinti junginiai, kurie neperžengė aukščiau išvardytų kriterijų.

Molekulinis dokas

Molekulinis dokas kiekvienam junginiui sukuria balą, pagrįstą baltymų ir ligandų kompleksų surišimo afinitetais. Molekulinis dokas buvo naudojamas identifikuoti mažas molekules, kurios sugebėjo gerai tilpti į BChE baltymų surišimo vietą. LigandFit 39 buvo naudojamas atlikti molekulinio doko tyrimus ir nustatyti tikslią ligandų orientaciją aktyviose baltymų vietose. „ LigandFit“ modulis buvo suskirstytas į tris etapus: (i) prijungimas, kai buvo bandoma prijungti ligandą prie vartotojo apibrėžtos surišimo vietos; (ii) in situ ligando minimizavimas; ir (iii) balų skaičiavimas, kai kiekvienai ligandai buvo apskaičiuotos skirtingos balų funkcijos. 3Dh kristalų struktūra BChE (PDB kodas: 1P0I) buvo atsisiųsta iš baltymų duomenų banko (PDB, www.rcsb.org) su gera skiriamąja geba (2 Å). Baltymai buvo paruošti pridedant vandenilio atomus, naudojant CHARMm jėgos lauką 40, naudojant molekulinį modeliavimo modulį. Po baltymų paruošimo, prieš prijungiant mažąsias molekules, reikia nustatyti aktyviąją baltymo vietą. Aktyvioji baltymo vieta gali būti vaizduojama kaip rišamoji vieta, iš esmės kaip taškų rinkinys ant grotelių, esančių ertmėje. Baltymo surišimo vietai apibrėžti buvo taikomi du metodai: (i) remiantis receptoriaus forma, naudojant „trintuko“ algoritmą, ir (ii) tūris, kurį užima žinoma ligando vieta jau aktyviojoje vietoje. Šiam tyrimui mes pasirinkome antrąjį metodą, norėdami rasti aktyviąją BChE ertmę. Iš pradžių doko parametrai buvo patvirtinti prijungiant bendrojo kristalo molekulę prie BChE aktyviosios vietos. Pažeistos molekulės iš virtualiojo atrankos proceso ir 5 aktyvūs inhibitoriai buvo sukrauti į aktyviąją BChE vietą, kad būtų galima rasti tinkamiausią orientaciją ir junginio sugebėjimą jungtis. Dokavimo proceso metu kiekvienam ligandui buvo suformuota 10 geriausių konformacijų, remiantis doko balais po energijos minimizavimo, naudojant intelektualųjį minimizerio metodą, kuris prasideda staigiausio nusileidimo metodu, po kurio eina konjuguotojo gradiento metodas. Prijungtos pozos buvo patvirtintos atsižvelgiant į vandenilio jungčių sąveiką tarp kandidatų molekulių ir aktyviosios vietos liekanų.

Tankio funkcinė teorija

Pagrindinis orbitalinės energijos skaičiavimo tikslas buvo pateikti vertingos informacijos apie BChE inhibitorių elektrostatines savybes. DFT yra sėkmingas ir perspektyvus požiūris, kurį naudoja kvantiniai chemikai periodinių sistemų kvantiniam mechaniniam modeliavimui 41 . Yra svarių įrodymų, kad DFT tiksliai apskaičiuoja mažų molekulių elektronines ir struktūrines savybes, apskaičiuodama elektroninę materijos struktūrą. Molekulių doko tyrimų metu atrinktos užfiksuotos junginių pozos buvo naudojamos kaip DFT įvestis, o ne junginių bioaktyvios konformacijos. Kadangi doko rezultatai parodė tinkamą junginių orientaciją į jungtis, jie buvo tinkami apskaičiuoti tokias orbitos energijas kaip HOMO ir LUMO naudojant DS. Orbitalinės energijos apskaičiavimas naudojant B3LYP pateikė informaciją apie molekulių gebėjimą perkelti savo energiją iš HOMO, kuris gali veikti kaip elektronų donoras, į LUMO, kuris gali veikti kaip elektronų akceptorius. Šie elektrostatiniai savybių skaičiavimai galėtų suteikti naudingos informacijos kuriant naujus BChE inhibitorius.

Rezultatai ir DISKUSIJA

Farmakoforinis metodas, paremtas ligandu, buvo naudojamas išaiškinti erdvinių cheminių ypatybių, turinčių esminę įtaką struktūriškai įvairių ir stiprių BChE inhibitorių sąveikai su jų tiksliniu baltymu, išdėstymą. Ligandu pagrįsti metodai atskleidžia svarbias ir bendrąsias įvairių ligandų chemines savybes, ir šie požymiai gali būti naudojami kaip 3D užklausa atliekant virtualias didelių cheminių duomenų bazių atrankas, siekiant nustatyti naujus paveiktus junginius.

Farmakoforo modelis

HypoGen algoritmas buvo naudojamas konstruojant kiekybines hipotezes, kurios koreliavo eksperimentinę ir numatytą inhibitorių aktyvumo vertes. Kiekvieno tyrimo pabaigoje buvo suformuluota dešimt geriausių hipotezių, remiantis 26 chemiškai skirtingų BChE inhibitorių rinkiniu (1 paveikslas), ir parodytos kiekvienos hipotezės statistinių parametrų vertės, tokios kaip kaina, koreliacija ( r ) ir RMS. 1 lentelėje.

Pilno dydžio lentelė

Tarp dešimties hipotezių devyniose hipotezėse buvo 1 vandenilio jungties akceptorius (HBA) ir 1 hidrofobinė alifatinė (Hy-Ali) grupė, o tai rodo, kad šios cheminės savybės yra būtinos BChE slopinimui. Iš 10 hipotezių tik 3 hipotezės buvo pasirinktos tolesniam apdorojimui remiantis maksimalia tinkamumo verte (didesne nei 9). Debnath analizėje 42, kuri naudojama atrenkant geriausią hipotezę, teigiama, kad geriausias farmakoforinis modelis turėtų turėti didžiausią sąnaudų skirtumą, gerą koreliacijos koeficientą, mažiausiai RMS ir mažiausią visų išlaidų vertę. Išlaidų skirtumai parodo hipotezės nulinės ir visos kainos skirtumą. 40–60 bitų skirtumas lemia prognozuojamą 75–90% koreliacijos tikimybę, o jei skirtumas didesnis nei 60 bitų, manoma, kad hipotezės koreliacijos tikimybė yra didesnė nei 90% 31 . „Hypo1“ parodė didžiausią kainų skirtumą - 120, 12 bitų, palyginti su „Hypo4“ ir „Hypo5“, ir tai rodo jo reikšmingumą. Koreliacijos koeficientas yra pagrįstas tiesine regresija, gauta iš geometrinio pritaikymo indekso; „Hypo1“ parodė aukščiausią koreliacijos koeficientą (0, 96), parodydamas jo aukštą numatymo sugebėjimą. RMS koeficientas parodo numatomo aktyvumo vertės nuokrypį nuo eksperimentinės vertės, o RMS vertės buvo atitinkamai 1, 02, 1, 23 ir 1, 24 Hypo1, Hypo4 ir Hypo5. Šis rezultatas taip pat patvirtina išvadą, kad Hypo1 buvo reikšmingas, palyginti su dviem kitomis hipotezėmis. Farmakoforo modelio patikimumas taip pat priklauso nuo to, ar visos sąnaudų vertės yra nutolusios nuo nulinių išlaidų ir artimos fiksuotoms sąnaudoms. Fiksuotos išlaidos reiškia paprastą modelį, kuris puikiai tinka visiems duomenims, tuo tarpu nulinė kaina reiškia, kad duomenyse nėra ryšio ir kad eksperimentinė veikla paprastai paskirstoma pagal jų vidutinę vertę. Fiksuotos ir bendros „Hypo1“ vertės vertės buvo atitinkamai 94, 82 ir 108, 57. Taigi „Hypo1“, kurį sudarė 2 HBA, 1 Hy-Ali ir 1 hidrofobinis aromatinis junginys (Hy-Ar), buvo išrinkta kaip geriausia hipotezė ir naudojama tolesnėms analizėms. „Hypo1“ cheminės savybės ir 3D erdvinis išdėstymas pavaizduoti 2 paveiksle.

Image

„Hypo1“ farmakopfo modelis ir jo geometriniai parametrai, kur HBA: vandenilio jungčių akceptorius; Hy-Ali: hidrofobinis alifatinis; ir Hy-Ar: hidrofobinis aromatinis.

Visas dydis

Hypo1 buvo naudojamas įvertinti 26 treniruojamų junginių slopinamąjį aktyvumą, siekiant išsiaiškinti jo numatomą tikslumą. „Hypo1“ sugebėjo numatyti 26 treniruojamų junginių slopinamojo aktyvumo vertes ta pačia didumo tvarka (2 lentelė). Vienas vidutiniškai aktyvus ir du neaktyvūs junginiai buvo nepakankamai įvertinti ir pervertinti atitinkamai kaip neaktyvūs ir vidutiniškai aktyvūs. Visi aktyvūs junginiai buvo nuspėti pagal savo aktyvumo diapazonus, nurodant prognozuojamą Hypo1 gebėjimą. „Hypo1“ suderintas su aktyviausiu 1 junginiu (IC 50 : 3, 6 nmol / L) ir mažiausiai aktyviu junginiu 26 (IC 50 : 11 400 nmol / L) treniruočių komplekte (3 paveikslas). Remdamiesi šia analize, mes manome, kad Hypo1 sugebėjo labai tiksliai įvertinti junginių aktyvumą, palyginti su jų eksperimentinėmis IC50 reikšmėmis (2 lentelė). Klaidos reikšmė buvo apibrėžta kaip santykis tarp eksperimentinės ir prognozuojamos aktyvumo vertės, o Hypo1 parodė puikų nuoseklumą. Geriausias farmakoforinis modelis „Hypo1“ buvo patvirtintas įvairiais metodais, tokiais kaip Fisherio atsitiktinumas, bandymų rinkinys ir jaukų rinkinys, siekiant parodyti jo tvirtumą ir statistinį reikšmingumą.

Pilno dydžio lentelė

Image

Geriausias farmakoforinis modelis Hypo1, suderintas su treniruojamaisiais junginiais: A) 1 aktyvusis junginys (IC 50 3, 6 nmol / L) ir B) mažo aktyvumo junginys 26 (IC 50 11 400 nmol / L). Farmakoforo savybės yra koduotos spalvomis (HBA, vandenilio jungčių akceptorius: žalias; Hy-Ali, hidrofobinis alifatinis: šviesiai žalsvai cianas; Hy-Ar, hidrofobinis aromatinis: cianinis).

Visas dydis

Farmakoforo modelio patvirtinimas

Fišerio atsitiktinių imčių testas

Remiantis statistiniu patvirtinimu, Hypo1 reikšmingumui įvertinti buvo pritaikytas Fišerio testas. Hipotezei pagrįsti buvo pasirinktas 95% pasitikėjimo lygis ir iš viso buvo sukurta 19 atsitiktinių skaičiuoklių. Hipotezės reikšmingumas buvo apskaičiuotas naudojant formulę S = [1− (1 + X) / Y] × 100, kur X yra bendras hipotezių, kurių visos išlaidos yra mažesnės nei pirminės hipotezės, skaičius, o Y yra bendras skaičius HypoGen bėgimų (pradiniai + atsitiktiniai bėgimai). Čia X = 0 ir Y = (1 + 19), taigi 95% = {1 - [(1 + 0) / (19 + 1)]} × 100. Bendra 19 atsitiktinių farmakoforų modelių kaina, palyginti su „Hypo1“, parodė, kad pirminė hipotezė buvo žymiai pranašesnė už kitas 19 hipotezių, kurios parodė, kad „Hypo1“ nebuvo sukurtas atsitiktinai (4 pav.). Šis rezultatas suteikė pasitikėjimo, kad Hypo1 gali būti geriausia hipotezė, kurioje yra visos būtinos cheminės savybės, slopinančios BChE aktyvumą.

Image

Skirtumas tarp 19 užmaskuotų važiavimų. Buvo pasirinktas 95% pasitikėjimo lygis.

Visas dydis

Testo rinkinio patvirtinimas

Tiriamąjį rinkinį sudaro 45 struktūriškai skirtingi junginiai iš treniruočių rinkinių molekulių. Testų rinkinys buvo naudojamas ištirti „Hypo1“ sugebėjimą numatyti išorinių junginių aktyvumą tame pačiame aktyvumo diapazone. Išskyrus vieną aktyvųjį junginį, kuris buvo nepakankamai įvertintas kaip vidutiniškai aktyvus, visų likusių junginių savo aktyvumo diapazoną nustato Hypo1 (3 lentelė). Hypo1 parodo stiprų koreliacijos koeficientą 0, 94 tarp eksperimentinio ir prognozuojamo BChE slopinamojo aktyvumo verčių bandymo rinkinyje (5 paveikslas). Šis rezultatas taip pat parodė, kad Hypo1 tinka ne tik treniruoklių komplektams, bet ir išoriniams junginiams; šis rezultatas taip pat parodė numatomą „Hypo1“ sugebėjimą atskirti aktyvius ir neaktyvius BChE inhibitorius.

Pilno dydžio lentelė

Image

Koreliacijos ryšys tarp eksperimentinio aktyvumo ir aktyvumo, kurį numatė Hypo1 tiriamųjų molekulių (rudos spalvos) ir treniruočių rinkinio molekulių (mėlynos spalvos) atžvilgiu.

Visas dydis

Jaukų rinkinio patvirtinimas

Kaip galutinis patvirtinimas, apgaulės rinkinys buvo patikrintas naudojant geriausią lanksčios paieškos modulį / DS. Norint nustatyti Hypo1 tvirtumą, buvo apskaičiuoti keturi parametrai: klaidingi teigiami, klaidingi neigiami, sodrinimo koeficientas (EF) ir tinkamumo balas (GF). EF ir GF buvo apskaičiuoti naudojant šiuos parametrų rinkinius: įvykių sąrašus (H t ), aktyvių procentinių procentų kiekį (% Y), aktyviųjų medžiagų procentinį santykį atitikimų sąrašuose (% A), klaidingus negatyvus ir klaidingus teigiamus duomenis (lentelė) 4). „Hypo1“ pavyko iš viliojimo rinkinio išgauti 76% aktyviųjų junginių. Buvo numatoma, kad 6 aktyvūs junginiai bus neaktyvūs junginiai (klaidingi neigiami). Hypo1 parodė GH rodiklį 0, 86, tai rodo, kad Hypo1 turėjo didesnį polinkį rodyti tikrus teigiamus rezultatus. Remdamiesi bendrais patvirtinimais, buvome tvirtai įsitikinę, kad Hypo1 įrodė puikų BChE inhibitoriaus aktyvumo prognozę.

Pilno dydžio lentelė

Virtuali atranka

Patvirtinta hipotezė „Hypo1“ buvo naudojama kaip 3D struktūrinė užklausa, norint nuskaityti naujas molekules kandidates iš Maybridge (60 000) ir Chembridge (50 000) cheminių duomenų bazių. Iš viso per pirmąjį patikrinimą buvo gauti 45 496 paveikti junginiai; iš jų 1619 junginių buvo parinkti tolesnei analizei, taikant maksimalią tinkamumo vertę, didesnę kaip 8. Vėliau šios molekulės buvo patikrintos dėl ADMET ir Lipinski's Penkių taisyklių. ADMET savybės apskaičiavo kraujo-smegenų barjero (BBB) ​​prasiskverbimo, tirpumo, citochromo P450 (CYP450) 2D6 slopinimo, hepatotoksiškumo, HIA, prisijungimo prie plazmos baltymų (PPB) reikšmes ir įvertino platų ligandų toksiškumo diapazoną. Vaistas neturėtų kirsti BBB, todėl lygis „3“ buvo pasirinktas taip, kad parodytų mažą BBB įsiskverbimą. 0 reikšmė CYP26 ir hepatotoksiškumas rodo, kad molekulės yra mažai toksiškos. Tirpumo ir HIA ribinės vertės buvo atitinkamai 3 ir 0. Iš 1619 molekulių 202 molekulės išlaikė BBB lygį, absorbciją, tirpumą ir toksiškumo kriterijus. Šie paveikti junginiai buvo toliau filtruojami taikant Lipinskio penkių taisyklių nuostatą, kurioje teigiama, kad LogP turėtų būti mažesnis nei 5, molekulinė masė mažesnė nei 500, vandenilio jungčių donorų skaičius mažesnis nei 5, vandenilio jungčių priėmėjų skaičius mažesnis nei 10, o besisukančių jungčių skaičius yra mažesnis nei 10. Molekulių lankstumas ir bendras vandenilio jungčių priėmėjų ir vandenilio jungčių donorų skaičius yra svarbios prognozės, kad junginys turės gerą oralinį biologinį prieinamumą. Remiantis panašiomis į vaistą savybėmis, galutinai atrinkta 84 molekulės. Įtakos junginiams, gautiems atliekant virtualųjį atrankos procesą, buvo tiriami molekuliniu būdu, kad sumažėtų klaidingai teigiamo dažnis.

Molekulinis dokas

Kaip tikslinis baltymas molekuliniam prijungimui buvo pasirinktas BChE kompleksas su butano rūgštimi iš PDB. Specifinės kovalentinės arba nekovalentinės substratų ar inhibitorių sąveikos nustatymas ir pertvarkymas vaidina lemiamą vaidmenį biologinėje funkcijoje. Trys atskiri aktyviosios srities domenai suteikia BChE inhibitorių selektyvumą. Pirmasis domenas yra acilą rišanti kišenė, kurioje yra du likučiai (L286 ir V288), atsakingi už didesnių substratų jungimąsi su acilo grupėmis 43 . Antrasis domenas randamas šalia aktyviosios vietos ertmės lūpos, o trečiasis domenas apibūdinamas kaip cholino surišimo vieta (arba katijono-pi vieta). Katalitinis BChE domenas yra sudarytas iš nukleofilinio serino, histidino ir glutamato liekanų. Substratas buvo stabilizuotas tarp „katalizinės triados“, sudarytos iš S198, E197 ir H438 aktyviosios estetinės vietos, oksianiono angos ir acilą rišančios kišenės. Katalizės mechanizmas priklauso nuo įkrovimo relės sistemos, kurioje H438 imidazolo žiedas perduoda elektronus nuo E197 iki S198 ir dėl to S198 hidroksilo deguonis tampa nukleofilu 44 . Nukleofilinis šio hidroksilo deguonies užpuolimas substrato esterine jungtimi lemia acilo fermento tarpinį junginį ir laisvojo cholino fragmentą. Tada acilo grupė nuo S198 hidrolizuojama nukleofiliškai veikiant vandens molekulei, kuri aktyvuojama paimant protoną iš H438, kad susidarytų katalizinė triada.

Iš pradžių ko-kristalas buvo įdėtas į aktyviąją BChE vietą, siekiant patikrinti, ar parinkti parametrai gali sudaryti tinkamiausią rišimo orientaciją. RMSD vertė 0, 79 Å buvo gauta, kai geriausia dokuota poza sutapo su bendrakristalais, o tai atskleidė, kad numatytieji parametrai galioja norint rasti geriausią BChE orientaciją aktyviojoje vietoje. Tie patys parametrai buvo naudojami jungiant kandidatus į dokus. Iš virtualios atrankos atrinktos molekulės buvo sukrautos BChE aktyviojoje vietoje. Labiausiai galimi inhibitoriai buvo išrinkti iš 84 junginių, reitinguojamų pagal doko vertinimą, ir buvo rankiniu būdu patvirtinti kritinei sąveikai su gyvybinėmis aminorūgštimis aktyviojoje BChE vietoje. Tarp aktyviųjų liekanų S198, E197 ir H438 BChE aktyviojoje vietoje pastebėtas tarpmolekulinis vandenilio ryšys (6 paveikslas). Iš 84 junginių 33 kandidatų molekulės parodė vandenilio jungčių sąveiką su S198 ir H438, taip pat patikimą hidrofobinę sąveiką su Y323 ir F329.

Image

(A) „Chembridge“ (junginys 30080), (B) „Maybridge“ (KM_02281) ir (C) „Maybridge“ (SPB_07954). Junginiai kandidatai vaizduojami kaip žali lazdelės. Vandenilio ryšiai parodyti juodai. Aiškiau išdėstytas vaizdas Y323 nebuvo parodytas.

Visas dydis

Tankio funkcinė teorija

Orbitalinės energijos, tokios kaip HOMO (didžiausia užimta molekulinė orbitalė) ir LUMO (žemiausia neužimta molekulinė orbitalė), buvo apskaičiuotos 7 (5 aktyviems, vienam vidutinio sunkumo ir vienam neaktyviam inhibitoriui) treniruočių rinkinio junginiams ir 33 patapimams iš molekulinio doko. HOMO ir LUMO yra atsakingi už krūvio perdavimą cheminės reakcijos metu 45 . Buvo palyginta apskaičiuota 33 įvykių ir žinomų inhibitorių orbitinė energija, siekiant analizuoti mažų molekulių energijos perdavimą ir stabilumą baltymų aktyviojoje vietoje. Palyginus HOMO energiją su žinomų BChE inhibitorių aktyvumo verte, atsiranda atvirkštinė koreliacija, rodanti, kad inhibitoriaus HOMO energija gali perkelti savo elektronus į kai kuriuos kritinius likučius aktyviojoje BChE vietoje. Didžiausia HOMO energetinė vertė paveiktuose junginiuose reiškia didžiausią stiprų BChE slopinimo tikimybę. Taigi HOMO verčių ir treniruočių rinkinių molekulių koreliacija parodė, kad 10 pataikytų junginių turėjo didesnes reikšmes nei pranešti BChE inhibitoriai (treniruočių rinkinys) (5 lentelė). A smaller energy gap (between the LUMO and HOMO) of the hit molecules illustrates that the molecule are more reactive 46 . The wide energy gap in the hit molecules is unfavorable for the electron to be excited from the HOMO to the LUMO, which consequently leads to a weak affinity of the inhibitor for BChE. Among the 10 compounds, 5 hit compounds (Figure 7) were selected based on their lowest energy gaps that suggested the molecules would be reactive. Table 5 clearly showed that the moderate and inactive compounds had high energy gaps that were not suitable for the reactivity of the molecules. The atomic orbital composition of the frontier molecular orbital for compound 30080 is shown in Figure 8. On the basis of the results above, we suggest that the hit compounds may possess equivalent or greater electronic properties compared with most active compounds and could be used to design novel classes of BChE inhibitors.

Pilno dydžio lentelė

Image

A 2D representation of the final 5 hit compounds.

Visas dydis

Image

The orbital energy values and energy gap for compound 30080.

Visas dydis

Išvados

In this study, pharmacophore models were generated based on a series of known BChE inhibitors. The main purpose of quantitative pharmacophore generation is to predict or differentiate the active inhibitors from inactive compounds. The best pharmacophore model, Hypo1, consisting of 2 HBA, 1 Hy-Ali, and 1 Hy-Ar, was validated by Fischer's randomization method, a test set, and decoy set. Fischer's method confirmed the 95% statistical confidence of Hypo1; the test set showed a fairly high correlation between experimental and predicted IC 50 values (correlation coefficient of 0.96), indicating satisfactory predictive ability; additionally, good EF (0.76) and GF (0.87) values for Hypo1 were calculated from the decoy set. The three validation methods confirmed that Hypo1 was the best hypothesis to differentiate the active inhibitors from inactive inhibitors of BChE. Thus, Hypo1 was used as a 3D query to screen molecular structural libraries, including the Maybridge and Chembridge databases. The hit compounds were filtered using ADMET, Lipinski's Rule of Five, and molecular docking to reduce the number of false positive results. Finally, 33 compounds were selected based on their critical interactions with the significant amino acids in BChE's active site. To confirm the inhibitors' potencies, we calculated the orbital energies, such as HOMO and LUMO, for hit compounds and 7 training set compounds. From among the 33 hit compounds, 10 compounds with the highest HOMO values were selected, and this set was further culled to 5 compounds based on their energy gaps, which is important for stability and energy transfer. From the overall results, we confirmed that 5 hit compounds satisfied all the pharmacophoric features in Hypo1 and are potential BChE inhibitors.

Autoriaus indėlis

Sugunadevi SAKKIAH contributed to all parts of the work, including experimental design, conduct, and analysis, and preparation of the manuscript. Prof Keun Woo LEE analyzed the results.